KR20140071455A - 망막 변성 병태의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 망막 변성 병태의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일반적인 양상에 따르면, 본 발명은 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한, NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 바람직하게는 성분 또는 기질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태의 치료를 위한 방법 및 이러한 방법에서 이용하기 위한 재조합 벡터 및 재조합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막의 혈관신생을 내포하는 질환을 발병시킬 위험 또는 해당 질환의 진행을 결정하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 망막 변성 병태의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은, 드루젠(drusen) 및 아나필라톡신-유래 맥락막의 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태를 치료하기 위한 조성물 및 방법, 그리고 병리학적으로-유도된 CNV를 비롯한, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막의 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태를 치료 혹은 예방하는데 적합한, NLRP3-인플라마좀(inflammasome)의 염증 매개체, 성분 또는 기질을 포함하는, 선택된 유전자 산물의 발현을 지시하는 유전자 전달 벡터의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막의 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태는 연령-관련 황반 변성이다.
선진국에 있어서, 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration: AMD)은 나이든 개체에 있어서 법적 시각상실의 가장 만연된 원인이다. AMD는 황반 내 망막 색소 상피(retinal pigment epithelium: RPE) 아래쪽의 브루크 막(Bruch's membrane) 상에 초점 세포외 침착물(deposit)의 축적을 특징으로 하는 진행성 질환이며, 이는 드루젠으로서 안구 조사에서 인식된다. 드루젠 축적은 건식 AMD와 습식 AMD의 양쪽 모두에서 공통적인 주된 병적 홀마크이다. 황반 내 드루젠의 존재, 상기 침착물의 밀도 및 이 물질에 의해 커버되는 면적은 AMD 질환 과정에서 초기 단계를 나타낸다. 드루젠을 가진 개체는 AMD의 말기 결합 형태로의 진행의 위험이 있는 것으로 여겨진다. AMD의 위축성 "건식" 형태의 말기인 지리학상 위축(Geographic atrophy: GA)은, 중심와(fovea) 아래쪽의 RPE의 초점 변성을 수반하는 시력 상실에 이른다. RPE 없이, 중심와 원추 광수용기(foveal cone photoreceptor)는 변성되어 중심 망막 시력상실을 초래한다. 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization: CNV)은 AMD의 삼출성 "습식" 형태의 말기를 특징으로 하며, 이때 새로운 혈관은 브루크 막/RPE를 통해 파손되어 출혈을 일으켜, RPE와 중심와 광수용기 사이에 혈전을 초래하여 즉각적인 시력상실을 가져온다.
AMD 질환은 환경적 요인과 유전적 요인이 둘 모두 연루되어 있는 고전적으로 다요인성이다. 질환 이환성과 연관된 서열 변이체는 이제 증가하는 수의 면역 조절 유전자를 특징으로 하고 있다. 안구 표면 상의 보체의 활성화는, 초기 질환 과정에서 주된 역할을 하는 것으로 여겨지고, 그 결과 드루젠 침착을 유발한다. 그러나, AMD 대상체의 눈에서 관찰되는 염증 반응의 개시에 연루되는 기전은 아직 해명되지 않았다.
드루젠 침착물은 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)에 의해 매개되는 멸균 염증 반응의 공지된 활성인자의 사실상 특징인 세포밖의 입상 단백질 응집체이다. NLRP3은 ATP, 요산 결정, 아밀로이드 유사 구조 및 미토콘드리아 기능장애 등과 같은 "위험" 신호의 수용체로서 작용하며, 이들은 NLRP3를 포함하는 인플라마좀, 카스파제-동원 도메인을 포함하는 세포자멸사-관련 반점-유사 도메인(ASC) 및 프로-카스파제-1을 활성화시켜, 프로-IL-1β 및 프로-IL-18의 그들의 성숙한 염증전(pro-inflammatory) 형태로의 분할을 초래한다. 또한, 과잉의 드루젠 축적은 인접한 RPE 세포를 파괴시킬 수 있고, 이것은 이어서 이제는 NLRP3 인플라마좀을 활성화시키는 것으로 알려진 세포 과정을 괴사에 의해 사멸시킨다.
현재의 항체-기반 요법은 VEGF의 생활성을 저해함으로써 AMD의 진행된 형태를 표적화한다. 그러나, 이들 모노클로날 항체(루센티스(Lucentis)(등록상표) 및 아바스틴(Avastin)(등록상표))의 직접적이고 규칙적인 안구내 주사는 망막 박리, 출혈 및 감염의 위험을 수반한다. 건식 황반 변성에 대해서 이용가능한 FDA-승인된 치료는 없지만, 이제 소수의 임상 시험 중에 있다. 따라서, 새로운 AMD 요법의 발생은 상업적으로 중요하다.
임상적 관점으로부터, 염증 과정은 오랜 동안 병적 측면 및 질환 발병(development)과 연관되어 왔지만, 본 발명자들은, 습식 AMD의 경우에 망막 내 염증의 전반적인 저해가 사운드 요법(sound therapy)이 아님을 제안하고 있다. 본 발명자들의 관찰에 대해 강점을 부여함으로써, 습식 AMD를 지닌 개체에서의 인플릭시맙(레미케이드(Remicade)(등록상표))의 최근의 임상 시험 결과는 이들 대상체의 50% 이상에서, 증상이 크게 악화된 것을 나타내었다.
IL-18은 광범위한 다양한 기능을 지닌 분자이고, 그 기능의 다수는 IL-18이 방출되는 환경에 따라서 서로 이분법적인 상반성이 있다. 이것은 혈관형성 혹은 혈관 성장을 조절함에 있어서 IL-18의 역할에 관한 사례이다. 예를 들어, IL-18은 류마티스성 관절염의 모델에서 혈관형성 촉진 효과를 지니는 것으로 나타나 있는 반면(Park et al, 2001, Evidence of IL-18 as a novel angiogenic mediator. Journal of Immunology 167: 1644-1653), 이것은 포진성 각질 각막염에서 항혈관형성인 것으로 밝혀졌다(Kim B et al, 2006, Application of plasmid DNA encoding IL-18 diminishes development of herpetic stromal keratitis by antiangiogenic effects. Journal of Immunology 175:509-516). 혈관형성제로서의 IL-18의 역할 대 지혈제로서의 그의 역할 간의 불일치에 대한 이유는 불명확한 채이지만 내포된 특정 혈관상(vascular bed)에 의해 부분적으로 결정된다.
Qiao 등(Interleukin-18 Regulates Pathological Intraocular Neovascularaization. Journal of Leukocyte Biology. Volume 81, April 2007, 1012-1021)은 조숙아의 망막증의 산소-유도 모델을 이용하여, 안구내 혈관신생의 발달을 촉발시켰다. 안구내 혈관신생은 내부 망막을 라이닝하는 혈관의 혈관신생을 내포한다. Qiao 등은 산소 유도 망막증의 발병 동안 C57BL/6 마우스들에게 재조합 IL-18을 투여하였는 바, 어떠한 혈관신생의 저해도 발견하지 못하였다. Qiao 등은, IL-18이 안구내 망막 혈관신생의 발달을 저해하기 보다 그의 퇴행을 촉진시킴으로써 안구내 망막 혈관신생을 조절한다고 결론을 내렸다.
본 발명은 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막의 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태 및/또는 병리학적으로-유도된 CNV, 바람직하게는, AMD, 더 바람직하게는 습식 AMD와 관련된 맥락막의 혈관신생에 대한 새롭고 개선된 요법에 관한 것이다.
맥락막은 안구밖이고 완전히 망막에 대해 분리되어 있는 혈관상이다. 이것은 망막 안구내 혈관구조와 마찬가지 방식으로 작용하지 않는다. 맥락막 혈관신생 (CNV)은 눈의 맥락막 층 내에 새로운 혈관의 형성이다. 이것은 황반변성증 습식 AMD(연령-관련 황반 변성)의 통상의 증상이며, Qiao 등의 망막 혈관신생(안구내)와는 별개이다.
본 명세서에 있어서, 맥락막의 혈관신생(CNV)이란 용어는 망막 혈관신생(안구내)을 포함하지 않는다. 안구내 혈관신생은 내부 망막의 혈관 라이닝의 혈관신생을 내포한다. 이것은 맥락막과 연루된 맥락막 혈관신생과는 구별되며, 혈관상은 안구밖에 있으며 망막과는 완전히 분리되어 있다. 이상적으로는, 본 명세서에 있어서, 안구내 혈관신생에 대한 IL-18의 이용은 배제된다.
본 명세서에 있어서, "NLRP3 인플라마좀, 성분 또는 기질"이란 용어는 NALP3, ASC 및 프로-카스파제-1 및 프로-IL-18 및 IL-18을 커버하는 것으로 이해될 것이다. NLRP3, ASC 및 프로-카스파제-1이 올리고머화될 경우, 이들은 활성 카스파제-1을 생산하고, 이것은 이어서 프로-IL18을 분할시켜 II-18을 숙성시킨다. 이와 같이 해서, 프로-IL18은 카스파제-1의 기질이라는 사실로 인해서 인플라마좀의 성분이다. IL-18의 24KDa 비활성 전구체는 "프로-IL-18"이라 지칭되고, 18KDa 숙성 IL-18은 "IL-18" 또는 "염증전 IL-18"이라 지칭된다. NLRP3 및 NALP3은 본 명세서에서 상호호환가능하게 이용되며, 동일 인플라마좀 성분으로 지칭된다. 바람직한 실시형태에 있어서, NLRP3 인플라마좀, 성분 또는 기질은 "Il-18"이라 지칭되는 숙성 Il-18이다. IL-18이란 또한 NCBI 등록 번호 NM_001562.3으로 규정된 뉴클레오타이드 서열 및 NCBI 등록번호 NP_001553.1로 규정된 단백질 서열을 의미하는 것이 이해될 것이다. 또. IL-18의 전달이란 또한 예를 들어 안구내 주사를 통해서 국소적으로 또는 정맥내 주사를 통해서 전신으로 재조합 IL-18(rIL-18)의 전달을 포함하는 것이 이해될 것이다.
본 발명자들은, 공여자 AMD 눈으로부터 단리된 드루젠이 NLRP3-인플라마좀을 활성화시켜, IL-1β 및 IL-18의 분비를 유발하는 것을 나타내었다. 드루젠 성분 C1Q는 또한 NLRP3-인플라마좀을 활성화시킨다. 게다가, AMD의 바이오마커인 산화적-스트레스 관련 단백질-변성 카복시에틸-피롤(CEP)은, 인플라마좀을 프라밍한다. 본 발명자들은, 건식 AMD-유사 병적 측면을 모델화한 CEP-MSA-면역화된 마우스들의 망막 내의 활성된 마크로파지에서 카스파제-1 및 NLRP3을 분할시키는 것을 발견하였다. 본 발명자들은, 습식 AMD의 승인된 동물 모델인 레이저 유도 맥락막 혈관신생(CNV)이 Nlrp3 -/-에서 악화되지만 Il1r1 -/- 마우스에서는 그렇치 않으므로, CNV 발병을 조절하는데 IL-18이 직접 연루된 것을 보여주고 있다. 이들 지견은 AMD의 진행에서 NLRP3 및 IL-18에 대한 보호 역할을 나타낸다.
NLRP3 및 그의 성분이 AMD의 주된 질환 병리에 대항한 보호제로서 직접 연루된다는 것이 본 발명자들의 견해이다. 따라서, 눈에 IL-18을 생산하거나 전달하는 것을 목표로 하는 전략은, CNV의 진행을 예방함에 있어서, 특히 습식 AMD의 맥락에서 유익한 것으로 입증될 수 있다.
본 발명의 제1의 일반적인 양상에 따르면, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태의 치료에서 이용하기 위한, NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 바람직하게는 성분 또는 기질이 제공된다.
본 발명의 망막(안구내) 혈관신생 및 맥락막(안구외) 혈관신생은 혈관구조의 뚜렷한 병태이다. 본 발명자들은 IL-18이 맥락막 혈관신생의 촉진을 억제하는 것을 발견하였다.
이상적으로는, NLRP3-인플라마좀의 성분 또는 기질은, 재조합 IL-18을 비롯한, IL-18이다.
이상적으로는, 망막 병태는 병리학적으로-유도된 CNV, 예컨대, AMD, 바람직하게는 건식 및/또는 습식 AMD, 더 바람직하게는 습식 AMD와 관련된 맥락막 혈관신생(CNV)을 포함한다.
본 발명의 이 일반적인 양상에 따르면, 염증 매개체, 성분 또는 기질은 연령-관련 황반 변성을 발병시킬 위험이 있는 대상체에서 인터류킨-18(IL-18) 발현을 제어, 유지 혹은 촉진시키는데 이용되어, 특히 습식 AMD의 맥락에서 CNV의 진행을 예방할 수 있다.
인플라마좀의 업-스트림(up-stream) 성분이 또한 이용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이들 성분으로는 NLRP3, ASC 또는 프로-카스파제-1, 프로-IL-18 등을 포함한다. 그러나, IL-18 또는 재조합 IL-18의 전달이 바람직하다.
이상적으로는, 인터류킨-18(IL-18)을 포함하는, 염증 매개체, 성분 또는 기질은, 혈관신생 질환의 발병 전에 혹은 초기 단계의 혈관신생 질환에 투여된다.
드루젠에 의한 NLRP3 인플라마좀의 활성화는, 밸런스가 존재할 수 있고, 이에 따라서, 소정 초점 수준의 드루젠은 IL-18을 유도하는 그의 능력으로 인해 용인되고, 이어서 항혈관형성 효과기로서 작용할 수 있어, 염증성 미세 환경에서 맥락막 항상성을 유지하는 것을 시사한다. 일단 임계 수준의 드루젠이 축적되면, 그의 보호 역할은 주변 조직에 대한 과도한 손상에 의해 무효화되는 공산이 있다. 중요하게는, 본 발명자들은, 드루젠-유발성 염증 매개체가 CNV 발병에 대해서 보호적이며, IL-18의 얻어지는 NLRP3 매개 상승은 VEGF의 다운스트림 생성을 억제하는 것이 입증되었다. 게다가, IL-18은, 염증의 더욱 통상적인 모델인 실험적인 포도막염의 발병에 역할하지 않는 것으로 나타났다.
일 실시형태에 따르면, 망막 변성 병태는 연령-관련 황반 변성이다. 명세서 전체를 통해서 연령-관련 황반 변성은 습식 연령-관련 황반 변성 또는 건식 연령-관련 황반 변성일 수 있는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 습식 연령-관련 황반 변성(AMD)의 발병 위험이 있는 환자에서 맥락막 혈관신생(CNV)을 제어하는데 이용하기 위한 인터류킨-18(IL-18) 또는 재조합 IL-18이 제공된다. IL-18의 얻어지는 NLRP3 매개 상승은 VEGF의 다운스트림 생산을 방지하며, 본 발명자들은 CNV 발병에 대해서 보호성인 것으로 발견하였다.
본 명세서에서의 IL-18이란 언급은 모두 재조합 IL-18(rIL-18)을 지칭하는 것으로 또한 이해되어야 한다.
본 발명의 일반적인 양상에 따르면, IL-18 또는 재조합 IL-18은 국소 효과 혹은 전신 효과를 유발하여 제공하도록 투여될 수 있다.
IL-18 또는 재조합 IL-18 단백질은 그 자체로 투여될 수 있다. IL-18 또는 재조합 IL-18은 또한 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 선택적으로, IL-18은 약제학적으로 허용가능한 애주번트와 함께 투여될 수 있다. 이러한 애주번트는 담체, 희석제, 및 부형제, 예컨대, 멸균수 및 오일 등을 포함할 수 있다. 또한, 애주번트, 부형제 및 보조물질은 이하에 열거되어 있다.
투여는 각종 경로를 통해서 수행될 수 있는 것이 이해될 것이다. 이들 경로는 필요에 따라 국소 혹은 전신 효과를 제공하도록 설계된다. 이들 경로는, 경구, 국소, 폐, 직장, 피하, 피부내, 비강내, 두개내, 근육내, 안구내 또는 관절내 주사 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 전형적인 투여 경로는 정맥내에 이어서 피하이지만, 기타 경로도 동등하게 유효하다. 근육내 주사는 또한 팔 혹은 다리 근육에서 수행될 수 있다.
몇몇 방법에 있어서, IL-18은 특정 조직 내로 직접 주입될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 투여는 서방성 조성물의 일부로서 일 수 있다.
비경구 투여를 위하여, IL-18은 멸균 액체, 예컨대, 물, 오일, 식염수, 글라이세롤 혹은 에탄올일 수 있는 약제학적 담체와 함께 생리학적으로 허용가능한 희석제 중에 물질의 용액 혹은 현탁액의 주사가능한 용량으로서 투여될 수 있다. 부가적으로, 보조물질, 예컨대, 습윤제 혹은 유화제, 계면활성제, pH 완충물질 등은 조성물에 존재할 수 있다. 약제학적 조성물의 기타 성분은 석유, 동물, 채소, 혹은 합성 기원의 것들, 예를 들어, 땅콩유, 대두유 및 광유이다. 일반적으로, 글라이콜, 예컨대, 프로필렌 글라이콜 혹은 폴리에틸렌 글라이콜은 적절한 액체 담체, 특히 주사가능한 용액이다.
IL-18은 또한 단백질 IL-18의 지속 방출을 허용하기 위한 방식으로 조제될 수 있는 데포 주사 혹은 이식물 제제의 형태로 투여될 수 있다.
전형적으로, 조성물은 액체 용액 혹은 현탁액으로서 주사제로서 제조될 수 있으며; 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 혹은 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 바람직하다. 이 제제는 또한 폴리락타이드, 폴리글라이콜라이드 또는 증대된 전달을 위한 공중합체 등과 같은 리포솜 혹은 마이크로 입자에 에멀젼화 혹은 캡슐화될 수 있다.
기타 제형은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방성 제형 또는 분말의 형태를 취할 수 있다. 국소 적용은 경피 혹은 피부내 전달을 야기할 수 있다. 대안적으로, 경피 전달은 피부 패취를 이용해서 달성될 수 있다.
이상적으로는, 상기 투여 모드는 눈에, 바람직하게는 망막에, 더 바람직하게는 맥락막 층에 IL-18의 전달을 야기한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 국소 전달 수단은 안구내 주사 등과 같이 눈에 IL-18, rIL-18, 또는 IL-18/rIL-18을 포함하는 약제학적 조성물의 직접 주사를 포함한다. 주사는 눈의 유리체 내로(유리체내), 눈 뒤로(안와), 결막 밑으로(결막하) 또는 테논의 캡슐 밑으로(태논낭하) 행해지는 망막하일 수 있다.
바람직한 또 다른 실시형태에 따르면, 염증전 인터류킨-18(IL-18), rIL-18 또는 IL-18/rIL-18을 포함하는 약제학적 조성물은, 대상체에게 전신으로 전달될 수 있다. 전신 전달 수단은 비경구 혹은 장용 수단을 포함할 수 있고, 본질적으로 모든 비국소 전달 수단을 망라할 수 있다. 이상적으로는, 전신 전달 수단으로는 주사, 직접 주사 및/또는 바이러스 매개 전달을 포함한다.
바람직한 실시형태에 따르면, 전신 주사 수법은 정맥내 주사에 의한 정맥내 전달을 포함한다. 정맥내 주사는 대상체의 말초 정맥으로 행해질 수 있다. 이 투여 경로를 위하여, IL-18, rIL-18, 또는 IL-18/rIL-18을 포함하는 약제학적 조성물은 대상체의 혈류에 직접 투여/주사된다.
바람직하게는, IL-18은, 직접 주사, 예컨대, 정맥내 주사에 의해 및/또는 바이러스 매개 전달에 의해 전신으로 망막으로 전달된다.
바이러스 매개 전달 수법으로는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus: AAV), 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 유전자 전달 벡터를 포함한다. 선택적으로, AAV 요법을 포함하는 바이러스 매개 전달 수법은, NLRP3, ASC 또는 프로-카스파제-1을 도입함으로써 인플라마좀 성분의 업스트림에 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 맥락막, 혈관신생의 치료에 적합한 형태로 프로-IL-18 또는 IL-18의 발현을 지시하는 재조합 바이러스 유전자 전달 벡터가 제공된다.
재조합 바이러스 유전자 전달 벡터는, 전신 투여를 위한 형태로, 예를 들어, 정맥 내 투여에 의해 행해질 수 있다.
재조합 바이러스 유전자 전달 벡터는 또한 AMD, 바람직하게는 습식 AMD를 발병할 위험이 있는 대상체의 눈에 투여하기 위한 형태일 수 있다.
예를 들어, 벡터는, 망막하 또는 유리체내 주사를 포함하는, 안구내 주사를 통해서 눈에 전달하기에 적합한 형태일 수 있다.
바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV), 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 유전자 전달 벡터일 수 있다. 이상적으로는, 유전자 전달 벡터의 전달은, 예를 들어, 소량의 유체가 망막 아래쪽에 주입되는 망막하 주사를 통해서 이루어진다. 이것은 단일 투여를 수반하는 장기 질환 관리의 관점에서 이점을 지닌다. 벡터는 또한 대상체들에서의 유리체내 투여를 위해 최적화되어 있을 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 실시형태에 따르면, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태, 예컨대, 연령-관련 황반 변성(AMD)을 발병시킬 위험이 있는 대상체에서 인터류킨-18(IL-18) 발현을 제어, 유지 혹은 촉진시키기 위하여 대상체에 IL-18의, 바이러스, 바람직하게는 AAV 매개 전달의 이용을 내포하는, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태, 바람직하게는 습식 AMD에 대한 새로운 유전자 요법이 제공된다.
이 바람직한 실시형태에 따르면, AMD, 바람직하게는 습식 AMD를 발병할 위험이 있는 대상체의 눈에 투여하기에 적합한 IL-18의 발현을 지시하는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 유전자 전달 벡터가 제공된다.
AAV 벡터는 II-18 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함한다. AAV는 AAV 혈청형 1 내지 11, 바람직하게는 혈청형 2, 8 또는 9 중 어느 하나일 수 있다. 이상적으로는, IL-18 유전자는 AAV 역말단 반복부위(inverted terminal repeat: ITR)의 측면에 있다.
많은 상이한 촉진제가 이용될 수 있다. 이들은 이상적으로는 세포 특이적 촉진제이다. 이들은, 망막 색소 상피 세포(RPE) 특이적 촉진제, 예컨대, CRALBP 또는 RPE65, 내피 세포 특이적 촉진제, 예컨대, 타이-2(Tie-2) 또는 클라우딘-5(claudin-5), 또는 로도스핀을 포함하는 광수용기 특이적 촉진제를 포함할 수 있다.
AAV는 형질도입 망막 세포에서 매우 효과적인 안질환에 대해서 이용되는 주된 바이러스 벡터이다. 이것은 또한 임상적 관점으로부터 매우 중요한 비면역원성이다. AAV 수법은 숙주 조직, 특히 망막 등과 같은 중추신경계의 조직에 대해 유전자를 전달하는 매우 안전한 수단으로서 알려져 있다. 숙주 게놈 내로 통합될 수 있는 아데노바이러스와 대조적으로, AAV는 세포를 감염시킬 것이고, 이어서 그들의 유전자 물질은 에피솜 DNA로서의 핵에 체류할 것이다. 이 인자는 그들의 우수한 안전성 프로파일 및 낮은 면역원성에 대한 키(key)일 공산이 있다. 이와 동시에, AAV 수법은 이제 파킨슨병, 알츠하이머병 및 근이영양증에 대한 임상 시험의 범위에서 그리고 그의 제안과 관련하여 이용 중에 있고, AAV는 이제 망막 용도를 위해 잘 확립되어 있으며, 많은 임상 시험이 레버씨 선천성 흑암시(Leber's Congenital Amaurosis: LCA)라 불리는 망막색소변성증의 열성 형태의 치료를 위해 진행 중에 있다.
지금까지, 11가지 AAV 혈청형이 문헌에 기재되어 있으며, 이들 혈청형에 있어서의 주된 차이는 이들이 감염시킬 수 있는 표적 세포에 관련된다. AAV-2, AAV-8 및 AAV-9는 RPE 세포를 효과적으로 형질주입하는 것으로 밝혀졌다. 이와 같이 해서, 본 발명은 바람직하게는 AAV-2, AAV-8 및/또는 AAV-9의 이용을 포함할 수 있다.
하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명은, 5' 및 3' UTR을 포함하는 IL18을 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 좌측 및 우측 AAV 역말단 반복부위(L-ITR 및 R-ITR)를 편입시키도록 하는 등과 같이 벡터 내로 이 유전자를 도입시킴으로써 벡터(예컨대, AAV 혈청형 -2, -8 및 -9 등과 같은 AAV 벡터)를 구성하는 것을 포함한다.
본 발명의 제2양상에 따르면, 치료를 필요로 하는 대상체에게 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질을 투여하는 단계를 포함하는, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
바람직한 실시형태에 따르면, 연령-관련 황반 변성을 발병시킬 위험이 있는 대상체에게 인터류킨-18(IL-18)을 투여하는 단계를 포함하는, 습식 연령-관련 황반 변성(AMD)을 치료하는 방법이 제공된다. IL-18은 국소 혹은 전신 효과를 제공하기 위하여 투여될 수 있다.
바람직한 실시형태에 따르면, 국소 전달 수단은 직접 안구내 주사를 포함한다. 주사는 눈의 유리체 내로(유리체내), 눈 뒤로(안와), 결막 밑으로(결막하) 또는 테논의 캡슐 밑으로(태논낭하) 행해지는 망막하일 수 있다.
바람직한 또 다른 실시형태에 따르면, 염증전 인터류킨-18(IL-18)은 대상체에 전신으로 전달될 수 있다. 전신 전달 수단은 비경구 또는 장용 수단을 포함하고, 모든 비국소 전달 수단을 본질적으로 망라한다. 이상적으로는, 전신 전달 수단은 주사, 직접 주사 및/또는 바이러스 매개 전달을 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에 따르면, 전신 주사 수법은 정맥내 주사에 의한 정맥내 전달을 포함한다. 정맥내 주사는 대상체의 말초 정맥으로 일 수 있다. 이 투여 경로를 위하여, 재조합 IL-18은 대상체의 혈류에 직접 투여/주사된다.
본 발명의 제3양상에 따르면, 습식 또는 건식 연령-관련 황반 변성 등과 같은, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 질환을 발병시킬 위험을 나타내는 바이오마커로서, NLRP3-인플라마좀 유도 매개체, 바람직하게는 염증전 IL-18(IL-18)의 용도가 제공된다.
본 발명의 제4양상에 따르면, 바이오마커로서 인플라마좀 유도 매개체, 바람직하게는 염증전 IL-18(IL-18)을 이용해서, 대상체에서 습식 또는 건식 연령-관련 황반 변성 등과 같은, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 질환을 발병시킬 위험을 결정하거나 해당 질환의 진행을 모니터링하는 방법이 제공되되, 해당 방법은,
대상체에서 IL-18 및/또는 IL-18 결합 단백질 수준을 순환시키는 레벨을 획득하는 단계; 및
상기 IL-18 및/또는 IL-18 결합 단백질 수준의 레벨을 기준치와 비교하는 단계를 포함하되, 상기 대상체의 상기 질환 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생의 발병의 위험 혹은 진행은 기준치와 비교한 상기 IL-18 수준 및 또는 IL-18 결합 단백질의 레벨에 기초한다.
IL-18과 그의 결합 단백질(IL-18 결합 단백질)의 비는, 정상 기준치로부터의 변동의 척도로서 통상 이용되지만, IL-18 수준이 단독으로 이용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
이제, 본 발명은 이하의 비제한적인 도면 및 실시예와 관련하여 설명될 것이다.
도 1: 드루젠은 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킨다: (a) 비흡연의 병들지 않은, 건식 및 습식 AMD-병든 개체들로부터의 안저촬영. (b) 단지 500㎛ 이하 내지 초현미경적 크기의 입자의 범위에서의 드루젠 단편. (c) 부르크 막(Bruch's membrane: BM)/드루젠 제제의 SDS-PAGE 분석. (d) 황색-형광 단백질 표지된-ASC(YFP-ASC)를 안정적으로 발현하는 불멸화 BL6 BMDM의 생세포 영상. 세포는 3시간 동안 LPS로 프라이밍시킨 후 250 ng ㎖-1 드루젠으로 추가로 2시간 동안 처치(treatment)하고, 폴리(dAdT)는 양성 대조군으로서 이용하였다. ASC-YFP의 올리고머화는 반점 형성에 의해, 원래의 배율 x 60으로 관찰되었다. (e, f) IL-1β 및 IL-18의 생산은 100 ng ㎖-1 LPS로 하룻밤 프라이밍되고 나서 증가된 용량의 드루젠 제제(250 ng ㎖-1 및 500 ng ㎖-1)로 7시간 동안 처리된 인간 PBMC에서 ELISA에 의해 측정되었다(***P ≤ 0.0001). (g) 드루젠에 의한 THP-1 세포의 처리 후의 카스파제-1의 분할 산물의 웨스턴 블롯. (h) 증가된 용량의 드루젠으로 처치된 후의 야생형(WT)(청색 막대) 및 NLRP3-결함(Nlrp3 -/-)(적색 막대) 골수-유래 대식세포(bone marrow-derived macrophage: BMDM)들에서의 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 IL-1β(좌측 패널) 및 IL-6(우측 패널)의 생산(*** P ≤ 0.0001). (i) 증가된 용량의 드루젠으로 처치 후의 WT(청색 막대) 및 Nlrp3 -/-(적색 막대) 골수-유래 수지상 세포(bone marrow-derived dendritic cell: BMDC)들에서 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 IL-1β(좌측 패널) 및 TNFα(우측 패널)의 생산(*** P ≤ 0.0001). 모든 ELISA 데이터는 세 벌로 수행된 최소 3가지 별개의 실험을 나타낸다.
도 2: 드루젠의 성분인 CEP는 NLRP3 인플라마좀을 프라이밍할 수 있다: (a) LPS, CEP-부가된 알부민(CEP-HSA) 또는 HSA의 증가된 용량(50 및 100 ㎍ ㎖-1)으로 프라이밍 후 5mM ATP로 처치된 인간 PBMC에서의 IL-1β의 생산. (b) CEP-HSA로 프라이밍 후 ATP 또는 폴리(dAdT)로 활성화된 WT 및 Nlrp3 -/- BMDM들에서의 IL-1β 생산. (c, d) HSA 또는 CEP-HSA로 프라이밍되고, ATP로 활성화되거나 또는 미처리된 채로 있는 WT 또는 Tlr2 -/- BMDM들에서의 IL-1β 및 IL-6 생산. (e,f) IL-1β 및 TNFα 생산은, LPS 또는 CEP로 프라이밍되고 ATP로 활성화된 C3H/HeN BMDM들(WT) 또는 C3H/HeJ BMDM들(이는 돌연변이체 TLR4를 포함함)에서 측정되었다. (g) YFP-ASC를 안정적으로 발현하는 불멸화된 BL6 BMDM들의 생세포 영상. 세포는 CEP-HSA(상부 패널) 또는 HSA(하부 패널)에서 3시간 동안 프라이밍된 후 250 ng/㎖ 드루젠으로 추가로 2시간 동안 처치되었다. ASC-YFP의 올리고머화는 반점 형성에 의해 원래의 배율 x 60으로 관찰되었다. 모든 ELISA 데이터는 세 벌로 수행된 최소 3가지 별개의 실험을 나타낸다.
도 3: 드루젠의 성분인 보체 인자 C1Q는 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킨다: (a) CEP로 3시간 동안 프라이밍되고 C1q로 증가된 용량에서 6시간 동안 활성화된 BMDM들에서의 IL-1β(좌측 패널) 및 TNFα(우측 패널)의 생산. (b) C1Q의 증가된 용량으로 처치된 THP1 세포에서의 카스파제-1 분할 산물의 웨스턴 블롯. (c) YFP-ASC를 안정적으로 발현하는 불멸화된 BL6 BMDM들의 생세포 영상. 세포는 LPS(상부 패널) 또는 CEP-HSA로 3시간 동안 프라이밍한 후 10 ㎍ ㎖-/- C1Q (우측 패널)로 추가로 2시간 동안 처치하였다. ASC-YFP의 올리고머화는 반점 형성에 의해, 원래의 배율 x 60으로 관찰되었다. (d) LPS(3시간)로 프라이밍되고 C1Q(16시간)로 증가된 용량(2.5, 5 및 10 ㎍ ㎖-/- C1Q)에서 활성화된 WT 및 Nlrp3-/- BMDC들에서의 IL-1β(좌측 패널) 및 TNF-α(우측 패널) 생산. (e) 100ng ㎖-/- LPS로 하룻밤 프라이밍되고 5㎍ ㎖-/- C1Q로 6시간 동안 활성화되되, 증가된 용량(10배)의 ZVAD(카스파제-1 저해제)가 C1Q 처치 1시간 전에 부가된 인간 PBMC에서의 IL-1β IL-18 및 IL-6 생산. 모든 ELISA 데이터는 세 벌로 수행된 최소 3가지 별개의 실험을 나타낸다.
도 4: 분할된 카스파제-1 p10은 CEP-MSA 면역화된 마우스들에서 활성화된 대식세포와 공편재화(co-localize)된다: (a-c) CEP-MSA 면역화된 마우스들의 망막 동결절편의 면역염색은 F4/80 양성 대식세포(a)를 부르크 막을 향해서 맥락막으로부터 연장되어 있는 맥락막의 영역(b)으로 편재화하고, (c) 망막의 외부 세그먼트(outer segment: OS) 및 외부 핵층(outer nuclear layer: ONL)에서 RPE 위쪽을 보여준다. (a,b) 상부 패널 (c) 좌측패널, 차등 간섭 대비(differential interference contrast: DIC) 화상, (a,b) 하부 패널 (c) 우측 패널, 형광 화상(F4/80-적색, DAPI-청색). (d,e) 카스파제-1 p10(적색) 및 F4/80(녹색)을 이용한 CEP-MSA 면역화된 마우스들의 망막 동결절편의 공표지화(Co-labelling)는 (d) 맥락막/부르크 막 내 및 이를 초월하여 존재하는 대식세포 및 (e) 망막의 OS 내에서의 대식세포 돌출부에서의 공편재화를 나타낸다. (f) CEP-MSA 면역화된 마우스들의 망막 동결절편의 공표지화는 NLRP3(적색) 및 F4/80(녹색)의 공편재화를 나타낸다. (g) NLRP3 및 F4/80 염색의 고배율.
도 5: NLRP3은 IL-1β 독립적인 방식에서 레이저-유도 CNV 병변 형성에 대해 보호성이다: (a) WT(좌측 상부 패널), Nlrp3 -/-(상부 중간 패널) 및 Il1r1 -/-(우측 상부 패널) 마우스들에서의 레이저 유도 CNV는 레이저 화상 후 6일에 CNV 발병을 보인다. WT(좌측 하부 패널), Nlrp3 -/-(하부 중간 패널) 및 Il1r1 -/-(우측 하부 패널)로부터의 공초점 Z-스택의 3-D 재구성된 화상. CNV 부피 렌더링(막대 그래프). (b) Nlrp3 -/- 및 Il1r1 -/- 마우스들의 간상 및 원추 기능(rod and cone function)의 망막전기측정(Electroretinographic: ERG) 분석. (c) 면역염색은 Nlrp3 -/- 마우스들에서 레이저 유도 손상의 부위에 활성화된 대식세포(F4/80-녹색)의 편재화를 나타낸다. (d) 분할된 카스파제-1(적색)에 대해서 손상 후 3시간에 WT(좌측 패널) 또는 Nlrp3 -/-(우측 패널) 망막 동결절편의 면역염색.
도 6: NLRP3은 IL-18 생산에서의 그의 역할을 통해서 CNV 병변 형성에 대한 그의 보호를 부여하고, 이어서 VEGF 수준을 조절한다: (a) Il18 -/- 마우스의 간상 및 원추 기능의 망막전기측정(ERG) 분석. (b) Il18 -/- 마우스들의 레이저 유도 CNV는 레이저 화상 후 6일에 CNV 발병을 보인다(좌측 패널). 공초점 Z-스택의 3-D 재구성된 화상(우측 패널). CNV 부피 렌더링(막대 그래프). (c) CNV 부피는 WT 마우스들(도 5)에 비해서 유의하게 증가하였다(*P = 0.0292). VEGF의 생산은 24시간 동안 증가된 용량의 IL-18로 처치하거나 또는 미처치 상태인 채인 (d) ARPE-19 세포 및 (e) 마우스 뇌 미세혈관 내피 세포(B.end3)에서 ELISA에 의해 평가되었다. ELISA 데이터는 세 벌로 수행된 최소 3가지 별개의 실험을 나타낸다.
도 7: (a) BCA 검정에 의해 결정되는 바와 같이 동일량의 단백질이 장입된, ARPE-19 세포(좌측) 및 THP1 세포(우측)에서의 NLRP3 발현의 웨스턴 블롯. (b) ARPE-19 세포는 각종 TLR 리간드; 100 ng/㎖ LPS, 또는 2 ㎍/㎖ Pam3Cys 또는 25 ㎍/㎖ 폴리(I:C), 또는 1 ㎍/㎖ R848, 또는 5 ㎍/㎖ CpG-ODN로 프라이밍되고, 미처치된 채로 있거나 또는 추가 시간 동안 ATP로 활성화되었다. IL-1β 생산이 이어서 측정되었다.
도 8: a) RPE 수프는 드루젠의 단리 후 생산된 망막/RPE 물질을 함유하는 것에 대해서 광 현미경 하에 관찰되었다. b) 이 물질(100 ng/㎖, 250 ng/㎖ 및 500 ng/㎖)이 LPS 프라이밍된 PBMC들에 첨가되었지만 IL-1β 수준 또는 c) IL-18 수준의 증가를 초래하지 못했다. d) IL-6 발현은 증가된 용량의 RPE 수프에 의해 변화되지 않았다. e) RPE 수프는 WT 또는 Nlrp3 -/- 마우스 BMDC들에서 IL-1β 수준의 어떠한 변화도 이끌어내지 못했다. f) 실험군들 간에 IL-6 발현의 차동 변화는 없었다.
도 9: 드루젠에 의한 THP1 세포의 처치 후의 카스파제-1 P10 웨스턴 블롯의 농도 분석.
도 10: a) IL-1β 수준은 LPS 프라이밍된 WT 및 ATP에 의해 활성화된 Tlr2 -/- BMDM들에서 유의하게 증가하였고, b) IL-6 수준은 유의하게 상이하지 않았다.
도 11: 증가된 용량의 C1Q에 의한 THP1 세포의 처치 후의 카스파제-1 P10 웨스턴 블롯의 농도 분석.
도 12: 용액 중 C1Q의 제타 전위 측정치는 11.8 mV의 제타 평균을 나타낸다.
도 13: 100 ng/㎖ LPS로 하룻밤 프라이밍되고, 5 ㎍/㎖ C1Q로 6시간 동안 활성화되되, 증가된 용량(10배)의 (a) DPI(ROS 저해제), (b) 발필로마이신(Bafilomycin)(라이소솜 산성화를 저해함), (c) CA-074 Me(카텝신 B 저해제)가 C1Q 처치 1시간 전에 부가된 인간 PBMC 중에서의 IL-1β, IL-18 및 IL-6 생산.
도 14: 망막의 외부 세그먼트(OS) 및 공막 내의 양성 세포를 나타낸, CEP-MSA 면역화된 마우스 망막에서의 CD68 염색(적색).
도 15: CEP-MSA 면역화된 마우스 망막 동결절편은 NLRP3에 대해서 염색되었고, 양성 면역재활성은 (a) 망막의 외부 세그먼트, (b) 망막 색소 상피(RPE), (c) 공막 내 세포 및 (d) 맥락막 내 세포에서 관찰되었다.
도 16: F4/80(좌측 패널, 적색) 및 카스파제-1 p10(중앙 패널, 녹색)은 WT 마우스들(우측 패널) 내 레이저 유도 CNV의 부위에 공편재화되었다
도 17: IL-18은 손상 24시간 후 WT 마우스들에서 레이저 유도 손상의 부위에서 관찰되었다(좌측 패널-적색 염색). 이 염색은 Nlrp3 -/- 마우스들에서의 손상 부위에서 명백하지 않았다(우측 패널-적색 염색).
도 18(a) 레이저 유도 후 CNV 주입된 IL-18(1㎍) 중화 항체는 에피플루오레슨트 현미경에 의해 측정된 바와 같이 WT 마우스들에서 유의하게 증가하였다, (b) CNV의 공초점, Z-스택 3-D 렌더링된 화상. (c) 유의하게 증가된 CNV는 모의 주입된 마우스에 비해서 레이저 손상 후 1㎍ IL-18 중화 항체가 주입된 WT 마우스들에서 관찰되었다(*P = 0.0368).
도 19 CD11c 및 CD11b에 대해서 염색된 (a) BMDC들 및 (b) BMDM들의 유동 세포계수분석.
도 20 (a) RPE는 광수용기의 외부 세그먼트에 인접하게 놓여있다. (b) 532㎚ 레이저에 의한 망막/RPE/브루크 막/맥락막 복합체의 표적화된 열 파괴는 50㎛ 직경 손상, 그린포니아 심플리시폴리아 아이소렉틴-알렉사-568(Griffonia simplicifolia isolectin-Alexa-568)(적색) 및 팔로이딘-알렉사-488(Phalloidin-Alexa-488)(녹색)을 초래하였다.
도 2: 드루젠의 성분인 CEP는 NLRP3 인플라마좀을 프라이밍할 수 있다: (a) LPS, CEP-부가된 알부민(CEP-HSA) 또는 HSA의 증가된 용량(50 및 100 ㎍ ㎖-1)으로 프라이밍 후 5mM ATP로 처치된 인간 PBMC에서의 IL-1β의 생산. (b) CEP-HSA로 프라이밍 후 ATP 또는 폴리(dAdT)로 활성화된 WT 및 Nlrp3 -/- BMDM들에서의 IL-1β 생산. (c, d) HSA 또는 CEP-HSA로 프라이밍되고, ATP로 활성화되거나 또는 미처리된 채로 있는 WT 또는 Tlr2 -/- BMDM들에서의 IL-1β 및 IL-6 생산. (e,f) IL-1β 및 TNFα 생산은, LPS 또는 CEP로 프라이밍되고 ATP로 활성화된 C3H/HeN BMDM들(WT) 또는 C3H/HeJ BMDM들(이는 돌연변이체 TLR4를 포함함)에서 측정되었다. (g) YFP-ASC를 안정적으로 발현하는 불멸화된 BL6 BMDM들의 생세포 영상. 세포는 CEP-HSA(상부 패널) 또는 HSA(하부 패널)에서 3시간 동안 프라이밍된 후 250 ng/㎖ 드루젠으로 추가로 2시간 동안 처치되었다. ASC-YFP의 올리고머화는 반점 형성에 의해 원래의 배율 x 60으로 관찰되었다. 모든 ELISA 데이터는 세 벌로 수행된 최소 3가지 별개의 실험을 나타낸다.
도 3: 드루젠의 성분인 보체 인자 C1Q는 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킨다: (a) CEP로 3시간 동안 프라이밍되고 C1q로 증가된 용량에서 6시간 동안 활성화된 BMDM들에서의 IL-1β(좌측 패널) 및 TNFα(우측 패널)의 생산. (b) C1Q의 증가된 용량으로 처치된 THP1 세포에서의 카스파제-1 분할 산물의 웨스턴 블롯. (c) YFP-ASC를 안정적으로 발현하는 불멸화된 BL6 BMDM들의 생세포 영상. 세포는 LPS(상부 패널) 또는 CEP-HSA로 3시간 동안 프라이밍한 후 10 ㎍ ㎖-/- C1Q (우측 패널)로 추가로 2시간 동안 처치하였다. ASC-YFP의 올리고머화는 반점 형성에 의해, 원래의 배율 x 60으로 관찰되었다. (d) LPS(3시간)로 프라이밍되고 C1Q(16시간)로 증가된 용량(2.5, 5 및 10 ㎍ ㎖-/- C1Q)에서 활성화된 WT 및 Nlrp3-/- BMDC들에서의 IL-1β(좌측 패널) 및 TNF-α(우측 패널) 생산. (e) 100ng ㎖-/- LPS로 하룻밤 프라이밍되고 5㎍ ㎖-/- C1Q로 6시간 동안 활성화되되, 증가된 용량(10배)의 ZVAD(카스파제-1 저해제)가 C1Q 처치 1시간 전에 부가된 인간 PBMC에서의 IL-1β IL-18 및 IL-6 생산. 모든 ELISA 데이터는 세 벌로 수행된 최소 3가지 별개의 실험을 나타낸다.
도 4: 분할된 카스파제-1 p10은 CEP-MSA 면역화된 마우스들에서 활성화된 대식세포와 공편재화(co-localize)된다: (a-c) CEP-MSA 면역화된 마우스들의 망막 동결절편의 면역염색은 F4/80 양성 대식세포(a)를 부르크 막을 향해서 맥락막으로부터 연장되어 있는 맥락막의 영역(b)으로 편재화하고, (c) 망막의 외부 세그먼트(outer segment: OS) 및 외부 핵층(outer nuclear layer: ONL)에서 RPE 위쪽을 보여준다. (a,b) 상부 패널 (c) 좌측패널, 차등 간섭 대비(differential interference contrast: DIC) 화상, (a,b) 하부 패널 (c) 우측 패널, 형광 화상(F4/80-적색, DAPI-청색). (d,e) 카스파제-1 p10(적색) 및 F4/80(녹색)을 이용한 CEP-MSA 면역화된 마우스들의 망막 동결절편의 공표지화(Co-labelling)는 (d) 맥락막/부르크 막 내 및 이를 초월하여 존재하는 대식세포 및 (e) 망막의 OS 내에서의 대식세포 돌출부에서의 공편재화를 나타낸다. (f) CEP-MSA 면역화된 마우스들의 망막 동결절편의 공표지화는 NLRP3(적색) 및 F4/80(녹색)의 공편재화를 나타낸다. (g) NLRP3 및 F4/80 염색의 고배율.
도 5: NLRP3은 IL-1β 독립적인 방식에서 레이저-유도 CNV 병변 형성에 대해 보호성이다: (a) WT(좌측 상부 패널), Nlrp3 -/-(상부 중간 패널) 및 Il1r1 -/-(우측 상부 패널) 마우스들에서의 레이저 유도 CNV는 레이저 화상 후 6일에 CNV 발병을 보인다. WT(좌측 하부 패널), Nlrp3 -/-(하부 중간 패널) 및 Il1r1 -/-(우측 하부 패널)로부터의 공초점 Z-스택의 3-D 재구성된 화상. CNV 부피 렌더링(막대 그래프). (b) Nlrp3 -/- 및 Il1r1 -/- 마우스들의 간상 및 원추 기능(rod and cone function)의 망막전기측정(Electroretinographic: ERG) 분석. (c) 면역염색은 Nlrp3 -/- 마우스들에서 레이저 유도 손상의 부위에 활성화된 대식세포(F4/80-녹색)의 편재화를 나타낸다. (d) 분할된 카스파제-1(적색)에 대해서 손상 후 3시간에 WT(좌측 패널) 또는 Nlrp3 -/-(우측 패널) 망막 동결절편의 면역염색.
도 6: NLRP3은 IL-18 생산에서의 그의 역할을 통해서 CNV 병변 형성에 대한 그의 보호를 부여하고, 이어서 VEGF 수준을 조절한다: (a) Il18 -/- 마우스의 간상 및 원추 기능의 망막전기측정(ERG) 분석. (b) Il18 -/- 마우스들의 레이저 유도 CNV는 레이저 화상 후 6일에 CNV 발병을 보인다(좌측 패널). 공초점 Z-스택의 3-D 재구성된 화상(우측 패널). CNV 부피 렌더링(막대 그래프). (c) CNV 부피는 WT 마우스들(도 5)에 비해서 유의하게 증가하였다(*P = 0.0292). VEGF의 생산은 24시간 동안 증가된 용량의 IL-18로 처치하거나 또는 미처치 상태인 채인 (d) ARPE-19 세포 및 (e) 마우스 뇌 미세혈관 내피 세포(B.end3)에서 ELISA에 의해 평가되었다. ELISA 데이터는 세 벌로 수행된 최소 3가지 별개의 실험을 나타낸다.
도 7: (a) BCA 검정에 의해 결정되는 바와 같이 동일량의 단백질이 장입된, ARPE-19 세포(좌측) 및 THP1 세포(우측)에서의 NLRP3 발현의 웨스턴 블롯. (b) ARPE-19 세포는 각종 TLR 리간드; 100 ng/㎖ LPS, 또는 2 ㎍/㎖ Pam3Cys 또는 25 ㎍/㎖ 폴리(I:C), 또는 1 ㎍/㎖ R848, 또는 5 ㎍/㎖ CpG-ODN로 프라이밍되고, 미처치된 채로 있거나 또는 추가 시간 동안 ATP로 활성화되었다. IL-1β 생산이 이어서 측정되었다.
도 8: a) RPE 수프는 드루젠의 단리 후 생산된 망막/RPE 물질을 함유하는 것에 대해서 광 현미경 하에 관찰되었다. b) 이 물질(100 ng/㎖, 250 ng/㎖ 및 500 ng/㎖)이 LPS 프라이밍된 PBMC들에 첨가되었지만 IL-1β 수준 또는 c) IL-18 수준의 증가를 초래하지 못했다. d) IL-6 발현은 증가된 용량의 RPE 수프에 의해 변화되지 않았다. e) RPE 수프는 WT 또는 Nlrp3 -/- 마우스 BMDC들에서 IL-1β 수준의 어떠한 변화도 이끌어내지 못했다. f) 실험군들 간에 IL-6 발현의 차동 변화는 없었다.
도 9: 드루젠에 의한 THP1 세포의 처치 후의 카스파제-1 P10 웨스턴 블롯의 농도 분석.
도 10: a) IL-1β 수준은 LPS 프라이밍된 WT 및 ATP에 의해 활성화된 Tlr2 -/- BMDM들에서 유의하게 증가하였고, b) IL-6 수준은 유의하게 상이하지 않았다.
도 11: 증가된 용량의 C1Q에 의한 THP1 세포의 처치 후의 카스파제-1 P10 웨스턴 블롯의 농도 분석.
도 12: 용액 중 C1Q의 제타 전위 측정치는 11.8 mV의 제타 평균을 나타낸다.
도 13: 100 ng/㎖ LPS로 하룻밤 프라이밍되고, 5 ㎍/㎖ C1Q로 6시간 동안 활성화되되, 증가된 용량(10배)의 (a) DPI(ROS 저해제), (b) 발필로마이신(Bafilomycin)(라이소솜 산성화를 저해함), (c) CA-074 Me(카텝신 B 저해제)가 C1Q 처치 1시간 전에 부가된 인간 PBMC 중에서의 IL-1β, IL-18 및 IL-6 생산.
도 14: 망막의 외부 세그먼트(OS) 및 공막 내의 양성 세포를 나타낸, CEP-MSA 면역화된 마우스 망막에서의 CD68 염색(적색).
도 15: CEP-MSA 면역화된 마우스 망막 동결절편은 NLRP3에 대해서 염색되었고, 양성 면역재활성은 (a) 망막의 외부 세그먼트, (b) 망막 색소 상피(RPE), (c) 공막 내 세포 및 (d) 맥락막 내 세포에서 관찰되었다.
도 16: F4/80(좌측 패널, 적색) 및 카스파제-1 p10(중앙 패널, 녹색)은 WT 마우스들(우측 패널) 내 레이저 유도 CNV의 부위에 공편재화되었다
도 17: IL-18은 손상 24시간 후 WT 마우스들에서 레이저 유도 손상의 부위에서 관찰되었다(좌측 패널-적색 염색). 이 염색은 Nlrp3 -/- 마우스들에서의 손상 부위에서 명백하지 않았다(우측 패널-적색 염색).
도 18(a) 레이저 유도 후 CNV 주입된 IL-18(1㎍) 중화 항체는 에피플루오레슨트 현미경에 의해 측정된 바와 같이 WT 마우스들에서 유의하게 증가하였다, (b) CNV의 공초점, Z-스택 3-D 렌더링된 화상. (c) 유의하게 증가된 CNV는 모의 주입된 마우스에 비해서 레이저 손상 후 1㎍ IL-18 중화 항체가 주입된 WT 마우스들에서 관찰되었다(*P = 0.0368).
도 19 CD11c 및 CD11b에 대해서 염색된 (a) BMDC들 및 (b) BMDM들의 유동 세포계수분석.
도 20 (a) RPE는 광수용기의 외부 세그먼트에 인접하게 놓여있다. (b) 532㎚ 레이저에 의한 망막/RPE/브루크 막/맥락막 복합체의 표적화된 열 파괴는 50㎛ 직경 손상, 그린포니아 심플리시폴리아 아이소렉틴-알렉사-568(Griffonia simplicifolia isolectin-Alexa-568)(적색) 및 팔로이딘-알렉사-488(Phalloidin-Alexa-488)(녹색)을 초래하였다.
실시예
재료 및 방법
드루젠 단리
드루젠 및 소량의 브루크 막을 이들 실험에 이용하기 위하여 6명의 AMD 공여자 눈(88M, 91F, 97M, 85F, 85M 및 80M)으로부터 앞서 기재된 바와 같이(8) 단리하였다.
CEP-알부민 생산
인간 혈청 알부민(시그마 알드리치사(Sigma Aldrich), 미국)에는 앞서 기재된 바와 같이(54) CEP를 부가시켰다.
ELISA 분석
ELISA는 이 연구를 통해서 이용되는 각종 실험군으로부터 상청액 중 사이토카인을 정량하는데 이용하였다. IL-1β(알앤디 시스템즈사(Sigma Aldrich)), IL-18(MBL 인터내셔널사(MBL International)), IL-6(알앤디 시스템즈사), TNF-α(알앤디 시스템즈사) 및 VEGF(알앤디 시스템즈사)는 전체를 통해서 분석되었다. 모든 ELISA는 세 벌로 최소 3회 수행하였다. 이 연구 동안 이용된 저해제는 인플라마좀 활성화 1시간 전에 이하의 최고 농도에서 첨가되었다: 1 ㎍/㎖의 카스파제-1 저해제 VI(칼바이오켐사(Calbiochem)), 5μM 사이토칼라신(cytochalasin) D(시그마 알드리치사, 아일랜드), 10μM CA-074 Me(카텝신 B 저해제)(시그마 알드리치사, 아일랜드), 10μM DPI(시그마 알드리치사, 아일랜드).
웨스턴 블롯 분석
일반적으로, 카스파제-1(산타-크루즈 바이오테크사(Santa-Cruz Biotech)), 베타-액틴(아브캄사(Abcam)), NLRP3(시그마 알드리치사, 아일랜드), TLR-4(산타-크루즈 바이오테크사)에 대해 특이적인 항체들을 4℃에서 하룻밤 막 상에서 인큐베이팅시켰다. 막을 TBS로 세척하고, 서양고추냉이-퍼옥시다제(Horse-Radish-Peroxidase: HRP) 컨쥬게이트를 구비한 래비트(IgG)(1:2500)(시그마 알드리치사, 아일랜드), 또는 마우스(IgG)(1:1000)(시그마 알드리치사, 아일랜드)에 대항하여 2차 항체로 3시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 면역 복합체는 증강된 화학발광(enhanced chemiluminescence: ECL)을 이용해서 검출하였다. 모든 웨스턴 블롯은 최소 3회 반복하였다.
세포 배양
ARPE-19 세포주(ATCC CRL 2302)는 LGC 프로켐사(LGC promochem)로부터 얻었고, THP1 세포 및 1차 단리된 인간 말초 혈액 단핵 단구(peripheral blood mononuclear monocyte: PBMC)들은 시험관내 인플라마좀 활성화 검정을 위하여 이용하였다. 세포들은 둘베코의 변성 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM)와, 10% 우태아 혈청(foetal calf serum: FCS)과 함께 1.2g/ℓ 중탄산나트륨, 2.5mM L-글루타민, 15mM HEPES, 0.5mM 피루브산나트륨(시그마 알드리치사)을 지니는 햄스 F12 배지(Ham's F12 medium)의 1:1 혼합물 중에서 37℃, 5% CO2, 95% 공기에서 배양하였다. BMDC들 및 BMDM들은 또한 유사유전자형 C57/Bl6 백그라운드 상의WT, NLRP3-/-, TLR-2-/-, C3H/HeN 및 C3H/HeJ 마우스들로부터 단리되었다. BMDC들 및 BMDM들은 항-CD11c-APC 및 항-CD11b-PeCy7로 염색하였다. 세포들은 단일 생세포 상에 게이팅하고, CD11c 및 CD11b의 발현은 유동 세포계수에 의해 평가하였다(도 19). 마우스 bEnd.3 미세혈관 내피 세포들은 글루타맥스(Glutamax) 및 10% FCS를 함유하는 DMEM 중 파이브로넥틴(시그마 알드리치사, 아일랜드) 코팅된 조직 배양 플라스크 상에서 성장시켰다.
ASC 반점 형성 분석.
황색 형광(YFP) 단백질 표지된 ASC를 발현하는 불멸화된 BMDM(본 대학의 에이케 라츠(Eicke Latz) 박사로부터의 기증품)은 LPS, HSA 또는 CEP-HSA로 프라이밍된 후, 3 또는 6시간 동안 각각 드루젠 또는 C1Q으로 활성화되었다. 반점 형성의 생세포 영상화는 온도 및 CO2-조절된 공초점 레이저 주사 현미경(Olympus FluoView TM FV1000)을 이용해서 수행되었다.
CEP-MSA 면역화
본 발명자들은 표준 마우스 면역하 프로토콜(55)을 이용하였다. 본 발명자들은 PBS 중 케타민-질라진(80 내지 90 ㎎/㎏ 케타민, 2 내지 10 ㎎/㎖ 질라진)으로 마우스를 마취시켰다. 본 발명자들은 앞서 기재된 바와 같이(18) 초기 및 모든 추가 용량에 대해서 CFA 또는 IFA(디프코 랩스사(Difco Labs)) 중 CEP-MSA 200㎍을 사용하였다.
맥락막 혈관신생(CNV)의 쥣과 모델
국제시력안과연구협회(Association for Research in Vision and Ophthalmology: ARVO) 표준 및 모든 관련된 국가 및 기관 승인에 충실한 이 연구 과장 동안 행해진 모든 동물 실험은 이 연구의 개시 전에 얻어졌다. 혈관상이 망막 내에 증식되어 신생혈관성 AMD를 모방하고 있는 CNV를, 앞서 기재된 바와 같은(21) 현미경 전달 시스템을 내장하고 있는 녹색 532㎚ 이리덱스 아이리스 레이저(Iridex Iris laser)(532㎚, 140mW, 100 mSec, 50㎛ 스팟 크기, 3 스팟/눈)를 이용해서 마우스들에 유도시켰다. 이 수법은 Nlrp3-/-, Il1r1-/-, IL-18-/- 및 WT 마우스들에서 CNV를 유도하는데 이용되었으며, 각 실험적 검정에 있어서 동물들은 성(gender) 일치되어 있었다. 이와 동시에, 본 발명자들은 또한 IL18(아브캄사)에 대해서 지향된 중화 항체를 레이저 화상 후 유리체내에 직접 주입하였다. 마우스들은 실험 6일 후 희생시키고, 신경 망막을 제거하였다. 아이-컵(eye-cup)들은 이어서 4℃에서 하룻밤 그리포니아-심플리시폴리아-아이소렉틴-알렉사-568 분자(몰리큘라 프로브사)(1:300)를 인큐베이팅하고, CNV는 공초점 현미경에 의해 평가하였다(도 20a 및 도 20b).
망막 플랫마운트(flatmount) 및 망막 동결절편의 간접 면역염색
간접 면역염색은 AMD의 동물 모델에서 신경 망막에 존재하는 활성화된 대식세포 및 분할된 카스파제-1을 분석하는데 이용하였다. F4/80, 활성화된 대식세포용 CD68(아브캄사), 및 카스파제-1(P10)(산타 크루즈 바이오테크사(Santa Cruz Biotech)), NLRP3(산타 크루즈 바이오테크사 및 아브캄사) 및 IL18(아브캄사)에 대한 항체들은 공초점 레이저 주사 현미경(Olympus FluoView TM FV1000)과 함께 이용되었다.
통계학적 분석
통계학적 분석은, 2개의 개체 실험 군이 분석된 경우 0.05 이하의 P값을 나타내는 유의성과 함께, 스튜던트의 T-테스트를 이용해서 수행하였다. 다중 비교를 위하여, ELISA 분석의 경우에서와 같이, ANOVA는 터키-크래머(Tukey-Kramer) 포스트T-테스트 및 0.05 이하의 P값으로 표시되는 유의성과 함께 이용하였다.
결과
RPE는 외부 망막과 맥락막 사이에 위치된 입방 세포의 단층이다. 이 멜라닌화된 신경상피는 a) 산란 및 반사 광의 흡착, b) 외부 혈액-망막 장벽(oBRB)의 형성 및 c) 광수용기 외부 세그먼트의 무력해진 선단의 식세포작용에 의한 제거를 포함하는 다수의 기능을 갖는다(22). 드루젠의 프로테옴(proteomic) 및 면역조직화학 분석은 보체 캐스케이드에 내포된 모든 단백질, 아밀로이드 침착물에서 발견되는 단백질뿐만 아니라 스트레스에 반응하여 합성된 단백질인 다수의 결정체를 가상으로 확인한다(23, 24). 숙주-유래 입상물, 예컨대, 콜레스테롤 결정 및 아밀로이드 침착물(25, 26)이 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킬 수 있다는 최근의 발견을 고려해서, 본 발명자들은 드루젠이 또한 인플라마좀의 활성화를 개시시킬 수 있었는지를 결정하는 것에 관심을 가졌다.
드루젠은 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킨다
병들지 않은 눈의 안저촬영사진을 건식 혹은 습식 AMD를 가진 개체들의 것과 비교하였다(도 1a). 안저 화상 내의 점모양 광 침착물은 건식 및 습식 AMD 양쪽 모두에서 드루젠 축적을 나타내고, 망막하 CNV는 습식 AMD 사진에서 나타난다. 단리된 드루젠은 샘플을 소립상체 내로 해리시키기 위하여 초음파처리하였다(도 1b). 드루젠 샘플의 SDS-PAGE 분석은 60 kDa보다 큰 고분자량 단백질의 코호트를 나타내었다(도 1c). 인플라마좀은 다합체성 단백질 복합체이다. 카스파제-1은 프로-IL-1β 및 프로-IL-18을 그들의 숙성 형태로 분할시키기 위하여 인플라마좀 복합체에서 활성화된 시스테인 프로테아제이다. 카스파제-1의 활성화는 다합체성 복합체의 플랫폼을 생성하는 올리고머를 형성하는 단백질 ASC를 필요로 한다. 통상 ASC는 세포를 통해서 균일하게 분포되지만, 일단 활성화된 ASC는 "반점"으로서 알려진 단일 점으로 응집한다. 황색 형광 단백질 표지된-ASC(YFP-ASC)를 안정적으로 발현하는 BMDM들은 LPS로 프라이밍되고, 드루젠으로 처치되거나, 또는 폴리(dAdT)으로 형질감염되었다(양성 대조군). ASC-YFP는 LPS 단독으로 처치된 대식세포에서 포착하기 어렵다(도 1d, 좌측 패널), 그러나, 드루젠으로 활성화된 LPS 프라이밍된 대식세포에 있어서, 강렬한 단일 형광 반점의 형성은 명백하게 입증되며, 이는 ASC 올리고머화를 나타내는 것이다.
AMD와 관련된 염증성 반응은 국소 및 전신 성분 둘 모두를 지니는 것으로 여겨진다. 본 발명자들은 NLRP3의 존재에 대해서 그리고 TLR 리간드의 범위에 반응해서 IL-1β를 생산하는 그들의 능력에 대해서 초기에 ARPE-19 세포주를 테스트하고, ATP로 활성화하였다. 본 발명자들은 ARPE-19 세포가 NLRP3을 발현하는 한편, IL-1β의 수준이 검정 감도의 하한에 있는 것을 발견하였다(도 7). 말초 골수 세포들은 AMD에서 망막에 접근하는 그들의 능력으로 인해 IL-1β 및 IL-18의 주된 공급원이며, 본 발명자들은 이들 세포가 본 발명자들의 시스템에서 관심 대상인 주된 세포인 것으로 가설을 세웠다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)들은 매우 낮은 농도에서도 드루젠에 의한 활성화에 반응하여 IL-1β 및 IL-18을 생산하였다(도 1e 및 도 1f). 본 발명자들은 이들 실험에 대한 대조군으로서 AMD 눈으로부터 드루젠의 절개 동안 생산된 RPE 물질을 이용하였다(도 8). 드루젠에 의한 처치 후 THP-1 세포 용해물에서의 카스파제-1 발현의 면역블롯 분석은 증가된 수준의 분할된 카스파제-1 p10을 확인하였다(도 1g 및 도 9). 종합하면, 이들 결과는 AMD 공여자 눈으로부터의 드루젠이 카스파제-1 및 ASC 인플라마좀 복합체를 활성화시킬 수 있고, 이어서 PBMC들에서 IL-1β 및 IL-18 생산을 초래하는 것을 입증하고 있다.
본 발명자들은, NLRP3이 입상체 물질에 의해 인플라마좀 활성화가 요구되는 바와 같이 아마도 드루젠-유도 인플라마좀 활성화용의 센서였던 것을 추론하였다. 본 발명자들은 야생형(WT) 마우스와 NLRP3-결함(Nlrp3 -/-) 마우스 양쪽 모두로부터 골수를 단리시키고, 골수 유래 대식세포 및 수지상 세포(BMDM 및 BMDC)들을 배양하였다. WT BMDM들과 BMDC들 양쪽 모두는 드루젠에 반응하여 유의한 수준의 IL-1β를 생산하였고, 역으로 Nlrp3 -/- BMDM들 BMDC들(도 1h 및 도 1i, 좌측 패널)는 드루젠에 반응하여 숙성 IL-1β의 생산을 촉진시키는 것이 불가능하였다. IL-6 및 TNFα의 수준은 드루젠의 존재에 의해 변화되지 않았는 바, 이는 IL-1β 생산에 대한 특이적 효과를 나타내는 것이다(도 1h 및 도 1i 우측 패널). 이들 결과는 AMD 드루젠이 NLRP3 인플라마좀을 활성화할 수 있는 것을 입증한다.
CEP-부가된 인간 혈청 알부민은 NLRP3 인플라마좀을 프라이밍한다
드루젠에서 확인된 단백질의 65%까지는 AMD 및 정상 공여자의 양쪽 모두로부터 단리된 드루젠에서 발견되었다. 그러나, 산화성 단백질 변성은 또한, 카복시에틸 피롤 단백질 부가체를 포함하는, 드루젠에서 관찰되었다. 누적되는 산화 손상은 AMD의 병인에 기인한다(27, 28, 29). 카복시에틸 피롤(CEP) 부가체는 도코사헥사에노에이트(DHA)-함유 지질의 산화로부터 유일하게 생산되며, AMD 대상체들의 혈청 및 드루젠에 대해서 유의하게 더 풍부하다(19). 최근, 이들 CEP 중 카복시알킬피롤은, 내피 세포 상의 톨-유사 수용체 2(Toll-like receptor 2: TLR2)에 의해 인식되는 것으로 나타났다(30). TLR2 활성화가 프로-IL-1β, 프로-IL-18 및 NLRP3을 유도하기 위하여 세포를 프라이밍한 경우, 본 발명자들은 드루젠 내 및 브루크 막 상의 CEP 부가된 단백질이 신규한 프라이밍 제제를 제공할 수 있다는 가설을 세웠다.
이것을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 증가된 농도의 CEP-부가된 HSA 또는 HSA 단독으로 RBMC들을 프라이밍하고 ATP로 이 세포들을 활성화시켰다. IL-1β 수준은 CEP-HSA의 증가된 농도로 증가되었지만, HSA 단독으로 프라이밍된 세포에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다(도 1a). CEP-HSA로 프라이밍되고 ATP로 활성화된 WT BMDM들은 또한 IL-1β를 생산하였고, Nlrp3 -/- 마우스들에서 효과는 관찰되지 않았다(도 2b). CEP-HSA가 TLR2 활성화를 통해 세포를 프라이밍하는 지의 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 HSA 또는 CEP-HSA로 WT 및 TLR2 -/- BMDM을 프라이밍하고 ATP로 활성화되었다. ATP 활성화는 WT BMDM에서 IL-1β 증가를 유발하였지만, CEP-HSA로 프라이망된 TLR2 -/- BMDM에서는 그러하지 않았다. 또한, IL-1β 유도는 활성화 전에 HSA로 프라이밍된 BMDM에서 관찰되지 않았으며, 이것은 재차 TLR2를 활성화시키는 능력을 암시하는 CEP 변성인 것을 확인해준다(도 2c). IL-6 수준은 CEP-HSA 처리된 WT 세포들 간에 동등하였고, 이것은 IL-1β에 대한 반응의 특이성을 확인해준다(도 2d). IL-1β 수준은 LPS 프라이밍된 WT BMDM들에서 측정되었고, TLR2 -/- BMDM들을 확실하게 하기 위하여 ATP에 의해 활성화된 TLR2 - /- BMDM들은 최적으로 반응하고 있다(도 10). 본 발명자들의 CEP-HSA가 LPS 오염되지 않은 것을 확실하게 하기 위하여, 본 발명자들은 C3H/HeN 및 C3H/HeJ 마우스들로부터 BMDM들을 단리하였다. C3H/HeJ 마우스들은 그들의 Tlr4 유전자의 돌연변이를 보유하고, 이는 이들에게 LPS에 대한 비반응성을 부여한다(31). C3H/HeJ BMDM들은 LPS가 아니라 CEP-HSA로 프라이밍된 경우 ATP에 반응해서 IL-1β를 생산하였으며(도 2e), 이것은 본 발명자들의 CEP 부가체가 LPS-무함유이고 TLR2 결찰을 통해 인플라마좀을 프라이밍하는 것을 나타낸다. TNF-α는 CEP 프라이밍된 세포가 아니라 LPS 프라이밍된 WT C3H/HeN BMDM들에서 검출되었다(도 2f). 본 발명자들은 CEP-처치된 BMDM들에서 ASC-YFP 반점 형성을 측정함으로써 NLRP3 인플라마좀을 프라이밍하는 CEP의 능력을 추가로 조사하였다. 포커스된 ASC-YFP 반점은 CEP-HSA로 프라이밍되고 드루젠으로 활성화된 BMDM들에서 관찰되었다(도 2g, 상부 패널). 드루젠 단독은 ASC의 올리고머화를 유발할 수 있는 것으로 나타났으며(도 2g, 하부 패널), 이는, 그 단독인 드루젠이 인플라마좀 활성화에 대한 다수-단백질 플랫폼의 형성을 개시할 수 있는 것을 의미한다. 그러나, 본 발명자들은, PBMC들 또는 BMDM/BMDC들이 드루젠 단독으로 처치되고 ELISA에 의해 평가된 경우 IL-1β 증가를 일관되게 검출하는 것은 불가능하였다.
드루젠 성분 보체 인자 C1Q는 인플라마좀을 활성화시킨다
드루젠은 변형되어 궁극적으로 GA에서처럼 막망을 손상시킬 수 있지만(29), 모든 사람들이 드루젠 발달 시력 손상을 제시하지는 않으므로, RPE에 기계적 상해를 일으키는, 드루젠의 입상체 속성에 부가해서, 드루젠의 일부 성분(들)이 더욱 구체적인 방식으로 인플라마좀의 활성화에 연루될 수 있는 것으로 상정가능하다. 본 발명자들은 드루젠에서 확인된 고전적인 보체 경로의 주된 초기화 성분인 C1Q를 연구하도록 제기하였다(32). C1Q는 숙주 조직에 극히 손상을 입힐 가능성이 있는 선천적인 면역 체계의 효과기이므로, 드루젠에서의 그의 존재는 조기 혹은 진행 중인 염증성 상해를 나타낸다. 본 발명자들은 NLRP3 인플라마좀을 활성화하는 C1Q의 능력을 직접 평가하였다. BMDM들에 대한 C1Q 단독의 부가는 IL-1β의 생산을 초래하지 않았지만, C1Q의 부가 전에 CEP-HSA로 프라이밍된 세포는 유의한 수준의 IL-1β를 생산하였다(도 3a, 좌측 패널). 염증전 사이토카인 TNFα의 분비는 CEP-HSA 프라이밍된 BMDM들에 C1Q의 부가 시 변하지 않은 채였으며(도 3a, 우측 패널), 이것은, C1Q가 인플라마좀을 특이적으로 활성화시키고 있고, 일반적으로 염증전 사이토카인의 상향 조절에 연루되지 않는 것을 나타낸다. 본 발명자들은, C1Q로 활성화된 THP1 인간 단구성 세포에서 분할된 카스파제-1 p10을 관찰하였으며(도 3b, 도 11), YFP-ASC 반점은 LPS(도 3c, 우측 상부 패널) 또는 CEP(도 3c, 우측 하부 패널)로 프라이밍된 후 C1Q에 의해 활성화된 세포 내에서 집중된 초점에서 볼 수 있었으므로 C1Q가 ASC 올리고머화를 초래할 수 있었던 것을 더욱 확립하였다.
C1Q로 처치된 WT BMDC들은 유의한 수준의 IL-1β를 생산하였지만, 그러나 Nlrp3 -/- BMDM들은 C1Q 활성화에 반응해서 IL-1β를 생산하는데 실패하였고(도 3d, 좌측), TNFα의 수준은 변하지 않은 채였다(도 3d, 우측). 카스파제-1의 역할을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 C1Q 활성화 전에 카스파제-1 저해제인 ZVAD를 인간 PBMC에게 부가하였다. 카스파제-1 저해는 용량 의존적 방식으로 IL-1β 및 IL-18 생산의 양쪽 모두를 저감시켰다(도 3e). 종합하면, 이들 결과는 C1Q가 NLRP3 인플라마좀에 의해 감지된 위험 신호로서 작용할 수 있는 것을 나타낸다. 인간 혈액으로부터 단리된 C1Q와 드루젠에서 발견되는 C1Q는 모두 응집하는 성향을 지니고, 본 발명자들은 이것이 C1Q의 용액의 제타-전위 분석을 수반하는 것을 나타내었고, 본 발명자들은 C1Q가 어떻게 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킬 수 있는지에 있어서 이것이 주된 인자인 것으로 여기고 있다(도 12).
C1Q 인플라마좀 활성화는 포식리소좀과 연루된다
기타 보체 인자와 함께 C1Q의 침작물은 아밀로이드 구조와 관련되거나 이 구조의 성분인 것으로 밝혀졌다(33, 34). 따라서, 드루젠의 성분으로서의 C1Q이 그의 응집을 초래하여, 이들 입상 침착물을 식균하도록 시도함에 따라서 대식세포를 원조할 공산이 있다. NLRP3 인플라마좀 활성화로 이어지는 기전은 여전히 논란의 대상이며, 이는 자극제에 좌우될 수 있다. 하나의 기전은 라이소좀 함유물의 라이소좀 파열 및 해리로 이어지는 입상체 구조의 식세포 작용을 내포한다(35). 다른 제안된 기전은 ROS-감작성 TXNIP 단백질을 통한 NLRP3 인플라마좀의 활성화로 이어지는 반응성 산소종(reactive oxygen species: ROS)의 생산을 내포한다(36). ROS의 C1Q 유도(37, 38)가 인플라마좀 활성화를 담당하는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 C1Q 활성화 전에 NADPH 옥사다제 저해제 DPI로 PBMC를 처치하였다. DPI에 의한 ROS의 저해는 C1Q 유도 IL-1β 방출에 영향을 갖지 않았다(도 13a). 제안된 대안적인 기전은, 라이소좀 불안정성이 라이소솜-엑소펩티다제인 카텝신 B의 사이토졸로의 누설을 초래하며, 이는 그의 조립으로 이어지는 인플라마좀의 성분들에 의해 감지된다(35). C1Q에 의한 인플라마좀의 활성화에서 포식리소좀의 역할을 결정하기 위해서는, 라이소솜 산성화에 필요한 액포 H+ ATP아제 시스템을 차단하는 저해제인 발필로마이신 A, 및 카텝신 B 저해제 CA-074 Me를 이용하였다. 액포 H+ ATP아제 또는 카텝신 B의 저해는 IL-1β 및 IL-18의 C1Q 활성하된 생산을 제한하였으며, IL-6 생산에 대한 효과는 없었다(도 13b 및 도 13c). 이것은, C1Q가 NLRP3 활성화를 촉발시키는 포식용해소체(phagolysosomal) 프로세스를 변화시키는 것을 직접 의미한다.
NLRP3 인플라마좀은 CEP-MSA 면역화된 마우스들에서 활성이다
본 발명자들은 건식 AMD의 잘 특성 규명된 모델인 CEP-MSA 면역화된 마우스 모델의 병리에 연루되었는지의 여부를 결정하기 위하여 탐색하였다. 이 동물은 그의 망막 및 RPE에서 AMD-유사-병변을 전개시키고 나서 CEP-MSA로 면역화시켰다. 본 발명자들은, 활성화된 대식세포(F4/80 및 CD68 염색), 카스파제-1 p10 및 NLRP3의 존재에 대해서, CEP-MSA 면역화된 마우스들의 망막 절편을 분석하였다. 활성화된 대식세포는 맥락막 및 부르크 막 내에 존재하는 것으로 관찰되었다(도 4a, 도 4b, 도 14), 본 발명자들은 또한 망막의 외부 세그먼트에서 RPE 위쪽에서 대식세포를 침식하는 것을 관찰하였다(도 4c). 이들 절편의 염색은 분할된 카스파제-1 p10(도 4d, 도 4e) 및 NLRP3(도 4f, 도 4g, 도 15)에 의한 F4/80의 공편재화를 나타내었다.
NLRP3은 악화된 레이저-유도 CNV 발병에 대해 보호한다
습식(삼출성) AMD에 대해서 많이 이용되는 모델은 레이저 유도 CNV이며, 이것은 또한 아마도 조직 내 괴저성 미세환경의 유도로 인한 무균 염증(39)에 대한 이상적인 모델이다. 괴저 세포는 NLRP3 인플라마좀을 통한 멸균 염증 반응을 촉발시키는 것으로 알려져 있다(17). 본 발명자들은 NLRP3 인플라마좀이 편재화된 조직 손상에 반응하여 CNV 발병에서 주된 역할을 할 수 있다는 가설을 세웠다. 본 발명자들의 가설을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 WT, Nlrp3 -/- 및 Il1r1 -/- 마우스들의 망막에 초점 레이저 화상을 부여하고 CNV 부피를 평가하였다. 경이롭게도, 본 발명자들은, WT 및 Il1r1 -/- 마우스들과 비교할 때 Nlrp3 -/- 마우스들에서 유의하게 더 많은 CNV 발병 및 망막하 출혈을 발견하였다(도 5a). CNV의 3D Z-스택 공초점 부피 렌더링은 손상 후 6일에 Nlrp3 -/- 마우스들에서 CNV 부피의 유의한 증가를 확인하였다(도 5d, 히스토그램). 망막전기측정(ERG) 분석은 녹아웃된 마우스들이 손상 전 기능적인 간상 및 원추 반응을 지니는 것을 확인하였다(도 5b). 본 발명자들은 Nlrp3 -/- 마우스들에서 병변 부위에서 활성화된 대식세포 침윤(양성 F4/80 면역재활성)을 관찰하였다(도 5c), 그러나, 분할된 카스파제-1 및 IL-18은 WT 마우스들의 손상 부위에서 단지 명백하였고, Nlrp3 -/- 마우스들에서 현저하게 존재하지 않았다(도 5d, 도 16, 17). 이들 지견은 CNV의 이 동물 모델에서 관찰된 멸균 염증 반응에서 NLRP3 인플라마좀에 대한 역할을 기술하고 CNV 발병의 조절제로서 IL-18을 암시한다.
NLRP3은 IL-18을 통한 CNV 병변 형성에 대한 보호를 부여한다
악화된 CNV 발병에 대한 NLRP3-매개 보호에 있어서 IL-18에 대한 역할을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 IL18 -/- 마우스들에서 레이저 유도 CNV를 투여하였다. 이들 마우스는 ERG 분석에 의해 평가된 바와 같은 정상 망막 기능을 지니는 것으로 관찰되었다(도 6a). 손상 후 6일에 IL18 -/- 마우스들에서의 부르크 막의 레이저 유도 파괴 및 CNV 부피 정량화는 WT CNV(도 6c)에 비해서, 현저하게 증가된 병변(도 6b)을 보였다. 레이저 유도 CNV에 이은 유리체강내 주입된 IL-18 중화 항체가 또한 유의하게 증가된 CNV 발병을 유발하였다(도 18).
본 발명자들은 IL-18이 VEGF 합성의 조절을 통해 그의 보호를 부여하는 것을 추론하였다. 이 가설을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 재조합 IL-18로 ARPE19 세포 및 마우스 뇌 미세혈관 내피 세포주(bEnd.3)를 처치하고, 이어서 성장 배지에서 VEGF 수준을 분석하였다. IL-18은 ARPE-19 세포 및 bEnd.3 세포 양쪽 모두에 의해 분비된 VEGF의 수준을 유의하게 감소시켰다(도 6d, 도 6e). 이들 지견은 VEGF 발현의 조절에서 IL-18에 대한 역할이 직접 연루되었음을 시사하고, 아마도 Nlrp3 -/- 및 IL18 -/- 마우스들에서 악화된 CNV를 설명할 공산이 있다.
결론
본 발명자들의 연구는, AMD 공여자 눈으로부터 단리된 드루젠이 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킬 수 있는 것을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자들은, 데코레이팅(decorating) 드루젠 단백질에서 통상 발견되는 산화적 스트레스 관련 단백질 변성인 카복시에틸-피롤(CEP)이 인플라마좀을 프라이밍할 수 있는 것을 나타낸다. 이와 동시에, 본 발명자들은, 보체 성분 C1Q이 카스파제-1 및 포식리소좀 의존적 방식에서 NLRP3 인플라마좀을 활성화할 수 있는 것을 제시하고 있다. 본 발명자들은, 건식 AMD의 허용된 모델인, CEP-MSA 면역화 마우스들과 관련된 드루젠-유사-병변을 둘러싸고 있는 대식세포에서 활성화된 카스파제-1 및 NLRP3을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 습식 AMD의 통상적으로 이용되는 동물 모델이 NLRP3 활성화에 의존적이지만, NLRP3의 부재시 예기치 않게, CNV 발병이 악화된 것을 발견하였다. 본 발명자들은, 병적 혈관신생의 주된 조절자로서 IL-18을 시사하고, AMD의 발병에서 NLRP3 인플라마좀에 대한 보호 역할을 제안하고 있다.
본 발명자들의 관찰은, AMD의 예방에 관하여 주된 함축성을 지닌다. 현재의 항체-기반 요법은 VEGF의 생활성을 저해시킴으로써 AMD의 진행된 형태를 표적화한다. 그러나, 이들 모노클로날 항체(루센티스(Lucentis)(등록상표) 및 아바스틴(Avastin)(등록상표))의 직접적이고도 규칙적인 안구내 주사는 망막 박리, 출혈 및 감염의 위험을 수반한다.
본 발명자들은 AMD 공여자 눈으로부터 단리된 드루젠이 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킬 수 있다는 것을 나타내었다. AMD 드루젠은 단백질 침착물의 수집물로 구성되며, 이들의 다수는 CEP에 부가되어 있다. 정상의 공여자 눈으로부터의 드루젠은, 그의 입상체 속성으로 인해, 또한 인플라마좀 활성화를 유발할 수 있지만, 정의에 의한 망막에서의 그의 수준은 AMD 드루젠보다 낮으며, 생화학적 조성이 상이하다. 이들 차이는 아마도 AMD의 진행에 중요할 것이다. 그러나, 인플라마좀 활성화와 관련하여 대조군 및 AMD 드루젠의 비교는, 아직 완전히 해명되어 있지 않다.
본 발명자들은, CEP-HSA가 TLR2 활성화를 통해 인플라마좀을 프라이밍하여, AMD 눈 내에 높은 수준으로 초점에 축적되는 천연 발생적 프라이밍 제제를 제공할 수 있다는 것을 입증하였다. NLRP3의 경우에, 위험 신호는 사실상 통상적으로 입상체이고 세포밖에 있다. 드루젠의 성분인 C1Q는 아밀로이드 유사 방식으로 응집되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은, 혈액으로부터 단리된 C1Q가 라이소솜 산성화 및 카텝신 B에 의존하는 방식으로 NLRP3 인플라마좀을 활성화하는 것을 나타낸다.
AMD에서 일어나는 멸균성 염증 반응은 과도한 드루젠 축적에 부수적으로 인접한 RPE 세포에서 일어나는 초점 괴사의 결과인 듯하다. 부르크 막 내의 드루젠 축적은 초기 AMD 발병의 홀마크 특성 및 진단 표시자이며, 질환의 병인에 중심이 되는 것으로 여겨진다. 본 발명자들은 CEP-MSA 면역화된 마우스들에서 AMD-유사-병변과 연관된 대식세포에서 인플라마좀 활성화를 관찰하였지만, 본 발명자들의 관찰은, AMD의 삼출성 형태인 CNV으로의 진행에서 염증 과정에 대한 보호 역할을 처음으로 직접 나타낸 것으로, 이는 질환 예방에서 염증 과정의 억제를 지향하는 현재의 도그마에 직접 반하는 것이다. 실제로, 소정 수준의 염증인 "파라-염증"(para-inflammation)은 숙주에 대해서 유익할 수 있는 것이 현재 용인되고 있다. 임상적 관점으로부터, 염증 과정은 오랜 동안 AMD 병인 및 질환 발병과 관련되어 왔지만, 본 발명자들은 습식 AMD의 경우에 망막에서 염증의 전반적인 저해가 사운드 요법이 아닌 것을 제안하고 있다. 본 발명자들의 관찰에 대해 강점을 부여함으로써, 습식 AMD를 지닌 개체에서의 인플릭시맙(레미케이드(Remicade)(등록상표))의 최근의 임상 시험 결과는 이들 대상체의 50% 이상에서, 증상이 크게 악화된 것을 나타내었다.
NLRP3 인플라마좀은 또한 최근에 마우스들에서의 실험적인 결장염 및 결장암에 대항하여 IL-18 생산을 통한 보호를 부여하는 것으로 밝혀졌다.
이전의 연구는 IL-18이 망막 혈관 발달에서 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다. IL-18 -/- 마우스들은 혈관확장 및 혈관 누설을 보였고, VEGF 및 bFGF 수준은 또한 IL-18 -/- 마우스 망막에서 상향 조절되었다. IL-18에 대한 항혈관형성 역할은 또한 허혈후 손상에서 그리고 종양 혈관형성의 저해에서 관찰되었다.
드루젠에 의한 NLRP3 인플라마좀의 활성화는 밸런스가 존재할 수 있고, 이에 따라서, 드루젠의 소정의 초점 수준은 IL-18을 유도하고 이어서 항혈관형성 효과기로서 작용할 수 있는 그의 능력으로 인해 용인되고, 염증성 미세 환경에서 맥락막 항상성을 유지하는 것을 시사한다. 임계 수준의 드루젠이 축적되면, 그의 보호 역할은 주변 조직에 대한 과잉의 손상에 의해 무효화된다. 중요하게는, 본 발명자들은 드루젠-유발성 염증 매개체가 CNV 발병에 대해서 보호성이고, 이것은 VEGF의 다운스트림 생산을 방지하는 IL-18의 얻어지는 NLRP3 매개 상승인 것을 입증하였다. 게다가, IL-18은, 염증의 더욱 통상적인 모델인 실험적인 포도막염의 발병에서 역할하지 않는 것으로 나타났고, 이 지견은 본 발명자들의 지견으로부터 유도되는 요법의 장래의 형태에 대한 직접적인 함축성을 지닌다. 전반적으로, 본 발명자들의 관찰은, NLRP3이 AMD의 주된 질환 병리에 대한 보호제로서 직접 관여하고, 또한, 눈에 IL-18를 전달하거나 생성하는 것을 목적으로 한 전략이 습식 AMD의 맥락에서 CNV의 진행을 예방함에 있어서 유익한 것으로 입증될 수 있는 것을 시사한다.
보조적 방법
임상 평가
AMD 대상체들 및 병들지 않은 개체들은 피험자 임상 동의에 따른 임상 안과의사에 의해 평가되었다. 최적 교정 시력은 스넬렌 시력표(Snellen Chart)를 이용해서 측정하였다. 근거리 시력은 표준 테스트 유형을 이용해서 평가하였다. 눈의 전안부(anterior segment)는 세극동 생체현미경(slit-lamp biomicroscopy)에 의해 조사하였다. 안압은 골드만 안압측정(Goldmann Tonometry)에 의해 측정하였다. 상세한 검안경 시험 및 컬러 안저 촬영은 트로피카마이드(Tropicamide)(1%)를 이용한 동공 확장 후 수행하였다. 건식 AMD는 AMD-관련 황반 변화(드루젠, RPE의 과색소침착, 저색소침착 또는 지리학상 위축)로 인한 시지각적 효과(visual distortion)의 존재에 의해 진단하였다. 습식 AMD는 CNV를 예시하는 플루오레세인 혈관촬영 사진에 의해 보충된 임상 조사에 의해 진단되었다.
마우스들의 ERG 분석
마우스들은 하룻밤 암순응(dark-adapted)시키고, 희미한 적색 광 하에 망막전위도검사를 위하여 준비시켰다. 동공 확장은 1% 사이클로펜탈레이트 및 2.5% 페닐에프린의 점적에 의해 수행하였다. 동물들은 케타민(2.08㎎/15g 체중) 및 질라진(0.21㎎/15g 체중)의 복강내(I.P.) 주사에 의해 마취시켰다. 균일한 망막 조명을 확보하기 위하여, 광의 표준화 플래쉬를 간츠펠트 볼(Ganzfeld bowl) 내에서 마우스에게 제공하였다. ERG 반응은 각막 수화를 유지하기 위하여 도전성 제제로서 비디식(Vidisic)(닥터 만 파마(Dr Mann Pharma), 독일)을 이용해서 금선 전극(gold wire electrode)(롤란드 컨설팅 게엠베하(Roland Consulting Gmbh))에 의해 양안으로부터 동시에 기록하였다. 참조 전극과 접지 전극은 각각 눈의 외부 코너로부터 대략 1㎜ 및 꼬리에 대해서 앞쪽에 피하 위치시켰다. 체온은 직장 온도 프로브에 의해 제어된 가열 장치를 이용해서 37℃에서 유지하였다. 반응은 레티스캔 레티포트 일렉트로피지올로지 유닛(RetiScan RetiPort electrophysiology unit)(롤란드 컨설팅 게엠베하)을 이용해서 분석하였다. 프로토콜은 인간 망막전위도검사를 위한 국제 임상 표준 위원회에서 승인된 것에 기초하고 있다. 원추-단리 반응은 30 칸델라/m-2의 간상-억제 배경조명에 대항하여 제시된 3 칸델라/m-2/s 강도의 백색 플래쉬를 이용해서 기록되었으며, 미리 암순응된 동물을 자극 전 10분 동안 이 조명에 노출시켰다. 0.5 Hz 주파수에서 제공되는 48개의 개별의 플래쉬에 대한 반응은, 컴퓨터로 평균화되었다. 표준 규약에 따라, a-파는 기준선에서부터 a-파 골까지 측정되었고, b-파는 a-파 골에서 b-파 피크까지 측정되었다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 실시형태(들)로 제한되지 않지만 본 발명의 범위로부터 벗어나는 일 없이 수정 혹은 변형될 수 있다.
본 발명은 이하의 제1세트의 실시형태들에 의해 설명될 것이다.
1. 망막 변성 병태에 대항하여 보호성인 염증 매개체.
2. NLRP3-인플라마좀의 성분인 염증 매개체.
3. 염증전 인터류킨-18(IL-18)인 NLRP3 인플라마좀 성분
4. 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생(CNV)을 내포하는 망막 변성 병태의 치료에서 이용하기 위한 실시형태 2 내지 3 중 어느 하나에 따른 인플라마좀 성분.
5. 습식 및 건식 AMD를 포함하는, 연령-관련 황반 변성(AMD)인 것인 실시형태 4에 따른 인플라마좀 성분.
6.IL-18의 활성이 유지 및/또는 촉진되는 것인 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 따른 NLRP3-인플라마좀.
7. 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생(CNV)을 내포하는 망막 변성 병태의 치료를 위한 약제의 제조에서의 NLRP3 인플라마좀 유도 IL-18, 변이체 혹은 그의 일부의 용도로서, 상기 치료는 골수 또는 골수 유래 세포 혹은 조직에 및/또는 안구 세포 혹은 조직에 직접 NLRP3 인플라마좀 활성인자, 예컨대, IL-18의의 전달을 포함하는 것인 상기 용도.
8. IL-18의 바이러스-매개 전달을 포함하는 실시형태 7에 따른 용도.
9. IL-18의 활성을 유지 또는 촉진시키는 것을 포함하는 변성 망막병증의 진행의 지연을 위한 방법.
10. 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생 관련 질환을 내포하는 질환, 예컨대, 습식 또는 건식 AMD을 발병시킬 위험을 나타내는 바이오마커로서의, NLRP3-인플라마좀 유도 매개체, 바람직하게는 염증전 사이토카인 IL-18의 용도.
11. -인플라마좀 유도 매개체, 바람직하게는 염증전 사이토카인 IL-18을 바이오마커로서 이용해서, 대상체에서 질환인 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생 관련 질환, 예컨대, 습식 또는 건식 AMD의 발병의 위험 혹은 진행을 결정하는 방법으로서, 해당 방법은,
- 대상체에서 순환하는 IL-18 수준의 레벨을 획득하는 단계;
- 상기 IL-18 수준의 레벨을 기준치와 비교하는 단계를 포함하되, 질환인 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생의 발병의 위험이 있는 대상체 혹은 해당 질환의 진행은 상기 기준치와 비교한 상기 IL-18 수준의 레벨에 기초한다.
본 발명은 이제 이하의 제2세트의 실시형태들에 의해 설명될 것이다.
1. 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태의 치료에 있어서 이용하기 위한, NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 바람직하게는 성분 또는 기질.
2. 망막 병태가 연령-관련 황반 변성인 것인 실시형태 1에 따라 이용하기 위한 염증 매개체, 성분 또는 기질.
3. 연령-관련 황반 변성이 습식 연령-관련 황반 변성 또는 건식 연령-관련 황반 변성인 것인 실시형태 2에 따라 이용하기 위한 염증 매개체, 성분 또는 기질.
4. NLRP3-인플라마좀의 성분이 프로-인터류킨-18(프로 IL-18) 또는 인터류킨-18(IL-18)인 것인 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 따라 이용하기 위한 염증 매개체, 성분 또는 기질.
5. 프로-인터류킨-18(프로-IL-18) 또는 인터류킨-18(IL-18)이 혈관신생 질환 을 발병시킬 위험이 있는 대상체에서 또는 초기 단계의 혈관신생 질환에서 투여되는 것인 방법에 이용하기 위한 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 따라 이용하기 위한 염증 매개체, 성분 또는 기질.
6. 연령-관련 황반 변성을 발병시킬 위험이 있는 대상체에서 인터류킨-18(IL-18) 발현을 제어, 유지 혹은 촉진시키는데 있어서 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 따라 이용하기 위한 염증 매개체, 성분 또는 기질.
7. 습식 연령-관련 황반 변성(AMD)을 발병시킬 위험이 있는 환자에서 맥락막 혈관신생(CNV)을 제어하는 데 이용하기 위한 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 따라 이용하기 위한 프로-인터류킨-18(프로-Il-18).
8. 프로-인터류킨-18(프로-IL-18)이 망막에 전달되는 것인 실시형태 7에 따라 이용하기 위한 프로-인터류킨-18(프로-Il-18).
9. 프로-인터류킨-18(프로-IL-18)이 직접 주사에 의해 및/또는 바이러스 매개 전달에 의해 망막으로 전신으로 전달되는 것인 실시형태 8에 따라 이용하기 위한 프로-인터류킨-18(프로-Il-18).
10. 프로-인터류킨-18(프로-IL-18)이 아데노-연관 바이러스(AAV) 매개 전달에 의해 망막에 전달되는 것인 실시형태 8 또는 9에 따라 이용하기 위한 프로-인터류킨-18(프로-Il-18).
11. 유발성 프로-IL-18을 발현하는 아데노-연관 바이러스(AAV)가 망막에 전달되는 것인. 실시형태 10에 따라 이용하기 위한 프로-인터류킨-18(프로-Il-18).
12. 망막 색소 상피(RPE) 세포에서 그리고 그 부근에서 카스파제-1의 발현이 프로-IL-18의 IL-18로의 처리를 조절하고, 상기 IL-18은 보호 효과 on 맥락막의 혈관신생(CNV) 발병에 대한 보호 효과를 지니는 것인, 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 따라 이용하기 위한 프로-인터류킨-18(프로-Il-18).
13. 안구, 바람직하게는 맥락막, 혈관신생의 치료에 적합한 형태로 프로-IL-18의 발현을 지시하는 재조합 바이러스 유전자 전달 벡터.
14. AMD, 바람직하게는 습식 AMD를 발병할 위험이 있는 대상체의 눈에 투여하기 위한 형태인 것인 실시형태 13에 따른 재조합 바이러스 유전자 전달 벡터.
15. 상기 벡터가 망막하 또는 유리체내 주사를 통해 눈에 전달하기에 적합한 형태인 것인 실시형태 13 또는 14에 따른 재조합 바이러스 유전자 전달 벡터.
16. 상기 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV), 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 유전자 전달 벡터인 것인 실시형태 13 내지 15 중 어느 하나에 따른 재조합 바이러스 유전자 전달 벡터.
17. 프로-IL-18의 발현을 지시하고, AMD, 바람직하게는 습식 AMD를 발병할 위험이 있는 대상체의 눈에 투여하기에 적합한 것인, 실시형태 16에 따른 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 유전자 전달 벡터.
18. 상기 유전자 전달 벡터가 프로-Il-18 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 벡터인 것인, 실시형태 17에 따른 재조합 AAV 벡터.
19. 상기 AAV가 AAV 혈청형 1 내지 11, 바람직하게는 혈청형 2, 8 또는 9 중 어느 하나인 것인, 실시형태 17 또는 18에 따른 재조합 AAV 벡터.
20. 상기 프로-IL-18 유전자가 AAV 역말단 반복부위(ITR)들의 측면에 있는 것인, 실시형태 16 내지 19 중 어느 하나에 따른 재조합 AAV 벡터.
21. 치료를 필요로 하는 대상체에게 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질을 투여하는 단계를 포함하는, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태를 치료하는 방법.
22. 연령-관련 황반 변성을 발병시킬 위험이 있는 대상체에게 프로-인터류킨-18(프로-Il-18)을 투여하는 단계를 포함하는, 습식 연령-관련 황반 변성(AMD)을 치료하기 위한 실시형태 21에 따른 방법.
Claims (21)
- 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 포함하는 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 NLRP3-인플라마좀(inflammasome)의 염증 매개체, 바람직하게는 성분 또는 기질.
- 제1항에 있어서, 상기 NLRP3-인플라마좀의 성분은 인터류킨-18(IL-18), 바람직하게는 재조합 IL-18(rlL-18)인 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 망막 병태는 연령-관련 황반 변성, 바람직하게는 습식 연령-관련 황반 변성 또는 건식 연령-관련 황반 변성인 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NLRP3-인플라마좀의 성분, 바람직하게는 인터류킨-18(IL-18)은, 바람직하게는 주사에 의해, 더 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 전신으로 전달되는 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NLRP3-인플라마좀의 성분, 바람직하게는 인터류킨-18(IL-18)은, 바람직하게는 안구내 주사에 의해, 더 바람직하게는 망막하, 유리체내 주사, 안와(retrobulbar), 결막하 및/또는 태논낭하(subtenon) 주사를 통해서 국소 전달되는 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 눈에 전달하기 위한, 바람직하게는 망막에 전달하기 위한, 더 바람직하게는 맥락막에 전달하기 위한 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 습식 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration: AMD)을 발병시킬 위험이 있는 환자에서 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization: CNV)을 제어하는데 이용하기 위한 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인터류킨-18(IL-18)은 혈관신생 질환의 발병 전에 또는 초기 단계의 혈관신생 질환에서 대상체에게 투여되는 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 연령-관련 황반 변성을 발병시킬 위험이 있는 대상체에서 인터류킨-18(IL-18) 발현을 제어, 유지 또는 촉진시키는데 이용하기 위한 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질.
- 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인터류킨-18(IL-18)은 망막으로 전달되는 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 인터류킨-18(Il-18).
- 제10항에 있어서, 인터류킨-18(IL-18)은 주사에 의해 및/또는 바이러스 매개 전달에 의해 망막에 전신으로 전달되는 것인 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 인터류킨-18(Il-18).
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 인터류킨-18(IL-18)은 아데노-연관 바이러스(adeno-associated 바이러스: AAV) 매개 전달에 의해 망막에 전달되며, 바람직하게는, 유발성 IL-18을 발현하는 아데노-연관 바이러스(AAV)가 망막에 전달되는 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 인터류킨-18(Il-18).
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, IL-18은 맥락막의 혈관신생(CNV) 발병에 대한 보호 효과를 지니는 것인, 망막 변성 병태의 치료에 이용하기 위한 인터류킨-18(Il-18).
- 맥락막의 혈관신생의 치료에 적합한 형태로 IL-18의 발현을 지시하는 재조합 바이러스 유전자 전달 벡터.
- 제14항에 있어서, AMD, 바람직하게는 건식 AMD, 더 바람직하게는 습식 AMD를 발병시킬 위험이 있는 대상체의 눈에 투여하기 위한 형태인 것인 재조합 바이러스 유전자 전달 벡터.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 벡터는 안구내 주사에 의해, 바람직하게는, 망막하, 유리체내, 안와, 결막하 및/또는 태논낭하 주사를 통해서 눈에 전달하는데 적합한 형태인 것인 재조합 바이러스 유전자 전달 벡터.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV), 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 유전자 전달 벡터인 것인 재조합 바이러스 유전자 전달 벡터.
- 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 망막 변성 병태를 치료하는 방법으로서, 치료를 필요로 하는 대상체에게 NLRP3-인플라마좀의 염증 매개체, 성분 또는 기질을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 습식 연령-관련 황반 변성을 발병시킬 위험이 있는 대상체에게 인터류킨-18(Il-18)을 투여하는 단계를 포함하는 건식 및/또는 습식 연령-관련 황반 변성(AMD)을 치료하는 방법.
- 습식 또는 건식 연령-관련 황반 변성 등과 같은, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 질환을 발병시킬 위험을 나타내는 바이오마커로서의, NLRP3-인플라마좀 유도 매개체, 바람직하게는 염증전 사이토카인 IL-18(IL-18)의 용도.
- 인플라마좀 유도 매개체, 바람직하게는 염증전 사이토카인 IL-18(Il-18)을 바이오마커로서 이용해서, 대상체에서, 습식 또는 건식 연령-관련 황반 변성 등과 같은 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 질환을 발병시킬 위험을 결정하거나 해당 질환의 진행을 모니터링하는 방법으로서, 해당 방법은,
- 대상체에서 IL-18 및/또는 IL-18 결합 단백질 수준을 순환시키는 레벨을 획득하는 단계; 및
- 상기 IL-18 및/또는 IL-18 결합 단백질 수준의 레벨을 기준치와 비교하는 단계를 포함하되,
상기 대상체의 상기 질환 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생의 발병의 위험 혹은 진행은 기준치와 비교한 상기 IL-18 수준의 레벨에 기초하는 것인, 드루젠 및 아나필라톡신-유래 맥락막 혈관신생을 내포하는 질환을 발병시킬 위험을 결정하거나 해당 질환의 진행을 모니터링하는 방법.
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