KR20140079067A - Ｅｂｖ 감염 인간망막색소 상피세포를 이용한 혈관신생 질환용 세포 모델 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus; EBV) 감염 인간망막색소상피세포(human retinal pigment epithelial cells; ARPE)를 이용한 혈관신생 질환용 세포 모델에 관한 것으로서, EBV를 세포에 감염시키는 단계; 상기 감염시킨 세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양한 세포의 EBV 감염 여부를 확인하는 단계를 포함하는 혈관신생 질환용 세포 모델 제조방법을 제공하고, 상기 제조방법에 따라 제조된 혈관신생 질환용 세포 모델을 제공한다. 또한, 상기 혈관신생 질환용 세포 모델을 이용한 혈관신생질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

ＥＢＶ 감염 인간망막색소 상피세포를 이용한 혈관신생 질환용 세포 모델{Angiogenesis cell model using EBV-infected human retina pigment epithelia cell}
본 발명은 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus; EBV) 감염 인간망막색소상피세포(human retinal pigment epithelial cells; ARPE)를 이용한 혈관신생 질환용 세포 모델에 관한 것이다.
엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus; EBV)는 전 세계에 널리 분포하는 헤르페스(herpes)과, 감마헤르페스(gammaherpes)아과, 림포크립토바이러스(lyphocryptovirus) 속에 속하는 바이러스이다. EBV에 감염되면, 바이러스가 B림프구 내 genome으로 들어가 면역반응에 의해 제거되지 않으므로 잠복 감염 상태로 유지된다. EBV 초감염 연령은 위생적인 환경에 따라 다르지만 3세에 약 80%, 20세 전후에 90%, 20대 후반에는 거의 100%에서 항체 양성율을 나타낸다. 유아기에 초감염되면 무증상이나 경한 증상으로 그치는 경우가 많지만, 청년기에 초감염 되면 일부에서 전염성 단핵구증(infectious mononucleosis, IM)을 일으키고, 때로는 만성 EBV 감염증(chronic EBV infection)이나 일단 감염이 잠재되는 EBV가 재활성화 과정에서 opportunistic B cell lymphoma, Burkitt's lymphoma(B L), 상인두암(nasopharyngeal carcinoma, NPC)을 일으킨다. 이와 같이 초감염 연령에 따라 발병률이 다른 이유는 잘 알려지지 않았으나 생체 면역기구의 성숙도에 따라 나타나는 차이라고 여겨진다. 한편, EBV는 여러 신생물성 이상(neoplastic disorders)을 일으키는 중요한 발암물질이고, 용해성 감염 세포는 EBV-관련 악성 종양의 성장을 촉진하는데, 이러한 현상은 혈관신생을 증가시키는 것과 관련이 있다. 눈의 망막(retina)에 있어 EBV 감염은 드물지만 실제 임상에서 만성 활동성 EBV 감염 시 합병증의 하나로 EBV에 의한 망막염이 발생한다는 보고가 있으며 이는 혈관신생과 이에 따른 망막괴사를 동반하는 것으로 알려져 있다.
혈관신생(Angiogenesis)은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 현상으로, 악성(고형)종양, 당뇨병성 망막증, 노인성 황반 변성증, 관절 류머티즘 등의 염증성 질환 등에 있어서 그에 따른 발증이나 진전에 깊이 관여하고 있다는 것이 알려져 있다. 또한, 암 치료상 중요한 문제가 되고 있는 전이에 있어서 그 길을 확보한다는 의미에서 혈관신생이 중요한 스텝이 되고 있다. 이와 같이 혈관신생은 다양한 병변에서 관찰되고, 각각의 병태의 진전을 조장하기 때문에, 혈관신생을 평가하고 각종 약물의 개발시에 이들 약물의 효능을 평가하는데 사용될 수 있는 모델의 개발이 시급하다. 특히, 세포모델의 개발은 임상 모델과 동물실험모델에 비하여 현저히 적은 비용이 소요되며 손쉬운 처치와 결과를 얻을 수 있어 그 효용성이 매우 높다고 생각된다.
한편, 한국특허출원 제10-2009-7006423호(출원일 2009.03.27)는 혈관 신생용 신속 생체 내 모델에 관한 것으로서, 발생 초기 혈관은 생장 인자를 함유하는 생장 기질에 의하여 지지된다. 발생 초기 혈관은 이들 혈관을 형성하는 세포 중에서 선택적으로 발현된 형광 단백질에 의하여 표지된다고 개시하고 있으나, 본 발명의 EBV 감염 인간망막색소상피세포를 이용한 혈관신생 질환용 세포모델에 대한 언급은 없다.
따라서, 본 발명자들은 EBV 감염된 인간망막색소상피세포(human retinal pigment epithelial cells; ARPE)에 있어서, 세포크기가 줄어들면서 수가 많아지고 뭉쳐서 자라는 특성을 보이고, 혈관신생(angiogenesis)에 관여한다고 알려진 인자들의 발현이 상대적으로 증가하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus; EBV)를 감염시킨 세포를 이용한 혈관신생 질환용 세포 모델 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된 혈관신생 질환용 세포 모델을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 혈관신생 질환용 세포 모델을 이용한 혈관신생 치료제 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus; EBV)를 세포에 감염시키는 단계; 상기 감염시킨 세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양한 세포의 EBV 감염 여부를 확인하는 단계를 포함하는 혈관신생 질환용 세포 모델 제조방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 세포는 인간망막색소상피세포(human retinal pigment epithelial cells; ARPE)이고, 상기 EBV 감염 여부를 확인하는 단계는 EBNA1, EBNA2, EBNA3A, LMP1 및 LMP2A로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현을 확인하는 것을 특징으로 하고, 상기 혈관신생 질환은 바이러스 망막염인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기의 방법에 따라 제조된 혈관신생 질환용 세포 모델을 제공한다.
본 발명에 관한 세포 모델은 혈관신생 질환 치료 연구의 피험 약제의 약효 평가에 적합한 것이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이어도 사용할 수 있다. 본 발명에서 EBV의 도입 대상이 되는 세포주는 인간망막색소상피세포(human retinal pigment epithelial cells; ARPE)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기의 방법에 따라 혈관신생 질환용 세포 모델을 제조하는 단계; 상기 혈관신생 질환용 세포 모델에 치료제 후보 물질을 투여하는 단계; 및 상기 치료제 후보 물질의 치료 효과를 측정하는 단계를 포함하는 혈관신생질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 혈관신생질환 치료제 후보 물질이란 혈관신생질환에 대한 치료효과가 있는 것으로 예상되어, 치료 효과를 측정하기 위한 실험대상으로 사용될 수 있는 모든 물질을 의미하며, 실험동물에 적용할 수 있고 치료 효과를 측정할 수 있으면 천연물질 또는 그로부터 얻어진 것이든, 인공적으로 합성된 것이든 제한되지 않고, 그 종류도 제한되지 않는다.
본 발명은 EBV 감염 인간망막색소상피세포(human retinal pigment epithelial cells; ARPE)를 이용한 혈관신생 질환용 세포모델에 관한 것으로서, EBV 감염된 인간망막색소상피세포는 세포크기가 줄어들면서 수가 많아지고 뭉쳐서 자라는 특성을 보이고, 혈관신생(angiogenesis)에 관여한다고 알려진 인자들의 발현이 상대적으로 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 이를 이용하면 혈관신생 메카니즘을 밝히는 용이한 세포 모델로서 이용될 수 있다.
도 1은 ARPE 세포에 EBV 감염시킨 후, 세포 변화 및 EBV 감염 여부를 확인한 실험결과를 나타낸다. A, 감염시킨 후 세포수가 많아지면서 크기도 줄어드는 것을 나타내는 결과; B, EBV mRNA의 발현 확인 RT-PCR결과(EBVt-B 세포는 양성 대조군으로 사용); C, EBV 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과.
도 2는 EBV 감염시킨 ARPE세포에서 혈관신생(angiogensis) 관련 전사인자를 비롯한 신호전달 물질의 발현 변화를 확인한 RT-PCR 및 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. A, 감염시킨 후 혈관신생(angiogenesis) 관련 물질인 Hif-1alpha, STAT-3, VEGF, IL-8, TGF-beta, MCP-1의 발현이 증가하고, 항-혈관신생 인자(anti-angiogenic factor)로 알려진 PEDF는 감소함을 확인; B, 대표적인 혈관신생 인자(angiogenic factor)인 STAT-3, VEGF, angiotensin-1 (Ang-1)의 발현을 단백질 수준에서 확인한 웨스턴 블랏 실험 결과; C, STAT-3 타겟 유전자인 c-Myc, cyclin D1과 MMP2 유전자의 발현이 증가함을 확인한 RT-PCR 결과.
도 3은 EBV 감염시킨 ARPE 세포에서 혈관신생(angiogensis) 관련 물질인 IL-8. VEGF, TGF-beta, MCP-1의 발현 증가로 인해 배양액으로의 분비가 증가 되는지를 확인한 ELISA 실험결과를 나타낸다.
도 4는 EBV 감염시킨 ARPE 세포가 상피-중간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition; EMT)이 일어나는 지를 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 5는 EBV 감염시킨 ARPE 세포에서 일어나는 상피-중간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition; EMT) 변화에 관여하는 신호전달 물질을 확인한 웨스턴 블랏 실험결과를 나타낸다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> EBV -감염 RPE 세포의 제작 및 EBV -감염 RPE 세포에서의 EBV 관련 분자의 검출
1. EBV -감염 RPE 세포의 제작
EBV B95-8 세포주(ATCC)로부터 EBV 상등액 스톡(stock)을 제조하였다. 망막 세포를 EBV 스톡 상등액에 첨가하고, 2시간 동안 37℃에서 배양한 후에 DME/F12 (1:1) 배지(HyClone)를 첨가하였다(3×104 cells/ml). 배양물은 1일-4주 동안 배양되었다.
2. 세포 배양
정상 망막색소 상피세포(retinal pigment epithelial cells)인, ARPE19는 ATCC로부터 얻었다. 세포들은 10% FBS(HyClone), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 글루타민(glutamine)이 첨가된 DME/F12 (1:1) 배지에서 5% CO2, 37℃에서 유지하였다. EBV-형질전환된 B 세포는 양성 대조군으로서 사용되었다.
3. RT - PCR
총 RNA는 RNeasy Mini kit (Qiagen)을 이용하여 추출하였고, oligo (dT) 프라이머와 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 산물은 특이적 프라이머 세트(Bioneer)(표 1) 및 Prime Taq Premix (GeNet Bio)를 이용하여 증폭시켰고, 아가로스 젤에 전기영동을 수행한 후, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 multiple Gel DOC system (Fujifilm)을 사용하여, UV 하에서 band를 확인하였다.
RT-PCR을 위해 사용되는 특이 프라이머 서열
Target Primers, 5´ → 3´
Sense Antisense
EBNA1 GAG CGG GGA GAT AAT GTA CA TAA AAG ATG GCC GGA CAA GG
EBNA2 AAC CCT CTA AGA CTC AAG GC ACT TTC GTC TAA GTC TGC GG
LMP1 CAC GAC CTT GAG AGG GGC CCA GCC AGA TGG TGG CAC CAA GTC
LMP2A ATG ACT CAT CTC AAC ACA TA CAT GTT AGG CAA ATT GCA AA
IL-8 ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT TCT CAG CCC TCT TCA AAA ACT TCT C
TGF-β GGA CAC CAA CTA TTG CTT CAG TCC AGG CTC CAA ATG TAG G
Hif-1α TGA TTG CAT CTC CAT CTC CTA CC GAC TCA AAG CGA CAG ATA ACA CG
VEGF AGG AGG GCA GAA TCA TCA CG CAA GGC CCA CAG GGA TTT TCT
STAT3 ACC TGC AGC AAT ACC ATT GAC AAG GTG AGG GAC TCA AAC TGC
MCP-1 AAT GCC CCA GTC ACC TGC TGT TAT GCA ATT TCC CCA AGT CTC TGT ATC
PEDF CAG AAG AAC CTC AAG AGT GCC CTT CAT CCA AGT AGA AAT CC
c-Myc TTC GGG TAG TGG AAA ACC AG CAG CAG CTC GAA TTT CTT CC
Cyclin D1 CTG GAG CCC GTG AAA AAG AGC CTG GAG AGG AAG CGT GTG AGG
N-cadherin CAC CCA ACA TGT TTA CAA TCA ACA ATG AGA C CTG CAG CAA CAG TAA GGA CAA ACA TCC TAT T
E-cadherin GAC GCG GAC GAT GAT GTG AAC TTG TAC TGTR TGT GGA TTG AAG
Vimentin GGA AGA GAA CTT TGC CGT TGA A GTG ACG AGC CAT TTC CTC CTT
ZO-1 CCA GAA TCT CGG AAA AGT GC ACC GTG TAA TGG CAG ACT CC
α-SMA ATC ACC ATC GGA AAT GAA CG CTG GAA GGT GGA CAG AGA GG
Snail CAG ATG AGG ACA GTG GGA AAG G ACT CTT GGT GCT TGT GGA GCA G
MMP2 TGG CAA GTA CGG CTT CTG TC TGG CAA GTA CGG CTT CTG TC
β-actin ATC CAC GAA ACT ACC TTC AA ATC CAC ACG GAG TAC TTG C
4. 면역블롯팅( Immunoblotting )
회수한 세포들을 프로테아제 억제 칵테일(protease inhibitor cocktail) 및 포스파타아제 억제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail; Sigma-Aldrich)이 포함된 NP-40 buffer(Elpis Biotech)로 용해하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 BCA assay kit (Pierce)를 이용하여 정량한 후, SDS gel loading buffer와 혼합하여 100℃에서 5분간 끓여 변성(denaturation) 시켰다. SDS-PAGE 젤에서 전기영동된 단백질은 니트로셀룰로스 막(Millipore)으로 옮겨졌고, 그 후 비특이적 단백질 결합을 차단하기 위해 막을 5% 스킴 밀크(skim milk)로 덮어 씌우고, 여러 항체를 이용하여 일반적인 면역블롯을 수행하였다. 그 후, ECL kit (Advansta) 및 multiple Gel DOC system으로 면역반응성 단백질을 검출하였다. 다음의 1차 Abs가 사용되었다. NF-κB p105/p50, p100/p52, p65, phospho-p65 (Ser536), Rel-B, c-Rel, phospho-STAT-3(Tyr705), STAT-3 및 β-actin은 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)로부터 구했고, EBNA-2, EBNA-3A, LMP-1, LMP-2A, Ang-1, VEGF 및 Ref-1는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구했고, β-tubulin은 BD Biosciences로부터 구했다. 밀도측정(Densitometry) 분석은 ImageJ 1.38 software (National Institutes of Health)로 수행하였다.
5. 결과
EBV 감염을 통해 RPE 세포를 형질전환하기 위해서, 본 발명자들은 우선 유세포분석기를 이용하여 ARPE-19 세포 상의 CD21에 대한 표면 발현을 조사하였다. ARPE-19 세포는 CD21을 발현하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 잠재기 타입 III(latency type III)를 나타내는 EBV-함유 RPE 세포를 구축하였다. 전형적으로, B세포에서의 EBV 형질전환 과정은 거의 4주에 걸쳐 확립되고, 형질전환의 초기 징후(세포 크기 증가, 세포 응집 및 갑작스러운 성장 증가)는 1-3 주 후에 관찰된다. EBV-감염 ARPE-19 세포는 적어도 1주일 내에 응집되어 큰 세포덩어리(clump)를 형성하였으며, 1주일 후에는 비감염 세포와 비교시 성장에 있어서 갑작스러운 증가를 나타냈다. 특히, EBV 노출 2 주 후에는 부착 세포들이 낮은 부착력을 가진 섬유아세포(fibroblast)-유사 방추형(spindle-shaped) 세포와 비슷했다(도 1A). EBV 감염을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 바이러스 전사체 및 단백질 분석을 위한 RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 수행하였다. 비노출 ARPE-19 세포에 있어서는 EBV-관련 유전자 전사체 및 단백질들을 관찰할 수 없었다(도 1B 및 1C). 반면, EBV 노출 후에는, EBV-감염 ARPE-19 세포에서 EBNA1, EBNA2, EBNA3A, LMP1 및 LMP2A의 발현을 확인하였다(도 1B 및 1C).
< 실시예 2> RPE 세포에 있어서 EBV 감염에 의한 다양한 전염증 및 전혈관신생 인자의 생산 유도
1. ELISA 분석
세포를 24 시간 동안 배양한 후, 배양 상등액을 회수하여, ARPE-19 세포 또는 EBV-감염 ARPE-19 세포에 의해 분비되는 IL-8의 양을 제조사의 지시에 따라 Single Analyte ELISArray Kit (Qiagen)으로 정량화하였다. VEGF, MCP-1 및 TGF-β는 Single cytokine ELISA assay Kit (R&D systems)를 이용하여 정량화했다. 결과는 생물학적 반복 횟수의 평균±표준편차(standard deviation; SD)로 표시하였다.
2. 결과
이전의 연구들은 EBV를 포함한 바이러스 감염이 면역세포 및 종양세포에서 사이토카인 또는 케모카인의 생산을 유도한다고 밝혀냈다. 또한, 본 발명자들은 EBV 감염에 의해서 섬유아세포-유사 세포로 ARPE 세포가 분화되는 것은 성장 및 혈관생성 인자를 유도시키는 능력과 관련되어 있다고 추정한다. 오토크라인(autocrine) 및 파라크라인(paracrine) 반응을 통해, 상기 인자들은 종양세포를 포함하는 여러 세포의 성장을 촉진하고, 종양 성장에 필요한 영양분 및 산소를 공급하여 혈관 발달을 유도한다. 이를 시험하기 위해서, 본 발명자들은 RT-PCR 및 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 전염증(pro-inflammatory) 사이토카인 및 혈관신생 인자들의 mRNA 수준 및 단백질 수준을 분석하였다. 상기 인자들의 분비 수준은 ARPE-19 또는 EBV-감염 ARPE-19 세포의 배양 상등액에서 Single Analyte ELISArray kit을 이용하여 정량적으로 분석되었다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 전혈관신생(pro-angiogenic) 및 성장 인자인 IL-8, VEGF, MCP-1 및 TGF-β은 EBV 감염 후에 더 많이 발현된 반면, 항-혈관신생 인자인 PEDF 발현은 비-감염 세포와 비교하면 EBV 감염 후에 감소하였다. 또한 IL-8, VEGF 및 TGF-β의 분비 수준은 EBV 감염 ARPE-19 세포에서 크게 향상되었다(도 3A 내지 도 3C). 그러나, APRE-19 세포는 MCP-1의 기본 수준이 높게 생산되기 때문에, EBV 노출 반응에 따른 증가가 ARPE-19 세포에서 관찰되는 다른 인자들보다 덜 두드러졌다(도 3D). 특히, 상피-중간엽 이행(epithelial- mesenchymal transition; EMT)를 유도하는 것으로 알려진 TGF-β의 분비는 EBV 감염 ARPE-19 세포에서 증가된 반면, 비-감염 세포에서는 TGF-β를 생산하지 않았다. EBV 감염 ARPE-19 세포에 있어서 전염증(pro-inflammatory) 및 전혈관신생(pro-angiogenic) 인자의 생산을 유발하는 분자를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 Hif-1α 및 Stat3를 주목하였는데, 이는 신혈관형성(neovascularization)과 관련되어 있다. Hif-1α, p-STAT3 및 Ang-1의 발현 수준은 비-감염 세포와 비교하여 EBV 감염 ARPE-19 세포에서 크게 증가되었다. 더구나, c-Myc, cyclin D1 및 MMP2와 같은 Stat3 표적 유전자는 또한 EBV 감염 후에 현저히 증가되었다(도 2C).
< 실시예 3> RPE 세포에 있어서 EBV 감염에 의한 표현형 변화 유도
ARPE-19 세포에 있어서 EBV 감염에 의한 섬유아세포-유사 세포로의 분화 및 TGF-β의 분비는 상피-중간엽 이행(epithelial- mesenchymal transition; EMT)과 유사하기 때문에, 본 발명자들은 EBV 감염 ARPE-19 세포가 상피-중간엽 이행(epithelial- mesenchymal transition; EMT) 되었는지 조사하였다. 이를 입증하기 위해서, EMT 마커들의 발현이 EBV 감염 후에 변화하였는지 RT-PCR 분석을 통해 조사하였다. 일반적으로, ARPE-19 세포는 N-cadherin 및 ZO-1를 우세하게 발현하는 것으로 나타난 반면, E-cadherin, vimentin, α-SMA 및 Snail의 발현은 거의 없거나 낮은 수준이었다(도 4). 놀랍게도, EBV 감염 ARPE-19 세포는 상피 마커인 E-cadherin과 ZO-1, 및 N-cadherin은 거의 발현이 검출되지 않았다. 반대로, 상기 세포들은 중간엽 마커인, vimentin, α-SMA 및 Snail을 높게 발현하였다(도 4). 따라서, 이 결과는 RPE 세포에서의 EBV 감염이 EMT 형성의 개시에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
< 실시예 4> EBV 감염에 의한 EMT 개시 및 발달에 관여하는 NF -κB 신호전달
1. NF -κB 전좌 ( translocation ) 측정
EBV 감염 후에, 세포질 액(cytosol) 및 핵 세포 분획(nuclear cellular fractions)은 Nuclear/Cytosol Fractionation Kit (BioVision)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 준비되었다. EBV 감염되거나 감염되지 않은 2×106 세포를 회수하여, 200㎕ Cytosol Extraction buffer A에 부유하였다. 10분 동안 얼음에서 반응시킨 후에, 세포 부유액에 Cytosol Extraction buffer B를 첨가하고 얼음에 1분 동안 두었다. 그 후, 원심분리를 통해 얻어진 상등액을 세포질 액 분획으로 표시하였고, 펠렛은 100㎕ Nuclear Extraction buffer Mix에 재부유하고 핵 분획으로 표시하였다. 모든 분획들은 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.
2. 결과
NF-κB 신호전달의 활성화는 TGF-β-매개 EMT의 발달 및 유지를 위해 요구된다. 최근 연구에서는 염증-유도 세포의 이동 및 침윤이 NF-κB-의존 Snail 안정화를 통하여 일어난다고 밝혔다. 비록 ARPE-19 세포가 p52, p50 및 c-Rel과 같은 몇몇 NF-κB를 발현한다 하더라도, 이들 NF-κB 단백질들은 핵으로 전좌하지 않았다. 오직 EBV-감염 ARPE-19 세포만이 5개의 다른 NF-κB 단백질들(p65, p50, p52, c-Rel 및 RelB)의 발현을 크게 증가시켰고, 이들 NF-κB 활성 형태를 핵으로 전좌시켰다(도 5). 이러한 결과는 NF-κB가 EBV 감염에 의한 EMT의 개시 및 유지에 필수적이라는 것을 나타낸다.

Claims (6)

  1. 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus; EBV)를 세포에 감염시키는 단계;
    상기 감염시킨 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 배양한 세포의 EBV 감염 여부를 확인하는 단계를 포함하는 혈관신생 질환용 세포 모델 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 인간망막색소상피세포(human retinal pigment epithelial cells; ARPE)인 것을 특징으로 하는 혈관신생 질환용 세포 모델 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 EBV 감염 여부를 확인하는 단계는 EBNA1, EBNA2, EBNA3A, LMP1 및 LMP2A로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현을 확인하는 것을 특징으로 하는 혈관신생 질환용 세포 모델 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관신생 질환은 바이러스 망막염인 것을 특징으로 하는 혈관신생 질환용 세포 모델 제조방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 혈관신생 질환용 세포 모델.
  6. 제 1 항의 방법에 따라 혈관신생 질환용 세포 모델을 제조하는 단계;
    상기 혈관신생 질환용 세포 모델에 치료제 후보 물질을 투여하는 단계; 및 상기 치료제 후보 물질의 치료 효과를 측정하는 단계를 포함하는 혈관신생질환 치료제 스크리닝 방법.
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