KR20140105654A - 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유한 항산화 및 고혈압 치료 또는 예방을 위한 조성물 - Google Patents

발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유한 항산화 및 고혈압 치료 또는 예방을 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2단계 발효공정을 거친 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유한 항산화 및 고혈압 치료 또는 예방을 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 발효 산약 추출물 또는 분말은 산약원말을 홍국균(Monascus sp.)을 이용한 1차 발효; 및 젖산균 균주를 이용한 2차 발효를 수행한 후, 멸균, 건조 공정을 통해 수득한 발효산약으로서 DPPH radical 소거활성, 환원력(reducing power) 및 ACE 저해활성을 측정한 결과, 탁월한 항산화 및 고혈압치료 및 예방효과를 나타냄을 확인하여 본 발명의 발효산약 추출물 또는 분말을 이용한 항산화 및 고혈압 질환의 치료 및 예방용 식품, 의약품, 의약외품 등의 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유한 항산화 및 고혈압 치료 또는 예방을 위한 조성물 {A comprising an extracts of fermented Dioscorea batatas Dence containing high GABA content and showing anti-oxidative and anti-hypertensive activity}
본 발명은 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유한 항산화 및 고혈압 치료 또는 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.
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산약 (Dioscorea Rhizome)은 마 (Dioscorea batatas DECNE.) 또는 참마 (Dioscorea japonica THUNB.) 등 마과 (Dioscoreaceae)의 주피를 제거한 근경을 그대로 또는 쪄서 말린 것이다. 마(Dioscorea sp.)는 백합목 마과식물 (Dioscoreacea)로 현재 10속 650여종이 알려져 있으며 다년생 넝쿨성 초본으로 전세계의 열대 및 아열대지방에서 널리 분포하는 식량 작물로서(Purseglove, J.W. 1972. Dioscoreaceae. In 'Tropocal crops monocotylodons' Longman, I.(ed.). London. 97), 우리나라의 전체 생산량 중 약 70% 정도가 경북 북부지역에서 생산되고 있고, 한방에서는 자양, 강장, 폐결핵 등에 유효하고 소염, 해독, 진해, 거담, 이뇨, 신경통, 류마티즘에 효과가 있는 것으로 알려져 있다 (Jung, D.H. 2007. In: Encyclopedia of Health and Functional Foods. Shinil Books Publishing Co., Seoul, Korea. Ma, 191-192). 마 (Dioscorea batatas Dence)의 주요 성분으로는 전분이 생체중의 8~24%, 점질물이 0.6~2.4%를 차지하며, 약용성분으로는 amylose, cholin, saponin, mucin 등이 포함되어 있다 (Kim, C.M., Son, K.H., Kim, S.H., and Kim, H.P. 1991. Steroidal sapogenin contents in some domestic plants. Arch. Pharm . 14, 305-310). 한편 마의 주요 약용성분으로 알려진 steroidal saponin은 항암 및 항염증 작용(Baek, S.H., Kim, S.H., Son, K.H., Chung, K.C., and Chang, H.W. 1994. Inactivation of human pleural fluid phospholipse A2 by dioscin. Arch . Pharm . Res . 17, 218-222; Baek, Y.J., Bae, H.S., and Kim, H.Y. 1991. In vivo antitumor effects of lactic acid bacteria on Sarcoma 180 and mouse Lewis Lung Carcinoma. Cancer Resea . and Treat . 23, 188-197), 세포의 DNA 돌연변이를 방지하는 항 돌연변이성 작용 등 다양한 생리활성에 관여하는 것으로 알려져 있다(Lee, I.S., Chung, S.Y., Shim, C.S., and Koo, S.J. 1995. Inhibitory effect of yam (Dioscorea batatas Dence) extracts on the mutagenicity. Kor . J. Soc . Food Sci . 11, 351-355).
그러나 상기문헌의 어디에도 산약을 홍국균 (Monascus sp.) 및 젖산균을 이용한 2단계 발효 공정을 통해 얻어진 발효 산약 분말에 관한 기술내용이 개시되거나 교시된 바는 없다.
따라서 본 발명자들은 산약 가공식품 연구의 일환으로 발효방법에 따른 기초자료를 확보하기 위하여 수행하였고 또한 산약을 홍국균 (Monascus sp.) 및 젖산균을 이용한 2단계 발효 공정을 통해 얻어진 발효산약 분말을 대상으로 천연색소, HPLC를 이용한 모나콜린 (Monacolin) K의 정량, 총 폴리페놀/총 플라보노이드 함량 및 GABA (γ-aminobutyric acid) 함량변화뿐만 아니라 DPPH radical 소거활성, 환원력(reducing power) 및 ACE 저해활성을 측정한 결과, 우수한 색소 생산능 및 탁월한 항산화 및 고혈압치료 및 예방효과를 탁월한 항산화 및 고혈압치료 및 예방효과를 나타내는 고함량의 GABA 함량을 갖는 발효산약을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 고혈압 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 고혈압 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 발효 산약은 모나스쿠스(Monascus sp.) MK2균주, 모나스쿠스 푸르푸레우스(Monascus purpureus) KFRI1134, 모나스쿠스 필로서스 (Monascus pilosus) KCCM60084, 모나스쿠스 루버(Monascus ruber) KFRI1138, 또는 모나스쿠스 앙카 (Monascus anka) KFRI370 등의 건강기능식품공전에서 인정되는 4종의 균주에 속하는 홍국균주 및 기타 생리기능성 물질 생산능이 인정되는 돌연변이 균주로부터 선택된 하나 이상의 홍국균 (Monascus sp.)을 이용한 1차 발효; 및 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) KCTC3171, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCTC3107, 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) HLJ59, 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 스트렙토코커스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) 균주들로부터 선택된 하나 이상의 젖산균 균주를 이용한 2차 발효를 연속적으로 수행한 발효 산약,
보다 바람직하게는, 건조 상태의 모나스쿠스(Monascus sp.) MK2균주, 모나스쿠스 푸르푸레우스(Monascus purpureus) KFRI1134, 모나스쿠스 필로서스 (Monascus pilosus) KCCM60084, 모나스쿠스 루버(Monascus ruber) KFRI1138, 또는 모나스쿠스 앙카 (Monascus anka) KFRI370 등의 건강기능식품공전에서 인정되는 4종의 균주에 속하는 홍국균주 및 기타 생리기능성 물질 생산능이 인정되는 돌연변이 균주로부터 선택된 하나 이상의 홍국균 (Monascus sp.), 바람직하게는, 홍국균 모나스쿠스(Monascus sp.) MK2균주을, 건조 및 멸균 단계를 거친 산약 시료에 홍국 균주를 분말대비 0.1~20%, 바람직하게는, 1~10%, 보다 바람직하게는, 1~5%(v/v)로 접종하고, 발효 온도 1~50℃, 바람직하게는,10~45℃, 보다 바람직하게는, 20~40℃에서 수분함유 상대습도 20~90%, 바람직하게는, 40~80%, 보다 바람직하게는, 50~70%로, pH 3.0 내지 8.0 바람직하게는, pH 5.0 내지 7.0에서, 발효시간 1일 내지 20일, 바람직하게는 3일 내지 10일 동안 Lin's 배지 등의 발효 배지에 접종하에 10 내지 1000rpm, 바람직하게는, 50 내지 300rpm의 속도로 진탕발효를 수행하여 1차 발효하는 1단계; 상기 1차 발효물에 건조 상태의 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) HLJ59, 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 스트렙토코커스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) 등의 균주로부터 선택된 젖산균 균주, 바람직하게는, 젖산균 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) HLJ59균주을, 분말대비 0.1~20%, 바람직하게는, 1~10%, 보다 바람직하게는, 1~5%(v/v)로 접종하고, 발효 온도 1~50℃, 바람직하게는,10~45℃, 보다 바람직하게는, 20~40℃에서 수분함유 상대습도 20~90%, 바람직하게는, 40~80%, 보다 바람직하게는, 50~70%로, 발효시간 1시간 내지 1주일간, 바람직하게는 12시간 내지 48시간동안 락토바실리(Lactobacilli) MRS broth (Difco, Sparks, USA) 등의 발효 배지에 접종하에 1 내지 10회, 바람직하게는 1 내지 3회 2차 발효하여 발효물을 얻은 2단계; 및 상기 2단계의 발효물을 멸균한 후 건조하고 분말화하는 3단계를 포함하는 공정을 통하여 수득한 발효 산약 분말을 포함한다.
본원에서 정의되는 발효 산약 추출물은 본원에서 정의되는 발효산약 분말을 당업계에 통상적인 추출방법으로 제조된 추출물을 포함하며, 예를 들어, 상기 추출물은 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 주정 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 또는 20 내지 90% 물 및 주정 혼합용매에 가용한 추출물, 바람직하게는,
본 발명의 발효산약 분말 시료 중량의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 2 내지 20배에 달하는 부피의 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 주정 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 또는 20 내지 90% 물 및 주정 혼합용매를 가하고 20 내지 120℃, 바람직하게는 30 내지 80℃에서 약 1 내지 72시간, 바람직하게는 2 내지 12시간 동안에서 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출하여 추출한 후 감압여과 및 농축하여 본 발명의 발효 산약 추출물을 수득할 수 있다.
상기 제조방법으로 제조한 발효 산약에 대하여 색소, HPLC를 이용한 모나콜린 (Monacolin) K의 정량, 총 폴리페놀/총 플라보노이드 함량 및 GABA (γ-aminobutyric acid) 함량변화뿐만 아니라 DPPH radical 소거활성, 환원력(reducing power) 및 ACE 저해활성을 측정한 결과, 우수한 색소 생산능 및 탁월한 항산화 및 고혈압치료 및 예방효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서 본 발명은 상기 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조한 항산화, 항고혈압 활성을 나타내는 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 항산화, 항고혈압 활성을 나타내는 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 고혈압 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 고혈압의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 분말을 0.1 내지 99% 중량으로 포함된다.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 또한 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 분말에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 외용제제에는 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 발효 산약 분말 또는 이의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 5 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
따라서, 또한, 본 발명은 고혈압의 예방 및 개선 효과를 갖는 상기 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품 조성물 및 식품첨가제를 제공한다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 고혈압의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 발효 산약 분말 또는 이의 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본원에 사용된 용어인 기능성 식품 조성물은 식품 제품, 식료품, 식이 보충제, 영양 보충제, 또는 식품 제품용 또는 식료품용 보충 조성물을 포함한다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 기능성 식품이 식품 제품, 식료품, 식이 보충제, 영양 보충제, 또는 식품 제품용 또는 식료품용 보충 조성물인 기능성 식품에 관한 것이다. 바람직하게는, 기능성 식품은 식이 보충제, 영양 보충제, 또는 식품 제품용 또는 식료품용 보충 조성물이다.
본원에서 사용된 용어 식품 제품은 인간 또는 동물이 섭취하기에 적합한 임의의 식품 또는 사료를 의미한다.
식품 제품은 제조되고 포장된 식품(예를 들어, 마요네즈, 샐러드 드레싱, 빵 또는 치즈 식품) 또는 동물 사료 (예를 들어, 압출되고 펠렛화된 동물 사료, 조질의 혼합된 사료 또는 애완 동물 사료 조성물)일 수 있다. 본원에 사용되는 용어 식료품은 인간 또는 동물 소비에 맞춘 임의의 물질을 의미할 수 있다. 용어 식이 보충제는 단일 또는 다중 투여 단위로 포장된 인간 또는 동물의 규정식을 보충하기 위한 소량의 화합물을 의미한다. 식이 보충제는 일반적으로 상당한 양의 칼로리를 제공하지는 않지만 다른 미세영양분(예를 들어, 비타민 또는 무기물)을 함유할 수 있다. 용어 영양 보충제는 칼로리 공급원과 조합된 식이 보충제를 포함하는 조성물을 의미한다. 일부 양태에서, 영양 보충제는 식사 대용물 또는 보충제(예를 들어, 영양 또는 에너지 바 또는 영양 음료 또는 농축물)이다.
식품 제품 또는 식료품은, 예를 들어 음료, 예컨대 비-알콜성 및 알콜 음료, 및 음료수와 액체 제품에 첨가되는 액체 제제이고, 비-알콜성 음료는 예를 들어 청량 음료, 스포츠 음료, 과일 쥬스, 예를 들어 오렌지 쥬스, 사과쥬스 및 그레이프프루트 쥬스; 레모네이드, 차, 니어워터 음료 및 우유 및 다른 낙농 음료, 예를 들어 요구르트음료, 및 다이어트 음료이다. 다른 양태에서, 식품 제품 또는 식료품은 본 발명의 조성물을 포함하는 고체 또는 반-고체 식품을 의미한다. 이들 형태는 비제한적으로 구워진 제품, 예를 들어 케이크 및 쿠키, 푸딩, 낙농제품, 과자, 스낵 식품, 또는 냉동된 과자 또는 신상품(예를 들어, 아이스크림, 밀크 쉐이크), 조제된 냉동 식사, 캔디, 스낵 제품(예를 들어, 칩), 액체 제품, 예를 들어 스프, 스프레드, 소스, 샐러드 드레싱, 조제된 고기 제품, 치즈, 요구르트 및 다른 임의의 지방 또는 오일 함유 식품, 및 식품 성분(예를 들어, 밀가루)을 포함한다. 용어 식품 제품 또는 식료품은 또한 기능성 식품 및 조제된 식품 제품을 포함하고, 후자는 인간의 소비를 위해 승인된 임의의 미리 포장된 식품을 의미한다.
본 발명의 상기 분말 및 이의 추출물은 목적 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 분말 및 이의 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 식이 보충제는 임의의 적합한 형식으로 전달될 수 있다. 바람직한 양태에서, 식이 보충제는 경구 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본 발명의 식이 보충제의 성분은 경구 소비를 위해 허용되는 부형제 및/또는 담체에 함유되어 있다. 담체, 및 이에 따른 식이 보충제 그 자체의 실제 형태는 중요하지 않다. 담체는 액체, 젤, 젤캡, 캡슐, 분말, 고체 정제(코팅되거나 또는 코팅되지 않음), 차 등일 수 있다. 식이 보충제는 바람직하게는 정제 또는 캡슐의 형태이고, 가장 바람직하게는 경질 (껍질) 캡슐의 형태이다. 적합한 부형제 및/또는 담체는 말토덱스트린, 탄산 칼슘, 인산 이칼슘, 인산 삼칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 덱스트로스, 쌀 가루, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 크로스카멜로즈 나트륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스포비돈, 수크로스, 식물성 검, 락토스, 메틸셀룰로스, 포비돈, 카복시메틸셀룰로스, 옥수수 전분 등(이의 혼합물을 포함한다)을 포함한다. 바람직한 담체는 탄산 칼슘, 마그네슘 스테아레이트, 말토덱스트린 및 이의 혼합물을 포함한다. 통상적인 기술을 이용하여 다양한 성분 및 부형제 및/또는 담체를 혼합하고, 바람직한 형태로 성형한다. 본 발명의 정제 또는 캡슐을 약 6.0 내지 7.0의 pH에서 용해되는 장내 코팅으로 코팅시킬 수 있다. 소장에서는 용해되지만 위장에서는 용해되지 않는 적합한 장내 코팅은 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트이다. 제형화하고 투여하기 위한 기술에 대한 추가의 상세한 설명은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publising Co., Easton, PA)]의 최신 판본에서 발견될 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 분말 및 이의 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 발효산약 분말 또는 이의 추출물은 천연색소, HPLC를 이용한 모나콜린 (Monacolin) K의 정량, 총 폴리페놀/총 플라보노이드 함량 및 GABA (γ-aminobutyric acid) 함량변화뿐만 아니라 DPPH radical 소거활성, 환원력(reducing power) 및 ACE 저해활성을 측정한 결과, 우수한 색소 생산능 및 탁월한 항산화 및 고혈압치료 및 예방효과를 탁월한 항산화 및 고혈압치료 및 예방효과를 나타내, 고혈압치료 및 예방효과를 나타내는 식품, 의약품, 외약외품 등의 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 1단계 및 2단계 발효산약의 모나콜린 K 생산능을 나타낸 도이며 (데이타는 평균±SE으로 표기됨);
도 2은 1단계 및 2단계 발효산약의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 변화를 나타낸 도이며 (데이타는 평균±SE으로 표기됨);
도 3은 1단계 및 2단계 발효산약의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 도이며 (데이타는 평균±SE으로 표기됨);
도 4은 1단계 및 2단계 발효산약의 환원력을 나타낸 도이며 (데이타는 평균±SE으로 표기됨);
도 5은 1단계 및 2단계 발효산약의 ACE 효소 저해능을 나타낸 도이며 (데이타는 평균±SE으로 표기됨);
도 6은 1단계 및 2단계 발효산약의 GABA 함량을 나타낸 도이다 (데이타는 평균±SE으로 표기됨).
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 발효산약의 제조
1.1. 사용 균주 및 배양
본 실험에 사용한 균주는 본 연구실에서 신규 분리한 균주들 중에서 홍국색소 생산능이 우수한 것으로 조사된 Monascus sp. MK2 균주 (Jeon et al., 2006)와 ACE 저해물질 생산능이 우수한 것으로 조사된 Lactobacillus brevis HLJ59 균주 (Jeon et al., 2010)를 발효마 제조에 발효 균주로 선발하여 본 실험에 사용하였다. 발효마의 제조를 위해 Monascus sp. MK2의 전배양 기본 배지로 3% rice powder, 0.15% NaNO3, 0.1% MgSO4H2O 및 0.25% KH2PO4, pH 6.0로 구성된 Lin's 배지 (Monascus 속 균주의 전배양 기본 배지로 3% rice powder, 0.15% NaNO3, 0.1% MgSO4H2O 및 0.25% KH2PO4의 조성으로 이루어진 배지의 명칭으로 Lin이 고안한 배지라고 하여 통상적으로 Lin's 배지로 칭함, Lin, 1973)를 사용하였으며, 본 배양은 전 배양과 동일한 Lin's 배지에 Monascus sp. MK2 전 배양액을 2% (v/v)로 접종한 후 초기 pH 6.0, 배양온도 30℃에서 130 rpm으로 5일간 진탕 배양하여, 발효마의 제조를 위한 종균으로 사용하였다.
Lactobacillus brevis HLJ59 균주는 Lactobacilli MRS broth (288130, Difco, Sparks, USA)에 접종하고 37℃에서 24시간 2회 배양하여 균주를 활성화시킨 후 사용하였다.
1.2. 발효산약의 제조
본 실험에 사용한 마 시료는 2011년 경북 안동에서 재배한 병마(Dioscorea batatas Dence.)를 구입하였으며, 구입 직후 4℃에 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다. 발효마를 제조하기 위하여 마는 흐르는 물에 세척하여 뿌리 표면에 부착된 이물질을 없애고 말단 부분과 껍질을 제거한 후, 약 3 mm 정도로 절단하고 60℃에서 항량 건조하여 냉동보관 하면서 사용하였다. 발효마의 제조는 건조된 마를 물에 침지한 후 불림을 행하였으며, 침지 후 물빼기를 실시한 다음 100 g씩 배양통에 분취하였다.
이후 121℃에서 15분간 가압 멸균하고 실온으로 냉각시킨 다음 Monascus sp. MK2 배양액을 5% (v/w)로 접종 한 후 30℃에서 7일간 발효한 경우(1단 발효)와 Monascus sp. MK2 배양액을 5% (v/w)로 접종 한 후 30℃에서 7일간 발효한 다음 Lactobacillus brevis HLJ59 균주를 5% (v/w)로 접종하여 2일간 발효한 경우(2단 발효), 또한 Lactobacillus brevis HLJ59 균주를 5% (v/w)로 접종하여 2일간 발효한 경우(1단 발효)와 Lactobacillus brevis HLJ59 균주를 5% (v/w)로 접종하여 2일간 발효한 다음 Monascus sp. MK2 배양액을 5% (v/w)로 접종 하여 7일간 발효한 경우 (2단 발효)로 구분하여 각각 발효를 실시하였으며, 배양체의 덩어리 형성 방지를 위해 하루에 3회 규칙적으로 흔들어 주었다. 발효가 완료된 후에는 60℃에서 수분함량 10% 이하로 건조한 후 분쇄하여 냉동보관 하면서 실험에 필요한 시료, 즉, (a) Monascus sp. MK2 배양액을 5% (v/w)로 접종 한 후 30℃에서 7일간 발효한 발효산약 (이하, MK2라 함), 100g; (b) Monascus sp. MK2 배양액을 5% (v/w)로 접종 한 후 30℃에서 7일간 발효한 다음 Lactobacillus brevis HLJ59 균주를 5% (v/w)로 접종하여 2일간 발효한 발효산약 (이하, MK2/HLJ59라 함), 100g; (c) Lactobacillus brevis HLJ59 균주를 5% (v/w)로 접종하여 2일간 발효한 발효산약 (이하, HLJ59라 함), 100g; Lactobacillus brevis HLJ59 균주를 5% (v/w)로 접종하여 2일간 발효한 다음 Monascus sp. MK2 배양액을 5% (v/w)로 접종 하여 7일간 발효한 발효산약 (이하, HLJ59/MK2라 함), 100g을 각각 수득하여 하기 실험에 사용하였다.
1.3. 시약
Folin-ciocalteau’s phenol reagent (제품번호-F9252), DPPH (제품번호-D9132), tannic acid(제품번호-403040), GABA(γ-aminobutyric acid(제품번호-A5835)), angiotensin converting enzyme (ACE, 제품번호-A6778)), hippuril-L-histidine-L-leucine (HHL, 제품번호-H4884)) mevinolin(monacolin K(제품번호, M2147) 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외의 시약은 특급 및 일급 시약을 사용하였다.
실험예 1. 발효마의 색소 측정
상기 실시예에서 수득한 본 발명의 발효산약에 대한 색소측정을 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 측정하였다.
발효마로부터 색소의 측정은 80% 에탄올로 각각 추출한 후 추출액을 6,000 xg에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 적정배수까지 희석하고 UV-VIS spectrophotometer (Hewlett Packard 8453, Germany)를 사용하여 황색 색소는 400 nm, 오렌지 색소는 470 nm 및 적색 색소는 500 nm에서 측정한 흡광도 값을 각각의 색소 값으로 나타내었다. 또한 적색 색소와 황색 색소의 생성량을 500 nm/400 nm의 비율로서 상대적으로 비교하였고, 1.0을 기준으로 하여 그 이상은 적색 색소의 생성 비율이 높은 것으로 그 이하는 황색 색소의 생성 비율이 높은 것으로 나타내었으며, 이때 흡광도 (OD) 1.0을 1 unit로 나타내었다.
본 실험 결과, 식품공업에서 가장 많이 사용되어 온 색소는 대부분 타르계 합성색소로서 그 발암성 등 안전성에 문제가 발생함에 따라 천연색소에 대한 소비자의 요구가 증대됨으로서 식품에서의 천연색소 사용량이 계속적으로 증가되고 있으며, 이처럼 식품에 사용되는 색소는 식품산업에서의 제품의 가치를 높이고, 소비자의 구매욕구와 식욕을 향상시키는 역할을 하고 있다(Judie, D.D. 1987. Applications and colorants, Food Technol. 23, 78-88). 천연색소의 공급원으로는 특정 식물의 꽃, 잎, 뿌리 및 열매로부터 얻는 식물성 천연색소와 미생물이 생산하는 미생물 유래 천연색소가 주를 이루고 있으며, 그 중에서 역사상 오래 전부터 주목 받아 온 것은 홍주, 육류가공, 홍두부, 기타 음식물의 착색에 이용되어온 홍국 (Ang-khak)이 있다(Kim, C.M., Son, K.H., Kim, S.H., and Kim, H.P. 1991. Steroidal sapogenin contents in some domestic plants. Arch . Pharm. 14, 305-310).
본 연구에서는 Monascus sp. MK2 균주와 Lactobacillus brevis HLJ59 균주를 이용하여 마의 1단 발효와 2단 발효를 실시하였으며, 이때 생산되는 색소 생산량은 표 1과 같다.
Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때 황색, 오렌지색 및 적색 색소의 생산능이 각각 14.03, 13.88 및 15.71로서 가장 높게 나타났으며, Monascus sp. MK2로 1단 발효를 실시하고, Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 2단 발효를 하였을 경우에는 황색, 오렌지색 및 적색 색소의 생산능이 각각 13.77, 12.66 및 14.82로서 Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때 보다는 약간 낮아지기는 하였으나 큰 변화는 없는 것으로 조사되었다. 그러나 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 하였을 때와 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 후 Monascus sp. MK2를 이용하여 2단 발효를 유도하였을 경우에는 Lactobacillus brevis HLJ59 균주가 생성하는 산의 영향으로 Monascus sp. MK2의 증식이 어려워져 색소 생산능이 낮은 것으로 생각된다. 따라서 색소의 생산은 Monascus sp. MK2를 이용한 1단 발효 또는 Monascus sp. MK2로 1단 발효를 실시하고 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 2단 발효 하는 것이 좋을 것으로 사료된다.
2 단계 발효에 따른 발효산약의 색소 생성능
Fermentation form Production of Monascus Pigments (units) Red/Yellow
Yellow Orange Red
Control 0.151) ±0.022) 0.11±0.01 0.03±0.01 0.20
MK2 14.03±0.56 13.88±0.21 15.71±0.90 1.12
MK2/HLJ59 13.77±0.19 12.66±0.19 14.82±0.39 1.08
HLJ59 0.14±0.02 0.11±0.01 0.02±0.01 0.14
HLJ59/MK2 0.25±0.01 0.22±0.01 0.33±0.01 1.32
1) Means are three replication. 2)Data are expressed as mean±SE.
실험예 2. HPLC를 이용한 모나콜린 (Monacolin) K의 정량
상기 실시예에서 수득한 본 발명의 발효산약에 대한 HPLC를 이용한 모나콜린 (Monacolin) K의 정량 측정을 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 측정하였다.
발효마로부터 모나콜린 (Monacolin) K의 정량은 발효마 1 g에 80% 에탄올 20 mL을 첨가하여 30℃, 150 rpm으로 3시간 동안 교반하고 정치 시킨 후 6,000 xg에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 membrane filter (0.45 μm, Millipore, USA)로 여과하여 시료로 사용하였으며, 이때 사용한 HPLC 분석조건은 다음과 같다.
Monacolin K의 정량은 Luna 5 μ Phenyl-Hexyl column (250 × 4.6 mm, Phenomenex Inc., USA)이 장착된 HPLC (Sykam, Germany)를 이용하여 flow rate : 1.0 mL/min, UV 237 ㎚에서 검출하면서 injection volume 20 uL로 하여 acetonitile : 0.1% Phosphoric acid = 55 : 45의 비율로 용출 시킨 후 표준 monacolin K (M2147, Sigma co., USA)를 이용하여 peak의 면적비로써 비교 정량분석 하였다.
본 실험 결과, 모나콜린 (Monacolin) K (Lovastatin, Mevinolin)는 고지혈증 치료제로 사용되고 있는 것으로 1979년 일본의 Endo교수가 처음 발견한 물질로서 cholesterol 생합성 경로에서 HMG-Co A reductase를 특이적으로 억제함으로써 강력한 cholesterol 생합성 저해작용을 하는 것으로 보고되었다(Bilheimer, D.W., Grundy, S.M., Brown, M.S., and Goldstein, J.L. 1983. Mevinolin and colestipol stimulate receptor mediated clearance of low density lipoprotein from plasma in familial hypercholesterolemia heterozygotes. Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 80, 4124-4128).
도 1과 같이 Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때 모나콜린 (Monacolin)n K의 생산능이 487.94 mg/kg로 나타났으며, Monascus sp. MK2로 1단 발효를 실시하고 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 2단 발효를 하였을 경우에는 모나콜린 (Monacolin) K의 생산능이 481.71 mg/kg로 나타남에 따라 Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때 보다는 약간 낮아지기는 하였으나 색소와 마찬가지로 큰 변화는 없는 것으로 조사되었다.
또한 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 하였을 때와 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 후 Monascus sp. MK2를 이용하여 2단 발효를 유도하였을 경우에는 Lactobacillus brevis HLJ59 균주가 생성하는 산의 영향으로 Monascus sp. MK2의 증식이 어려워져 색소와 마찬가지로 모나콜린 (Monacolin) K 생산이 이루어 지지 않은 것으로 사료된다.
실험예 3. 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량
상기 실시예에서 수득한 본 발명의 발효산약에 대한 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드(flavonoid) 함량 측정을 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 측정하였다(Swain, T., W.E. Hillis, and M. Oritega. 1959. Phenolic constituents of Prunus domestica. 1. Quantitative analysis of phenolic constituents. J. Sci. Food Agric. 10, 83-88.; Jia, Z., Tang, M., and Wu, J. 1999. The determination of flavonoid contents in mulberry and they scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem. 64, 555-559).
발효마의 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법(Swain et al., 1959)을 일부 변형하여 측정하였다. 원심분리한 상등액의 농도별 시료 50 uL에 2% Na2CO3 용액 1 mL을 가하고, Folin & Ciocalteu's phenol reagents 50 uL를 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시킨 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 tannic acid (Sigma co., USA)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 작성한 검량선으로부터 총 polyphenol 함량을 계산하였다.
총 플라보노이드(flavonoid) 함량 측정은 Jia법(Jia et al., 1999)을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 원심분리한 상등액의 농도별 시료 150 uL에 증류수 600 uL, 5% NaNO2 45 uL를 가한 후 6분간 방치하고, 10% AlCl3 .6H2O 150uL를 가하였다. 11분간 방치 후1M NaOH를 500 uL를 가하고 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 rutin (제품번호- R5143 ) (Sigma co., USA)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 작성한 검량선으로부터 총 플라보노이드(flavonoid) 함량을 계산하였다.
총 페놀성 화합물은 다양한 구조와 분자량을 가진 이차대사산물로 식물계에 널리 분포되어 있으며 free radical을 제거함으로써 산화를 억제하여 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 막아 항암, 항균, 노화방지 및 심장질환 예방을 예방하는 등의 생리활성 물질로 알려져 있으며 식품, 의약품, 화장품 등 많은 분야에 활용되고 있다(Ferreres, F., Gomes, D., Valento, P., Gonalves, R., Pio, R., Chagas, E.A., Seabra, R.M., and Andrade, P.B. 2009. Improved loquat (Eriobotrya japonica Lindl.) cultivars: Variation of phenolics and antioxidative potential. Food Chem. 114, 1019-1027).
도 2와 같이 Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때 총 폴리페놀 화합물의 함량이 703.65 mg/kg로 나타났으며, Monascus sp. MK2로 1단 발효를 실시하고 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 2단 발효를 하였을 경우에는 총 폴리페놀 화합물의 함량이 723.77 mg/kg로 나타남에 따라 Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때 보다는 다소 높아지기는 하였으나 큰 함량의 변화는 없는 것으로 조사되었다.
총 플라보노이드 함량 역시 총 폴리페놀 화합물과 마찬가지로 Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때와 Monascus sp. MK2로 1단 발효를 실시하고 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 2단 발효를 하였을 경우에 높은 결과를 나타내었다.
또한 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 하였을 때와 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 후 Monascus sp. MK2를 이용하여 2단 발효를 유도하였을 경우에는 총 폴리페놀 화합물과 플라보노이드의 함량이 각각 265.49 mg/kg, 258.78 mg/kg 및 94.81 mg/kg, 79.26 mg/kg으로 나타났다. 이는 대조구인 마 자체 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드의 함량이 각각 265.66 mg/kg, 107.9 mg/kg으로 거의 같은 것으로 조사됨에 따라 Lactobacillus brevis HLJ59 균주는 총 폴리페놀 화합물과 플라보노이드 화합물의 생성에는 영향이 없는 것으로 사료된다.
실험예 4. DPPH radical 소거활성
상기 실시예에서 수득한 본 발명의 발효산약에 대한 DPPH radical 소거활성 측정을 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 측정하였다(Blois, M. S. 1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature. 181, 1199-1200.).
발효마의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거활성은 Blois 등(Blois, 1958)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 원심 분리한 상등액의 농도별 시료 200 uL에 DPPH 용액을 800 uL를 가하여 혼합한 다음 실온에서 10분간 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 DPPH radical 소거활성은 시료 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 차이를 비교하여 나타내었으며, 양성 대조군으로 ascorbic acid를 사용하였다.
DPPH는 화학적으로 안정화 된 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로서 515 nm~525 nm 부근에서 최대 흡광도를 가지는 보라색의 화합물로 ascorbic acid, BHA, 토코페롤, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 짙은 보라색이 탈색됨으로서 항산화 물질의 전자공여능을 측정할 때 사용된다(Blois, 1958).
Fig. 3에서와 같이 마자체 추출물의 경우 DPPH radical 소거활성이 66.4% 이었으나 Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때 DPPH radical 소거활성이 74.7%로 나타났으며, Monascus sp. MK2로 1단 발효를 실시하고 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 2단 발효를 하였을 경우에는 DPPH radical 소거활성이 81.7%로 증가하는 것으로 조사되었다.
또한 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효하였을 때와 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 후 Monascus sp. MK2를 이용하여 2단 발효를 유도하였을 경우에는 DPPH radical 소거활성이 각각 62.8%와 58.9% 로 나타났다. 이러한 결과는 Chung 등(Chung, H.J. 1999. Antioxidative effect of ethanolic extracts of some tea materials on red pepper seed oil. Kor . J. Soc . Food Sci . Nutr . 28, 1316-1320)의 보고에서 항산화 성분 함량과 free radical 소거작용과의 상관관계에서 폴리페놀 함량에 비례하여 활성이 증가한다고 보고와 일치하였다. 따라서 DPPH radical 소거활성의 경우에는 Monascus sp. MK2로 1단 발효를 실시하고 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 2단 발효를 유도하는 것이 좋을 것으로 사료된다.
실험예 5. 환원력( reducing power ) 측정
상기 실시예에서 수득한 본 발명의 발효산약에 대한 환원력(reducing power) 측정을 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 측정하였다 (Ferreres, F., Gomes, D., Valento, P., Gonalves, R., Pio, R., Chagas, E.A., Seabra, R.M., and Andrade, P.B. 2009. Improved loquat (Eriobotrya japonica Lindl.) cultivars: Variation of phenolics and antioxidative potential. Food Chem . 114, 1019-1027).
발효마의 환원력 측정은 Ferreira 등(Ferreres et al., 2009)의 방법을 응용하여 측정하였다. 원심 분리한 상등액의 농도별 시료 1 mL에 200 mM 인산 완충용액(pH 6.6) 및 1%의 potassium ferricyanide 1 mL를 차례로 가한 다음 50℃에서 30분간 반응하였다. 여기에 10% TCA용액 1 mL을 가하여 반응을 정지 시킨 다음 10,000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 얻은 상등액 1 mL에 증류수 및 ferric chloride 용액을 각 1mL씩 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료의 환원력을 흡광도 값으로 나타내었다.
환원력은 Fe3 + 이온을 Fe2 + 이온으로 환원시키는 능력을 측정하는 것으로 환원력이 클수록 강력한 항산화제가 되는데 이러한 환원력의 정도는 항산화 활성과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며 높은 환원력을 가지는 물질은 흡광도 수치가 높게 나타나게 된다(Gordon, M.H. 1990. The mechanism of antioxidant action in vitro. In Food antioxidants. Hudson BJF, ed. Elsevier Applied science, London, UK. 1-8).
도 4에 나타낸 바와 같이 마자체 추출물의 경우 흡광도 값이 0.87 이었으나 Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때 흡광도 값이 1.32로 나타났으며, Monascus sp. MK2로 1단 발효를 실시하고 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 2단 발효를 하였을 경우에는 흡광도 값이 1.50으로 증가하는 것으로 조사되었다.
또한 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 하였을 때와 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 후 Monascus sp. MK2를 이용하여 2단 발효를 유도하였을 경우에는 흡광도 값이 각각 0.91와 0.81 로 나타났다. 이상의 결과는 DPPH radical 소거활성의 결과와 일치하는 것으로 조사되었으며, 페놀성 화합물이 항산화능이 크게 관여한다는 기존의 보고와 유사하였다 (Kim E.Y., Baik, J.H., Kim, J.H., Kim, S.R., and Rhyu, M.R. 2004. Screening of the antioxidant activity of some medicinal plants. Korean J. Food Technol. 36, 333-338).
실험예 6. ACE 저해활성
상기 실시예에서 수득한 본 발명의 발효산약에 대한 ACE 저해활성 측정을 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 측정하였다(Cushman, D.W. and H.S. Cheung. 1971. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung. Biochemical Pharmacology . 20, 1637-1648.).
발효마의 ACE 저해활성의 측정은 Cushman과 Cheung의 방법(Cushman et al., 1971)을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 원심분리한 상등액의 농도별 시료 100 uL에 100 mM sodium borate buffer (pH 8.3) 100 uL를 가한 후, 37℃에서 5분간 전 배양시켰다. 여기에 기질로 hippuril-L-histidine-L-leucine (HLL, Sigma, U.S.A) 용액 50 uL를 첨가한 후, 다시 37℃에서 30분간 반응시킨 후 1 N HCl 250 uL를 가하여 반응을 정지시켰다. 여기에 ethyl acetate 1 mL를 가하여 30초간 vortexing한 다음 1,500 xg 으로 15분간 원심분리 한 후 상등액 800 uL를 취하였다. 이 상등액을 120℃에서 40분간 완전히 건조 시킨 후 동일조건의 100 mM sodium borate buffer (pH 8.3) 1 uL을 가하여 완전히 용해 시켜 228 nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해활성을 계산하였다.
ACE는 renin-angiotensin-aldosterone system의 중요한 효소물질로서 불활성형의 angiotensin-I 으로부터C-terminal에서 dipeptide인 His-Leu를 분리시켜 가수분해 함으로서 강력한 혈관수축작용을 하는 angiotensin-II를 생성하는데, 혈압을 감소시키는 bradykinin을 불활성화시키는 효소로서 결국 본태성고혈압의 원인이 되고 있다(Noh, H., and Song, K.B. 2001. Isolation of an angiotensin converting enzyme inhibitor from Oenanthe javanica. Agric . Chem . Biotechnol . 44, 98-99). 따라서 ACE 저해제는 ACE 활성을 저해함으로서 angiotensin-II의 생성저해, aldosterone의 분비 감소, 혈관확장제인 bradykinin의 증가 등의 과정을 통하여 신장혈관을 확장시켜 나트륨의 배설을 촉진시킴으로서 혈압을 낮추어 줄 수 있으며, 이로 인해 심혈관질환 및 뇌혈관질환 등 고혈압과 관련이 깊은 질환을 치료하는데 사용될 수 있다(Oh, S.J., Kim, S.H., Kim, S.K., Baek, Y.J., and Cho, K.H. 1997. Angiotensin Ⅰ- Converting Enzyme Inhibitory Activity of the K-Casein Fragments Hydrolysated by Chymosin , Pepsin , and Trypsin. Korean J. Food Sci . Technol . 29, 1316-1318).
도 5에 나타낸 바와 같이 마자체 추출물의 경우 ACE 저해활성이 53.9% 이었으나 Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때 ACE 저해활성이 71.9%로 나타났으며, Monascus sp. MK2로 1단 발효를 실시하고 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 2단 발효를 하였을 경우에는 ACE 저해활성이 86.9%로 증가하는 것으로 조사되었다.
또한 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 하였을 때와 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 후 Monascus sp. MK2를 이용하여 2단 발효를 유도하였을 경우에는 ACE 저해활성이 각각 84.1%와 84.4% 로 나타났다. 이러한 결과는 발효에 사용한 Lactobacillus brevis HLJ59 균주는 본 연구진에서 높은 ACE 저해활성이 있다고 보고한 바 있는 균주로서 Lactobacillus brevis HLJ59 균주가 생산하는 ACE 저해물질이 영향을 미친 것으로 사료된다(Jeon, C.P., Kim, Y.H., Lee, J.B., Jo, M.S., Shin, K.S., Choi, C.S., and Kwon, G.S. 2010. Physiological characteristics and angiotensin converting enzyme inhibitory activity of Lactobacillus brevis HLJ59 isolated from salted shrimp. Kor . J. Microbiology. 46, 9-14).
실험예 7. GABA 함량
상기 실시예에서 수득한 본 발명의 발효산약에 대한 GABA 함량 측정을 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 측정하였다.
발효마의 GABA 함량 측정은 아미노산분석기(Amino acid analyzer, Sykam, Germany)를 이용하여 정량 분석하였으며, 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 0.45 um membrane (Milipore, Co. USA)으로 여과한 후 분석용 시료로 사용하였다.
γ-aminobutyric acid (GABA)는 단백질에서 발견되지 않는 비단백질성 아미노산으로 신경전달 물질 중 아미노산계 신경전달물질의 대표적인 물질로서 동식물계에 널리 분포되어 있는데(Flora, J., Doreen, C., Lim, H.K., Tom, N., and Stephen, L. 2004. Production of GABA by cultured hippocampal glial cells. Neurochemistry International. 45, 273-283), 홍국(red yeast rice) 중에도 다량 존재하는 것으로 알려져 있다(Isato, K., and Kunio, H. 2000. Change in γ-aminobutyric acid content during beni-koji making. Biosci . Biotechnol . Biochem . 64, 617-619).
도 6에 나타낸 바와 같이 마자체로서는 GABA 함량이 66.6 mg/kg으로 조사되었으나 Monascus sp. MK2를 이용하여 1단 발효 하였을 때 GABA 함량이 777.8 mg/kg으로 나타났다. Monascus sp. MK2로 1단 발효를 실시하고 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 2단 발효를 하였을 경우에는 GABA 함량이 977.4 mg/kg으로 증가하는 것으로 조사되었다.
또한 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 하였을 때와 Lactobacillus brevis HLJ59 균주로 1단 발효 후 Monascus sp. MK2를 이용하여 2단 발효를 유도하였을 경우에는 GABA 함량이 각각 612.1 mg/kg과 615.6 mg/kg으로 나타났다. 이러한 결과는 발효에 사용한 Lactobacillus brevis HLJ59 균주는 ACE 저해물질 뿐만 아니라 GABA 생성능 또한 우수한 균주로서 Lactobacillus brevis HLJ59 균주가 생산하는 GABA가 영향을 미친 것으로 사료된다(데이타무).
본 연구에서 실시한 마의 2단 발효는 다양한 생리활성 물질의 생산성 증대에 효과적임을 나타내었으며, 향후 발효마를 활용한 기능성 식품 소재로서의 개발 가능성이 크다고 사료된다.
하기에 본 발명의 분말 또는 이의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
MK2/HLJ59 -------------------------------------------- 20 mg
유당 ------------------------------------------------ 100 mg
탈크 ------------------------------------------------- 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
MK2/HLJ59 -------------------------------------------- 10 mg
옥수수전분 ------------------------------------------ 100 mg
유당 ------------------------------------------------ 100 mg
스테아린산 마그네슘 ----------------------------------- 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
MK2/HLJ59 -------------------------------------------- 10 mg
결정성 셀룰로오스 ------------------------------------- 3 mg
락토오스 ------------------------------------------- 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 ------------------------------- 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
MK2/HLJ59 -------------------------------------------- 10 mg
만니톨 ---------------------------------------------- 180 mg
주사용 멸균 증류수 --------------------------------- 2974 mg
Na2HPO4 ,12H2O ----------------------------------------- 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
MK2/HLJ59 -------------------------------------------- 20 mg
이성화당 ---------------------------------------------- 10 g
만니톨 ------------------------------------------------- 5 g
정제수 ------------------------------------------------ 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
MK2/HLJ59 -------------------------------------------- 1000 mg
비타민 혼합물 ------------------------------------------- 적량
비타민 A 아세테이트 ------------------------------------ 70 ㎍
비타민 E ---------------------------------------------- 1.0 mg
비타민 B1 -------------------------------------------- 0.13 mg
비타민 B2 -------------------------------------------- 0.15 mg
비타민 B6 --------------------------------------------- 0.5 mg
비타민 B12 -------------------------------------------- 0.2 ㎍
비타민 C ----------------------------------------------- 10 mg
비오틴 ------------------------------------------------- 10 ㎍
니코틴산아미드 ---------------------------------------- 1.7 mg
엽산 --------------------------------------------------- 50 ㎍
판토텐산 칼슘 ----------------------------------------- 0.5 mg
무기질 혼합물 ------------------------------------------- 적량
황산제1철 -------------------------------------------- 1.75 mg
산화아연 --------------------------------------------- 0.82 mg
탄산마그네슘 ----------------------------------------- 25.3 mg
제1인산칼륨 -------------------------------------------- 15 mg
제2인산칼슘 -------------------------------------------- 55 mg
구연산칼륨 --------------------------------------------- 90 mg
탄산칼슘 ---------------------------------------------- 100 mg
염화마그네슘 ----------------------------------------- 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
MK2/HLJ59 -------------------------------------------- 1000 mg
구연산 ----------------------------------------------- 1000 mg
올리고당 ----------------------------------------------- 100 g
매실농축액 ----------------------------------------------- 2 g
타우린 --------------------------------------------------- 1 g
정제수를 가하여 ---------------------------------- 전체 900 ml
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (7)

  1. 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 고혈압 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 발효 산약은 모나스쿠스(Monascus sp.) MK2균주, 모나스쿠스 푸르푸레우스(Monascus purpureus) KFRI1134, 모나스쿠스 필로서스 (Monascus pilosus) KCCM60084, 모나스쿠스 루버(Monascus ruber) KFRI1138, 또는 모나스쿠스 앙카 (Monascus anka) KFRI370 등의 건강기능식품공전에서 인정되는 4종의 균주에 속하는 홍국균주 및 기타 생리기능성 물질 생산능이 인정되는 돌연변이 균주로부터 선택된 하나 이상의 홍국균 (Monascus sp.)을 이용한 1차 발효; 및 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) KCTC3171, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCTC3107, 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) HLJ59, 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 스트렙토코커스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) 균주들로부터 선택된 하나 이상의 균주를 이용한 2차 발효를 연속적으로 수행한 발효 산약임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 발효 산약은 건조 상태의 모나스쿠스(Monascus sp.) MK2균주을, 건조 및 멸균 단계를 거친 산약 시료에 홍국 균주를 분말대비 0.1~20%(v/v)로 접종하고, 발효 온도 1~50℃에서 수분함유 상대습도 20~90%로, pH 3.0 내지 8.0에서, 발효시간 1일 내지 20일 동안 Lin's 발효 배지에 접종하에 10 내지 1000rpm의 속도로 진탕발효를 수행하여 1차 발효하는 1단계; 상기 1차 발효물에 건조 상태의 젖산균 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) HLJ59균주을, 분말대비 0.1~20%(v/v)로 접종하고, 발효 온도 1~50℃에서 수분함유 상대습도 20~90%로, 발효시간 1시간 내지 1주일간 동안 락토바실리(Lactobacilli) MRS broth (Difco, Sparks, USA) 발효 배지에 접종하에 1 내지 10회 2차 발효하여 발효물을 얻은 2단계; 및 상기 2단계의 발효물을 멸균한 후 건조하고 분말화하는 3단계를 포함하는 공정을 통하여 수득한 발효 산약 분말임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 발효 산약 추출물은 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 건강기능식품 형태는 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 침출차, 건강보조 식품, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 건강기능식품.
  7. 고혈압의 예방 및 개선 효과를 갖는 상기 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품 조성물.
KR1020130019280A 2013-02-22 2013-02-22 발효 산약 분말 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유한 항산화 및 고혈압 치료 또는 예방을 위한 조성물 KR20140105654A (ko)

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KR20160072707A (ko) * 2014-12-15 2016-06-23 양촌감 영농조합법인 폴리페놀 성분 함량이 강화된 감음료 및 그 제조방법
KR20190044734A (ko) 2017-10-22 2019-05-02 (주)예스킨 고혈압 개선 식품조성물

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20160072707A (ko) * 2014-12-15 2016-06-23 양촌감 영농조합법인 폴리페놀 성분 함량이 강화된 감음료 및 그 제조방법
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