KR20140059051A - 바이오매스 생산 증가 유전자 및 이를 이용한 형질 전환 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대에서 분리한 바이오매스 생산을 증가시키는 유전자 및 이를 이용하여 형질 전환 식물체를 제조하는 방법 등에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는, 식물체의 바이오매스 생산 증가용 조성물, 재조합 발현벡터, 형질전환 식물체 등을 제공한다. 따라서, 본 발명의 바이오매스 생산 증가용 유전자를 이용하여 바이오매스 생산량이 증가된 형질전환 식물체를 얻을 수 있으며, 궁극적으로 이를 이용하여 펄프 및 제지 산업의 원료, 바이오에탄올의 원료를 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

바이오매스 생산 증가 유전자 및 이를 이용한 형질 전환 식물체 {Genes increasing biomass production and transgenic plants using them}

본 발명은 바이오매스 생산을 증가시키는 유전자 및 이를 이용하여 형질전환 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

고유가 시대가 도래하면서 식물의 바이오매스는 바이오 에너지를 생성하는 원료로서 그 중요성이 부각되고 있다. 곡물에 존재하는 녹말의 당화 과정을 이용한 1세대 바이오 연료생산은 농작물의 가격 상승, 식량 및 경제난을 초래하였으며 최근 관련 기술 개발이 지양되고 있다. 이에 비해서, 비식용 바이오매스 작물인 억새, 스위치그래스, 포플라 등에 존재하는 목질계의 셀룰로오스를 이용한 2세대 바이오 에너지 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 실질적으로 화석연료를 대체할 정도의 많은 양의 에너지를 생산하기 위해서는 기본적으로 식물의 바이오매스 생산 양을 증가시키고 지속적으로 유지시키기 위한 노력이 필요할 것이다. 이를 위하여 2차 성장에 주요하게 작용하는 형성층을 비롯한 관다발 조직 발달 및 생장의 조절 기작에 대한 연구가 필요하다.

식물의 관다발 조직은 물과 영양분을 비롯한 식물의 성장과 발달에 필요한 물질 이동통로로서 각각의 특이적 기능을 가진 세포들이 모여 특징적인 구조를 이룬다. 1차 생장인 길이 생장의 경우, 줄기에서의 관다발 조직은 가장 윗부분에 존재하는 정단 분열 조직에 의해서 생성되며, 분열 조직인 전형성층 (procambium), 일차 체관부 (primary phloem), 그리고 물관부 (xylem)로 이루어지게 된다. 시간이 지남에 따라 2차 성장을 위하여 bundle 사이의 유관속관조직 내로 확장된 형성층 (cambium) 세포들이 형성되고, 이들을 시원세포로 하여 이차 체관부과 물관부가 서로 다른 방향으로 발달함으로써 닫힌 원 모양의 구조를 이루게 된다.

줄기에서 관다발 조직의 발달은 다양한 식물생장호르몬이 관여하고 있다. 전반적인 분열조직의 활성과 밀접한 관련이 있는 옥신 (auxin)과 사이토키닌 (cytokinin)은 형성층 세포 분열에 영향을 미치고 지베렐린 (gibberellin)과 에틸렌 (ethylene)도 형성층 활성에 관여한다. 또한 브라시노스테로이드 (brassinosteroid)는 vascular bundle의 수나 양상(pattern)을 조절하며, 이는 옥신의 이동을 조절하여 생성되는 maxima에 따라서 결정된다. 이외에도 특정 유전자들이 각 조직 특이적인 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 예컨대 HD-ZIP Ⅲ 유전자 군에 속하는 ATHB8, CNA(ATHB15), PHB, PHV, REV가 모두 관다발 조직의 형성층에 주로 발현하며 이 유전자들에 의해서 각각의 관다발 안에서 체관부와 물관부의 발달 방향과 물관부 분화가 조절되고 있음이 알려져 있다. 또, 다른 조절인자인 KANADI는 miRNA165/166을 통하여 앞서 언급한 HD-ZIPⅢ의 발현을 조절하고, 이는 옥신 (auxin)과의 상호 작용으로 관다발 조직의 형성을 조절할 것으로 보고된 바 있다.

이렇게 복잡한 상호 조절 작용에 대해서 비교적 잘 연구되어 있음에도 불구하고 현재까지 관련된 유전자의 변형을 통하여 실제 생산할 수 있는 바이오매스의 양을 변화시킨 사례는 보고된 바가 없다. 이것은 특정 조직 발달에 관여하는 인자로는 바이오매스 생산량을 늘리기에 한계가 있음을 의미한다.

한편 애기장대는 발아해서 다음 씨가 맺힐 때까지의 1세대 기간이 약 6주로 짧고, 화학물질을 쓰면 다양한 형태의 돌연변이체를 간단히 만들 수 있다. 또 크기가 작아서 유리 용기 안에서 쉽게 재배할 수 있고 게놈 사이즈가 작다. 이러한 이유로 식물 연구를 위한 모델 식물로 많이 활용된다. 초장은 약 30cm이고, 장일조건 하에서는 발아 후 약 3주일이면 꽃눈을 형성하고 5~6주일이 되면 최초의 종자를 얻어낼 수 있고 자가 수정도 하지만 인공교배도 가능하다. 최대의 특징으로는 유전체크기가 1×10⁸ 염기쌍/1배체로서, 알려져 있는 현화식물에서는 가장 작다. 염색체 수는 2n＝10, 반복배열도 적다. 제한효소단편장다형(RELP)를 표지로 한 유전자 지도를 미국 MIT의 Haward Goodmam 등이 완성한 바 있고 ‘애기장대판’ 유전체 계획이 미국국립과학재단(NSF) 등의 후원으로 1990년부터 개시되었다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 장점을 가지는 애기장대를 이용하여, 바이오매스 생산을 증가시키기 위한 새로운 유전자를 발굴하고자 하였다.

본 발명자들은 바이오에너지의 원료가 되는 식물의 바이오매스 생산량을 증가시키기 위해 식물의 형성층 활성을 증가시키는 유전자를 발굴하고 이를 이용하여 바이오매스 생산량이 증가된 형질전환 식물체 생산을 가능하게 하였으며, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는, 식물체의 바이오매스 생산 증가용 조성물 및 이러한 조성물로 형질 전환된 식물체 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 식물체를 형질 전환시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 약 12,000 여 개의 애기장대 full-length cDNA가 각각 과발현되어 있는 FOX hunting system (Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system)을 이용하여 줄기단면을 관찰함으로써 형성층 활성이 증가되어 있는 개체들을 선별하고 표현형에 영향을 미칠 것으로 예상하는 과발현 유전자들을 분리, 및 동정하였다. 그리고, 이들 유전자들이 실제 표현형을 유도함을 실험을 통하여 증명하였고, 해당 유전자 과발현체들에서 나타나는 다양한 바이오매스 관련 표현형들을 규명하였다.

이에, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 식물체의 바이오매스 생산 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현 예로, 상기 염기 서열은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열이 삽입된 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 바이오매스 생산 증가용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물들로 형질전환된 식물체로, 상기 식물체는 바이오매스 생산이 증가되어 있는 것을 특징으로 하는 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 식물체의 바이오매스 생산을 증가시키는 방법으로, 상기 조성물을 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바이오 매스 생산 증가용 유전자, 즉 형성층 활성 조절 유전자 BAT1 (at4g31910)을 이용하면, 형성층 활성이 증대된 형질 전환 식물체를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 궁극적으로 펄프 및 제지 산업의 원료를 확충할 수 있을 뿐만 아니라, 목질계 셀룰로오스량의 증대로 인한 바이오에탄올의 원료를 확충할 수 있다. 이에 더하여, 땔감 및 펠렛 등의 형태로 난방 및 전력 생산 원료로 이용할 수도 있을 것으로 기대된다. 또한 곡물의 경우 출수량이 증대된 품종을 생산하고자 할 때, 줄기의 물리적 지지력을 강화하여 곡물의 무게를 이기지 못하여 도복되는 문제점을 해결할 수 있다.

도 1은 야생형에 비해 BAT1 유전자 과발현 식물체의 감소된 관다발 조직 개수 표현형 (a)과 브라시노스테로이드 신호 전달 결함 돌연변이체인 bri1-1과의 유사한 난쟁이 표현형 (b), 그리고 이러한 표현형을 뒷받침하는 브라시노스테로이드 신호 전달 표시 유전자들의 발현 양상 (c)을 나타낸 도면이다.
도 2는 BAT1 유전자가 결핍된 T-DNA 삽입 돌연변이체의 선별 및 선택된 bat1-1 결핍 돌연변이를 나타내며 (a), 야생형에 비해 바이오매스가 증대된 bat1-1 결핍 돌연변이체의 다양한 표현형을 나타내는 도면으로, 야생형에 비해 줄기의 길이가 긴 표현형을 가지는 bat1-1 결핍 돌연변이체 (b와 c)와 증가된 관다발 조직의 개수 (d)를 관찰할 수 있다.
도 3은 BAT1이 식물체에서 발현하는 위치를 나타낸 도면으로, 세포 내에서 BAT1은 핵 및 소포체에서 발현하며 (a), 어린 시기에는 잎, 떡잎 및 뿌리의 관다발 조직 (b와 c)에, 성체 시기에는 줄기의 관다발 조직 (d)에서 발현함을 나타낸 것이다.
도 4는 BAT1 유전자의 과발현에 의한 식물체 내의 감소된 각 브라시노스테로이드 중간 대사 물질의 측정된 양을 나타낸 도면이다.
도 5는 BAT1의 과발현에 의한 다양한 표현형이 내부적인 또는 외부적인 브라시노스테로이드의 처리에 의해 야생형과 유사한 표현형으로 회복됨을 관찰한 결과를 도시한 것으로, BAT1 유전자의 과발현에 의해 짧아진 하배축의 길이는 브라시노스테로이드 처리에 의해 그 길이가 야생형과 유사해지고 (a), 성체의 난쟁이 표현형 또한 브라시노스테로이드의 처리에 의해 회복됨을 관찰하였다 (b). 유전학적으로 BAT1 유전과 과발현 식물체를 브라시노스테로이드가 과다 축적된 돌연변이체인 DWF4 유전자 과발현 식물체와 교차 수정시켰을 때 그 표현형이 야생형과 유사해지는 것을 나타내었다 (c).
도 6은 BAT1 (at4g31910)의 염기서열 (a) 및 아미노산 서열 (b)을 나타낸 것이다.

앞서 기술한 바와 같이, 본 발명자들은 바이오매스 생산이 증대시키는 방법을 연구하기 위해, 애기장대 full-length cDNA에서 줄기 내부 관다발 조직에서의 형태적 변이와 줄기 외부에서 나타나는 1차 및 2차 성장의 특징을 살펴보았다.

그 결과, 형성층의 세포 수가 증가된 형질 전환 식물체에서 과발현된 유전자인 BAT1 (at4g31910)이 바이오매스의 증대 및 브라시노스테로이드의 대사에 영향을 미칠 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 식물체의 바이오매스 생산 증가용 조성물을 제공하는 것에 그 특징이 있다.

또한, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

한편, 코돈의 축퇴성으로 인해, 염기서열에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 따라서 본 발명에서 이용되는 염기서열은 첨부한 서열목록에 기재된 서열번호 1의 염기서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

또한, 상기의 바이오매스 생산량 증대 효과를 얻기 위해 식물발현용 재조합 벡터를 이용하여 유전자를 도입시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 삽입된 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 바이오매스 생산 증가용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 사용되는 식물발현용 재조합 벡터는 pCB302ES, pCXSN, pINDEX3, pBI121, 또는 pgR106 등 일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 조성물 중 하나의 조성물로 형질 전환된 식물체를 제공한다. 본 발명에 사용되는 식물체는 애기장대, 담배, 토마토, 억새, 스위치그래스, 또는 포플라일 수 있고, 바람직하게는 애기장대 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 식물체의 바이오매스 생산을 증가시키는 방법으로, 상기 본 발명의 조성물 중 하나를 이용하여 식물체를 형질 전환시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 실시예에서, 약 12,000 여 개의 애기장대 full-length cDNA가 각각 과발현되어 있는 FOX hunting system (Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system)을 이용하여 줄기 내부 관다발 조직에서의 형태적 변이와 줄기 외부에서 나타나는 1차 및 2차 성장의 특징을 살펴보았다.

그 결과, 그 중 F23231 FOX hunting system 형질 전환체는 바이오매스 증가와 직접적인 관련을 가지는 표현형인 형성층의 세포 수가 변화됨을 관찰 할 수 있었다. 선별된 형질 전환 식물체 F23231은 전형성층 (procambium)의 세포 수와 층 (layer) 수가 모두 변화되는 표현형을 보이며 형성층뿐만 아니라 관다발 조직의 개수 또한 야생형에 비하여 감소되어 있음을 확인하였다 (도 1a 참조). 더불어 로제트 잎의 표면적과 잎자루의 길이가 야생형에 비하여 크게 감소되어 있고 (도 1b 참조), 성체의 줄기 길이 역시 야생형의 70%에 불과함을 관찰할 수 있으며 (도 1c 참조), 이는 선별된 유전자의 조작 및 그 기능의 조절에 따른 바이오매스 증감에 영향을 줄 것으로 예상할 수 있다. 이러한 관다발 조직의 발달 및 전체적인 발달 과정의 결함 표현형은 다양한 환경적 조건 및 호르몬 신호 전달에 의해 조절되고 있음이 잘 알려져 있는데, 특히 위와 같이 선별된 F23231 식물체는 식물의 스테로이드계 호르몬인 브라시노스테로이드 (brassinosteroid; BR) 신호 전달에 결함이 생긴 돌연변이체와 비슷한 표현형임을 알 수 있었다. 도 1c에서 비교한 bri1-5 돌연변이체는 브라이노스테로이드의 막수용체로 알려진 BRI1의 결함 돌연변이로서, 대표적인 브라시노스테로이드 신호전달 결함 돌연변이체로 이용되어져 왔다.

따라서, 상기된 표현형을 매개하는 유전자를 찾기 위하여 선별된 형질 전환체 F23231로부터 과발현된 유전자를 분리 및 동정하는 실험을 수행하였다. 그 결과 선별된 형질전환체는 acylatransferase 도메인을 포함하고 있는 at4g31910 유전자가 과발현되어 있음을 확인하였고, 이후의 단백질의 기능과 연관하여 BAT1 ( BR-related AcylTransferase 1)으로 명명하였다. 상기 유전자의 기능을 살펴보기 위해 BAT1 결핍 돌연변이 (T-DNA 삽입을 통한 유전자의 knock out 돌연변이)를 얻었고 (도 2a), 그 중 bat1-1 결핍 돌연변이를 실험에 사용하였다. BAT1 과발현 식물체와는 대조적으로 bat1-1 결핍 돌연변이체는 줄기의 길이가 야생형에 비해 증가되고 (도 2b와 2c 참조), 관다발의 발달 및 줄기의 두께 역시 야생형에 비해 뚜렷이 증가되어 있음을 관찰하였다 (도 2d 참조). 이는 BAT1 유전자 조작에 의해 바이오매스가 직접적으로 증가됨을 증명하는 것이다.

또한, 본 발명자들은 BAT1 유전자의 과발현 또는 결핍 돌연변이 표현형을 통해 이 유전자가 바이오매스의 증대에 직접적인 관련이 있을 뿐만 아니라 브라시노스테로이드의 대사에도 영향을 미칠 수 있다는 가설을 규명하고자 하였다. 세포에서 사용된 브라시노스테로이드 호르몬은 이후 활성을 잃거나 세포내 저장된 형태로 변환하기 위한 비활성화 기작이 필요한 것으로 알려져 있다. 더불어 몇몇의 식물종에서 브라시노스테로이드의 아실화 (acylation) 형태는 동정된 바 있지만 그에 관련된 효소에 대한 연구는 잘 알려져 있지 않다. 앞서 동정된 BAT1은 acyltransferase 도메인을 포함하고 있고, BAT1 유전자가 과발현되었을 때 브라시노스테로이드 신호 전달의 결함 돌연변이체와 유사한 표현형을 보이는 것으로 보아 위의 새로 동정된 BAT1이 브라시노스테로이드의 비활성화에 관련된 효소임을 예상할 수 있다.

또한, BAT1 유전자의 분자적 기작 및 기능을 규명하기 위해 BAT1 단백질의 발현 위치를 세포 및 발달 시기에 따른 조직별로 관찰하였다 (도 3 참조). 세포 내에서 BAT1은 핵 및 소포체에서 발현하며 (도 3a 참조), 소포체에서의 발현은 이미 잘 알려진 브라시노스테로이드 호르몬의 생합성 관련 유전자가 위치하는 곳이기도 하다. 이는 브라시노스테로이드의 생합성 및 대사가 효율적으로 세포 내 같은 위치에서 일어나는 것으로 예상할 수 있다. 더불어 어린 시기의 발달 단계에서 BAT1은 잎과 떡잎 (도 3b 참조), 그리고 뿌리 (도 3c 참조)의 관다발 조직에서 발현하고, 성체 시기의 발달 단계에서는 줄기, 특히 관다발 조직 특이적인 발현이 관찰되었다 (도 3d 참조). 이러한 조직 특이적인 BAT1의 발현은 앞서 바이오매스 증감에 미치는 영향과 밀접한 관련성을 보이는 증거가 될 수 있다.

또한 본 발명의 실시예에서 바이오매스 증감 뿐만 아니라 브라시노스테로이드 호르몬의 비활성화에 관련되어 있을 것으로 생각되는 BAT1의 기능을 증명하기 위해 BAT1 과발현 형질전환체에서의 브라시노스테로이드 생합성 과정의 각각의 중간 대사 물질의 양을 GC-MS (Gas Chromatography/Mass Spectrometry)을 통해 측정하였다 (도 4 참조). 예상한 바와 같이 BAT1 과발현 형질 전환체에서 통계학적으로 유의미하게 6-deoxotyphasterol (6-deoxoTY), 6-deoxocastasterone (6-deoxoCS), 또는 typhasterol (TY) 등과 같은 브라시노스테로이드 중간 대사 물질이 야생형에 비해 감소되어 있음을 관찰하였다.

아울러, 본 발명의 실시예에서 브라시노스테로이드 비활성에 관련된 표현형이 외부 또는 내부적인 브라시노스테로이드에 의해 회복되는지를 확인하기 위해 하배축 (hypocotyl)의 길이 및 성체의 잎과 줄기의 표현형을 관찰하였다 (도 5 참조). 야생형에 비하여 하배축의 길이가 감소된 BAT1 유전자 과발현 식물체는 여러 브라시노스테로이드 대사 물질 (BL; brassinolide, CS; castasterone, 또는 TY; typhasterol)에 의해서 길이가 유의미하게 증가됨을 관찰하였다 (도 5a 참조). 또한 성체 시기에서도 난쟁이 표현형을 보이는 BAT1 유전자 과발현 식물체는 브라시노스테로이드 대사 물질을 스프레이로 처리해주었을 때 전체적인 줄기의 길이 및 작은 잎의 표면적이 증대됨을 관찰하였다 (도 5b 참조). 이러한 식물체 외부로부터의 브라시노스테로이드의 처리에 의한 BAT1 유전자 과발현 식물체의 표현형 회복은 내부적인 브라시노스테로이드에 의한 효과로도 살펴볼 수 있다. 브라시노스테로이드의 생합성을 매개하는 주요한 유전자인 DWF4 (DWARF4)는 과발현 식물체는 브라시노스테로이드의 양이 크게 증가하게 되어 결국 브라시노스테로이드 신호 전달 결함 돌연변이체와는 대조적으로 줄기 및 잎자루의 길이가 증가하는 표현형을 보이는 것으로 잘 알려져 있다. 이와 같은 DWF4 유전자 과발현 식물체와 본 발명에서 브라시노스테로이드의 합성이 비활성화되어 있을 것으로 생각되는 BAT1 유전자 과발현 식물체를 유전학적으로 교차수정시켰을 때 DWF4 유전자 과발현 식물체에서의 과축적된 브라시노스테로이드가 BAT1 유전자 과발현에 의해 비활성화되어 결국 야생형과 유사한 표현형을 보이는 것으로 관찰되었다 (도 5c 참조).

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 새로 규명된 유전자 조작에 의해 식물의 1, 2차 생장이 모두 증가하여 그에 따른 바이오매스 증대 식물체를 얻을 수 있음이 명백하다. 따라서 본 발명의 BAT1 유전자와 그 형질 전환 식물체인 bat1-1은 바이오매스 생산으로서의 응용에 널리 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 애기장대 ( Arabidopsis thaliana ) 로부터 전형성층 활성이 증가된 돌연변이체 선발 및 관다발 조직 표현형 분석

(1) 줄기의 단면 관찰

RIKEN(Rikagaku Kenkyusho)에서 애기장대 야생형인 Col-0에 RAFL cDNA (RIKEN amplified Arabidopsis Full-Length cDNA)를 이용하여 만든 약 12,000여 개 형질 전환 식물체의 종자를 얻었다. 식물체들은 약 23℃로 온도가 조절되는 온실에서 16시간 명조건 / 8시간 암조건의 24시간 주기를 가지는 장일 조건으로 성장시켰다. 형질 전환 식물체들은 같은 날짜를 키워도 서로 다른 생장 주기를 가지므로 같은 시기의 식물체를 관찰하기 위하여 한 개의 종자 꼬투리 (silique)가 맺혔을 때 줄기의 가장 밑부분을 3% 글루타르알데히드 (glutaraldehyde), 0.1M 인산나트륨 완충액 (sodium phosphate buffer, pH 7.2)에 담근 상태로 약 5mm를 잘라서 채취하였다. 채취된 샘플은 용액 안에 담궈서 10분간 진공 후 4℃에서 3시간동안 반응을 통해 고정시킨 후 통상적인 레진 포매(embedding) 를 실시하였다. 실온에서 rocker를 이용하여 흔들어주면서 0.1M 인산 나트륨 완충액 (sodium phosphate buffer, pH 7.2)으로 20분간 2차례 세정한 뒤 아세톤으로 30%부터 10분 간격으로 10%씩 올리며 100%까지 탈수 반응을 진행하였다. 2번째 새로운 100% 아세톤으로 바꿔준 뒤 8~9시간 반응 후 한차례 더 새로운 100% 아세톤으로 10분간 처리하였다. 1시간 간격으로 레진 (resin)과 아세톤의 비율을 1:3, 1:2, 1:1, 2:1과 같이 레진의 양을 점점 늘려서 치환하는 과정을 거친 후 100% 레진은 2시간 간격으로 치환하고 10분간 진공하는 과정으로 총 3회 반복했다. 포매틀을 이용하여 65℃ 오븐에서 24~48시간동안 굳혀서 만들어진 레진 시료는 (전체조직이 다 나오도록 사각형 혹은 사다리꼴로 다듬은 뒤 유리칼이나 다이아몬드칼을 이용하여) 2 ㎛ 절편으로 자른 후 0.05% 톨루이딘블루 (toluidine blue)로 염색하여 단면을 관찰하였다. 이를 통해, 야생형에 비해 전형성층의 세포 수와 층 수가 증가한 개체의 줄기 단면의 두께를 현미경을 이용하여 측정하였다.

(2) BAT1의 과발현 유전자 동정

12,000여 개의 FOX hunting system 중 상기 F23231 식물체의 관다발 조직에서 다양한 표현형을 보이게 하는 해당 외래 유전자를 찾기 위하여 F23231 식물체의 게놈 DNA를 추출하였다. 잎을 액체질소를 이용하여 급속 동결한 뒤, 스테인레스 구슬을 이용하여 갈아서 0.1M Tris-Cl, 0.05M EDTA 0.5M NaCl, 1.25% SDS (pH 8.0)로 이루어진 추출 용액 250 ㎕를 첨가한 후, 65℃에서 15분간 처리했다. 동일 부피 (250 ㎕)의 페놀 : 클로로폼 : 이소아밀알코올 (phenol : chloroform : isoamylalcohol, 25:24:1) 용액을 첨가하고 5~10분간 위 아래로 흔들어 잘 섞어준다. 13,000 rpm으로 10분 동안, 4℃에서 원심분리한 뒤 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 동일 부피의 이소프로판올 (isopropanol)을 첨가한 뒤 10여 차례 위아래로 흔들어 섞어준 후 다시 13,000 rpm으로 1분 동안 원심분리했다. 그리고 상층액은 따라버리고 DNA 펠렛 (pellet)을 70% 에탄올로 세정하고 30㎕의 물에 재현탁하여 게놈 DNA를 추출하였다. 식물 형질전환에 사용된 벡터 염기서열에 특이적인 프라이머 (GS4, 서열번호 3, 5’-ACATTCTACAACTACATCTAGAGG-3’; GS6, 서열번호 4, 5’-CGGCCGCCCCGGGGATC-3’)를 이용하여 게놈 DNA에 대한 PCR을 수행하였다. 증폭된 산물을 1% 아가로스 겔 (agarose gel) 전기영동하고, EtBr로 염색하여 크기를 확인한 뒤, 젤에서 DNA를 추출하여 sequencing으로 BAT1 (at4g31910) 유전자의 cDNA 염기서열임을 확인하였다. 형질 전환 식물체에서 이 유전자의 발현 검증을 위하여 줄기에서 추출한 RNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다.

(3) 브라시노스테로이드 신호 전달 특이적 표시 유전자의 발현 분석

관다발 조직의 변화와 함께 식물 호르몬인 브라시노스테로이드의 신호 전달과의 연관된 표현형을 분자적으로 검증하기 위하여 상기 식물체의 잎에서 Trizol 시약을 사용하여 RNA를 추출한 뒤 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 브라시노스테로이드 생합성 관련 유전자인 CPD, DWF4, ROT3 및 대조유전자인 ACT2에 특이적인 프라이머를 이용하여 qRT-PCR을 진행하였다. 이들 유전자는 브라시노스테로이드의 신호가 없을 때 증가하는 표시 유전자로 사용되었다.

(4) 줄기의 길이 측정

야생형과 BAT1 과발현 형질전환체 및 bat1-1 결핍 돌연변이체를 0.5X B5배지에서 7일간 키운 뒤 흙으로 옮겨 심어서 각각 줄기가 약 5 cm 크기로 자란 이후로 매일 줄기의 길이를 측정하였다. 도2의 b와 c에 따르면 BAT1 과발현 형질전환체는 야생형보다 줄기의 길이가 뚜렷하게 감소된 난쟁이 표현형을 보이고 이와 대조적으로 bat1-1 결핍 돌연변이는 줄기의 길이가 통계학적으로 유의미하게 야생형에 비하여 증가되어 있음을 확인하였다.

상기의 방법에 의하여 관찰한 줄기의 단면은 BAT1 과발현 식물체의 경우 도 1a에, bat1-1 결핍 돌연변이체의 경우 도 2d에 나타내었다. 이들의 대조적인 관다발의 개수 증감과 더불어 BAT1 과발현 식물체의 난쟁이 표현형과 bat1-1의 증대된 줄기의 길이 표현형은 각각 도 1b와 도 2b, 2c에 나타내었다. T-DNA 삽입 돌연변이의 선별 및 그의 모식도는 도 2a에 나타내었고 본 발명에서는 첫 번째 exon에 삽입된 bat1-1 결핍 돌연변이를 사용하였다. 또한, 도 1c에 나타난 바와 같이, 상기 방법에 의해 식물 호르몬인 브라시노스테로이드 생합성에 기능하는 것으로 알려진 유전자들의 발현이 야생형에 비하여 BAT1 과발현 식물체에서 크게 증가되어 있음을 확인하였다.

실시예 2. BAT1 RNA의 시, 공간적 발현 양상 확인

BAT1의 RNA 발현 양상을 관찰하기 위하여 상기 유전자의 프로모터를 pCAMBIA1303 (저작권은 Cambia사 소유, 호주) 바이너리 벡터에 재조합하였다. BAT1 유전자 프로모터의 2000 bp 앞부분에 특이적으로 5’ 쪽에는 EcoRⅠ을, 3’ 쪽에는 NcoⅠ을 삽입한 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, GUS 단백질과 융합되어 발현하도록 플라스미드 pCAMBIA1303-promoterBAT1-GUS를 제작하였다. 이를 식물에서 발현시키기 위해 아그로박테리움에 형질 전환시킨 뒤 애기장대에 플로랄 딥(floral dip) 방법을 이용하여 형질전환을 수행하였다. 형질 전환시킨 식물체는 종자를 받은 뒤 0.5X MS, 30mg/L 하이그로마이신 배지에서 자라는 독립적인 개체를 선별한 뒤 흙에 옮겨 심은 뒤 키워서 각각 종자를 따로 받아 다시 같은 조성의 배지에 심었을 때 살아남는 것과 죽는 표현형이 3:1 비율로 나타나는 개체군 중 일부를 흙에 옮겨 심고 일부는 염색하여 발현 패턴 분석에 이용하였다. GUS 단백질의 발현은 50mM NaPO₄(pH7.0), 1mM X0Gluc, 5mM K₃Fe(CN)₆, 5mM K₄Fe(CN)₆, 0.2% triton X-100 용액에 담가서 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 뒤 어린 시기의 잎과 떡잎 및 뿌리를 관찰하거나 성체의 다양한 조직을 현미경을 이용하여 관찰하였다.

도 3에 따르면, BAT1에 의해 코딩된 RNA는 잎, 떡잎과 뿌리의 관다발 조직에 발현함을 보여준다. 성체에서는 줄기의 관다발 조직에 특이적인 발현을 관찰할 수 있다. 이는 형질 전환 식물체가 관다발 조직에서 보여주는 표현형이 BAT1가 관다발 조직에 발현하여 기능할 것이라는 전제조건이 성립함을 증명하는 결과이다.

실시예 3. 세포내의 BAT1 단백질 발현 양상 확인

BAT1 단백질을 단일 엽육세포의 원형질체에 발현시키기 위하여 형광 단백질인 GFP와 융합시켜 발현시킬 플라스미드를 재조합하였다. (35S promoter-BAT1-GFP) 재조합된 플라스미드는 CsCl을 이용하여 2㎍/㎕의 고농도로 분리한 뒤 사용한다. 애기장대에서 단일 엽육 세포의 원형질체를 얻기 위하여 야생형인 Col-0를 3~4주 키운 뒤 잎을 잘게 썰어 0.4M mannitol, 20mM KCl 20mM MES, 1% cellulase, 0.25% macerozyme R10, 10mM CaCl₂, 0.1% BSA 용액에 넣고 호일로 빛을 차단하여 30분간 진공상태 후 3~4시간 상온에서 반응시켰다. 통상적으로 2×10⁴ 세포에 BAT1와 각 소기관에서 발현하는 표시 유전자를 합하여 40㎍의 DNA를 감염시키고 12~14시간 뒤 공초점현미경(confocal microscopy)을 사용하여 세포 내 발현을 관찰하여 도 3a에 나타내었다. 도 3a에서 보는 바와 같이 BAT1 단백질은 핵에 위치하고 있으며, 소포체의 표시 유전자인 BiP-RFP를 함께 감염시켰을 때 정확히 같은 위치에 발현하는 것을 확인하였다. 따라서 BAT1 단백질이 acyltransferse 효소로서 작용하는 기질은 핵에서 또는 소포체나 세포질에 존재하는 단백질이나 2차 대사산물일 가능성이 있는 것으로 기대된다.

결론적으로, BAT1 유전자가 결핍된 bat1-1는 바이오매스가 증가된 표현형을 보이므로 본 유전자를 응용 작물에 이용에 대한 실용성을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4. BAT1 과발현 식물체의 브라시노스테로이드 양 측정

BAT1 과발현 식물체에서 나타나는 난쟁이 표현형은 브라시노스테로이드 신호 전달 결함 돌연변이체와 유사한 점으로 보아 BAT1 유전자가 과발현 되었을 때 식물체 내의 브라시노스테로이드의 양에 어떠한 변화가 있는지 측정하였다. 도 4에서 보는 바와 같이 브라시노스테로이드의 생합성은 여러 대사 중간 물질을 거쳐 활성을 갖는 카스타스테론 (castasterone; CS) 또는 브라시놀라이드 (brassinolide; BL)로 전환하게 된다. 이들의 생합성되는 경로와 중간 대사 물질, 또는 각 단계로의 전환에 관여하는 생합성 유전자에 대해서는 비교적 연구가 잘 이루어져 있으나, 활성을 가진 브라시노스테로이드의 비활성화 또는 과다 합성에 의한 저장 형태 등에 대한 연구는 잘 밝혀져 있지 않다. 식물체 내의 브라시노스테로이드의 양을 측정하기 위하여 6주간 장일 조건의 온실에서 키운 60 g의 각각의 야생형 (Col-0), BAT1 유전자 과발현 식물체 및 bat1-1 결핍 돌연변이체를 준비하고 일련의 실험을 수행하였다. 시료의 원형 보존 및 물에 대한 용해성을 높이기 위해 동결하고 그대로의 상태로 감압하에 방치함으로써 시료 중의 수분을 승화시켜 제거하는 동결 건조를 수행하고 (lyophilization) 건조된 시료를 막대 사발을 이용하여 분말 상태로 준비하였다. 300 ml의 90% 메탄올을 이용하여 3회 추출한 용액을 얻고 회전감압농축기 (rotary evaporator)를 이용하여 감압하에 플라스크를 45~50 ℃의 더운 물이 담긴 수조 중에 회전하여 메탄올 용액을 농축시켰다. 증발되어 얻은 분획 추출물은 물 500 ml과 클로로포름 (CHCl₃) 500 ml을 이용해 용액을 3회에 걸쳐 분할하였다 (partitioning). 이 후 클로로포름 용액 분획을 위와 같이 회전감압농축기를 이용해 농축시키고 200 ml의 80% 메탄올과 200 ml의 n-hexane을 이용해 위 용액을 4회에 걸쳐 분할하였다. 농축된 80% 메탄올 분획 추출물은 에틸아세테이트 (ethyl acetate)와 인산완충액 (phosphate buffer, pH 7.8) 각각 300 ml씩을 이용해 3회에 걸쳐 다시 분할하였다. 에틸아세테이트 분획 추출물은 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피 (silica gel column chromatography)를 통해 활성 분획을 모아 농축하였다. 용출 용매로는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 그리고 100% (v/v)의 메탄올이 포함된 300 ml의 클로로포름 용액을 이용하여 컬럼 (column)을 통해 녹여 분리 (elution)하였다. 3%에서 7% (v/v) 메탄올 분획은 모아 감압농축시키고 SepPak C18 silica cartridge column을 이용하여 정제하였다. 이로써 얻은 분획은 감압농축하여 30 ml의 메탄올에 녹인 뒤, 고순도의 정제물을 얻기 위하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (reverse phase HPLC; high performance liquid chromatography, SenshuPak C18, 10 × 150 mm)를 수행하였다. 45%의 아세토니트릴 (acetonitrile; MeCN)을 1 분당 2.5 ml의 유속으로 흘려주어 각 분 마다 분획을 얻고, 가스크로마토그래프/질량분석기 (Gas Chromatograph/Mass spectrophotometry; GC/MS)를 이용하여 대조군의 각 브라시노스테로이드 중간 대사 물질과 함께 검출한 값으로 그 양을 대조하여 분석하였다.

이를 통해 BAT1 유전자 과발현 식물체는 야생형에 비하여 크게 감소된 브라시노스테로이드, 특히 6-deoxotyphasterol (6-deoxoTY), 6-deoxocastasterone (6-deoxoCS), 그리고 TY (typhasterol) 등의 브라시노스테로이드 중간 대사 물질이 관찰되었다.

실시예 5. BAT1 단백질의 기능 분석

BAT1의 cDNA를 포함하는 at4g31910/pGEM-T Easy 벡터의 염기서열을 BCM Search Launcher (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu) 의 인 실리코 번역 도구를 이용해서 아미노산 서열을 확인해본 결과 TAIR의 데이터베이스와 일치하는 458개의 아미노산으로 이루어져 있고 3개의 exon과 2개의 intron 부분이 있다(도 2a 참조). BAT1 단백질의 분자량은 약 51.1 kDa이고 등전점(Isoelectronic Point: pI) 값은 7.4946임을 확인할 수 있었다. BAT1의 아미노산 서열을 BLAST 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)에서 검색한 결과 acyltransferase 도메인을 포함하는 유전자들과 높은 상동성을 나타내었다.

InterProScan 프로그램(http://www.ebi.ac.uk)을 이용해서 기능이 알려진 도메인을 찾아본 결과 다른 acyltransferase와 공통적으로 acyltransferase 도메인을 가지고 있음을 확인함으로써 BAT1이 코딩하는 단백질이 acyltransferase 활성을 가질 수 있음을 예상할 수 있었다.

실시예 6. 브라시노스테로이드에 의한 BAT1 유전자 과발현 식물체의 표현형 회복

야생형과 BAT1 유전자 과발현 식물체를 약 23℃로 온도가 조절되는 온실에서 16시간 명조건 / 8시간 암조건의 24시간 주기를 가지는 장일 조건으로 0.5X B5배지에서 수직 상태로 성장시켰다. 수직으로 자란 식물체의 하배축 (hypocotyl)은 BAT1 유전자 과발현 식물체에서 뚜렷이 나타나게 되는데 다양한 브라시노스테로이드를 다양한 농도로 처리하고 7일 후 하배축의 길이를 측정하였다. 브라시노스테로이드는 브라시놀라이드 (brassinoldie;BL), 카스타스테론 (castasterone;CS), 테아스테론 (teasterone;TE), 또는 티파스테롤 (typhasterol;TY)을 각각 0.3 μM 또는 3 μM의 농도로 배지에 첨가하였다.

브라시노스테로이드에 의한 성체의 줄기 길이 회복 표현형을 관찰하기 위해 6주간 장일 조건에서 키운 BAT1 유전자 과발현 식물체를 활성이 높다고 알려진 브라시노스테로이드인 브라시놀라이드 (BL)와 카스타스테론 (CS) 1 μM을 스프레이로 일주일에 한 번씩 4 주간 처리해주었다. 각 브라시노스테로이드에 의한 감소된 줄기의 길이의 회복 표현형은 사진으로 나타내었다.

브라시노스테로이드의 생합성은 몇몇의 알려진 유전자에 의해 매개되는데 그 중 DWARF4 (DWF4) 유전자는 브라시노스테로이드의 생합성에 가장 중요한 유전자로서 DWF4 유전자가 과발현되었을 때, 식물체는 키가 크고 잎자루가 길고 휘어져 나가는 표현형을 나타내며 이는 크게 증가된 브라시노스테로이드의 양과 관련되어 나타난다. 본 발명에서는 이미 알려진 DWF4 유전자 과발현 식물체의 내부적인 브라시노스테로이드 양의 증가 표현형이 BAT1에 의해 어떤 영향을 받는지 알아보기 위해 유전학적으로 두 식물체를 교차수정시켰다. 두 식물체의 교차수정에 의한 자손의 표현형을 BAT1 유전자 과발현 식물체, DWF4 유전자 과발현 식물체, 그리고 야생형과 함께 비교하여 나타내었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Genes increasing biomass production and transgenic plants using them <130> PB12-10984 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1377 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana L. Heynh. <400> 1 atgcccatgt taatggcgac acgtatcgat ataatccaaa agcttaatgt atatccaagg 60 tttcaaaacc atgacaagaa gaaactaatc actctctcca atttggaccg tcagtgtcct 120 ttactcatgt actctgtctt cttctacaag aataccacaa ctcgtgactt tgactccgtc 180 ttctccaacc tgaagctcgg gctggaggag actatgtctg tgtggtatcc cgcggcaggg 240 agactgggtt tggacggagg tggctgcaag ctcaacatcc ggtgtaacga tggtggcgca 300 gtcatggtgg aggcggtggc gacaggtgtc aagttgtccg agcttggtga tttgactcag 360 tacaatgagt tttatgagaa tttagtttac aagccttcct tggatggtga tttctctgtg 420 atgcctcttg ttgttgctca ggtgacaaga tttgcatgtg gaggttactc aattggaatc 480 ggtacaagcc actctctatt tgatggaatc tcagcttacg aattcattca cgcgtgggcc 540 tccaactctc acattcacaa caaatccaac agcaagatta ctaataaaaa ggaagatgtg 600 gtcatcaaac cggttcatga tcgacgaaat ctactggtta accgggatgc tgtccgagaa 660 accaatgctg cagccatttg tcatctgtac cagttgatca aacaggcgat gatgacctat 720 caggagcaaa accgtaactt agagttacca gactctggtt ttgtgatcaa aacgttcgag 780 cttaatggcg atgcgataga aagcatgaag aagaaatcac tagaagggtt catgtgctcc 840 tcctttgagt ttcttgctgc tcatttgtgg aaggcaagaa caagggcttt agggttgagg 900 agagacgcca tggtgtgttt acaattcgca gtggacataa ggaaaagaac ggagacaccg 960 ctgccagaag ggttttccgg caacgcatac gtgcttgcct cggtggcatc caccgccaga 1020 gaattacttg aagagctaac actcgagtca atagtcaaca agatcagaga agccaagaaa 1080 tcaattgacc aaggttacat aaactcttac atggaagcac tcggaggtag taatgacgga 1140 aatctccctc ctctcaaaga gctaacccta atctccgact ggacaaaaat gccatttcac 1200 aatgttggct ttggcaacgg cggcgagcca gcggattaca tggccccact gtgtccaccg 1260 gtgccacaag ttgcttattt catgaagaac cctaaagatg ccaaaggtgt tcttgtgagg 1320 attggcttgg acccacgaga tgttaatggc ttttcaaatc atttccttga ttgctaa 1377 <210> 2 <211> 458 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana L. Heynh. <400> 2 Met Pro Met Leu Met Ala Thr Arg Ile Asp Ile Ile Gln Lys Leu Asn 1 5 10 15 Val Tyr Pro Arg Phe Gln Asn His Asp Lys Lys Lys Leu Ile Thr Leu 20 25 30 Ser Asn Leu Asp Arg Gln Cys Pro Leu Leu Met Tyr Ser Val Phe Phe 35 40 45 Tyr Lys Asn Thr Thr Thr Arg Asp Phe Asp Ser Val Phe Ser Asn Leu 50 55 60 Lys Leu Gly Leu Glu Glu Thr Met Ser Val Trp Tyr Pro Ala Ala Gly 65 70 75 80 Arg Leu Gly Leu Asp Gly Gly Gly Cys Lys Leu Asn Ile Arg Cys Asn 85 90 95 Asp Gly Gly Ala Val Met Val Glu Ala Val Ala Thr Gly Val Lys Leu 100 105 110 Ser Glu Leu Gly Asp Leu Thr Gln Tyr Asn Glu Phe Tyr Glu Asn Leu 115 120 125 Val Tyr Lys Pro Ser Leu Asp Gly Asp Phe Ser Val Met Pro Leu Val 130 135 140 Val Ala Gln Val Thr Arg Phe Ala Cys Gly Gly Tyr Ser Ile Gly Ile 145 150 155 160 Gly Thr Ser His Ser Leu Phe Asp Gly Ile Ser Ala Tyr Glu Phe Ile 165 170 175 His Ala Trp Ala Ser Asn Ser His Ile His Asn Lys Ser Asn Ser Lys 180 185 190 Ile Thr Asn Lys Lys Glu Asp Val Val Ile Lys Pro Val His Asp Arg 195 200 205 Arg Asn Leu Leu Val Asn Arg Asp Ala Val Arg Glu Thr Asn Ala Ala 210 215 220 Ala Ile Cys His Leu Tyr Gln Leu Ile Lys Gln Ala Met Met Thr Tyr 225 230 235 240 Gln Glu Gln Asn Arg Asn Leu Glu Leu Pro Asp Ser Gly Phe Val Ile 245 250 255 Lys Thr Phe Glu Leu Asn Gly Asp Ala Ile Glu Ser Met Lys Lys Lys 260 265 270 Ser Leu Glu Gly Phe Met Cys Ser Ser Phe Glu Phe Leu Ala Ala His 275 280 285 Leu Trp Lys Ala Arg Thr Arg Ala Leu Gly Leu Arg Arg Asp Ala Met 290 295 300 Val Cys Leu Gln Phe Ala Val Asp Ile Arg Lys Arg Thr Glu Thr Pro 305 310 315 320 Leu Pro Glu Gly Phe Ser Gly Asn Ala Tyr Val Leu Ala Ser Val Ala 325 330 335 Ser Thr Ala Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Thr Leu Glu Ser Ile Val 340 345 350 Asn Lys Ile Arg Glu Ala Lys Lys Ser Ile Asp Gln Gly Tyr Ile Asn 355 360 365 Ser Tyr Met Glu Ala Leu Gly Gly Ser Asn Asp Gly Asn Leu Pro Pro 370 375 380 Leu Lys Glu Leu Thr Leu Ile Ser Asp Trp Thr Lys Met Pro Phe His 385 390 395 400 Asn Val Gly Phe Gly Asn Gly Gly Glu Pro Ala Asp Tyr Met Ala Pro 405 410 415 Leu Cys Pro Pro Val Pro Gln Val Ala Tyr Phe Met Lys Asn Pro Lys 420 425 430 Asp Ala Lys Gly Val Leu Val Arg Ile Gly Leu Asp Pro Arg Asp Val 435 440 445 Asn Gly Phe Ser Asn His Phe Leu Asp Cys 450 455 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS4 <400> 3 acattctaca actacatcta gagg 24 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS6 <400> 4 cggccgcccc ggggatc 17

Claims (5)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 식물체의 바이오매스 생산 증가용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 염기 서열은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 식물체의 바이오매스 생산 증가용 조성물.
   
3. 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열이 삽입된 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 바이오매스 생산 증가용 조성물.
   
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 식물체로, 상기 식물체는 바이오매스 생산이 증가되어 있는 것을 특징으로 하는 식물체.
   
5. 식물체의 바이오매스 생산을 증가시키는 방법으로, 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법.

Images