KR20140062197A - Composition for the direct nucleic acid amplification and nucleic acid amplifying method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 직접 핵산 증폭용 조성물 및 이를 이용한 직접 핵산의 증폭방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for direct nucleic acid amplification and a method for amplifying a direct nucleic acid using the same.
분자생물학적 기법 및 유전체학의 발달로 인하여 방대한 유전체 정보를 활용한 맞춤 의학 시대의 도래와 종래의 진단 기법에서 유전 정보를 이용한 분자 진단 기법은 놀라운 기술적 발전을 거듭하여 수 천 가지 진단 반응 및 여러 수준의 돌연변이들을 동시에 검사할 수 있게 되었다. 일반적인 분자 진단방법은 특정 시료로부터 핵산 정제 과정을 거친 다음 정제된 핵산을 이용하여 핵산 증폭 과정을 통해 이루어 진다. 그러나 핵산 정제 과정은 특수한 장비(예, 원심분리 등)를 사용해야 하는 복잡함과 대량의 시료를 처리하기에는 많은 시간이 필요하고 번거롭기 때문에 신속한 진단을 위해서 방대한 양의 시료를 처리하기에 부적합하다. 물론 최근에 쉽고 빠르고 핵산을 정제할 수 있는 제품 및 핵산 정제를 위한 자동화 장비가 많이 개발되어 있지만 이 또한 어느 정도 이상 시료들을 처리하기에 번거롭기는 마찬가지이다. 그래서 이러한 문제들을 해결하고 신속한 분자진단 실현을 위해서는 핵산 정제 과정없이 시료로부터 직접 핵산 증폭이 가능한 방법이 필요하다.Due to the development of molecular biology techniques and genomics, the advent of customized medicine using vast amounts of genomic information and molecular diagnostic techniques using genetic information in conventional diagnostic techniques has resulted in incredible technological advances, resulting in thousands of diagnostic responses and multiple levels of mutation Can be tested simultaneously. A general molecular diagnostic method is a nucleic acid amplification process using a purified nucleic acid after a nucleic acid purification process is performed from a specific sample. However, the nucleic acid purification process is not suitable for handling large volumes of samples for rapid diagnosis because of the complexity of using specialized equipment (eg, centrifugation) and the time and labor required to process large volumes of samples. Of course, there have been many recently developed automated and easy-to-use products for nucleic acid purification and nucleic acid purification, but this is also a cumbersome task to process samples over a certain period. Therefore, in order to solve these problems and realize rapid molecular diagnosis, there is a need for a method capable of amplifying nucleic acid directly from a sample without a nucleic acid purification process.
혈액 시료는 증폭 반응, 특히 PCR에 의해 분석되는 시료로 사용된다. 그러나 혈액 내에 존재하는 다양한 중합효소 억제제들 때문에 혈액을 직접적인 시료로 사용하는 데는 한계가 있다. 혈액 내에 본래부터 고유하게 존재하는 활성 억제제들로는 헴(heme), 면역글로블린 G([Ig G), 염(예컨대, K+ 및 Na+), 담즙염과 혈액 세포에 내재되어 있는 DNA 분해효소와 단백질 분해효소가 있다. 더욱이, EDTA, 헤파린 및 구연산나트륨과 같은 혈액 응고 억제제는 중합 반응, 특히 PCR에 대한 강한 억제작용을 나타낸다.Blood samples are used as samples to be analyzed by amplification reactions, especially PCR. However, because of the various polymerase inhibitors present in the blood, there is a limit to using blood as a direct sample. Activity inhibitors that are inherently inherently present in blood include but are not limited to heme, immunoglobulin G ([IgG], salts such as K + and Na + ), bile salts and DNA degrading enzymes and proteins There is decomposition enzyme. Moreover, blood coagulation inhibitors such as EDTA, heparin and sodium citrate exhibit a strong inhibitory effect on polymerization reactions, particularly PCR.
일반적인 핵산 증폭 버퍼 조건에서는 혈액 및 여러 조직 시료로부터 핵산 정제 과정 없이 직접 핵산증폭을 하면 시료 내에 존재하는 여러 핵산증폭 억제제들에 의해 핵산증폭 반응이 약하거나 거의 일어나지 않는다. 최근에 혈액이나 혈액 조성물과 같은 정제되지 않은 시료로부터 핵산 정제 과정 없이 핵산을 증폭하기 위하여 트레할로스(trehalose), 카르니틴(carnitine), 비이온성 세제(non-ionic detergent) 및 헤파린(heparin)을 첨가하여 직접 핵산 증폭이 가능한 조성물을 제시하고 있다.In normal nucleic acid amplification buffer conditions, nucleic acid amplification is weak or rarely caused by various nucleic acid amplification inhibitors present in the sample when nucleic acid amplification is performed directly from the blood and various tissue samples without nucleic acid purification. Carnitine, non-ionic detergent and heparin are added to directly amplify nucleic acid from an unpurified sample such as a blood or blood composition without purification of the nucleic acid. A nucleic acid amplification-capable composition is proposed.
상기의 방법들은 혈액 시료를 직접적으로 이용한 중합효소 연쇄반응의 가능성을 제시하고는 있지만, 특별한 전처리 과정이 필요하다거나 직접적 증폭 반응의 실제적인 환경을 반영하지 못하였다.Although the above methods suggest the possibility of directly using polymerase chain reaction, there is a need for a special pretreatment process or does not reflect the actual environment of the direct amplification reaction.
본 발명자들은 생물학적 시료를 직접적으로 이용한 핵산 분자의 직접적인 효소 반응을 실시하는 독특한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 특정 성분의 종류 및 그 특정 성분의 농도가 생물학적 시료 내 핵산 분자의 정제 없이도 PCR 반응을 가능하게 한다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have intensively studied to develop a unique method of directly reacting a nucleic acid molecule using a biological sample directly. As a result, it has been found that the kind of a specific component and the concentration of the specific component can be used to purify a nucleic acid molecule in a biological sample And thus the present invention has been completed.
본 발명의 목적은 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 직접 핵산 증폭용 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a composition for direct nucleic acid amplification which does not require purification of a nucleic acid present in a biological sample.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 직접 핵산 증폭용 조성물을 생물학적 시료에 직접적으로 적용하는 직접 핵산을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for directly amplifying a direct nucleic acid to which a composition for amplifying a direct nucleic acid is directly applied to a biological sample.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 직접 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a composition for amplifying a direct nucleic acid which does not require purification of a nucleic acid present in a biological sample.
또한 본 발명은 상기 직접 핵산 증폭용 조성물을 생물학적 시료에 직접적으로 적용하는 직접 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for directly amplifying a direct nucleic acid to which a composition for amplifying a direct nucleic acid is directly applied to a biological sample.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 있어서, ‘직접 핵산 증폭’이란 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산을 추출 또는 정제와 같은 어떠한 전처리 과정을 거치치 않고 생물학적 시료를 직접 이용하는 증폭 반응을 의미한다.In the present invention, 'direct nucleic acid amplification' refers to an amplification reaction in which a biological sample is directly used without any pretreatment such as extraction or purification of a nucleic acid present in the biological sample.
본 발명에 있어서, ‘증폭 반응’은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 ‘PCR’이라 한다.)을 의미한다. In the present invention, an 'amplification reaction' means a reaction for amplifying a nucleic acid molecule. A variety of amplification reactions have been reported in the art and refer to a polymerase chain reaction (PCR).
본 발명에 있어서, ‘PCR’이란, 특정의 DNA 영역을 사이에 둔 2종류의 프라이머와 DNA 중합효소(내열성 DNA 폴리머라아제)를 이용하여 시험관 내에서 반복적인 DNA 합성반응을 통해 특정 DNA 영역을 증폭하는 방법이며, 유전자공학분야에서 일반적으로 이용되고 있는 주지기술을 의미한다.In the present invention, the term "PCR" refers to a method in which a specific DNA region is repeatedly subjected to a DNA synthesis reaction in vitro using two kinds of primers and a DNA polymerase (heat-resistant DNA polymerase) Amplification, and means well-known techniques commonly used in the field of gene engineering.
본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 핵산 증폭용 조성물에 있어서,The present invention relates to a nucleic acid amplification composition which does not require purification of a nucleic acid present in a biological sample,
상기 조성물은 트리신(tricine) 반응 완충용액, 베타인(betaine), dNTPs, DNA 중합효소, 및 지시약을 포함하는 직접 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.The composition provides a composition for direct nucleic acid amplification comprising a tricine reaction buffer solution, betaine, dNTPs, a DNA polymerase, and an indicator.
본 발명의 일 실시예에 따른 트리신(tricine) 반응 완충용액은 전형적으로 물에 트리신 염기를 녹이고, HCl를 첨가하여 원하는 pH를 얻어 제조될 수 있다. A tricine reaction buffer according to one embodiment of the present invention is typically prepared by dissolving trisine base in water and adding HCl to obtain the desired pH.
본 발명의 일 실시예에 따른 반응 완충용액의 완충성분으로는 트리신(tricine)을 사용할 수 있고, 바람직하게는 트리신 반응 완충용액 특히 pH 8.0 내지 9.0의 반응 완충용액을 사용한다. As a buffer component of the reaction buffer solution according to an embodiment of the present invention, tricine may be used, and preferably, a reaction buffer solution of tricine buffer solution, particularly pH 8.0 to 9.0, is used.
본 발명의 일 실시예에 따른 트리신 반응 완충용액은 통상의 PCR 반응시 이용되는 반응 완충용액의 성분인 트리스(Tris) 사용시 보다 PCR 반응시 안정성을 증대시키고, PCR 반응의 억제요인(inibitor)을 제어하여 PCR 반응이 효율적으로 이루어질 수 있도록 하는 장점이 있다. The trisin reaction buffer solution according to one embodiment of the present invention increases the stability during the PCR reaction and suppresses the inhibition factor of the PCR reaction (inibitor) when using Tris which is a component of the reaction buffer solution used in the usual PCR reaction And thus the PCR reaction can be efficiently performed.
보다 상세하게는 혈액 시료를 사용하여 트리스(Tris) 반응 완충용액과 트리신(tricine) 반응 완충용액을 사용하여 PCR을 진행하여 반응 완충용액에 따른 PCR 반응의 효율을 확인하였다. 그 결과 트리스(Tris) 반응 완충용액을 사용했을 때는 혈액 1 ul를 사용했을 경우에만 약하게 타겟 핵산증폭이 되었지만, 트리신(tricine) 반응 완충용액을 사용했을 경우 혈액의 양을 약 5 ul까지 사용하여도 PCR이 진행되어, 우수한 타겟 핵산의 증폭 효과를 확인하였다. More specifically, PCR was carried out using a blood sample using a Tris reaction buffer and a tricine reaction buffer solution to confirm the efficiency of the PCR reaction according to the reaction buffer solution. As a result, when Tris reaction buffer solution was used, the target nucleic acid amplification was weak only when 1 μl of blood was used. However, when the tricine reaction buffer solution was used, the amount of blood was used up to about 5 μl , The amplification effect of the excellent target nucleic acid was confirmed.
상기의 결과를 통하여 트리신(tricine) 반응 완충용액이 트리스(Tris) 반응 완충용액 보다 혈액의 양이 증가하여도 PCR 반응의 억제요인(inibitor)을 제어하여 PCR 반응이 효율적으로 이루어질 수 있도록 하는 것을 확인하였다. 도 2를 참조한다.The above results indicate that the tricine reaction buffer solution can control the inhibitory factor (inibitor) of the PCR reaction even when the amount of blood is higher than that of the Tris reaction buffer solution so that the PCR reaction can be efficiently performed Respectively. See FIG.
본 발명의 일 실시예에 따른 dNTPs는 핵산의 증폭 반응 시 GATC 합성을 위해 첨가되는 것으로서, 구아노신, 아데노신, 티미딘, 유리딘 및 시티딘으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.The dNTPs according to an embodiment of the present invention may be added to GATC synthesis in the amplification of nucleic acid, and may include one or more selected from guanosine, adenosine, thymidine, uridine, and cytidine.
상기 dNTPs는 최종 반응액을 기준으로 0.05 내지 1.0 mM, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 mM 농도를 포함한다. 만약 농도가 0.05 mM 미만 또는 1.0 mM를 초과할 경우 핵산 증폭반응에 의한 핵산 증폭이 원활하게 수행되지 않는다.The dNTPs include a concentration of 0.05 to 1.0 mM, preferably 0.1 to 0.5 mM based on the final reaction solution. If the concentration is less than 0.05 mM or more than 1.0 mM, amplification of the nucleic acid by the nucleic acid amplification reaction can not be performed smoothly.
본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 중합효소로는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소, Tfl DNA 중합효소, Hot Tub DNA 중합효소, Ultma DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, Tli DNA 중합효소, Pwo DNA 중합효소 등(이상 제품명)이 그 예로 제시될 수 있으나 본 발명이 이에만 국한되지 않음은 당연하다.A DNA polymerase according to one embodiment of the invention is Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Tfl DNA polymerase, Hot Tub DNA polymerase, Ultma DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Vent DNA polymerase, Tli DNA polymerase, Pwo DNA polymerase, and the like (the above product name) may be presented as an example, but the present invention is not limited thereto.
본 발명에 있어 지시약은 전기영동시 DNA의 진행 정도를 가늠하고 젤에 부하 (loading)하기 쉽게 하기위한 구성을 포함할 수 있다. In the present invention, the indicator may include an arrangement for measuring the progress of DNA during electrophoresis and for facilitating loading on the gel.
본 발명의 일 실시예에 따른 지시약은 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 페놀 레드(phenol red), 크레졸 레드(cresol red), 쿠마시 블루(coomassie blue), 레마졸 블루(remazol blue), 및 레마졸 바이올엣(Remazol violet)으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있다.The indicator according to one embodiment of the present invention may be selected from the group consisting of bromophenol blue, phenol red, cresol red, coomassie blue, remazol blue, Remazol violet, and the like can be used.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 지시약의 최종 농도는 최종 반응액을 기준으로 0.001 내지 0.5%(w/v), 바람직하게는 0.002 내지 0.09%(w/v)를 포함할 수 있다.In addition, the final concentration of the indicator according to an embodiment of the present invention may include 0.001 to 0.5% (w / v), preferably 0.002 to 0.09% (w / v) based on the final reaction solution.
만약 지시약의 최종 농도가 0.001%(w/v) 미만으로 포함할 경우 타겟 핵산의 증폭 효율이 미비하며, 0.5%(w/v)를 초과할 경우 오히려 PCR 반응 효율이 낮아지거나 억제되는 문제점이 있다. If the final concentration of the indicator is less than 0.001% (w / v), the amplification efficiency of the target nucleic acid is insufficient, and if the concentration exceeds 0.5% (w / v), the efficiency of PCR reaction is lowered or suppressed .
본 발명의 일 실시예에 따른 지시약은 혈액을 직접 사용한 PCR 반응에서 혈액 내에 존재하는 많은 PCR 반응의 근본적인 억제요인(inibitor)을 근본적으로 감소시키고, 비특이적 반응을 제어하여 타겟 핵산의 증폭효율을 개선시켜주는 증진제(enhancer) 역할을 한다.The indicator according to one embodiment of the present invention fundamentally reduces the fundamental inhibitory factor (inibitor) of many PCR reactions existing in the blood in a PCR reaction using blood directly, and improves amplification efficiency of target nucleic acid by controlling nonspecific reaction It acts as an enhancer.
보다 상세하게는 혈액을 직접 사용한 PCR 반응에서 지시약의 존재여부에 따른 핵산의 증폭량을 확인한 결과, 지시약의 일 예인 브로모페놀 블루(Bromophenol blue)를 첨가한 경우, 첨가하지 않았을 때 보다 타겟 핵산의 증폭량이 더 많아지는 것을 확인할 수 있었다. 도 3을 참고한다.More specifically, when the amplification amount of nucleic acid was checked according to the presence or absence of the indicator in a PCR reaction using blood directly, the addition of bromophenol blue, which is one example of the indicator, As shown in FIG. See FIG.
본 발명의 직접 핵산 증폭용 조성물은 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 혈액을 이용한 PCR 반응시 트리신(tricine) 반응 완충용액 내에 증폭효율의 개선을 위하여 베타인(betaine)을 첨가할 수 있다.The composition for amplifying a direct nucleic acid of the present invention is characterized in that a betaine is added to improve the amplification efficiency in a tricine reaction buffer solution in a PCR using a blood in which purification is not necessary for the nucleic acid present in the biological sample can do.
본 발명의 일 실시예에 따른 베타인(betaine)은 DNA 헬릭스 불안정화에 관련된 물질이며, 이는 트리신(tricine) 반응 완충용액과 함께 PCR 증진제(enhancer) 역할을 한다. According to one embodiment of the present invention, betaine is a substance related to DNA helix destabilization, which acts as a PCR enhancer together with a tricine reaction buffer solution.
보다 상세하게는 트리스(Tris) 반응 완충용액과 트리신(tricine) 반응 완충용액에 베타인(betaine)의 첨가 유무에 따른 PCR 반응의 증폭효율을 조사하였다. 그 결과 트리스(Tris) 반응 완충용액을 사용했을 때는 베타인 첨가 유무에 상관없이 지시약에 의한 직접 핵산의 증폭 증대효과는 나타나지 않았으며, 베타인의 첨가없이 지시약만을 첨가한 경우 베타인을 첨가하지 않았을 때보다 오히려 PCR 억제현상이 두드러지는 것을 확인하였다. More specifically, the amplification efficiency of PCR reaction was investigated by the addition of betaine to Tris reaction buffer and tricine buffer solution. As a result, when the Tris reaction buffer was used, the amplification effect of the direct nucleic acid by the indicator was not exhibited regardless of whether the betaine was added or not. When the indicator was added without the addition of the betaine, Rather, it was confirmed that the PCR inhibition phenomenon was prominent.
반면, 트리신(tricine) 반응 완충용액에 베타인 및 지시약을 모두 첨가하여 PCR 반응을 수행할 경우, PCR 반응의 안정성을 높일 수 있을 뿐만 아니라 나아가 직접 핵산의 증폭 효과를 증대할 수 있음을 확인하였다. On the other hand, it has been confirmed that when the PCR reaction is performed by adding both the betaine and the indicator to the tricine reaction buffer solution, the stability of the PCR reaction can be enhanced and the amplification effect of the direct nucleic acid can be further increased .
상기의 결과는 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 핵산 증폭 반응시 트리신(tricine) 반응 완충용액, 베타인, 그리고 지시약 모두의 상호작용에 의해 우수한 직접 핵산의 증폭 증대효과가 나타나는 것을 확인한 것이다. 도 8을 참고한다. The above results indicate that the amplification effect of direct nucleic acid is superior due to the interaction of both the tricine reaction buffer solution, betaine, and indicator in the nucleic acid amplification reaction in which purification of the nucleic acid present in the biological sample is not necessary . See FIG.
상기 본 발명에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 별개로 포장되거나 또는 성분의 어느 조합된 하나 이상의 혼합물로 포장된 추출 조성물의 성분들을 함유하는 키트로 제공될 수 있다. The composition for amplifying a direct nucleic acid according to the present invention may be provided as a kit containing components of the extract composition packaged separately or as a mixture of any combination of the components.
이와 같이, 키트는 예를 들어 별도의 용기에 각각이 포장된 추출 용액 및 시료 제조 용액을 함유할 수 있다.As such, the kit may contain, for example, an extraction solution and a sample preparation solution each packaged in a separate container.
임의로, 다른 성분, 예를 들어 중성화 용액도 키트 내에 포함될 수 있다. 추가로, 키트도 키트 형태로 상업적으로 구입가능 한, PCR 증폭을 수행하기 위한 성분을 함유할 수 있다.Optionally, other components, such as a neutralization solution, may also be included in the kit. In addition, kits may contain components for performing PCR amplification, which are commercially available in kit form.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 직접 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for amplifying a direct nucleic acid comprising the steps of:
(a) Tricine 반응 완충용액, 베타인(betaine), dNTPs, DNA 중합효소, 및 지시약을 포함하는 직접 핵산 증폭용 조성물을 생물학적 시료에 혼합하여 반응 혼합물을 제조하는 단계; 및(a) preparing a reaction mixture by mixing a composition for direct nucleic acid amplification comprising a Tricine reaction buffer solution, betaine, dNTPs, a DNA polymerase, and an indicator into a biological sample; And
(b) 상기 반응 혼합물을 이용하여 생물학적 시료로부터 타겟 핵산을 증폭하는 단계;(b) amplifying the target nucleic acid from the biological sample using the reaction mixture;
본 발명의 일 실시예에 따른 직접 핵산을 증폭하는 방법은 PCR 결과에 영향을 미치는 요인이 특정 성분의 종류일 수도 있고, 그 특정 성분의 농도일 수도 있다.In the method of amplifying a direct nucleic acid according to an embodiment of the present invention, factors affecting the PCR result may be a kind of a specific component or a concentration of the specific component.
본 발명의 일 실시예에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 최종 반응액을 기준으로 dNTPs 0.05 내지 1.0 mM, MgCl2 1 내지 10 mM, 베타인 0.05 내지 1 M, DNA 중합효소 1 내지 10 unit/㎕, 및 0.001 내지 0.5%(w/v) 지시약을 포함할 수 있다. The composition for direct nucleic acid amplification according to an embodiment of the present invention may contain 0.05-1.0 mM of dNTPs, 1 to 10 mM of MgCl 2 , 0.05-1 M of betaine, 1 to 10 unit / μL of DNA polymerase, And 0.001 to 0.5% (w / v) indicator.
본 발명의 일 실시예에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 최종 반응액을 기준으로 dNTPs 0.1 내지 0.5 mM, MgCl2 2 내지 6 mM, 베타인 0.1 내지 0.5 M, DNA 중합효소 3 내지 7 unit/㎕, 및 0.002 내지 0.09%(w/v)의 지시약을 포함할 수 있다. The composition for direct nucleic acid amplification according to an embodiment of the present invention may contain 0.1 to 0.5 mM of dNTPs, 2 to 6 mM of MgCl 2 , 0.1 to 0.5 M of betaine, 3 to 7 unit / And 0.002 to 0.09% (w / v) of indicator.
본 발명의 일 실시예에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물을 사용함으로써 생물학적 시료에 존재하여 효소 반응을 억제하는 물질들에 의한 장애를 극복할 수 있다.By using the composition for amplifying a direct nucleic acid according to an embodiment of the present invention, it is possible to overcome the obstacle caused by the substances which are present in the biological sample and inhibit the enzyme reaction.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 생물학적 시료는 (a) 단계의 반응 혼합물을 제조하기 전, 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 것으로, 상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 한다. The biological sample according to an embodiment of the present invention does not require purification of the nucleic acid present in the biological sample before the reaction mixture of step (a) is prepared, and the biological sample is blood.
본 발명에 있어서 혈액은 반응 혼합물에 첨가되기 전에, 헤파린, EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid) 및 구연산과 같은 항응고제로 전처리 하는 것이 바람직하다. 그러나, 항응고제는 효소 반응, 특히, PCR 작용을 억제하기 쉬우며, 이러한 이유로 항응고제는 PCR 반응에 첨가되는 혈액의 양을 결정하는데 제한 요소가 된다. 본 발명에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 항응고제에 의한 상기 결점을 극복할 수 있으며, 직접 증폭에 있어서 기존에 사용하는 혈액 양보다 많은 양의 혈액을 사용 가능하게 하는 장점이 있다.In the present invention, it is preferable that the blood is pretreated with an anticoagulant such as heparin, EDTA (ethylene diaminetetraacetic acid) and citric acid before it is added to the reaction mixture. However, the anticoagulant is liable to inhibit the enzyme reaction, in particular, the PCR action, and for this reason, the anticoagulant is a limiting factor in determining the amount of blood added to the PCR reaction. The composition for amplifying a direct nucleic acid according to the present invention can overcome the above drawbacks caused by an anticoagulant and has an advantage that a larger amount of blood than that used in the conventional method can be used for direct amplification.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명은 추출하고자 하는 대상이 되는 혈액 1 내지 5 ㎕에 접 핵산 증폭용 조성물 30 내지 100 ㎕를 첨가하여 사용할 수 있으며, 40 내지 60 ㎕가 사용되는 것이 바람직하다.According to a preferred embodiment of the present invention, 30 to 100 μl of the nucleic acid amplification composition may be added to 1 to 5 μl of the blood to be extracted, and 40 to 60 μl is preferably used .
본 발명에 일 실시예에 따른 직접 핵산을 증폭하는 방법은 프라이머 종류, 프라이머의 농도, PCR 반응시간, PCR 반응 주기 수, 및 PCR 적용 온도의 조정을 통해서, 타겟 핵산의 증폭에 가장 잘 맞는 PCR 조건의 확인 및 설정은 물론, 적합 PCR 제품을 선택할 수도 있다.The method of amplifying a direct nucleic acid according to an embodiment of the present invention may be performed by adjusting the PCR primer type, the concentration of the primer, the PCR reaction time, the number of PCR reaction cycles, PCR products, as well as confirmation and setting of PCR products.
혈액 시료는 핵산 정제 과정을 거칠 경우 많은 시간과 노력이 필요로 하며 정제 과정 중에 샘플의 손실 또는 샘플들 간의 오염이 발생할 수도 있다. 본 발명에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 혈액으로부터 DNA를 정제과정을 거치지 않고 혈액을 바로 핵산 증폭반응에 사용할 수 있는 장점이 있다.Blood samples require a great deal of time and effort when subjected to nucleic acid purification, and may result in sample loss or contamination between samples during the purification process. The composition for amplifying a direct nucleic acid according to the present invention is advantageous in that blood can be directly used for nucleic acid amplification reaction without purification process of DNA from the blood.
또한, 본 발명에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 핵산 증폭 반응의 주형인 DNA를 혈액으로부터 정제 과정없이 바로 핵산 증폭 반응에 이용할 수 있으므로 다량의 샘플들을 처리하기 위해 드는 시간과 비용 및 소요되는 인력을 절감할 수 있는 장점이 있다. 또한 DNA 정제 과정을 거치지 않기 때문에 신속하고 간편하게 분자 진단을 위한 상황에서 재빨리 결과를 얻을 수도 있고 외부에서 시료를 채취하여 진단을 위한 핵산 증폭 반응을 진행할 경우 핵산 정제 과정에 필요한 많은 장비와 시약이 필요로 하지 않아도 되는 장점이 있다. In addition, the composition for amplifying a direct nucleic acid according to the present invention can reduce the time, cost, and manpower required for processing a large amount of samples because DNA that is a template for nucleic acid amplification reaction can be used for nucleic acid amplification reaction without purification from blood. There is an advantage to be able to do. In addition, since DNA purification is not carried out, it is possible to quickly and easily obtain results in the case of molecular diagnostics. In the case of performing nucleic acid amplification reaction for diagnosis by collecting samples from outside, many equipment and reagents necessary for nucleic acid purification process are required There is an advantage to not have.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Tris-반응 완충용액을 사용하여 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 아가로스 젤 사진이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Tris-반응 완충용액과 Tricine-베이스 완충액을 사용하여 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이며,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 농도별로 첨가하여 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 첨가하여 혈액 양별로 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이며,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 브로모페놀 블루(bromophenol blue, BPB)를 첨가하여 DNA 중합효소(polymerase) unit 수별로 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 크레졸 레드(cresol red), 페놀 레드(phenol red), 쿠마시 브릴리안트 블루(coomassie vrilliant blue R-250), 레마졸 브릴리안트 블루(Remazol Brilliant Blue R), 레마졸 브릴리안트 바이올렛(Remazol Brilliant Violet 5R)을 각각 첨가하여 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이며,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로모페놀 블루(bromophenol blue, BPB), 크레졸 레드(cresol red), 페놀 레드(phenol red), 쿠마시 브릴리안트 블루(coomassie vrilliant blue R-250), 레마졸 브릴리안트 블루(Remazol Brilliant Blue R), 레마졸 브릴리안트 바이올렛(Remazol Brilliant Violet 5R)을 각각 첨가하여 혈액 양별로 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 Tris-반응 완충용액와 Tricine-반응 완충용액을 각각 사용하여 지시약 및 베타인(betaine) 첨가유무에 따른 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이다.FIG. 1 is a photograph of an agarose gel showing a PCR result of direct nucleic acid amplification using a Tris-buffered solution according to an embodiment of the present invention,
FIG. 2 is a photograph showing a PCR result of direct nucleic acid amplification using a Tris-Reaction buffer and a Tricine-Base buffer according to an embodiment of the present invention,
FIG. 3 is a photograph showing a PCR result obtained by amplifying direct nucleic acid by adding bromophenol blue according to an embodiment of the present invention,
FIG. 4 is a photograph showing a PCR result of directly amplifying a nucleic acid by the amount of blood added with bromophenol blue according to an embodiment of the present invention,
FIG. 5 is a photograph showing a PCR result of directly amplifying nucleic acid by the number of DNA polymerase units by adding bromophenol blue (BPB) according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a schematic view showing a cresol red, phenol red, coomassie vrilliant blue R-250, Remazol Brilliant Blue R, and the like, according to an embodiment of the present invention. , And Remazol
FIG. 7 is a graph showing the fluorescence intensity of bromophenol blue (BPB), cresol red, phenol red, coomassie vrilliant blue R-250, Remazol Brilliant Blue R and Remazol
FIG. 8 is a photograph showing a PCR result obtained by amplifying a direct nucleic acid according to the presence or absence of an indicator and betaine using a Tris-Reaction Buffer and a Tricine-Reaction Buffer according to an embodiment of the present invention.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are provided to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples in any sense.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.Hereinafter, the technical and scientific terms used herein will be understood by those skilled in the art without departing from the scope of the present invention. Descriptions of known functions and configurations that may be unnecessarily blurred are omitted.
[실시예 1] 혈액을 직접 사용한 유전자 증폭가능 여부 확인[Example 1] Confirmation of gene amplification using blood directly
(1) Tris-반응 완충용액을 이용한 직접 핵산 증폭가능 여부 확인 (1) Whether the direct nucleic acid amplification is possible using a Tris-reaction buffer solution
일반적으로 사용되는 PCR 반응 조건에서는 혈액 시료를 직접 첨가하여 PCR을 수행할 경우, 혈액 내 존재하는 많은 핵산 증폭 반응 억제인자들에 의해 PCR 반응이 거의 일어나지 않는다. In the case of the PCR reaction conditions in which the blood sample is directly added under the generally used PCR reaction conditions, the PCR reaction hardly occurs due to many nucleic acid amplification inhibitors present in the blood.
먼저 비 응고 혈액시료로부터 일반적인 Taq DNA 중합효소를 이용한 PCR 반응액을 사용하여 핵산증폭이 가능한지 테스트 하였다. 최종 반응액 50 ul을 기준으로 5 ul 10x Tris-반응 완충용액과 최종 농도 0.2 mM dNTPs, 4 mM MgCl2, 사람 SOX21 유전자로부터 디자인된 프라이머 세트 각각 20 pmoles의 정방향 프라이머(Forward primer) 5'-GTTAGGATTGTGCACTTCTTCT-3'와 역방향 프라이머(Reverse primer) 5'-GCATTCTAATGCTAATCTAGCGT-3', 1.25 units 또는 5 units의 HelixAmpTM Taq DNA polymerase(Nanohelix, 한국), 그리고 EDTA가 처리된 혈액을 각각 1, 3, 5 ul를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다. First, a non-clotted blood sample was tested for possible nucleic acid amplification using a PCR reaction solution using a general Taq DNA polymerase. A forward primer 5'-GTTAGGATTGTGCACTTCTTCT ( SEQ ID NO: 2) , each 20 pmoles of each primer set designed from 5 ul 10x Tris-Reaction buffer and final concentrations of 0.2 mM dNTPs, 4 mM MgCl2 and human SOX21 gene, 3 'and the reverse primer (reverse primer) 5'-GCATTCTAATGCTAATCTAGCGT- 3', 1.25 units , or 5 units of Taq DNA polymerase TM HelixAmp (Nanohelix, Korea), and the EDTA-treated blood, respectively 1, 3, and 5 ul of And the PCR reaction was carried out.
PCR 반응 조건은 초기 95℃에서 5분간 반응 후 95℃(20초)- 58℃(20초)-72℃(30초)을 40회 반복하고 추가로 72℃에서 5 분간 반응으로 수행하였다. PCR 반응이 끝난 후, 10 ul의 PCR 산물을 1% Agarose gel에서 전기영동을 통해 결과를 분석하였다. The PCR reaction conditions were 95 ° C (20 sec) - 58 ° C (20 sec) -72 ° C (30 sec) for 40 min and 95 ° C for 5 min. After the PCR reaction, 10 μl of the PCR product was analyzed by electrophoresis on 1% agarose gel.
그 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 일반적으로 사용되는 PCR 반응시 1.25 units의 DNA 중합효소를 사용했을 경우 PCR 반응이 일어나지 않았고, 5 units의 중합효소를 사용했을 경우 1 ul의 혈액을 첨가 했을 때만 타겟 핵산의 증폭을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 1, PCR reaction did not occur when 1.25 units of DNA polymerase was used in a general PCR reaction. When 5 units of polymerase was used, only when 1 μl of blood was added, target Amplification of the nucleic acid was confirmed.
상기의 결과는 일반적인 PCR 반응 조성물에서 혈액을 이용한 직접핵산 증폭이 DNA 중합효소의 양을 늘리면 약하게나마 직접 핵산 증폭이 가능함을 보여주는 결과이다. 이는 혈액 내에 존재하는 많은 억제요인(inibitor)에 기인한 PCR 반응 억제 현상을 중합효소의 양을 늘림으로써 어느 정도는 극복이 가능하다는 것을 보여주는 것이기는 하지만 증폭된 PCR 산물의 양이 낮고, 혈액의 첨가량이 늘어남에 따라 PCR 반응이 일어나지 않는 근본적인 문제점이 있다.
The above results show that direct nucleic acid amplification using blood in a general PCR reaction composition can amplify direct nucleic acid amplification by increasing the amount of DNA polymerase. This indicates that the inhibition of PCR reaction caused by many inhibitors in the blood can be overcome to some extent by increasing the amount of polymerase. However, the amount of amplified PCR product is low, There is a fundamental problem that the PCR reaction does not occur.
(2) Tricine-반응 완충용액을 이용한 직접핵산 증폭가능 여부 확인 (2) Confirmation of direct nucleic acid amplification using Tricine-Reaction Buffer
상기 (1)의 결과로부터 일반적으로 사용되는 PCR 반응 조성물에 중합효소의 unit수를 높이는 것으로 핵산증폭이 약하게는 가능하다는 것은 확인하였지만 효율이 높지 않고 혈액 첨가량을 늘리면 PCR 반응이 일어나지 않는 단점이 있어 이를 극복하기 위해 Tris-반응 완충용액(pH 9.0) 대신 Tricine(N-Tris(hydroxymethyl)methylglycine)-반응 완충용액(pH 8.6)을 사용하여 혈액으로부터 PCR 증폭 여부 정도를 비교하였다. From the results of the above (1), it has been confirmed that nucleic acid amplification can be weakly performed by increasing the number of units of the polymerase in the PCR reaction composition generally used. However, since the efficiency is not high and the amount of blood to be added is increased, The degree of PCR amplification from blood was compared using Tricine (N-Tris (hydroxymethyl) methylglycine) -reaction buffer (pH 8.6) instead of Tris-Reaction buffer (pH 9.0)
PCR 반응은 50 ul 반응으로 각각 완충용액에 dNTPs는 0.2 mM, MgCl2의 농도는 4 mM, betaine 0.2 M을 사용하였고 HelixAmpTM Taq DNA polymerase(Nanohelix, 한국)를 5 units를 사용, 혈액은 EDTA가 처리된 혈액을 각각 1, 3, 5 ul 첨가하여 PCR을 진행하였다. The PCR reaction was carried out in 50 μl of a buffer solution containing 0.2 mM of dNTPs, 4 mM of MgCl 2 , 0.2 M of betaine, 5 units of HelixAmp ™ Taq DNA polymerase (Nanohelix, Korea) The treated blood was added with 1, 3, and 5 μl of each, and PCR was performed.
그 결과 도 2에서 확인할 수 있듯이, Tris-반응 완충용액을 사용했을 때는 혈액 1 ul를 사용했을 경우에만 약하게 타겟 핵산이 증폭되었지만 반면, Tricine-반응 완충용액을 사용했을 때는 혈액 양을 약 5 ul까지 사용하여도 PCR이 진행되어 타겟 핵산이 증폭되는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 2, when the Tris-Reaction buffer solution was used, the target nucleic acid was slightly amplified only when 1 μl of blood was used, whereas when the Tricine-Reaction buffer was used, the blood volume was increased to about 5 μl It was confirmed that the PCR proceeded and the target nucleic acid was amplified.
상기의 결과는 Tricine-반응 완충용액이 Tris-반응 완충용액 보다 PCR 반응의 억제요인(inibitor)을 제어하여 PCR 반응이 효율적으로 이루어질 수 있도록 하는 것을 확인한 결과이다.
The above results confirm that the Tricine-Reaction Buffer can control the inhibitory factor (inibitor) of the PCR reaction more efficiently than the Tris-Reaction Buffer.
[[ 실시예Example 2] 지시약( 2] indicator ( dyedye )을 적용한 직접 핵산의 증폭 효율 증대 효과) To increase the amplification efficiency of direct nucleic acid
(1) (One) 브로모페놀Bromophenol 블루(Bromophenol blue)에Blue (Bromophenol blue) on 의한 효과 Effect by
일반적으로 PCR 반응 시 브로모페놀 블루(bromophenol blue)가 혈액을 직접적으로 사용하는 직접 핵산의 증폭에서 어떤 효과를 주는지 확인하기 위해서, 적절한 양의 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 첨가하여 PCR을 진행하였다. Generally, in order to confirm the effect of bromophenol blue on the direct nucleic acid amplification using blood directly during PCR, an appropriate amount of bromophenol blue was added to perform PCR Respectively.
PCR의 최종 부피는 50 ul로 Tricine-반응 완충용액과 함께 0.2 mM dNTPs, 4 mM MgCl2, 0.2 M betaine을 사용하였고, HelixAmpTM Taq DNA polymerase (Nanohelix, 한국)를 5 units를 사용하였으며, 혈액은 EDTA가 처리된 혈액을 3 ul 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다. The final volume of the PCR was 50 μl, using 0.2 mM dNTPs, 4 mM MgCl 2 , 0.2 M betaine with Tricine-Reaction Buffer, and 5 units of HelixAmp ™ Taq DNA polymerase (Nanohelix, Korea) 3 μl of EDTA-treated blood was added to perform PCR reaction.
그 결과 도 3에서 확인할 수 있듯이, 브로모페놀 블루(Bromophenol blue)를 0.005%(w/v)(레인 4,5), 0.01%(w/v)(레인 6,7) 첨가한 경우, 첨가하지 않았을 때 보다(레인 2,3) 타겟 핵산의 증폭량이 더 많아지는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 3, when 0.005% (w / v) (
반면에 고 농도의 0.05%(w/v)(레인 10, 11)와 0.1%(w/v)(레인 12, 13)의 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 첨가한 경우 오히려 PCR 반응 효율이 저하되거나 억제되는 것을 확인할 수 있었다.On the other hand, the addition of high concentrations of bromophenol blue at 0.05% (w / v) (lanes 10 and 11) and 0.1% (w / v) (lanes 12 and 13) And it was confirmed that it was lowered or suppressed.
뿐만 아니라 혈액의 양에 따라 테스트한 도 4에서도 확인할 수 있듯이, 브로모페놀 블루를 첨가하였을 경우가 브로모페놀 블루를 첨가하지 않았을 경우 보다 핵산의 증폭량이 증가한 것을 확인할 수 있었다. In addition, as shown in FIG. 4, which was tested according to the amount of blood, it was confirmed that the addition of bromophenol blue increased the amount of nucleic acid amplification compared to the case without addition of bromophenol blue.
또한 DNA 중합효소의 unit 수에 따른 브로모페놀 블루(bromophenol blue)의 핵산증폭 효율을 조사한 결과, 도 5에서도 확인할 수 있듯이 DNA 중합효소를 1.25 units 또는 2.5 units를 사용했을 경우보다 5 units를 사용했을 경우에 브로모페놀 블루(bromophenol blue)에 의한 핵산증폭 효율이 확실히 증대되는 것으로 확인되었다. In addition, as shown in FIG. 5, when 5 units of DNA polymerase was used in comparison with 1.25 units or 2.5 units, as shown in FIG. 5, the amplification efficiencies of bromophenol blue by the number of DNA polymerase units It was confirmed that the efficiency of nucleic acid amplification by bromophenol blue was significantly increased.
상기의 결과는 브로모페놀 블루(bromophenol blue)가 PCR 억제요인(inibitor)에 기인한 PCR 반응 억제 현상을 감소시켜 직접 핵산의 증폭 효율을 증가시킨다는 것을 확인한 결과이다.These results confirm that bromophenol blue increases the efficiency of direct nucleic acid amplification by reducing the inhibition of PCR reaction caused by PCR inhibitors (inibitors).
(2) 다른 지시약들에 의한 직접 핵산의 증폭 효율(2) efficiency of direct nucleic acid amplification by other indicators
상기 (1)에서 브로모페놀 블루(bromophenol blue)에 의한 향상된 직접 핵산의 증폭 효율결과를 확인하였다. In (1) above, the amplification efficiency of the improved direct nucleic acid by bromophenol blue was confirmed.
상기 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 이외에 비슷한 용도로 사용되는 다른 지시약들이 직접 핵산 증폭에 어떤 효과를 나타내는지 알아보기 위해 적절한 양의 크레졸 레드(cresol red), 페놀 레드(phenol red), 쿠마시 브릴리안트 블루(coomassie vrilliant blue R-250), 레마졸 브릴리안트 블루(Remazol Brilliant Blue R), 레마졸 브릴리안트 바이올렛(Remazol Brilliant Violet 5R)을 각각 첨가하여 테스트를 진행하였다. To investigate the effect of other indicators used for similar uses in addition to the above bromophenol blue on direct nucleic acid amplification, an appropriate amount of cresol red, phenol red, The test was conducted by adding coomassie vrilliant blue R-250, Remazol Brilliant Blue R and Remazol
PCR의 최종 부피는 50 ul로 Tricine-반응 완충용액을 사용하였고, EDTA가 처리된 혈액 3 ul를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다. The final volume of PCR was 50 μl using Tricine-Reaction Buffer, and 3 μl of EDTA-treated blood was added to perform the PCR reaction.
그 결과 도 6에서도 확인할 수 있듯이, 지시약을 첨가하지 않았을 때 보다(레인 2) 각각의 지시약을 0.005 내지 0.05%(w/v)의 농도로 첨가한 조건에서 타겟 핵산의 증폭효율이 모두 증가된 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 6, the amplification efficiency of the target nucleic acid was increased under the condition that each indicator was added at a concentration of 0.005 to 0.05% (w / v) (lane 2) I could confirm.
또한 혈액의 양에 따라 타겟 핵산의 증폭효율을 확인한 결과 도 7에서 확인할 수 있듯이, 전체적으로 타겟 핵산의 증폭량이 지시약을 첨가하지 않았을 때 보다 모두 다 증가한 것을 확인할 수 있었다. As a result of confirming the amplification efficiency of the target nucleic acid according to the amount of blood, it was confirmed that the amplification amount of the target nucleic acid as a whole was higher than that when the indicator was not added as a whole, as shown in FIG.
상기의 결과는 지시약으로 사용되는 크레졸 레드(cresol red), 페놀 레드(phenol red), 쿠마시 브릴리안트 블루(coomassie vrilliant blue R-250), 레마졸 브릴리안트 블루(Remazol Brilliant Blue R), 및 레마졸 브릴리안트 바이올렛(Remazol Brilliant Violet 5R)들 역시도 브로모페놀 블루(bromophenol blue)와 마찬가지로 혈액을 직접 사용한 PCR 반응에서 혈액 내에 존재하는 많은 PCR 반응의 억제요인(inibitor)을 감소시켜, 혈액 내 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요 없는 직접 핵산의 증폭 효율을 증가시킨다는 것을 확인한 결과이다.
The above results indicate that cresol red, phenol red, coomassie vrilliant blue R-250, Remazol Brilliant Blue R, Similar to bromophenol blue, Remazol
한편 혈액을 직접 사용해서 PCR을 수행할 경우, 지시약을 첨가물질로 사용했을 때 Tricine-반응 완충용액과 betaine의 첨가에 따른 타켓 핵산 증폭효과를 확인하였다.On the other hand, when PCR was performed directly using blood, the amplification effect of target nucleic acid by addition of Tricine-reaction buffer and betaine was confirmed when the indicator was used as an additive.
PCR 반응 최종 부피는 50 ul로 각각 Tris-반응 완충용액과 Tricine-반응 완충용액을 사용하였고 EDTA 처리된 혈액을 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다. The final volume of the PCR reaction was 50 μl using Tris-Reaction Buffer and Tricine-Reaction Buffer, respectively, and EDTA-treated blood was added to perform PCR reaction.
그 결과 도 8에서도 확인할 수 있듯이, Tris-반응 완충용액을 사용했을 때는 betaine 첨가 유무에 상관없이 브로모페놀 블루(bromophenol blue)와 페놀 레드(phenol red)에 의한 직접 핵산의 증폭 증대효과는 나타나지 않았고, bataine을 첨가하지 않고 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 첨가했을 때는(레인 3,4,5) 첨가하지 않았을 때보다 오히려 PCR 억제현상이 나타나는 것이 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 8, when the Tris-buffer solution was used, amplification effect of direct nucleic acid by bromophenol blue and phenol red was not observed regardless of whether betaine was added or not When bromophenol blue was added without bataine (
또한, Tricine-반응 완충용액을 사용하고 betaine을 첨가한 조건에서는 브로모페놀 블루(bromophenol blue)와 페놀 레드(phenol red)를 첨가했을 때 모두 직접 핵산의 증폭 증대효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. In addition, it was confirmed that the addition of bromophenol blue and phenol red directly enhanced the amplification of the direct nucleic acid under the conditions of using tricine-buffer solution and betaine.
상기의 결과는 Tricine-반응 완충용액, betaine, 그리고 지시약 모두의 상호작용에 의해 우수한 직접 핵산의 증폭 증대효과가 나타나는 것을 확인한 것이다. These results confirm that the amplification effect of excellent direct nucleic acid is shown by the interaction of both Tricine-Reaction buffer, betaine, and indicator.
또한, 상기의 결과들은 Tricine-반응 완충용액, 베타인(betaine), dNTPs, DNA 중합효소, 및 지시약을 포함하는 본 발명의 조성물이 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 혈액의 핵산 증폭 반응에 있어, 장비와 특정한 시약 없이도 효율적이고 간편하게 분자 진단에 이용할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다. The results also show that the compositions of the present invention, including Tricine-Reaction buffer, betaine, dNTPs, DNA polymerase, and indicator, need purification on the nucleic acid present in the biological sample, It is also a result of confirming that the reaction can be efficiently and easily used for molecular diagnostics without equipment and reagents.
Claims (10)
상기 조성물은 트리신(tricine) 반응 완충용액, 베타인(betaine), dNTPs, DNA 중합효소, 및 지시약을 포함하는 직접 핵산 증폭용 조성물.A nucleic acid amplification composition which does not require purification of a nucleic acid present in a biological sample,
Wherein the composition comprises a tricine reaction buffer, betaine, dNTPs, a DNA polymerase, and an indicator.
상기 지시약은 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 페놀 레드(phenol red), 크레졸 레드(cresol red), 쿠마시 블루(coomassie blue), 레마졸 블루(remazol blue), 및 레마졸 바이올엣(Remazol violet)으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.The method according to claim 1,
The indicator may be selected from the group consisting of bromophenol blue, phenol red, cresol red, coomassie blue, remazol blue, and Remazol violet ). ≪ / RTI >
상기 조성물은 최종 반응액을 기준으로 dNTP 0.05 내지 1.0 mM, MgCl2 1 내지 10 mM, 베타인 0.05 내지 1 M, DNA 중합효소 1 내지 10 unit/㎕, 및 0.001 내지 0.5%(w/v) 지시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. The method according to claim 1,
The composition comprises 0.05 to 1.0 mM dNTP, 1 to 10 mM MgCl 2 , 0.05 to 1 M beta, 1 to 10 unit / μl DNA polymerase, and 0.001 to 0.5% (w / v) ≪ / RTI >
상기 조성물은 최종 반응액을 기준으로 dNTP 0.1 내지 0.5 mM, MgCl2 2 내지 6 mM, 베타인 0.1 내지 0.5 M, DNA 중합효소 3 내지 7 unit/㎕, 및 0.002 내지 0.09%(w/v)의 지시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. The method of claim 3,
The composition is prepared by adding 0.1 to 0.5 mM of dNTP, 2 to 6 mM of MgCl 2 , 0.1 to 0.5 M of betaine, 3 to 7 unit / μl of DNA polymerase, and 0.002 to 0.09% (w / v) Wherein the composition comprises an indicator.
상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the biological sample is blood.
(a) 트리신(tricine) 반응 완충용액, 베타인(betaine), dNTPs, DNA 중합효소, 및 지시약을 포함하는 직접 핵산 증폭용 조성물을 생물학적 시료에 혼합하여 반응 혼합물을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 반응 혼합물을 이용하여 생물학적 시료로부터 타겟 핵산을 증폭하는 단계;A method for amplifying a direct nucleic acid comprising the steps of:
(a) preparing a reaction mixture by mixing a biological sample with a composition for direct nucleic acid amplification comprising a tricine reaction buffer, betaine, dNTPs, a DNA polymerase, and an indicator; And
(b) amplifying the target nucleic acid from the biological sample using the reaction mixture;
상기 생물학적 시료는 (a) 단계의 반응 혼합물을 제조하기 전, 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
Characterized in that the biological sample does not require purification on the nucleic acid present in the biological sample prior to preparing the reaction mixture of step (a).
상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
Wherein the biological sample is blood.
상기 조성물은 최종 반응액을 기준으로 dNTP 0.05 내지 1.0 mM, MgCl2 1 내지 10 mM, 베타인 0.05 내지 1 M, DNA 중합효소 1 내지 10 unit/㎕, 및 0.001 내지 0.5%(w/v) 지시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
The composition comprises 0.05 to 1.0 mM dNTP, 1 to 10 mM MgCl 2 , 0.05 to 1 M beta, 1 to 10 unit / μl DNA polymerase, and 0.001 to 0.5% (w / v) ≪ / RTI >
상기 조성물은 최종 반응액을 기준으로 dNTP 0.1 내지 0.5 mM, MgCl2 2 내지 6 mM, 베타인 0.1 내지 0.5 M, DNA 중합효소 3 내지 7 unit/㎕, 및 0.002 내지 0.09%(w/v)의 지시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
The composition is prepared by adding 0.1 to 0.5 mM of dNTP, 2 to 6 mM of MgCl 2 , 0.1 to 0.5 M of betaine, 3 to 7 unit / μl of DNA polymerase, and 0.002 to 0.09% (w / v) Lt; RTI ID = 0.0 > indicator. ≪ / RTI >
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| KR100746372B1 (en) * | 2005-02-28 | 2007-08-03 | 바이오퀘스트(주) | Methods for performing direct enzymatic reactions involving nucleic acid molecules |
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