JP2014528949A - 変性性の網膜状態の処置のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
被験体において循環中のIL−18および/またはIL−18結合タンパク質レベルを得ることと;
IL−18のレベルおよび/またはIL−18結合タンパク質レベルを参照に対して比較することであって、ここで疾患ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成の発症または進行という被験体のリスクが、参照に比較した、IL−18および/またはIL−18結合タンパク質のレベルに基づく比較と、
を包含する方法が提供される。
材料および方法
ドルーゼン単離
ドルーゼンおよび少量のブルッフ膜を、以前に記載されたように(8)、6つのAMDドナーの眼(88M、91F、97M、85F、85Mおよび80M)から、これらの実験における使用のために単離した。
ヒト血清アルブミン(Sigma Aldrich,USA)に、以前に記載のように(54)CEPを付加した。
この研究全体を通じて用いた種々の実験群から上清中でサイトカインを定量するにはELISAを用いた。IL−1β(RnD Systems)、IL−18(MBL International)、IL−6(RnD Systems)、TNF−α(RnD Systems)およびVEGF(RnD Systems)を詳細に分析した。全てのELISAは、三連で最低3分行った。この研究の間に用いたインヒビターは、インフラマソーム活性化の1時間前に以下の最高濃度で添加した:1μg/mlのカスパーゼ−1インヒビター VI(Calbiochem)、5μMのサイトカラシンD(Sigma Aldrich,Ireland),10μMのCA−074 Me(カテプシンBインヒビター)(Sigma Aldrich,Ireland)、10μMのDPI(Sigma Aldrich,Ireland)。
一般的には、カスパーゼ−1(Santa−Cruz Biotech)、β−アクチン(Abcam)、NLRP3(Sigma Aldrich,Ireland)、TLR−4(Santa−Cruz Biotech)に特異的な抗体を、膜の上で4℃で一晩インキュベートした。膜をTBSで洗浄して、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)複合体を有するウサギに対する二次抗体(IgG)(1:2500)(Sigma−Aldrich,Ireland)、またはマウス(IgG)(1:1000),(Sigma−Aldrich,Ireland)とともに、室温で3時間インキュベートした。免疫複合体を、増感化学発光(ECL)を用いて検出した。全てのウエスタンブロットは、最低三回繰り返した。
ARPE−19細胞株(ATCC CRL 2302)は、LGC promochemから入手し、THP1細胞および初代単離ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)を、インビトロのインフラマソーム活性化アッセイに用いた。細胞を37℃で、5%CO2、95%空気で、1:1の混合物のダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)とハム(Ham)のF12培地であって、1.2g/Lの炭酸水素ナトリウム、2.5mMのL−グルタミン、15mMのHEPES、0.5mMのピルビン酸ナトリウム(Sigma Aldrich)と10%のウシ胎仔血清(FCS)とを含む混合物の培地中で培養した。また、BMDCおよびBMDMは、WT、NLRP3−/−、TLR−2−/−、C3H/HeNおよびC3H/HeJのマウスから、類遺伝子性のC57/Bl6バックグラウンド上でも単離した。BMDCおよびBMDMを、抗−CD11c−APCおよび抗−CD11b−PeCy7を用いて染色した。細胞を、生きた単一の細胞上でゲートして、CD11cおよびCD11bの発現を、フローサイトメトリーによって評価した(図19)。マウスbEnd.3微小血管内皮細胞は、フィブロネクチン(Sigma Aldrich Ireland)コーティングした組織培養フラスコで、DMEM含有のGlutamaxおよび10%のFCS中で増殖した。
黄色蛍光(YFP)タンパク質標識したASCを発現している不死化したBMDM(ボン大学のEicke Latz博士より贈呈)を、LPS、HSAまたはCEP−HSAでプライミングし、次いで、ドルーゼンまたはC1Qを用いて、それぞれ3時間または6時間活性化した。スペック形成の生細胞画像化は、温度およびCO2を調節した共焦点レーザー走査顕微鏡(Olympus FluoView TM FV1000)を用いて撮った。
本発明者らは、標準的なマウス免疫プロトコール(55)を用いた。著者らは、PBS中に含有されるケタミン−キシラジン(80〜90mg/kgのケタミン、2〜10mg/mlのキシラジン)を用いてマウスを麻酔した。本発明者らは、200μgのCEP−MSAを含有するCFAまたはIFA(Difco Labs)を、前に記載のとおり(18)、最初および全ての追加用量に用いた。
本研究の経過中に行った全ての動物実験は、視覚と眼科学研究協会会議(Association for Research in Vision and Ophthalmology)(ARVO)の基準を順守し、全ての関連の国および制度上の承認は、本研究の開始の前に得た。CNV(血管床が網膜へと増殖し、新生血管AMDを模倣する)を、以前に記載された(21)顕微鏡送達システムを組み込んでいる、緑色の532nmのIridex Irisレーザー(532nm、140mW、100mSec、50μmのスポットサイズ、1つの眼あたり3スポット)を用いてマウスに導入した。この技術を用いて、Nlrp3−/−、Il1r1−/−、IL−18−/−およびWTマウス中でCNVを誘導し、各々の実験アッセイ動物では、性別をマッチさせた。相前後して、また本発明者らは、IL18に対する中和抗体(Abcam)をレーザー火傷の後、硝子体内に直接注射した。マウスを、実験の6日後に屠殺して、神経網膜を取り出した。次いで、眼杯を、Griffonia−simplicifolia−isolectin−Aleax−568分子(Molecular Probes)(1:300)を用いて4℃で一晩インキュベートして、CNVを共焦点顕微鏡で評価した(図20a,b)。
間接的な免疫染色を用いて、AMDの動物モデルにおける神経網膜に存在する、活性化されたマクロファージおよび切断されたカスパーゼ−1を分析した。活性化されたマクロファージ、およびカスパーゼ−1(P10)(Santa Cruz Biotech)、NLRP3(Santa Cruz BiotechおよびAbcam)およびIL18(Abcam)に関するF4/80に対する抗体CD68(Abcam)を、共焦点レーザー走査顕微鏡(Olympus FluoView TM FV1000)と組み合わせて用いた。
2つの個々の実験群を分析していた場合、0.05以下というP値で示される有意差によって、スチューデントのT検定を用いて、統計的分析を行った。多重比較のために、ELISA分析の場合と同様、ANOVAを、Tukey−Kramer事後テストとともに用いて、有意差は、0.05以下のP値で示した。
RPEは、外側網膜と脈絡膜との間に位置する立方形細胞の単層である。このメラニン化した神経上皮は、多数の機能を有し、この機能としては、a)散乱光および反射光の吸収、b)外側血液−網膜障壁(oBRB)の形成、ならびに光受容体外側部の弱った先端部の食作用による除去が挙げられる(22)。ドルーゼンのプロテオームおよび免疫組織化学な分析で、補体カスケードに関与する実質上あらゆるタンパク質、アミロイド沈着で見出されるタンパク質、ならびにストレスに反応して合成されるタンパク質である、多数のクリスタリンを特定した(23、24)。コレステロール結晶およびアミロイド沈着のような宿主由来の微粒子状物質(25、26)がNLRP3インフラマソームを活性化し得るという近年の発見を考慮して、本発明者らは、ドルーゼンが、インフラマソームの活性化を開始もできるか否かを決定することに興味を持った。
委縮型または滲出型のいずれかのAMDがある個体の写真と比較した罹患していない眼の眼底の写真(図1a)。眼底の画像における点状の光の出現は、委縮型および滲出型の両方のAMDにおけるドルーゼン蓄積であって、網膜下CNVが、滲出型AMDの写真にみえる。単離されたドルーゼンを超音波処理して、サンプルを小さい粒子状物質に分けた(図1b)。ドルーゼンサンプルのSDS−PAGE分析で、60kDaを超える高い分子量のタンパク質のコホートが示された(図1c)。インフラマソームは、多量体タンパク質複合体である。カスパーゼ−1は、インフラマソーム複合体中で活性化されたシステインプロテアーゼであり、pro−IL−1βおよびpro−IL−18をその成熟型に切断する。カスパーゼ−1の活性化には、多量体複合体のためのプラットフォームを創出するオリゴマーを形成するタンパク質ASCを必要とする。通常は、ASCは、細胞全体に均一に分布されるが、一旦、活性化されれば、ASCは、「スペック(speck)」として公知である、単一のポイントに凝集する。黄色蛍光タンパク質で標識されたASC(YFP−ASC)を安定に発現するBMDMを、LPSでプライミングして、ドルーゼンで処理するか、またはポリ(dAdT)(陽性コントロール)でトランスフェクトした。ASC−YFPは、LPS単独で処理したマクロファージでは識別困難である(図1d、左側パネル)が、ドルーゼンで活性化したLPSでプライミングしたマクロファージでは、ASCオリゴマー形成の指標である、強烈な単一の蛍光スペックの形成が明らかに認められる
ドルーゼン中で特定されたタンパク質の最大65%までが、AMDおよび正常なドナーの両方から単離されたドルーゼン中で見出された。しかし、酸化的タンパク質修飾もまた、カルボキシエチルピロールタンパク質付加物を含めて、ドルーゼン中で観察された。累積的な酸化的損傷は、加齢に寄与して、長期的には、AMDの発症機序に寄与すると推測された(27、28、29)。カルボキシエチルピロール(CEP)添加物は、ドコサヘキサエン酸塩(DHA)−含有脂質の酸化から特異的に生じ、AMD被験体のドルーゼンおよび血清に対して有意に豊富である(19)。近年では、それらのCEPの中でもカルボキシアルキルピロールは、内皮細胞上でトール様レセプター2(TLR2)によって認識されることが示された(30)。TLR2活性化が、細胞をプライミングして、pro−IL−1β、pro−IL−18およびNLRP3を誘導することを考えれば、本発明者らは、CEP付加したタンパク質がドルーゼン中で、およびブルッフ膜上で、新規なプライミング因子であり得ると仮定した。
ドルーゼンは、GAのように網膜を歪曲し最終的には損傷し得る(29)が、ドルーゼンを示す全ての患者が失明を発症するわけではなく、従って、RPEに対する機械的損傷を生じるドルーゼンの粒子状の性質に加えて、ドルーゼンのいくつかの構成要素(単数または複数)は、インフラマソームの活性化に、さらに特異的な方式で関与し得る。本発明者らは、C1Qを研究するために、ドルーゼンで特定された(32)、古典的な補体経路の最初の開始構成要素を選択した。C1Qは、宿主組織に対して過度な損傷である可能性を有する先天性の免疫系のエフェクターであるので、ドルーゼン中にそれが存在することは、炎症性の損傷が早期または継続中という指標である。本発明者らは、C1QがNLRP3インフラマソームを活性化する能力を直接向上させた。BMDMへC1Q単独を添加することは、IL−1βの産生を生じないが、C1Qの添加の前にCEP−HSAでプライミングされた細胞は、有意なレベルのIL−1βを産生した(図3a、左側パネル)。炎症促進性サイトカインTNFαの分泌は、CEP−HSAでプライミングされたBMDMに対するC1Qの添加の際に変化しないままであって(図3a、右側パネル)、このことは、C1Qがインフラマソームを特異的に活性化しており、一般には炎症促進性サイトカインの上方制御に関与しないことを示している。本発明者らは、C1Qで活性化されたTHP1ヒト単球細胞において切断されたカスパーゼ−1 p10を観察し(図3b、図11)、さらに、YFP−ASCスペックが、LPS(図3c、上の右側のパネル)またはCEP(図3c、最下部の右側のパネル)のいずれかでプライミングした後、C1Qで活性化された細胞内の濃縮された焦点でみることができるので、C1Qは、ASCオリゴマー形成を生じ得ることを証明した。
C1Qの沈着は、他の補体因子とともに、アミロイド構造と、またはその構成要素と関連することが示された(33、34)。従って、C1Qは、これらの粒子状の沈着を食作用するように試みるので、ドルーゼンの構成要素として、その凝集を生じ、マクロファージを補助し得る可能性がある。NLRP3インフラマソーム活性化をもたらす機序は、依然として議論の的であり、刺激に依存し得る。機序の1つは、粒子状構造の食作用を包含し、これがリソソーム破裂およびリソソーム内容の放出をもたらす(35)。別の提唱された機序は、反応性酸素種(ROS)の産生を包含し、これがROS感受性TXNIPタンパク質を介したNLRP3インフラマソームの活性化をもたらす(36)。ROSのC1Qの誘導(37、38)がインフラマソーム活性化を担うか否かを決定するために、本発明者らは、C1Q活性化の前にNADPHオキシダーゼインヒビターDPIでPBMCを処理した。DPIによるROSの阻害は、C1Q誘導性のIL−1β放出に影響を有さなかった(図13a)。提唱される別の機序は、リソソーム不安定性がリソソームエキソペプチダーゼ、カテプシンBのサイトゾルへの漏出(これは、インフラマソームの構成要素によって検知され、そのアセンブリにつながる)をもたらすということである(35)。C1Qによるインフラマソームの活性化におけるファゴリソソームの役割を決定するために、本発明者らは、リソソーム酸性化に必須の液胞のH+ATPase系をブロックするインヒビターであるバフィロマイシンA、およびカテプシンBインヒビターであるCA−074 Meを用いた。液胞H+ATPaseまたはカテプシンBのいずれかの阻害は、IL−1βおよびIL−18のC1Q活性化産生を制限し、IL−6産生には影響はない(図13b、c)。このことは、C1Qが、ファゴリソソームの過程を変更してNLRP3活性化を誘発することを直接意味する。
本発明者らは、インフラマソームが、CEP−MSAで免疫されたマウスモデルである、委縮型AMDの十分特徴付けされたモデルの病理に関係するか否かを決定しようとした。この動物は、CEP−MSAでの免疫後にその網膜およびRPEにおいてAMD様病変を発症する。本発明者らは、CEP−MSAで免疫されたマウスの網膜切片を、活性化されたマクロファージ(F4/80およびCD68染色)、カスパーゼ−1 p10およびNLRP3の存在について分析した。活性化マクロファージは、脈絡膜およびブルッフ膜内に存在することを確認し(図4a、図4b、図14)、また、本発明者らは、網膜の外側部においてRPE上の浸潤性マクロファージも観察した(図4c)。これらの部分の染色によって、F4/80と切断されたカスパーゼ−1 p10(図4d、図4e)およびNLRP3(図4f、図4g、図15)との同時局在化が示された。
滲出型(wet)(浸出性(exudative))AMDについてかなり用いられるモデルは、レーザー誘発性のCNVであって、またこれは、無菌性炎症についての理想的なモデルでもあり(39)、組織内の壊死性の微小環境の誘導に起因する可能性が高い。壊死性細胞は、NLRP3インフラマソームを通じて無菌性炎症応答を誘発することが公知である(17)。本発明者らは、NLRP3インフラマソームが、局在化した組織損傷に応答してCNV発達に重要な役割を果たし得ると仮定した。本発明者らの仮説を検討するため、本発明者らは、限局性のレーザー火傷をWTのNlrp3−/−およびIl1r1−/−のマウスの網膜に与えて、CNV容積を評価した。驚くべきことに、本発明者らは、WTおよびIl1r1−/−マウスと比較した場合、Nlrp3−/−マウスでは有意に多いCNV発達および網膜下出血を見出した(図5a)。CNVの3DのZ−スタック共焦点容積レンダリングによって、損傷の6日後のNlrp3−/−マウスのCNV容積の有意な増大が確認された(図5d、ヒストグラム)。網膜電図検査(ERG)分析によって、両方のノックアウトマウスが、機能的な桿体視細胞および錐体視細胞の応答を損傷前に有することが確認された(図5b)。本発明者らは、活性化されたマクロファージ浸潤(正のF4/80免疫反応性)を、Nlrp3−/−マウスの病変部位で観察した(図5c)が、切断されたカスパーゼ−1およびIL−18は、WTマウスの損傷部位でのみ明らかであって、特にNlrp3−/−マウスにはなかった(図5d、図16、図17)。これらの知見は、CNVのこの動物モデルで観察された無菌性炎症性応答におけるNLRP3インフラマソームの役割、およびCNV発達の調節因子としてのIL−18に向かうポイントを記載している。
増悪したCNV発達に対するNLRP3媒介性の防御におけるIL−18の役割を確認するために、本発明者らは、レーザー誘発性のCNVをIL18−/−マウスに投与した。これらのマウスは、ERG分析によって評価した場合、正常な網膜機能を有することが観察された(図6a)。損傷6日後のIL18−/−マウスにおけるブルッフ膜のレーザー誘発性の破壊およびCNV容積定量によって、WTのCNV(図6c)に比較して顕著な病変の増大が示された(図6b)。レーザー誘発性CNVに続いて硝子体内に注射されたIL−18中和抗体はまた、CNV発達の有意な増大を生じた(図18)。
本発明者らの研究では、AMDドナーの眼から単離したドルーゼンは、NLRP3インフラマソームを活性化し得ることが示された。さらに、本発明者らは、一般的に修飾ドルーゼンタンパク質でみられる酸化的ストレス関連タンパク質修飾である、カルボキシエチル−ピロール(CEP)が、インフラマソームをプライミングし得ることを示す。相前後して、本発明者らは、補体構成要素C1Qが、カスパーゼ−1およびファゴリソソーム依存性の方式でNLRP3インフラマソームを活性化し得ることを示す。本発明者らは、委縮型AMDの許容されたモデルである、CEP−MSA免疫マウスと関連するドルーゼン様病変の周囲のマクロファージ中の活性化されたカスパーゼ−1およびNLRP3を観察した。また、本発明者らは、委縮型AMDの通常用いられる動物モデルがNLRP3活性化に依存するが、予期せぬことに、NLRP3の非存在下では、CNVの発達は増悪したことを見出した。本発明者らは、IL−18を、病原性の新血管形成の重要な調節因子とみなし、AMDの発症におけるNLRP3インフラマソームの防御的な役割を示唆する。
臨床評価
AMDの被験体および罹患していない個体は、インフォームドコンセントに従って臨床の眼科医が評価した。最良矯正距離視力(best−corrected distance visual acuity)を、Snellen Chartを用いて測定した。近見視力は、標準試験タイプを用いて評価した。眼の前部は、スリット−ランプ生体顕微鏡で検査した。眼内圧は、Goldmann Tonometryで測定した。詳細な眼底検査およびカラーの眼底写真は、トロピカミド(1%)を用いて瞳孔散大後に行った。委縮型AMDは、AMD関連の黄斑の変化(ドルーゼン、RPEの色素過剰、低色素沈着、または地図状委縮)に起因する視力のゆがみの存在によって診断した。滲出型AMDは、CNVを図示するためにフルオレセイン血管造影写真によって補足した臨床試験で診断した。
マウスを、一晩暗野に順応させて、薄暗い赤い光のもとでの網膜電図写真のために準備した。瞳孔散大を、1%の1%のクリオペンタレートおよび2.5%のフェニレフリンの滴下によって行った。動物を、ケタミン(体重15gあたり2.08mg)およびキシラジン(体重15gあたり0.21mg)の腹腔内(I.P.)注射によって麻酔した。光の標準化されたフラッシュを、Ganzdeldボウルでマウスに与えて、網膜の均一な照射を確実にした。ERG応答を、同時に両方の眼から、Vidisic(Dr Mann Pharma,Germany)を導電材として用いて、金ワイヤ電極(Roland Consulting Gmbh)によって記録して、角膜の水和を維持した。参照電極および接地電極を、それぞれ、側頭眼角および尾の前から約1mm皮下に配置した。身体の温度を、直腸温度プローブで制御した加熱デバイスを用いて37℃で維持した。応答は、RetiScan RetiPort electrophysiology unit(Roland Consulting Gmbh)を用いて分析した。プロトコールは、ヒトの網膜電図写真について国際臨床基準委員会(International Clinical Standards Committee)が承認したものに基づいた。錐体視細胞単離物の応答は、30カンデラ/m−2という桿体視細胞−抑制バックグラウンド光(ここで事前に暗野に順応させた動物を刺激の前に10分間さらした)に対して示される3カンデラ/m−2/sの強度の白色フラッシュを用いて記録した。0.5Hzの頻度で示した、48の個々のフラッシュに対する応答をコンピューターで平均した。標準的な慣習に従って、a−波を、ベースラインからa−波トラフまで、およびb−波をa−波トラフからb−波のピークまで測定した。
1.変性性の網膜状態に対して防御性である炎症性メディエータ
2.NLRP3−インフラマソームの構成要素である炎症性メディエータ
3.炎症促進性インターロイキン−18(IL−18)であるNLRP3インフラマソーム構成要素
4.ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成(CNV)に関与する変性性の網膜状態の処置における使用のための実施形態2〜3のいずいれかに記載のインフラマソーム構成要素
5.実施形態4に記載のインフラマソーム構成要素であって、ここで上記の変性性の網膜の状態が加齢性黄斑変性症(AMD)、例としては、滲出型および委縮型AMDである、インフラマソーム構成要素。
6.先行する実施形態のいずれかに記載のNLRP3−インフラマソームであって、ここでIL−18の活性が維持されるか、および/または刺激されている、NLRP3−インフラマソーム。
7.ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成(CNV)に関与する変性性の網膜状態の処置のための医薬の製造における、NLRP3インフラマソーム誘発性IL−18、その改変体または一部の使用であって、ここで、この処置が、NLRP3インフラマソーム活性化因子、例えば、IL−18の骨髄もしくは骨髄由来の細胞もしくは組織への送達および/または眼の細胞もしくは組織への直接の送達を包含する、使用。
8.IL−18のウイルス媒介性の送達を含む実施形態7による使用。
9.IL−18の活性を維持または刺激することを包含する、変性性の網膜症の進行を遅延するための方法。
10.NLRP3−インフラマソーム誘発性メディエータ、好ましくは炎症促進性サイトカインIL−18の使用であって、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成関連の疾患に関与する疾患、例えば、滲出型または委縮型のAMDを発症するリスクを示すためのバイオマーカーとしての使用。
11.ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成関連の疾患、例えば、滲出型または委縮型のAMDの発症または進行のリスクを、被験体において、−インフラマソーム誘発性メディエータ、好ましくは炎症促進性サイトカインIL−18を、バイオマーカーとして用いて決定するための方法であって、この方法は;
−この被験体において循環中のIL−18のレベルのレベルを得ることと;
−参照に対してIL−18レベルのレベルを比較することであって、ここで疾患ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成の発症または進行の被験体のリスクが、参照に比較してIL−18レベルのレベルに基づくことと;
を包含する、方法。
1.ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態の処置における使用のための、炎症性メディエータ、好ましくはNLRP3−インフラマソームの構成要素または基質。
2.上記網膜の状態が、加齢性黄斑変性症である、実施形態1に記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
3.上記加齢性黄斑変性症が滲出型加齢性黄斑変性症または萎縮型加齢性黄斑変性症である、実施形態2による使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
4.上記NLRP3−インフラマソームの構成要素が、pro−インターロイキン−18(proIL−18)またはインターロイキン−18(IL−18)である、先行の実施形態のいずれかに記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
5.pro−インターロイキン−18(pro−IL−18)またはインターロイキン−18(IL−18)が、新生血管疾患の発症の前に、または初期段階の新生血管疾患において被験体に投与される方法での使用のための、先行する実施形態のいずれかに記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
6.加齢性黄斑変性症を発症するリスクのある被験体においてインターロイキン−18(IL−18)発現を制御、維持または刺激する際の先行する実施形態のいずれかに記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
7.滲出型加齢性黄斑変性症(AMD)を発症するリスクのある被験体において脈絡膜−新血管形成(CNV)を制御する際の使用のための先行する実施形態のいずれかに記載の使用のためのPro−インターロイキン−18(pro−Il−18)。
8.Pro−インターロイキン−18(pro−Il−18)が、網膜へ送達される、実施形態7に記載の使用のためのpro−インターロイキン−18(pro−Il−18)。
9.Pro−インターロイキン−18(pro−IL−18)が、網膜へ全身的に、直接注射によって、および/またはウイルス媒介性の送達によって送達される、実施形態8に記載の使用のためのpro−インターロイキン−18(pro−Il−18)。
10.Pro−インターロイキン−18(pro−IL−18)が、アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性の送達によって網膜へ送達される、実施形態8または9に記載の使用のためのpro−インターロイキン−18(pro−Il−18)。
11.誘導性のpro−IL−18を発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)が、網膜へ送達される、実施形態10に記載の使用のためのpro−インターロイキン−18(pro−Il−18)。
12.網膜色素上皮(RPE)細胞におけるおよびその周囲のカスパーゼ−1の発現が、pro−IL−18のIL−18への進行を調節し、IL−18が脈絡膜新血管形成(CNV)発症に対して防御効果を有する、先行の実施形態のいずれかに記載の使用のためのpro−インターロイキン−18(pro−Il−18)。
13.眼、好ましくは脈絡膜、新血管形成の処置のために適切な形態のpro−IL−18の発現を指向する組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
14.AMD、好ましくは滲出型AMDを発症するリスクのある被験体の眼に対する投与のための形態の実施形態13による組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
15.上記ベクターが、網膜下または硝子体内注射を介した眼への送達に適切な形態である、実施形態13または14に記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
16.前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルスまたはレンチウイルス遺伝子送達ベクターである、実施形態13〜15のいずれかに記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
17.Pro−IL−18の発現を指向し、かつAMD、好ましくは滲出型AMDを発症するリスクのある被験体の眼に対する投与に適切な、実施形態16に記載の組み換えアデノ随伴ウイルス(AAV)遺伝子送達ベクター。
18.前記遺伝子送達ベクターが、pro−Il−18遺伝子をコードするヌクレオチドを含んでいるAAVベクターである、実施形態17に記載の組み換えAAVベクター。
19.前記AAVが、AAV血清型1〜11のいずれか1つ、好ましくは血清型2、8または9である、実施形態17または18に記載の組み換えAAVベクター。
20.前記pro−IL−18遺伝子遺伝子が、AAV逆方向末端反復(ITR)に隣接する、実施形態16〜19のいずれかに記載の組み換えAAVベクター。
21.ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態を処置する方法であって、炎症性メディエータ、NLRP3−インフラマソームの構成要素または基質を処置の必要な被験体に投与することを包含する、方法。
22.加齢性黄斑変性症を発症するリスクのある被験体に対してプロ−インターロイキン−18(pro−Il−18)を投与することを包含する、滲出型加齢性黄斑変性症(AMD)を処置するための、実施形態21に記載の方法。
Claims (21)
- 炎症性メディエータ、好ましくは、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態の処置における使用のための、NLRP3−インフラマソームの構成要素または基質。
- 前記NLRP3−インフラマソームの構成要素が、インターロイキン−18(IL−18)、好ましくは組み換えIL−18(rIL−18)である、請求項1に記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
- 前記網膜の状態が加齢性黄斑変性症、好ましくは滲出型加齢性黄斑変性症または萎縮型加齢性黄斑変性症である、請求項1または請求項2に記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
- 前記NLRP3−インフラマソームの構成要素、好ましくはインターロイキン−18(IL−18)が、全身的に、好ましくは注射によって、より好ましくは静脈内注射によって送達される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
- 前記NLRP3−インフラマソームの構成要素、好ましくはインターロイキン−18(IL−18)が、局所的に、好ましくは眼内注射により、さらに好ましくは網膜下、硝子体内注射、眼球後方、結膜下および/またはテノン嚢下の注射を介して送達される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
- 眼への送達のため、好ましくは網膜への送達のため、さらに好ましくは脈絡膜への送達のための、請求項4または5に記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
- 滲出型加齢性黄斑変性症(AMD)を発症するリスクのある患者において、脈絡膜−新血管形成(CNV)を制御する際における使用のための請求項1〜6のいずれかに記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
- インターロイキン−18(IL−18)が、新生血管疾患の発症前、または初期段階の新生血管疾患において、被験体に投与される方法における使用のための請求項1〜7のいずれか1項に記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
- 加齢性黄斑変性症を発症するリスクのある被験体におけるインターロイキン−18(IL−18)発現を制御、維持または刺激する際の、請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
- インターロイキン−18(IL−18)が網膜に送達される、請求項2〜9のいずれか1項に記載の使用のためのインターロイキン−18(Il−18)。
- インターロイキン−18(IL−18)が、網膜へ全身的に、注射によっておよび/またはウイルス媒介性の送達によって送達される、請求項10に記載の使用のためのインターロイキン−18(Il−18)。
- インターロイキン−18(IL−18)が、網膜へ、アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性の送達によって送達され、好ましくはここで、誘導性のIL−18を発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)が網膜に送達される、請求項10または11に記載の使用のためのインターロイキン−18(Il−18)。
- IL−18が脈絡膜新血管形成(CNV)発達に対する防御効果を有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用のためのインターロイキン−18(Il−18)。
- 脈絡膜新血管形成の処置のために適切な形態でIL−18の発現を指向する、組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
- AMD、好ましくは委縮型AMD、より好ましくは滲出型のAMDを発症するリスクのある被験体の眼に対する投与のための形態の、請求項14に記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
- 前記ベクターが、眼内注射によって、好ましくは網膜下、硝子体内、眼球後方、結膜下および/またはテノン嚢下注射を介して眼に送達するために適切な形態である、請求項14または15に記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
- 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルスまたはレンチウイルス遺伝子送達ベクターである、請求項14〜16のいずれか1項に記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
- 処置の必要な被験体に対して、炎症性メディエータ、NLRP3−インフラマソームの構成要素または基質を投与することを包含する、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態を処置する方法。
- 滲出型加齢性黄斑変性症を発症するリスクのある被験体に対して、インターロイキン−18(Il−18)を投与することを包含する、委縮型および/または滲出型の加齢性黄斑変性症(AMD)を処置するための請求項18に記載の方法。
- 滲出型または萎縮型加齢性黄斑変性症のような、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜新血管形成に関与する疾患を発症するリスクを示すバイオマーカーとしての、NLRP3−インフラマソーム誘発性メディエータ、好ましくは炎症促進性サイトカインIL−18(IL−18)の使用。
- バイオマーカーとして、インフラマソーム誘発性メディエータ、好ましくは炎症促進性サイトカインIL−18(Il−18)を用いて、被験体において、滲出型または萎縮型加齢性黄斑変性症のような、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜新血管形成に関与する疾患を発症するリスクを決定するか、その疾患の進行をモニタリングするための方法であって:
−被験体において循環しているIL−18のレベルおよび/またはIL−18結合タンパク質のレベルを得ることと;
−参照に対してIL−18のレベルおよび/またはIL−18結合タンパク質のレベルを比較することであって、ここで疾患ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成の発症または進行という被験体のリスクが、参照と比較したIL−18レベルに基づいている比較と;
を包含する、方法。
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