KR20140068640A - 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법 - Google Patents

초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 입사레이저의 편광방향과 형광분자의 이중극자가 이루는 각도에 따라서 강도가 변하는 형광 분자 신호를 분석하여, 형광분자를 초고해상도로 촬상하고, 동시에 형광분자의 방향을 측정할 수 있는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법에 관한 것이다.
본 발명은 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법에 있어서, 타켓에 형광 분자를 표지하는 표지단계; 상기 형광 분자에 선형 편광된 입사레이저를 도입하는 입사 레이저 도입단계; 상기 입사레이저의 편광방향과 상기 형광분자의 이중극자가 이루는 각도에 따라서 강도가 변하는 형광 분자 신호를 이미징하는 형광분자 신호 이미징단계; 및 상기 형광분자 신호 이미징단계에서 이미징한 형광 분자 신호를 분석하는 형광분자 신호 분석단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법을 제공한다.

Description

초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법{A METHOD TO RESOLVE DIPOLE DIRECTIONS WITH SUPER-RESOLUTION}
본 발명은 빛의 편광성질을 이용한 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향을 감지할 수 있는 현미경의 개발에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 입사레이저의 편광방향과 형광분자의 이중극자가 이루는 각도에 따라서 강도가 변하는 형광 분자 신호를 분석하여, 형광분자 위치를 초고해상도로 촬상하고, 동시에 형광분자가 가지고 있는 이중극자의 방향성을 결정할 수 있는 방법이다.
아비의 법칙(Abbe's law)의 적용을 받는 형광 현미경은 약 200nm이상의 공간 해상도(spatial resolution) 한계를 가지며, 이는 단분자(single molecule) 수준의 생물학 연구 및 나노미터 단위의 물질의 연구에 사용되는 것에는 한계가 있으므로, 기존의 해상도 한계를 넘는 형광현미경을 개발할 필요성이 있다.
현재 다양한 방식으로 초고해상도(super-resolution) 형광 현미경을 이용한 방법이 개발되어 왔다. 그 중 상업화에 성공하여 활용되고 있는 방법은 형광분자의 빛 방출(emission)을 조절하여 빛이 방출된 형광분자의 위치를 나노미터 수준으로 결정한 후에 그 이미지를 재구성하는 방법이다. 이를 위하여 형광분자의 빛 방출을 조절하는 다양한 방법들이 개발되어 오고 있으나 그 모든 것들은 확률적인(stochastic) 방법들이다.
한편, 형광 현미경을 이용하여 형광분자들이 가지는 이중극자(dipole)의 방향성을 알아내기 위한 방법들이 존재한다. 편광된 입사빔과 형광분자의 이중극자간의 상호작용을 통하여 나타나는 형광분자의 이미지 패턴을 분석하여 형광 분자 하나에 대하여 그 이중극자(dipole)방향을 측정할 수 있다. 그러나 두 개 이상의 형광분자들이 200nm 거리 안에 존재할 때 두 이중극자간의 방향을 측정할 수 있는 방법이 현재 존재하지 않는다.
본 발명의 목적은 기존의 형광현미경에서 분해할 수 없는 가까운 거리에 존재하는 형광분자의 위치 및 이중극자의 방향을 정확히 측정하는 것에 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법에 있어서, 타켓에 형광 분자를 표지하는 표지단계; 상기 형광 분자에 선형 편광된 입사레이저를 도입하는 입사 레이저 도입단계; 상기 입사 레이저의 편광방향과 상기 형광분자의 이중극자가 이루는 각도에 따라서 강도가 변하는 형광 분자 신호를 이미징하는 형광분자 신호 이미징단계; 및 상기 형광분자 신호 이미징 단계에서 이미징한 형광 분자 신호를 분석하는 형광분자 신호 분석단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법을 과제의 해결수단으로 한다.
또한, 상기 입사 레이저 도입단계는 선형편광된 레이저를 제1 1/4파장판을 통해 원형편광으로 전환하는 제1단계; 상기 제1단계에서 원형편광된 레이저의 경로를 미러를 이용하여 변경하는 제2단계; 상기 제2단계에서 경로가 변경된 레이저의 단면적을 렌즈를 통하여 확장하는 제3단계; 상기 제3단계에서 사이즈가 확장된 레이저를 제2 1/4 파장판을 통하여 선형편광하는 제4단계; 상기 제4단계에서 선형편광된 레이저를 웨지프리즘과 다이크로익미러를 통하여 경로를 변경하는 제5단계; 상기 제5단계에서 경로가 변경된 레이저를 대물렌즈 상단에서 전반사시키는 제6단계; 및 상기 제6단계에서 전반사된 레이저가 상기 형광분자에 도입되는 제7단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법을 과제의 해결수단으로 한다.
또한, 상기 제4단계의 제2 1/4파장판 및 제5단계의 웨지프리즘은 모터에 의하여 회전되어, 상기 선형편광된 레이저를 회전시키는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법을 과제의 해결수단으로 한다.
또한, 상기 형광분자신호분석단계는 가우시안 점상 강도 분포함수의 최소제곱법을 이용하여, 검출되는 형광 분자 신호에 대응하는 형광 분자의 위치 정보를 획득하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법을 과제의 해결수단으로 한다.
또한, 상기 표지단계 내에서 타켓에 두 개의 형광 분자를 표지하고, 상기 형광분자신호분석단계는 [수식 1]을 이용하여 표현된 상기 두 개의 형광 분자의 형광 패턴을 [수식 2]를 이용하여 피팅하고, 형광 강도가 가장 센 부분을 새로운 형광 분자의 좌표로 결정하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법을 과제의 해결수단으로 한다.
[수식1]
Figure pat00001
I(x,y) : 두 개의 형광분자의 형광 강도의 합
(x10, y10) , (x20, y20) : 두 개의 형광 분자 각각의 중심 위치
(w1x, w1y) , (w2x, w2y) : x축과 y축 방향 각각의 점상강도분포함수의 표준편차
θ : 입사레이저의 편광각도
φ : 두 개의 형광분자의 평면상의 각도 차이
Acos2θ , Bcos2(θ-φ) : 두 개의 형광 분자 각각의 가우시안피크의 진폭
C : 노이즈를 포함한 상수
[수식 2]
Figure pat00002
I(x,y): 두 개의 형광분자의 형광 강도의 합
(x0, y0): 결정된 형광분자의 좌표
(wx, wy): x축과 y축 방향 각각의 점상강도분포함수의 표준편차
C′: 노이즈를 포함한 상수
또한, 상기 형광분석신호분석단계는 상기 [수식 2]를 통하여 결정된 좌표 중 최대 거리의 두 좌표를 유도하는 시점의 입사레이저 편광 방향이 상기 두 개의 형광 분자 중 하나의 형광 분자의 형광신호가 검출되지 않는 시점으로 결정하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법을 과제의 해결수단으로 한다.
또한, 상기 형광분자신호분석단계는 형광 분자 신호가 검출되지 않은 형광 분자의 이중극자 방향을 상기 형광 분자 신호가 검출되지 않는 순간의 상기 입사레이저의 방향과 90°의 차이를 이루는 방향으로 결정하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법을 과제의 해결수단으로 한다.
또한, 상기 형광분자신호분석단계는 입사 레이저의 방향에 따라 [수식 2]에 의해 결정된 형광분자의 위치가 이동하며, 이동 패턴은 입사빔의 방향을 기준으로 180도 마다 진동하는 패턴을 이용하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법을 과제의 해결수단으로 한다.
또한, 본 발명은 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 현미경에 있어서, 형광 분자에 선형 편광된 입사레이저를 도입하는 입사레이저도입부; 상기 입사레이저도입부로부터 도입되는 입사레이저에 의하여 방출되는 형광 분자 신호를 이미징하는 형광분자신호이미징부; 및 상기 형광 분자 신호 이미징부가 이미징한 형광 분자 신호를 분석하는 형광분자신호분석부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 현미경을 과제의 해결수단으로 한다.
또한, 상기 입사레이저도입부는 선형편광된 레이저를 원형편광으로 전환하는 제1 1/4 파장판; 상기 제1 1/4파장판에 의하여 원형편광된 레이저의 경로를 변경하는 미러; 상기 미러에 의하여 경로가 변경된 레이저의 단면적을 확장하는 렌즈; 상기 렌즈에 의하여 단면적이 확장된 레이저를 선형편광하는 제2 1/4 파장판; 상기 제2 1/4파장판에 의하여 선형편광된 레이저의 경로를 변경하는 웨지 프리즘; 및 다이크로익미러;를 포함하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 현미경을 과제의 해결수단으로 한다.
또한, 상기 입사레이저도입부(10)는 상기 선형 편광된 입사레이저를 두 개의 형광 분자에 도입하고, 상기 형광분자신호분석부(30)는 [수식 2]를 이용하여 상기 입사 레이저에 의하여 방출되는 형광 분자 신호를 분석하고, 상기 형광 분자의 위치정보를 획득하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 현미경을 과제의 해결수단으로 한다.
또한, 상기 형광분자신호분석부(30)는 상기 입사레이저의 편광방향과 형광분자의 이중극자가 이루는 각도에 따라서 변하는 형광분자신호의 강도를 분석하여 상기 형광분자의 이중극자의 방향정보를 획득하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 현미경을 과제의 해결수단으로 한다.
이와 같이 본 발명에 의한 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 입사레이저의 편광 방향을 조절하며, 입사레이저의 편광 방향에 따른 형광분자의 신호를 이미징하고, 이미징한 형광분자신호를 분석하여, 광학 현미경의 한계 해상도 내에 있는 형광분자의 위치를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 이미징한 형광분자신호를 분석하여, 형광분자의 이중극자 방향을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 입사레이저의 편광 방향을 조절함으로써, 형광 분자의 방출 신호를 조절하여 입사빔이 180도 변화하는 단시간 동안 형광분자의 방출 신호를 발생 및 소멸시키는 이미징을 구현함으로써, 기존의 랜덤한(sthochastical) 형광 분자 신호 조절을 기반으로 하는 초고해상도 현미경에 비하여 이미징하는 시간을 단축하는 효과가 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해 되어질 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 현미경의 구성도이다.
도 2는 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 현미경의 입사레이저도입부의 구성도이다.
도 3은 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법을 보여주는 흐름도이다.
도 4는 입사레이저가 도입되어 형광 분자 신호를 이미징하는 단계를 도시한 도면이다.
도 5는 입사레이저가 형광분자의 방향에 대하여 90°의 각도를 이루며 입사되는 경우를 도시한 도면이다.
도 6은 두 개의 전이 이중극자 방향을 나타내고, 각각의 이중극자 방향과 90도를 이루는 때의 입사레이저의 각도를 도시한 도면이다.
도 7은 입사레이저의 편광방향에 따른 두 개의 형광분자의 방출세기를 도시한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 93 base pairs의 DNA 홀리데이 정션을 도시한 도면이다.
도 9는 Cy3 방출신호의 대표적 타임트레이스를 도시한 도면이다.
도 10은 FFT 필터를 이용하여 입사레이저의 편광 변화에 따른 형광 분자 위치정보의 획득과정을 도시한 도면이다.
도 11은 도 10을 통하여 획득한 형광 분자 위치정보를 도시한 도면이다.
도 12는 43-45 bp 브랜치로 구성된 홀리데이 정션 및 획득된 형광 분자의 위치 정보를 도시한 도면이다.
도 13는 홀리데이정션의 브랜치사이의 거리 및 브랜치 사이의 각도를 도시한 그래프이다.
이하에서는 도면을 참조하면서, 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 현미경 및 그를 이용한 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법의 바람직한 실시예들을 구체적으로 설명한다. 우선 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
도 1은 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 현미경의 구성도이다.
도 1에 따르면, 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 현미경은 형광 분자에 선형 편광된 입사레이저를 도입하는 입사레이저도입부(10)와, 입사레이저도입부(10)로부터 도입되는 입사레이저에 의하여 방출되는 형광 분자 신호를 이미징하는 형광분자신호이미징부(20) 및 형광 분자 신호 이미징부(20)가 이미징한 형광 분자 신호를 분석하는 형광분자신호분석부(30)를 포함하여 구성된다.
도 2는 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 현미경의 입사레이저도입부(10)의 구성도이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 상기 입사레이저도입부(10)는 선형편광된 레이저를 원형편광으로 전환하는 제1 1/4 파장판(11)과, 상기 제1 1/4파장판(11)에 의하여 원형편광된 레이저의 경로를 변경하는 미러(12)와, 상기 미러(12)에 의하여 경로가 변경된 레이저의 단면적을 확장하는 렌즈(13)와, 상기 렌즈(13)에 의하여 단면적이 확장된 레이저를 선형편광하는 제2 1/4 파장판(14)과, 상기 제2 1/4파장판(14)에 의하여 선형편광된 레이저의 경로를 변경하는 웨지 프리즘(15) 및 다이크로익미러(16)를 포함하여 구성된다.
또한, 상기 형광분자신호분석부(30)는 가우시안 점상 강도 분포함수를 이용하여 입사레이저에 의하여 방출되는 형광 분자 신호를 분석하여 상기 형광 분자의 위치정보를 획득한다.
또한, 상기 형광분자신호분석부(30)는 상기 입사레이저의 편광방향과 형광분자의 이중극자가 이루는 각도에 따라서 변하는 형광분자신호의 강도를 분석하여 상기 형광분자의 이중극자의 방향정보를 획득한다.
도 3은 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법을 보여주는 흐름도이다.
도 3에 따르면, 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법은 타켓에 형광 분자를 표지하는 표지단계(S10)와, 상기 형광 분자에 선형 편광된 입사레이저를 도입하는 입사레이저도입단계(S20)와, 상기 입사레이저의 편광방향과 상기 형광분자의 이중극자가 이루는 각도에 따라서 강도가 변하는 형광 분자 신호를 이미징하는 형광분자신호이미징단계(S30) 및 상기 형광분자신호이미징단계(S30)에서 이미징한 형광 분자 신호를 분석하는 형광분자신호분석단계(S40)를 포함한다.
이 때, 상기 입사레이저도입단계(S20)는 선형편광된 레이저를 제1 1/4파장판(11)을 통해 원형편광으로 전환하는 제1단계와, 상기 제1단계에서 원형편광된 레이저의 경로를 미러(12)를 이용하여 변경하는 제2단계와, 상기 제2단계에서 경로가 변경된 레이저의 단면적을 렌즈(13)를 통하여 확장하는 제3단계와, 상기 제3단계에서 사이즈가 확장된 레이저를 제2 1/4 파장판(14)을 통하여 선형편광하는 제4단계와, 상기 제4단계에서 선형편광된 레이저를 웨지프리즘(15)과 다이크로익미러(16)를 통하여 경로를 변경하는 제5단계와, 상기 제5단계에서 경로가 변경된 레이저를 대물렌즈 상단에서 전반사시키는 제6단계 및 상기 제6단계에서 전반사된 레이저가 상기 형광분자에 도입되는 제7단계를 포함한다.
이 때, 모터(17)는 상기 제4단계의 제2 1/4파장판(14) 및 제5단계의 웨지 프리즘(15)을 회전하여 상기 선형편광된 레이저의 경로를 대물렌즈 중심을 축으로 회전한다.
도 7은 입사레이저의 편광방향에 따른 두 개의 형광분자의 방출세기를 도시한 도면이다.
도 7에 도시한 바와 같이, 중첩된(super-positioned) 점상강도분포함수(PSF)의 피크(peak)는 두 개의 형광 분자 중 더 밝은 형광분자의 위치로 이동함을 알 수 있다.
또한, 상기 형광분자신호분석단계(S40)는 [수식 2]의 가우시안 점상 강도 분포함수(Gaussian point spread function)의 최소제곱법(least-squares fit)을 이용하여, 검출되는 형광 분자 신호에 대응하는 형광 분자의 위치 정보를 획득한다.
또한, 상기 형광분자신호분석단계(S40)는 상기 [수식 2]를 이용하여 입사레이저의 방향 변화에 따른 위치 정보 패턴을 얻게 되며, 이 패턴에서 가장 먼 두 점이 입사레이저의 편광방향에 의하여 두 개의 형광 분자 중 한 형광 분자의 형광 신호가 오프(off)상태가 되는 시점으로 결정된다.
또한, 상기 형광분자신호분석단계(S40)는 형광 분자 신호가 검출되지 않은 형광 분자의 이중 극자 방향을 상기 입사레이저의 방향과 90°의 차이를 이루는 방향으로 결정한다.
도 7에서 도시된 바와 같이, 입사 편광 방향의 차이는 90° 이며, 이는 두 형광분자의 이중극자 방향의 차이와 같으므로, 형광 분자의 이중극자의 방향을 결정할 수 있다. 또한, 가우시안 피팅에 의하여 결정된 위치들 중 가장 멀리 떨어진 거리에서의 두 형광분자의 위치를 실제 형광분자의 위치로 결정함으로써 한계 해상도 내의 두 형광분자의 위치를 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 선형 편광되어 여기된 레이저에 의한 형광 방출의 변조를 통하여 한계 해상도 내에서 두 개의 형광 분자를 공간적으로 구별하고, 동시에 형광 분자의 정확한 이중극자 방향을 결정할 수 있다.
본 발명은 편광 포토스위칭(photo-switching)을 이용하여, 거리 및 평면상에서 이중극자의 홀리데이 정션(Holliday junction)의 두 개의 인접한 브랜치(branch)의 끝에 각각 표지 된 형광분자인 Cy3 사이의 각도를 측정하고, 동시에 Cy3의 위치(또는 두 Cy3 간의 거리)를 측정함으로써 DNA 홀리데이 정션(Holiday junction)의 2차원 기하학적 구조를 10나노미터 스케일로 이미징할 수 있다.
본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 생체분자의 방향 정보를 포함하여, 기존의 무작위 포토 스위칭(stochastic photo-switching)법을 이용한 초고해상도 현미경과 달리 예측가능한 포토 스위칭(non-stochastic photo-switching) 이미징 프로세스를 제공한다.
형광 분자의 전이 이중극자 모멘트(transition dipole moment)는 일반적으로 운동의 방향성과 생체분자의 이방성을 결정하기 위하여 사용되어 왔다.
그러나, 한계 해상도 내에서 전이 이중극자 모멘트 측정은 생체분자 복합체의 구조 및 나노 구조체에 관한 정보를 획득할 수 있으나, 기술 구현에 있어 용이하지 아니한 문제점이 있었다.
최근 Gould등에 의한 연구(T. J. Gould, Nat Method 5, 2008)는 형광광조사위치현미경(PALM) 및 편광 현미경을 결합하여 성공적으로 형광 분자의 위치와 이방성을 높은 해상도로 촬영하였다.
그러나 이러한 방법에 따르면, 형광분자의 이중극자의 이방성을 수직 성분 및 수평 성분의 비율(ratio)에 대한 정보만 획득할 수 있을 뿐, 직접적인 이중극자의 각도와 방향은 알 수 없는 문제점이 있었고, 초고해상도 이미징을 위해 무작위 포토 스위칭(stochastic photo-switching)법을 이용하고 있어, 이미징 시간이 오래 걸리는 등의 단점을 포함하여, 한계 해상도 내에 있는 형광 분자의 이중극자 방향을 결정하기 위한 방법을 개발할 필요성이 있다.
본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 형광분자의 전이이중극자와 여기된 입사빔의 편광(polarization of the excitation light) 간의 상호작용을 이용하는 간단한 이미징 기술을 제공하여, 기존의 현미경에 비하여 이미징하는 시간을 단축하는 효과가 있다.
형광분자의 방출 세기는 cos2 θ의 함수에 비례하여 변조되며, θ는 입사광의 전기장(electric field)과 형광체의 이중극자모멘트(μ) 사이의 각도이다. 따라서 형광체의 이중극자 모멘트 방향과 입사광의 전기장 방향이 90도를 이루면 형광분자의 방출 세기는 0이 되며, 이 때 전기장의 방향은 입사빔의 편광 방향과 일치한다.
그러므로, 입사광의 회전 편광은 θ가 90°일 때 주기적으로 형광 방출을 오프(off) 시키고, 전형적인 무작위적 포토스위칭 (stochastic photo-switching)에서 사용하는 단일 분자 위치기반 현미경에서의 포토스위칭(photo-switching) 방법을 통해 초고해상도 이미지를 얻는 것과 같이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 선형 편광된 소멸파(evanescent wave)가 현미경의 대물렌즈 가운데를 중심으로 회전 하도록 한다. 즉, 입사빔인 소멸파가 회전함에 따라서 선형 편광 방향도 회전하게 된다. 이 때, 선형편광된 입사빔을 제1 1/4 파장판(11, QWP, quarter-wave plate)에 투과시켜 원형편광빔으로 만든다.
레이저 빔과 형광분자가 반응하는 장소인 이미지 플랜(image plane)에서 원형편광된 여기된 광을 선형 편광으로 유도하고, 회전시키기 위하여, 본 발명은 제2 1/4 파장판(14, QWP)과 각 각도 편위가 0.5°와 1°인 두 개의 웨지 프리즘(15, wedge prism) 및 모터(17)를 포함한다.
원형편광은 스텝모터에 의해 회전하는 제2 1/4 파장판(14)의 중앙을 투과하게 됨에 따라 선형 편광으로 변하며, 이에 따라서 회전하는 선형 편광이 발생된다.
제 2 1/4 파장판(14, QWP) 뒤에 위치한 중공모터 내의 웨지프리즘(15)은 회전하는 선형편광빔을 굴절시켜 대물렌즈를 통과하는 광의 입사각도가 전반사의 임계각보다 더 크도록 한다.
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 선형 편광 된 소멸파는 z축에 대하여 회전하는 동안 상평면의 x-y평면 상에 선형 방향이 회전하며 유지되게 된다.
도 5는 입사레이저가 형광분자의 방향에 대하여 90°의 각도를 이루며 입사되는 경우를 도시한 도면이다.
도 5에 따르면, 제1형광분자(Fluo-1)가 꺼질 때, 남아있는 제2형광분자(Fluo-2)의 위치는 하나의 형광체의 광세기의 2D 가우시안 분포함수(2D Gaussian point spread function)의 최소제곱법(least-squares fit)을 이용하여 약 1나노미터의 정확도로 결정된다. 추가적으로 입사편광의 회전은 제2형광분자(Fluo-2)를 오프(off)시키고, 제1형광분자(Fluo-1)의 위치가 결정된다. 이러한 방법으로 각각 결정된 형광분자의 위치를 재구성하여, 2개의 형광분자를 한계 해상도 내에서 분석할 수 있다.
또한, 평면의 전이 쌍극자의 방향은 제1형광분자(Fluo-1)와 제2형광분자(Fluo-2)의 오프(off) 상태에서의 입사빔의 편광 각도(θ)에 90°를 더하여 줌으로써 오프(off)상태의 형광 분자의 이중극자 방향을 결정할 수 있다.
도 6은 두 개의 전이 이중극자 방향을 나타내고, 각각의 이중극자 방향과 90도를 이루는 때의 입사레이저의 각도를 도시한 도면이다.
도 6에 도시된 바와 같이, 두 개의 형광분자가 각각 오프(off) 상태일 때 결정된 입사광의 편광각도 θ 사이의 차이(α)는 형광 분자의 이중극자(혹은 쌍극자)의 평면상의 각도 차이(φ) 와 보각이다.
본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 현미경 및 그를 이용한 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 [수식 1]을 이용하여 상기 형광 분자가 입사레이저의 편광방향에 의하여 오프(off)상태가 되는 시점을 결정한다.
[수식1]
Figure pat00003
I(x,y) : 두 개의 형광분자의 형광 강도의 합
(x10, y10) , (x20, y20) : 두 개의 형광 분자 각각의 중심 위치
(w1x, w1y) , (w2x, w2y) : x축과 y축 방향 각각의 점상강도분포함수의 표준편차
θ : 입사레이저의 편광각도
φ : 두 개의 형광분자의 평면상의 각도 차이
Acos2θ , Bcos2(θ-φ) : 두 개의 형광 분자 각각의 가우시안피크의 진폭
C : 노이즈를 포함한 상수
두 형광분자의 점상 강도 분포 함수(PSF, point spread function)는 [수식 1]과 같이 각각 형광분자의 형광 강도(intensity)의 합에 의해 구성될 수 있다.
I(x,y)는 두 개의 형광분자의 강도의 합이고, (x10, y10) 및 (x20, y20)는 두 개의 형광분자 각각의 중심 위치이고, (w1x, w1y) 및 (w2x, w2y)는 x축과 y축 방향 각각의 점상 강도 분포 함수(PSF)의 표준 편차이고, θ는 입사레이저의 편광각도이고, φ는 두 개의 형광분자의 평면상의 각도 차이이고, Acos2θ 및 Bcos2(θ-φ)는 입사레이저의 편광방향과 각각의 형광분자의 전이 쌍극자 방향 사이의 상호작용에 의하여 결정되는 두 개의 형광 분자 각각의 가우시안피크의 진폭이고, C는 시스템으로부터의 노이즈를 포함한 상수이다.
임의의 편광 방향을 가지고 있는 입사빔이 입사되었을 때 한계 해상도 내에 위치하는 두 형광분자의 세기 프로파일(intensity profile)은 2D 가우시안 피팅으로 근사될 수 있으며 그 식은 아래 [수식 2]와 같다. 이 때, θ와 φ가 고정된 값이고, I0는 피크(peak)에서의 진폭을 의미한다.
[수식 2]
Figure pat00004
I(x,y): 두 개의 형광분자의 형광 강도의 합
(x0, y0): 결정된 형광분자의 좌표
(wx, wy): x축과 y축 방향 각각의 점상강도분포함수의 표준편차
C′: 노이즈를 포함한 상수
I(x,y)은 두 개의 형광분자의 형광 강도의 합이고,(x0, y0)은 가우시안 근사에 의해 결정된 새로운 형광분자의 좌표이며, (wx, wy)은 x축과 y축 방향 각각의 점상강도분포함수의 표준편차, C‘는 노이즈를 포함한 상수를 의미한다.
도 7은 입사레이저의 편광방향에 따른 두 개의 형광분자의 방출세기를 도시한 도면이다.
즉, 도 7에 따르면, 입사레이저의 편광 방향 변화에 따라서 발생하는 이중극자 방향이 직교하는 두 형광분자(거리는 150nm떨어져 있음)의 형광 세기 변화 및 두 형광분자의 중첩된 세기를 나타내는 프로파일(profile)을 알 수 있다.
이 때, [수식 2]에 의하여 2D 가우시안 함수로 근사되는 [수식 1]에 따른 중첩된 (super-positioned) 점상 강도 분포 함수(PSF)의 피크(peak)는 도 7의 빨간 선으로 도시한 바와 같이 더 밝은 형광분자의 위치로 이동함을 알 수 있다.
따라서, 가우시안 피팅에 의하여 결정된 위치들 중에서 형광분자와 가장 먼 위치일 때의 입사편광 방향은 방출되는 두 형광 분자 중 하나의 형광신호를 오프(off)상태로 만든다.
도 7에 따르면, 가우시안 피팅에 의해 결정된 위치들 중 가장 멀리 떨어진 거리에서의 두 형광분자의 위치를 실제 형광분자의 위치로 결정함으로써 한계 해상도 내의 두 형광분자 위치를 재구성할 수 있으며, 이때의 두 입사 편광 방향의 차이는 90°이며, 두 형광분자의 쌍극자 방향의 차이와 같으므로 형광 분자의 쌍극자 방향을 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 현미경 및 그를 이용한 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법을 이용하여, 홀리데이 정션(Holliday junction)의 입체구조를 측정할 수 있다.
본 측정을 위하여 본 발명의 일실시예는 도 8에 도시한 바와 같이 93 base pairs (bp) (~32 nm)의 네 방향 이중나선 DNA 정션(four-way double-stranded DNA junction, Holliday junction)을 제공한다. Cy3 형광분자는 three-carbon linker를 통하여 두 개의 인접한 DNA 가지의 5-terminal 인산염과 공유결합으로 각각 연결 하였고, 이때 Cy3는 DNA 끝단의 base pair 처럼 행동하여 DNA 끝단에 고정된다. Cy3-홀리데이 정션(Holliday junction)은 Cy3 형광분자의 쌍극자(dipole)의 방향을 한정하기 위하여, 폴리-L-라이신(PLL)이 코팅된 커버글래스 위에 고정을 하였다. PLL의 NH3+와 DNA backbone의 인산염 O-의 정전기적 인력에 의하여 Cy3-홀리데이 정션(Holliday junction)은 고정된다.
이중가닥 DNA(dsDNA, double-stranded DNA) 끝에 고정된 Cy3의 전이 쌍극자 평면(in plane) 방향은 DNA의 (base pair 끝단의 x-y평면의 정사영과 평행을 이루고, 알려진 이중가닥 DNA(dsDNA, double-stranded DNA)가 곧게 지속된 길이는 약 50nm이다. 도 8에 따르면, 홀리데이 정션(Holliday juntion)에 표지된 Cy3 형광분자의 전이쌍극자방향을 결정함으로써 홀리데이 정션(Holliday junction)의 브랜치(branch) 사이의 각도(Ø)를 결정할 수 있다.
이 때, 방출 신호를 이미징하는 과정에 있어서, 본 발명의 일실시예에 따르면 형광분자(Cy3)의 광안정성을 증가시키기 위해 이미징 버퍼(imaging buffer)를 사용하였으며, 버퍼의 조성성분은 3 mM of trolox, 0.8% (w/v) of D-glucose, 165 U/ml of glucose oxidase, and 2,170 U/ml of catalase의 산소 스캐빈징 시스템(oxygen-scavenging system)이 제공된다.
입사레이저에 의하여 형광분자의 구조가 손상되어 형광분자가 더 이상 형광을 방출하지 못하는 상태인 블리칭(bleaching)을 통해 형광 시그널 내에 두 개의 형광분자가 있음이 확인된 형광 이미지들은, 분석 소프트웨어인 매트랩을 이용한 2D 가우시안 함수의 최소제곱법(least-squares fit)을 통하여 형광분자의 중심위치를 결정할 수 있다.
두 형광체가 포토 블리칭 되지 않은, 50초 미만의 이미징 시간동안 발생하는 시료의 물리적인 x-y평면상의 위치 변화는 polynomial distortion correction을 이용하여 보정되었다.
회전하는 입사레이저의 편광 방향에 따라 규칙적인 진동(oscillating) 패턴을보이는 형광분자의 보정된 위치들은 도 10에 도시한 바와 같이 FFT 필터(fast Fourier transform filter)에 의하여 평활화(smoothed)된다.
공간적으로 고정된 이중극자의 점상강도분포함수(PSF, point spread function)는 입사레이저의 편광에 의하여 영향을 받는다. 형광 분자의 형광 세기 프로파일(profile)이 입사레이저의 편광에 의하여 비대칭적으로 형성되며 이를 2D 가우시안 함수(Gaussian function)의 최소제곱법(least squares fit)로 피팅하게 되면 결과적으로 위치 정확도에 오차가 발생한다. Enderlein(J. Enderlein, E. Toprak, and P. R. Selvin, Opt Express 14 (2006))에 의하면, 유효 CCD 픽셀 사이즈와 대물렌즈의 NA(numerical aperture)값에 따른 위치 정확도의 에러를 추산할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 100nm의 픽셀 사이즈와 1.49의 NA를 가지고 있고, 따라서 입사레이저의 편광에 의하여 발생하는 위치 에러는 수 나노미터보다 작을 것으로 예측할 수 있다.
도 9는 Cy3 방출신호의 대표적 타임 트레이스(time trace)를 도시하고, 도 9에 따르면 방출신호는 중공모터가 매 164ms마다 3.3° 의 스텝 각으로 계속적으로 회전할 때 사인 곡선으로 진동한다.
중공모터의 스텝 각은 이미징 하는 동안 각각 다른 시간에 이중극자들 중 하나의 이중극자 방향과 입사빔의 편광 방향이 직교하여 형광분자의 형광 방출을 제한하기에 충분하도록 작은 값을 가진다.
도 9에 의하면 Cy3의 방출 강도는 62s에서 거의 0에 이를 정도로 급감하는데, 이는 2개의 Cy3 형광체 중 하나가 50s와 62s사이에서 포토블리칭(photobleaching) 되는 것을 의미한다. 또한, 입사레이저의 회전이 145s에서 멈춘 이후에, 남아있는 Cy3의 형광신호는 더 이상 진동하지 않으며, 남아있는 Cy3의 포토블리칭(photobleaching)에 의하여, 형광분자의 방출신호는 171s에 갑자기 사라진다. 이에 의하여, 방출신호의 중심위치는 2-4nm의 위치 정확도로 결정된다.
입사레이저의 방향에 따라 결정된 방출신호의 위치 패턴은 편광의 방향은 도 10에 도시된 바와 같이 FFT 필터(fast Fourier transform filter)를 사용하여 평활화하였다.
평활화된 진동하는 위치 패턴정보들 중 가장 먼 거리에 있는 위치 진동 패턴의 피크인 순간은, 하나의 형광분자가 온(on)되고 다른 형광분자는 오프(off)되었을 때를 의미하며, 이 때의 위치 및 입사레이저의 정보를 이용하여 형광체 위치와 전이 이중극자 방향 정보를 확인할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 의하면, 입사레이저의 편광의 변화에 따른 5번의 성공적인 이미징 주기를 통해 이중극자 위치의 두 클러스터를 얻을 수 있으며, 이는 도 9 및 10에 도시된다. 또한, 클러스터들이 나타내는 정보는 형광 분자(Cy3)의 이중극자 방향을 포함한다.
이 때, 형광분자인 Cy3의 이중극자 위치를 나타내는 다섯 주기의 평균값은 각각 , [Rcm-1 = (49.1±3.0nm, 40.9±3.3nm) 와 Rcm-2 = (72.2±2.6nm, 15.9±4.2nm)] 이며, 이 두 점사이의 거리는 34.0 nm (±4.8nm, s.d.)이다. 또한 Cy3의 전이이중극자 각도는 θcm-1 = 46.8 ± 13.6° 와 θcm-2=155.4±19.1°(means ±s.d.)로 측정되었으며, 이는 입사레이저의 방향을 기준으로 한 상대 각도이다.
이 때, 두 형광분자의 이중극자 사이의 각도 (φ= 108.6°)는 θcm-1 와 θcm-2 사이의 차이에 의하여 획득된다.
이 때, 도 6 및 도 8에 도시된 바와 같이, 홀리데이 정션(Holliday junction)의 두 가지 사이의 각도 (θ = 71.4°±23.4°, means ±s.d.)는 φ=108.6°와 보각이다.
형광분자의 2개의 브랜치(branch)의 끝단 사이의 거리(D)는 [수식 3]에 의하여 구할 수 있으며, 36.5nm이다.
[수식 3]
Figure pat00005
이 때, a와 b는 도 8에서 도시한 홀리데이 정션(Holliday junction)의 두 브랜치(branch)의 각각의 길이를 의미한다. 도 11에 도시한 바와 같이, 측정된 거리(34.0 ± 4.8 nm)는 계산된 D(36.5nm) 값과 일치함을 확인할 수 있다.
도 9에서 63s 내지 144s 사이의 구간에 도시된 바와 같이, 두 개의 Cy3 형광분자 중 하나의 위치와 이중극자 방향은 포토블리칭에 의해 하나만 남은 Cy3에 대한 진동하는 형광 방출 트레이스(trace)를 이용하여 직접적으로 확인할 수 있다.
직접적으로 획득한 하나의 Cy3의 좌표[(x, y; θ) = (48.2 ± 1.8 nm, 43.2 ± 0.9nm; 52.0 ± 3.7°)]는 Rcm-1 및 θcm-1와 거의 동일하였다.
본 발명의 또다른 실시예는 도 12에서 도시한 바와 같이, 더 짧은 브랜치(branch)들로 구성된 홀리데이 정션(Holliday junction)을 이미징하였다.
두 개의 형광분자의 중심위치인 Rcm-1((50.3 ±21.nm, 21.5±0.4nm)) 및 Rcm-2 ( (33.4±1.2nm, 38.0±1.4nm))사이의 거리는, 네 번의 주기를 통한 이중극자 위치들에 의하여 결정되고, 이는 23.6 nm (±2.0nm; s.d.)이다. 그리고 Cy3의 전이 이중극자 각도는 θcm-1 = 162.7 ± 5.9° 및 θcm-2 = 59.0 ± 7.1° (means ±s.d.)로 측정되었으며, 이는 입사레이저의 방향을 기준으로 한 상대각도이다.
홀리데이 정션(Holliday junction)의 두 브랜치(branch, 43 bp and 45 bp)사이의 각도(103.7 ± 9.2°, mean ±s.d.)는 두 각도(θcm-1 및 θcm-2)사이의 차이의 보각으로 정하여 진다. 두 브랜치(branch)의 끝단 사이에 측정된 거리(23.6 ± 2.0nnm)는 계산된 값(23.5 nm)과 거의 동일하였다.
도 13는 홀리데이정션의 브랜치사이의 거리 및 브랜치 사이의 각도를 도시한 그래프이다.
본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 현미경 및 그를 이용한 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 도 14에 도시된 바와 같이, 다양한 홀리데이 정션(Holliday junction)들의 D(인접한 브랜치 사이의 거리)와 Ø(인접한 브랜치 사이의 각도)를 결정하였다.
도 13에 의하면, 93-93 bp-branch (푸른 직사각형; N = 19) 과 43-45 bp-branch 홀리데이정션(Holliday junction) (붉은 직사각형; N = 22)의 실험데이터(D 및 Ø)는 예측되는 값과의 Pearson's correlation coefficient가 각각 r93-93 = 0.85 및 r43-45 = 0.85로 나타났으며, 실험값과 예측 값이 거의 일치하는 결과를 얻었다. 이때 예측값은 [수식 3]을 이용하여 Ø에 의한 함수(실선으로 도시됨)로 계산된 D를 구한 것이다.
이러한 결과는 홀리데이 정션( Holliday junction)의 2D 구조를 결정함에 있어서 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법의 타당성을 보여준다.
즉, 입사레이저의 편광에 의한 포토스위칭(photo-switching)을 이용하여, 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 현미경 및 그를 이용한 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 홀리데이 정션(Holliday junction)의 인접한 두 브랜치(branch)의 끝단에 표지된 Cy3 형광분자들 간의 거리 및 그 형광 분자의 이중극자 각도를 측정함으로써, 수 디그리(degree) 수준의 정확도와 10nm 수준의 해상도로 DNA 홀리데이 정션(Holliday junction)의 2D 기하학적 구조를 이미징할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 예측가능한(non-stochastic) 포토 스위칭 제어 와이드필드(wide-field) 전반사 현미경에 의한 단분자 이미징에 기반하며, 이는 한계 해상도 내에 있는 생체분자들의 방향성에 관한 정보와 위치 정보를 포함한 나도 구조물을 볼 수 있는 간단하고 예측가능한 포토스위칭 이미징 법을 제공한다.
즉, 본 발명에 따른 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법은 한계 해상도 내에 있는 두 형광 분자의 공간적 위치를 결정하고 동시에 그 분자들의 이중극자 방향을 정확하게 결정하는 효과가 있다.
본 명세서에서 설명되는 실시예와 첨부된 도면은 본 발명에 포함되는 기술적 사상의 일부를 예시적으로 설명하는 것에 불과하다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이므로, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아님은 자명하다. 본 발명의 명세서 및 도면에 포함된 기술적 사상의 범위 내에서 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 변형 예와 구체적인 실시 예는 모두 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
10: 입사레이저도입부 20: 형광분자신호이미징부
30: 형광분자신호분석부 11: 제1 1/4 파장판
12: 미러 13: 렌즈
14: 제2 1/4 파장판 15: 웨지프리즘
16: 다이크로익미러 17: 모터

Claims (8)

  1. 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법에 있어서,
    입사레이저의 편광방향과 형광분자의 이중극자가 이루는 각도에 따라서 강도가 변하는 형광 분자 신호를 이미징하는 형광분자 신호 이미징단계(S30); 및
    상기 형광분자 신호 이미징단계에서 이미징한 형광 분자 신호를 분석하는 형광분자신호분석단계(S40);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    1/4파장판(14) 및 웨지프리즘(15)은 모터(17)에 의하여 회전되어, 선형편광된 레이저를 회전시키는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    회전하는 선형편광 레이저가 상기 웨지프리즘(15)에 의해 대물렌즈를 통과한 후 전반사되며 발생하는 소실파의 편광은 현미경의 샘플 스테이지 평면에 평행한 방향을 이루면서 회전하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 형광분자 신호 분석단계(S40)는 [수식 1]을 이용하여 표현된 두 개의 형광 분자의 형광 패턴을 [수식 2]를 이용하여 피팅하고, 형광 강도가 가장 센 부분을 새로운 형광 분자의 좌표로(x0, y0) 결정하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 방법.
    [수식1]
    Figure pat00006

    I(x,y) : 두 개의 형광분자의 형광 강도의 합
    (x10, y10) , (x20, y20) : 두 개의 형광 분자 각각의 중심 위치
    (w1x, w1y) , (w2x, w2y) : x축과 y축 방향 각각의 점상강도분포함수의 표준편차
    θ : 입사레이저의 편광각도
    φ : 두 개의 형광분자의 평면상의 각도 차이
    Acos2θ , Bcos2(θ-φ) : 두 개의 형광 분자 각각의 가우시안피크의 진폭
    C : 노이즈를 포함한 상수

    [수식 2]
    Figure pat00007

    I(x,y): 두 개의 형광분자의 형광 강도의 합
    (x0, y0): 결정된 형광분자의 좌표
    (wx, wy): x축과 y축 방향 각각의 점상강도분포함수의 표준편차
    C′: 노이즈를 포함한 상수
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광분석신호분석단계(S40)는 상기 [수식 2]를 통하여 결정된 좌표 중 최대 거리의 두 좌표를 유도하는 시점의 입사레이저의 편광방향이 상기 두 개의 형광 분자 중 하나의 형광 분자의 형광신호가 검출되지 않는 시점으로 결정하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 형광분자신호분석단계(S40)는 형광 분자 신호가 검출되지 않은 형광 분자의 이중극자 방향을 상기 두 개의 형광 분자중 하나의 형광 분자 신호가 검출되지 않는 순간의 상기 입사레이저의 방향과 90°의 차이를 이루는 방향으로 결정하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 방법.
  7. 입사레이저도입부(10)는 선형 편광된 입사레이저를 두 개의 형광 분자에 도입하고, 형광분자 신호 분석부(30)는 [수식 2]를 이용하여 상기 입사 레이저에 의하여 방출되는 형광분자 신호를 분석하여, 상기 형광분자의 위치정보(x0, y0)를 획득하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광 분자의 이중극자 방향 감지 현미경.
    [수식 2]
    Figure pat00008

    I(x,y): 두 개의 형광분자의 형광 강도의 합
    (x0, y0): 결정된 형광분자의 좌표
    (wx, wy): x축과 y축 방향 각각의 점상강도분포함수의 표준편차
    C′: 노이즈를 포함한 상수
  8. 제7항에 있어서,
    상기 형광분자 신호 분석부(30)는 상기 입사레이저의 편광방향과 형광분자의 이중극자가 이루는 각도에 따라서 변하는 형광분자신호의 강도를 분석하여 상기 형광분자의 이중극자의 방향정보를 획득하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 촬상 및 형광분자의 이중극자 방향 감지 현미경.
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