KR20140078968A - 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서 및 센싱 방법 - Google Patents

그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서 및 센싱 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서 및 센싱 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서는 수은 이온에 대한 민감도 및 선택성이 우수하며, 그래핀 산화물을 이용하여 전기화학적인 환원전위 측정법 또는 전기화학 임피던스 분광법을 통해 수은 이온을 검출하는 바, 새로운 검출 방법이다. 또한, 간단하고 저렴한 방법으로 우수한 효과를 낼 수 있다.

Description

그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서 및 센싱 방법{Biosensor detecting mercury ion using graphene oxide and sensing method thereof}
본 발명은 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서 및 센싱 방법에 관한 것이다.
현대의 산업 발전과 함께 산업 폐수 및 폐기물 등에 의한 환경오염으로 인류는 다양한 중금속의 중독 위험에 노출되어 있다. 특히, 그 중 수은은 중독되면 신경계에 이상이 생겨 언어장애, 운동 장애 등이 나타나고 심하면 사지가 마비될 수 있는 치명적인 물질이다.
이처럼 수은 이온은 인간의 건강에 유해한 영향을 끼치기 때문에 생물학적으로 중요한 중금속이다. 대양과 화산에 의한 방출[Renzoni, A; Zino, F.; Franchi, E. Environ. Res. 1998, 77, 68.], 금채광[Malm, O.Environ. Res. 1998, 77, 73.], 혹은 고체 폐기물 소각에 의한 수은 오염은 면역계, 유전자, 신경계에 대한 극심한 독성 때문에 큰 이슈가 되어 왔다. 이와 같이 수은은 매우 위험한 맹독성 오염물질이지만 불행하게도 우리 주변 환경 속에 많이 존재한다. 주변 환경 속에 존재하는 수은은 먹이 사슬을 통해 축적된다. 먹이사슬의 상층에 위치할수록 축적도가 상승하기 때문에 음식물 섭취를 통해 인간에게 축적되는 오염물질의 수준도 높아진다. 수은은 여러 가지 경로를 통해 물에 잘 용해되는 이온형태(Hg2+)로 전환되고 생선이나 다른 여러 음식물에 축적된다. 따라서 이들을 먹는 인간에게도 당연히 수은의 축적이 일어난다. 그러므로 수용액상에 존재하는 수은의 함량을 잘 모니터링 하는 것은 인류의 건강을 지키는 중요한 활동 중 하나가 될 수 있다. 따라서 상기 금속 이온에 대해 충분한 선택성을 갖는 새로운 바이오센서의 개발에 큰 관심이 모아지고 있다.
클락형(Clack-type) 포도당 센서의 출현 이후로, 전기화학적 바이오센서는 그 선택성, 간단성, 민감도, 및 경제성 때문에 질병의 진단, 음식의 분석, 환경의 관찰 및 분석의 분야에서 우수한 분석 기술로 발전되어 왔다. 게다가 다른 바이오센서에 비해서 그 성능의 저하가 없이도 소형화를 할 수 있다는 장점이 있다. 새로운 바이오센서의 플랫폼과 새로운 전략을 이용하여 전기화학적 바이오센서의 민감도와 선택성 등을 더욱 발달시키기 위한 연구가 진행되고 있다. 그 중에서도 그래핀을 이용한 바이오센서의 플랫폼에 대한 관심이 높아지고 있다.
그래핀(graphene)은 탄소원자가 2차원(2D) 격자 내로 채워진 평면 단일층 구조를 의미하며, 이것은 모든 다른 차원구조의 흑연(graphite) 물질의 기본 구조를 이룬다. 즉, 상기 그래핀은 0차원 구조인 풀러렌(fullerene), 1차원 구조인 카본나노튜브 또는 3차원 구조로 적층된 흑연의 기본 구조가 될 수 있다. 2004년 Novoselev 등은 SiO2/Si 기판의 상부 상에서 프리-스탠딩 그래핀 단일층을 수득하였다고 보고하였으며, 이것은 기계적인 미세 분할법에 의하여 실험적으로 발견되었다. 최근 많은 연구그룹들이 그래핀이 갖는 허니콤(벌집)형태의 결정 구조, 두 개의 상호침투하는 삼각 형태의 하위 격자 구조, 및 하나의 원자 크기에 해당하는 두께 등에 의하여 그래핀이 특이한 물리적 특성(예를 들면, 제로 밴드갭)을 보이는 점에 주목하고 있다. 또한 그래핀은 특이한 전하 운송 특성을 갖는데, 이로 인하여 그래핀은 종래에는 관찰되지 않았던 독특한 현상을 보여준다. 예를 들면, 반정수 양자 홀 효과 및 바이폴라 초전류 트랜지스터 효과 등이 그 예이며, 이 또한 상기 설명한 그래핀의 특유한 구조에 기인하는 것으로 여겨진다.
그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)과 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(Electrochemically Reduced Graphene Oxide, ERGO)은 바이오센서의 구성물, 세포 이미징(cellular imaging), 약물 전달 등에 있어서 활용 가능성이 높은 물질로 알려져 있다. 이들은 기존의 그라파이트보다 매우 큰 표면적을 가지며, 높은 전기전도도 및 강력한 기계적 강도를 가진다. 또한 부서지기 쉬운 그라파이트보다 유연하여, 유연성이 필요한 전기제품 등에 대해서 장점을 가지며, 그라파이트보다 더 많은 균일분포된 전기화학적 활성사이트를 가진다. 또한 기존에 전극표면의 재료로 많이 사용되어온 카본나노튜브가 많은 정제과정을 거친다고 하더라도, 카본나노튜브 내부에 촉매로 사용된 금속나노입자가 남아있는 것은 확인된 사실이며, 이 불순물은 전기화학적 성질을 가지기 때문에 카본나노튜브의 전기화학적 성질이 변하게 된다는 점에서, 이러한 단점을 가지지 않는 그래핀은 우수한 전극 표면 재료라는 평가를 받고 있다.
따라서, 이러한 그래핀을 이용하여 전기화학적으로 수은 이온을 검출하는 방법에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 수은 이온 검출용 바이오센서에 대해 탐색하던 중, 그래핀 산화물을 이용하는 경우, 수은 이온 검출에 있어서 민감도 및 선택성이 우수해진다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 센싱 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 센싱 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서는 수은 이온에 대한 민감도 및 선택성이 우수하며, 그래핀 산화물을 이용하여 전기화학적인 환원전위 측정법 또는 전기화학 임피던스 분광법을 통해 수은 이온을 검출하는 바, 새로운 검출 방법이며, 간단하고 저렴한 방법으로 우수한 수은 이온 검출 효과를 낼 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 수은 이온 검출 방법의 개략적인 과정을 나타내는 도이다.
도 2는 pH에 따른 순환전압전류법(CV)의 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 수은 이온의 농도에 따른 순환전압전류법(CV)의 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 양이온의 종류에 따른 순환전압전류법(CV)의 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 pH에 따른 전기화학 임피던스(EIS)의 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 수은 이온의 농도에 따른 전기화학 임피던스(EIS)의 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 양이온의 종류에 따른 전기화학 임피던스(EIS)의 결과를 나타내는 도이다.
본 발명은 전극에 단일 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드가 결합되어 있으며, 상기 단일 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드가 수은 이온(Hg2+)과 결합하면, 수은 이온(Hg2+)과 결합된 단일 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드는 다른 단일 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드와 결합하여, 이중 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드를 형성하는 것을 특징으로 하는, 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서를 제공한다.
상기 이중 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드는 그래핀 산화물과 결합하지 않고, 상기 단일 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드는 그래핀 산화물과 결합하는 것을 특징으로 하며, 상기 이중 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드와 결합된 그래핀 산화물의 양을 측정함으로써 수은 이온(Hg2+)의 양을 측정할 수 있다.
또한, 상기 결합된 그래핀 산화물의 양은 순환전압전류법 또는 전기화학 임피던스 분광법으로 측정할 수 있다.
상기 전극은 금 전극일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서는 검출 대상 용액 등에서 수은 이온(Hg2+)의 농도가 증가할수록 순환전압전류법에서의 피크전류가 더욱 감소하거나, 전기화학 임피던스 분광법에서 전하 이동 저항값이 더욱 감소하여 비교적 정확한 수은 이온(Hg2+)의 양을 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오센서는 pH 3의 환경에서의 수은 이온 검출이 가장 최적화되며, 다른 종류의 양이온은 검출되지 않아 Hg2+ 이온에 대하여 선택성이 높다.
또한, 본 발명은
1) 전극에 단일 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드를 고정화하는 단계;
2) 상기 단일 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드가 고정된 전극에 6-머캅토-1-헥산올을 가하여 6-머캅토-1-헥산올을 전극에 결합시키는 단계;
3) 상기 단일 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드 및 6-머캅토-1-헥산올이 고정화된 전극에 수은 이온(Hg2+)을 포함하는 용액을 가하여 폴리-T-올리고뉴클레오티드에 수은 이온(Hg2+)을 결합시켜, 이중 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계;
4) 상기 수은 이온(Hg2+)이 결합된 이중 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드에 그래핀 산화물을 결합시키는 단계; 및
5) 상기 전극에 결합된 그래핀 산화물의 양을 측정하는 단계;
를 포함하는, 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 센싱 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서는 수은 이온에 대한 민감도 및 선택성이 우수하며, 그래핀 산화물을 이용하여 전기화학적인 환원전위 측정법 또는 전기화학 임피던스 분광법을 통해 수은 이온을 검출하는 바, 새로운 검출 방법이다. 또한, 간단하고 저렴한 방법으로 우수한 효과를 낼 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 센싱
폴리-T-올리고뉴클레오티드(PTO)(SH-C6-5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'는 Genotech(Korea)에서 구매하였으며, 그라파이트 분말(<150 ㎛)을 포함한 모든 화학물질은 Sigma Aldrich에서 구매하였다. 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)는 0.01 M의 인산염(phosphate) 및 100 mM의 NaNO3로 구성되며, 인산완충액(phosphate buffer)은 1 M의 인산염으로 구성된다.
1-1. 금 전극 표면에 대한 폴리-T-올리고뉴클레오티드(Poly-T-Oligonucleotide, PTO)의 고정화
표면 개질에 앞서, 금으로 코팅된 유리전극을 piranha 용액(H2SO4:H2O2 = 3:1)으로 세척한 뒤, 물로 세척하고 질소 기체로 건조하였다. 또한, 10 nM의 폴리-T-올리고뉴클레오티드(PTO)를 1 mM의 tris(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)에 담그어 이황화결합을 환원시켰다. 이후, 상기 세척된 금 전극을 10 nM의 PTO 및 1 mM의 TCEP(1 M의 인산완충액으로 희석됨)의 혼합용액에 2시간 동안 담그어 PTO를 금 전극에 고정화하였다. 금 전극에 PTO를 고정화시킨 후에, 1mM의 6-머캅토-1-헥산올에 상기 전극을 1시간 동안 담그었다.
1-2. Hg 2+ 이온의 결합 및 그래핀 산화물의 전착
개질된 전극을 다양한 농도의 PBS 내의 Hg(NO3)2에 1.5시간 동안 담그어 Hg2+ 이온을 전극에 결합하였다. 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)은 그라파이트 분말로 수정된 Hummers 방법(W. Hummers, R. Offeman, Journal of the American Chemical Society 80 (1958) 1339.)을 이용하여 제조하였다. 제조된 그래핀 산화물을 초음파 분산기로 1시간 동안 음파처리한 뒤, 450 nm 컷오프(cut-off) 막 유리 필터로 걸렀다. 그래핀 산화물 용액의 pH는 HCl 및 NH4OH를 이용하여 조정하였다. 이후, 상기 Hg2+ 이온이 결합된 전극표면을 상기 0.05 mg/ml의 그래핀 산화물 용액에 1시간 동안 담그어 그래핀 산화물을 전착시켰다.
본 발명에 따른 수은 이온 검출방법의 개략정인 과정은 도 1에 나타내었다.
실험예 1. 순환전압전류법(Cyclic voltammetry, CV)
상기 실시예에 따라, 폴리-T-올리고뉴클레오티드가 결합된 전극에 Hg2+ 이온을 결합하고, 그래핀 산화물을 가하여 제조한 전극에 대하여 순환전압전류법을 수행하였다. 순환전압전류법(Cyclic voltammetry, CV)은 PC와 연결된 일정 전위기(potentiostat)로 lvium compactstat를 이용하여 수행하였다.
1-1. pH에 따른 순환전압전류법
금 전극, 금/PTO/6-머캅토-1-헥산올 전극, 금/PTO/6-머캅토-1-헥산올/그래핀 산화물(pH 3) 전극 및 금 전극/PTO/6-머캅토-1-헥산올/그래핀 산화물(pH 7) 전극에 대한 순환전압전류법의 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 금 전극/PTO/6-머캅토-1-헥산올/그래핀 산화물(pH 3)의 전극에서 피크 분리가 가장 크게 나타났으며, 금 전극, 금/PTO/6-머캅토-1-헥산올 전극, 금/PTO/6-머캅토-1-헥산올/그래핀 산화물(pH 7) 전극에서는 피크의 분리가 작게 나타나는 바, pH 3이 수은 이온 측정의 최적의 조건임을 알 수 있다.
1-2. Hg 2+ 이온의 농도에 따른 순환전압전류법
Hg2+ 이온의 농도를 0 nM, 1.0 nM, 4.2 nM, 17.3 nM, 72.1 nM 및 300.0 nM로 하여 각각의 환원 전위를 측정하였다. 전극 표면에 대하여 0.0 V 부터 -1.2 V까지 전압을 가하여 전기화학적으로 환원시켰다. 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 피크전류는 -0.9 V에서 나타났으며, Hg2+ 이온의 농도가 증가함에 따라 피크전류가 감소함을 확인하였다. 따라서 Hg2+ 이온이 증가할수록 전극에 결합하는 그래핀 산화물의 양이 감소한다는 사실을 확인하였다.
1-3. 양이온의 종류에 따른 순환전압전류법(Cyclic voltammetry, CV)
Hg2+ 이외의 Ba2+, Co2+, Ni2+, Cd2+ 및 Zn2+를 검출하기 위하여 순환전압전류법을 수행하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, Hg2+ 이온의 경우에는 다른 양이온에 비하여 피크전류가 감소함을 확인하였다. 따라서 본 발명의 검출용 바이오센서는 Hg2+에 특이적임을 확인할 수 있다.
실험예 2. 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy, EIS)
상기 실시예에 따라, 폴리-T-올리고뉴클레오티드가 결합된 전극에 Hg2+ 이온을 결합하고, 그래핀 산화물을 가하여 제조한 전극에 대하여 전기화학 임피던스 분광법을 수행하였다. 전기화학 임피던스 분광법은 PC와 연결된 일정 전위기(potentiostat)로 lvium compactstat를 이용하여 수행하였다.
전기화학적 셀에서 Ag/AgCl에 연결된 작업 전극은 개질된 금 전극, 및 백금 와이어가 각각 사용된 기준 전극과 상대전극으로 구성되었다.
전기화학 임피던스 분광법은 PBS 내의 K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6](1 mM, 1:1 분자비)의 형식전위(formal potential)에서 10 kHz 및 0.05 Hz 사이에서 측정하였다. 랜들(Randle) 등가회로는 나이퀴스트 플롯으로 나타난 임피던스 스펙트럼을 피팅하는데 사용되었다.
2-1. pH에 따른 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy, EIS)
금 전극, 금/PTO/6-머캅토-1-헥산올 전극, 금/PTO/6-머캅토-1-헥산올/그래핀 산화물(pH 3) 전극 및 금 전극/PTO/6-머캅토-1-헥산올/그래핀 산화물(pH 7) 전극에 대한 전기화학 임피던스 분광법의 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 금 전극/PTO/6-머캅토-1-헥산올/그래핀 산화물(pH 3)의 전극에서는 산화환원 쌍(redox couple)의 전하 이동 저항값(charge transfer resistance)이 가장 크게 측정되었으며, 금 전극, 금/PTO/6-머캅토-1-헥산올 전극 및 금/PTO/6-머캅토-1-헥산올/그래핀 산화물(pH 7) 전극에서는 산화환원 쌍의 전하 이동 저항값이 작게 측정되었는 바, pH 3이 수은 이온 측정의 최적의 조건임을 알 수 있다.
2-2. Hg 2+ 이온의 농도에 따른 전기화학 임피던스 분광법
Hg2+ 이온의 농도를 0 nM, 1.0 nM, 4.2 nM, 17.3 nM, 72.1 nM 및 300.0 nM로 하여 각각의 전하 이동 저항값을 측정하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, Hg2+ 이온의 농도가 증가함에 따라 산화환원 쌍의 전하 이동 저항값이 감소함을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 바이오센서가 Hg2+ 이온의 양을 우수하게 검출할 수 있음을 알 수 있다.
2-3. 양이온의 종류에 따른 전기화학 임피던스 분광법
Hg2+ 이외의 Ba2+, Co2+, Ni2+, Cd2+ 및 Zn2+를 검출하기 위하여 전기화학 임피던스 분광법을 수행하였다. 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, Hg2+ 이온을 제외한 다른 양이온의 경우에는 아무것도 가하지 않은 실험군과 유사한 저항값이 측정된 반면, Hg2+ 이온의 경우에는 산화환원 쌍의 전하 이동 저항값이 약 60%정도로 낮아졌음을 알 수 있다. 이를 통해 본 발명의 검출용 바이오센서는 Hg2+에 특이적임을 확인할 수 있다.

Claims (5)

  1. 전극에 단일 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드가 결합되어 있으며, 상기 단일 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드가 수은 이온(Hg2+)과 결합하면, 수은 이온(Hg2+)과 결합된 단일 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드는 다른 단일 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드와 결합하여, 이중 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드를 형성하는 것을 특징으로 하는, 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이중 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드는 그래핀 산화물과 결합하지 않고, 상기 단일 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드는 그래핀 산화물과 결합하는 것을 특징으로 하며, 상기 이중 가닥의 폴리-T-뉴클레오티드와 결합된 그래핀 산화물의 양을 측정함으로써 수은 이온(Hg2+)의 양을 측정하는 것을 특징으로 하는, 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서.
  3. 제2항에 있어서, 상기 결합된 그래핀 산화물의 양은 순환전압전류법 또는 전기화학 임피던스 분광법으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전극은 금 전극인 것을 특징으로 하는, 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 검출용 바이오센서.
  5. 1) 전극에 단일 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드를 고정화하는 단계;
    2) 상기 단일 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드가 고정된 전극에 6-머캅토-1-헥산올을 가하여 6-머캅토-1-헥산올을 전극에 결합시키는 단계;
    3) 상기 단일 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드 및 6-머캅토-1-헥산올이 고정화된 전극에 수은 이온(Hg2+)을 포함하는 용액을 가하여 폴리-T-올리고뉴클레오티드에 수은 이온(Hg2+)을 결합시켜, 이중 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계;
    4) 상기 수은 이온(Hg2+)이 결합된 이중 가닥의 폴리-T-올리고뉴클레오티드에 그래핀 산화물을 결합시키는 단계; 및
    5) 상기 전극에 결합된 그래핀 산화물의 양을 측정하는 단계;
    를 포함하는, 그래핀 산화물을 이용한 수은 이온 센싱 방법.
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