KR20140050733A - 근섬유 단편을 사용한 근조직 재생 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이식을 위한 균일한 크기의 근섬유 단편들을 수득하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이들 근섬유 단편은 원래의 근육을 따라 배향하여 장섬유로 재구성될 수 있다. 상기 이식된 근세포는 조직학 및 면역조직화학에 의해 확인되는 바와 같이 원래의 혈관 및 신경 네트워크와 통합된다. 본 발명은 자가 근육이 수술실에서 공여 위치로부터 수거되어 처리되고 표적 위치 내로 주입될 수 있기 때문에 특히 유리하다. 상기 단편화된 근섬유는 숙주 내에서 용이하게 통합될 수 있다.

Description

근섬유 단편을 사용한 근조직 재생{MUSCLE TISSUE REGENERATION USING MUSCLE FIBER FRAGMENTS}
정부 권리
본 발명은 미국 국방부에 의해 수여된 허여 번호 제W81XWH-08-1-0333호 - 정형외과 외상 연구 프로그램(OTRP) 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 확고한 권리를 갖는다.
기술 분야
본 발명의 기술 분야는 근조직의 재생을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 근조직을 함유하는 구조물(construct)에 관한 것이다.
외상성 상해, 종양 절제 또는 절개, 또는 기능적 손상에 의해 손실된 골격 근조직의 재구성은 이용 가능한 기능적 근조직 또는 근조직 대체물의 결여에 의해 저해된다. 자가 이식편은 임상적으로 사용되어 왔지만, 주변에 충분한 공여자 근조직의 존재를 필요로 하며 공여 위치에 근육 결함을 남길 수 있다. 허터(Herter) 등[참조: J. Plast Reconstr. Aesthetic Surgery 60, 760-768 (2007)]은 공여자 조직을 제공하는 다양한 위치를 분석하고 이들 기술의 이점 및 단점을 제공한다.
이식편 없이 근육을 재생하는 현재의 방법은 주로 시험관내 조직 배양을 통한 근육 세포 또는 섬유 단리 및 팽창에 의존한다. 이들 세포 또는 섬유는 주입 치료하는데 사용되거나, 근육 기능을 달성하기 위해 스캐폴드(scaffold)를 사용하여 근조직을 조작하는데 사용된다. 이들 방법은 세포 조작 및 상당한 시간을 필요로 하고, 이후에 치료에 사용될 수 있다. 추가로, 상기 세포 또는 장섬유가 근육 내로 직접 주입되는 경우, 상기 방법은 세포 또는 섬유의 배향 조절에 있어서의 어려움과 혈관 및 신경 통합의 지연으로 인한 낮은 생존가능성에 의해 제한된다. 따라서, 회복을 필요로 하는 영역에서 주입 또는 이식을 통해 근육을 재생하여, 이식편이 숙주 혈관 및 신경 네트워크와 용이하게 통합될 수 있고 생존 가능한 근육을 제공하는 보다 나은 방법이 요구된다.
발명의 요약
근육을 재생하기 위한 방법 및 조성물이 기술된다. 분해된 근섬유 단편이 기능적 근조직의 재생에 특히 효과적임이 발견되었다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 단편은 기능적 위성 세포(satellite cell)를 보유하지만 세포벽 파괴를 나타내고 평균 크기가 150㎛ 미만이다. 상기 방법은 공여 위치로부터 근조직을 추출하고 상기 추출된 조직으로부터 근섬유를 분해하며 분해된 근섬유를 섬유 단편(이는 세포벽 파괴를 나타내고 바람직하게는 평균 크기가 150㎛ 미만이지만 기능적 위성 세포는 보유한다)으로 단편화함으로써 조성물을 제조 및 이식하는 과정을 포함한다. 이식시, 상기 근섬유 단편 조성물은 상기 단편들로부터 길쭉한 근섬유를 재구성(reconstituting 또는 reconstructing)하여 표적 근육 위치에 이식되는 경우 원래의 근섬유와 정렬하여 배향될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 세포 단편은 평균 크기가 300㎛ 미만, 바람직하게는 150㎛ 미만, 일부 경우 보다 바람직하게는 약 80 내지 120㎛ 또는 약 90 내지 110㎛이다. 상기 단편은 임의의 형태일 수 있지만, 바람직하게는 둥글거나 길쭉한 형태, 예를 들면 긴 치수 대 짧은 치수의 종횡비가 약 2:1 내지 1:1인 형태이다. 근섬유가 긴 원통형 다핵 세포이므로, 상기 단편은 하나 이상의 핵을 보유할 뿐만 아니라 하나 이상의 기능적 위성 세포와 연관되는 것이 또한 바람직할 수 있다.
하나의 양태에서, 근조직을 추출하는 단계는 자가 조직의 근조직을 추출함으로써 실시될 수 있으며, 조직으로부터 근섬유를 분해하는 단계는 상기 근섬유를 콜라게나제 타입 I과 같은 효소로 분해하는 것을 추가로 포함한다. 상기 개별 섬유를 단편으로 단편화하는 단계는 기계적 교반에 의해, 예를 들면, 유체 전달(피펫팅)을 통해 또는 초음파 처리를 통해 실시될 수 있다. 일부 경우, 단편화는 상기 근섬유 단편의 75% 이상이 세포벽 파괴를 나타낼 때까지 수행될 수 있다.
본 발명의 치료학적 용도는 상기 조성물을 근육 결함 표적 위치에 전달함으로써 실시될 수 있다. 한 가지 접근법에서, 상기 조성물은 생리학적으로 적합한 유체 중에서 현탁될 수 있으며, 상기 조성물은 상기 근육 결함 표적 위치 내로 주입될 수 있다. 대안적으로, 상기 조성물은 스캐폴드 상에 시딩(seeding)될 수 있으며, 상기 시딩된 스캐폴드는 근육 결합 표적 위치에 이식된다.
상기 방법은 상기 조성물을 줄기 세포, 근육 전구 세포, 성장 인자 또는 이러한 제제의 배합물과 같은 보조제와 함께 동시 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 보조제는 골 형성 단백질(BMP), RUNX-2 단백질, LIM 무기화 단백질, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 표피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α, 형질전환 성장 인자-β, 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래된 신경 영양 인자(BDNF), 뉴레귤린(NRG), 및 아그린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다.
스캐폴드가 사용되는 경우, 상기 스캐폴드 지지된 단편을 시험관내 배양한 후, 상기 스캐폴드를 근육 결함 표적 위치에 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 스캐폴드는 콜라겐 겔, 피브린 겔, 알기네이트 겔, 또는 UV-유도된 가교결합 가능한 겔 시스템으로부터 선택된 주입 가능한 스캐폴드일 수 있다. 대안적으로, 상기 스캐폴드는 유기 매트릭스 또는 중합체성 매트릭스를 포함하는 이식 가능한 스캐폴드일 수 있다. 상기 유기 매트릭스는, 예를 들면, 점막하(submuscosa)와 같은 탈세포화 조직일 수 있다. 중합체 매트릭스 물질의 예는 하나 이상의 천연 중합체(예: 콜라겐 또는 엘라스틴)이거나 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-카프트로락톤)(PLCL) 또는 이들의 배합물과 같은 하나 이상의 합성 중합체일 수 있다.
일부 양태에서, 상기 매트릭스는 하나 이상의 천연 중합체와 하나 이상의 합성 중합체의 배합물, 예를 들면, 콜라겐과 폴리카프로락톤(PCL)에 의해 형성되는 전기방사된 섬유 매트릭스일 수 있다. 상기 시딩된 스캐폴드는 골 형성 단백질(BMP), RUNX-2 단백질, LIM 무기화 단백질, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 표피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α, 형질전환 성장 인자-β 또는 이들의 배합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 효율적인 기능적 근육 재생을 위한 근섬유의 균일하게 구조화된 소형 단편 뿐만 아니라 이들 근섬유 단편의 제조 방법 및 사용 방법을 기술한다. 소형 근섬유 단편의 사용은 원래의 근육의 섬유 방향을 따라 숙주 근조직 내로 주입된 단편의 효율적인 재-어셈블리(re-assembly)를 유도한다. 숙주의 혈관 및 신경 네트워크로의 통합이 관찰되었다.
도 1은 본 발명에 따르는 근조직의 재생을 위해 근섬유 세포로부터 근섬유 단편을 형성하는 방법을 도식적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따르는 근섬유 단편의 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명에 따르는 근조직 재생에서의 단계들의 블록 다이어그램이다.
도 4a는 래트에서의 화학적으로 유도된 TA 근육 상해에 MF를 주입함으로써 근 위축 모델로의 근섬유 단편(MF) 기술의 적용을 도식적으로 도시한 것이다.
도 4b는 TA 근육 상해 내로의 MF의 직접 주입이 7일, 21일 및 28일째에 근육 기능을 현저하게 개선시킴을 보여주는 그래프이다(스튜던트 t-검정, P<0.05, n=7, 2회의 독립적인 실험).
도 5a 내지 5d는 주입한지 3주 후 상기 근 위축 연구의 세포의 형태학 검정을 제공하며, 주입된 MF 및 MF-유도된 근육 전구 세포(Pax7+ 세포)(도 5b)와 숙주 근육(도 5a), 혈관 네트워크(도 5c) 및 신경 네트워크(도 5d)와의 통합을 보여주고, 스케일 바는 50㎛이다.
도 6a 내지 6c는 외상성 근육 결함 모델로의 이식성 MF-포함 구조물의 투여를 도시한다. 도 6a는 래트에서 수술에 의해 유도된 TA 근육 결함 내로의 MF/콜라겐 구조물 이식의 도식적 다이어그램이다. 상기 결함이 있는 TA 근육 내로의 MF/콜라겐의 이식은 기능적으로(도 6b) 및 구조적으로(도 6c, 이식한지 4주 후) 개선된 근육 회복을 효율적으로 유도한다. * b 및 c에서의 ANOVA 및 Tukey 검정, P < 0.05, n=7, 2개의 독립적 실험;
도 7a 및 7b는 요도 괄약근 실금(USI) 모델로의 MF 기술의 적용을 도시한다. 도 7a는 요도 괄약근 상해 내로의 MF 주입의 도식적 다이어그램이다.
도 7b는 MF 주입 후 개선된 괄약근 기능으로 인해 개선된 요역학 기능을 나타내는 그래프이다. 전기 자극 존재(P2) 및 전기 자극 부재(P1) 뇨 누출점 압력. P2 - P1 = 외부 괄약근이 견디는 최대 방광압, * 스튜던트 t-검정, P < 0.01, n=3;
도 8a는 임상적 용도를 위해 처리되는 사람 근섬유 단편에 대한 대체 기술(약 30분의 처리 시간)을 도시한다.
도 8b는 균질하고 균일한 크기의 사람 MF의 형상 및 중량 기준의 수율(30 내지 40%)을 나타내는 현미경 사진이다.
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정한 용어들이 먼저 정의된다:
용어 "약" 또는 "대략"은 당해 기술 분야에서 통상의 기술 중의 하나에 의해 측정되는 바와 같은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 부분적으로는 상기 값이 측정 또는 결정되는 방식, 예를 들면, 상기 측정 시스템의 한계 또는 특정 목적에 요구되는 정밀도에 따라 좌우될 것이다. 예를 들면, "약"은 당해 기술 분야의 실시에 따라 1 또는 1 이상의 표준 편차 내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20%까지, 바람직하게는 10%까지, 보다 바람직하게는 5%까지, 보다 더 바람직하게는 1%까지의 범위를 의미할 수 있다. 특정한 값이 명세서 및 특허청구범위에 기술된 경우, 달리 기재되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하는 것으로 추정되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 단수형("a" "an" 및 "the")은 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "분자"를 지칭하면 하나 이상의 이러한 분자를 포함하고, "수지"는 하나 이상의 이러한 상이한 수지들을 포함하며, "방법"을 지칭하면 본원에 기술된 방법을 위해 개질 또는 치환될 수 있는 당해 기술 분야의 통상의 숙련가들에게 공지된 상응하는 단계들 및 방법들에 대한 지칭을 포함한다.
"이방성"은 물질(예: 근관세포, 스캐폴드 등)의 물리적 특성(예: 탄성, 인장 강도, 파단 신도 등)이 작용(예: 신장 또는 변형)의 방향에 따라 상이함을 의미하며, 이는 물질의 특성이 모든 방향에서 동일한 "등방성"과 대비된다. 예를 들면, 이방성 세포 기질은 한 축(예: 종축)을 따른 최대 인장 강도가 상기 축에 수직인 축을 따른 최대 인장 강도에 비해 더 클 수 있다(예를 들면, 0, 1 또는 2 내지 4, 5, 6 또는 그 이상의 MPa). 상기 파단 신도는 한 축(예: 종축)을 따른 파단 신도가 상기 축에 수직인 축을 따른 파단 신도에 비해 더 작을 수 있다(예를 들면, 10, 20, 30 또는 40 내지 50, 60, 70 또는 80% 또는 그 이상). 응력 곡선의 피크(MPa)는, 한 축(예: 종축)에 수직인 축에 비해, 상기 한 축(예: 종축)에 따른 더 낮은 변형(%)에서 달성될 수 있다. 바람직하게는, 상기 물질은 실온에서 습윤 조건하에(예를 들면, 포스페이트 완충 식염수 중에 침지됨) 시험된다.
본원에서 사용되는 용어 "부착하다"는 기질에 직간접적으로 부착하는 세포들 뿐만 아니라 다른 세포에 부착하는 세포들도 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "생체적합성 기질"은 세포 군집이 침착될 수 있는 피험자 내로 이식하기에 적합한 물질을 지칭한다. 생체적합성 기질은 상기 피험자에 일단 이식되면 독성 또는 상해 효과(injurious effect)를 일으키지 않는다. 하나의 양태에서, 상기 생체적합성 기질은 보수 또는 대체를 필요로 하는 바람직한 구조로 형상화될 수 있는 표면을 갖는 중합체이다. 상기 중합체는 또한 보수 또는 대체를 필요로 하는 구조의 일부로 형상화될 수도 있다. 상기 생체적합성 기질은 세포가 부착되거나 그 위에서 성장하도록 하는 지지성 프레임워크(framework)를 제공한다. 세포들의 배양된 군집은 이후 상기 생체적합성 기질 상에서 성장할 수 있으며, 이는 세포-세포 상호작용을 요하는 적당한 세포간 거리를 제공한다.
"생분해성 스캐폴드" "생분해성 메쉬" 또는 "생분해성 매트릭스"는 피험자의 신체에서 분해 및/또는 흡수될 수 있는 물질을 갖는 스캐폴드이다. 바람직하게는, 상기 스캐폴드 또는 매트릭스는 상기 매트릭스의 기공들의 상부와 내부 둘 다에 세포 침착이 허용되도록 다공성이며, 특정 양태에서, 성형된다. 이러한 제형은 상기 스캐폴드의 상부 및/또는 내부에 상기 세포 군집을 시딩하기 위해 생분해성 스캐폴드에 하나 이상의 세포 군집을 제공함으로써 제조될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 시딩된 스캐폴드는 이후 수령 피험자의 신체 내에 이식되며, 여기서 상기 조직화된 세포 군집은 기능성 조직 구조의 형성을 용이하게 한다.
본원에서 사용되는 용어 "공중합체"는 중합체성 성분들의 블록, 그래프 또는 랜덤 조합에 의해 형성되는 공중합체, 삼원공중합체 또는 그 이상의 다원 중합체 조성물을 포함하는 것을 의도한다.
본원에서 사용되는 용어 "탈세포화된" 또는 "탈세포화"는 비손상 무세포 하위구조만 남기고 세포 및 조직 내용물이 제거된 바이오구조(예: 기관, 또는 기관의 일부)를 지칭한다. 신장과 같은 기관은 다양한 특수 조직으로 구성된다. 기관 또는 실질(parenchyma)의 특수 조직 구조는 상기 기관과 관련된 특정한 기능을 제공한다. 상기 기관의 지지 섬유상 네트워크는 간질(stroma)이다. 대부분의 기관은 특수한 조직을 지지하는 특수하지 않은 결합 조직으로 구성된 간질 프레임워크를 갖는다. 상기 탈세포화 방법은 상기 특수한 조직을 제거하고 결합 조직의 복잡한 3차원 네트워크를 남긴다. 상기 결합 조직 하위 구조는 주로 콜라겐으로 구성된다. 상기 탈세포화 구조물은 상부에 상이한 세포 군집이 융합될 수 있는 생체적합성 기질을 제공한다. 탈세포화 바이오구조는 이들의 형태를 변형시킬 수 있는 경질 또는 반-경질일 수 있다. 본 발명에서 유용한 탈세포화 기관의 예는 심장, 신장, 간, 췌장, 비장, 방광, 요관 및 요도를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
근섬유 단편에 대해 본원에서 사용되는 용어 "직경"은 단편의 평균 직경을 의미한다. 바람직하게는, 모든 단편의 80% 이상이 언급된 직경 범위 내에 있다. 보다 바람직하게는, 모든 단편의 90% 이상은 언급된 직경 범위 내에 있고, 가장 바람직하게는 모든 단편의 95% 이상은 언급된 직경 범위 내에 있다.
본원에서 사용되는 용어 "전기방사" 또는 "전기방사된"은 물질이 전기장의 존재하에 스트리밍, 분무, 스퍼터링, 드립핑 또는 기타 방식으로 이송되는 임의의 방법을 지칭한다. 상기 전기방사된 물질은 하전된 컨테이너의 방향으로부터 접지된 표적을 향해, 또는 접지된 콘테이너로부터 하전된 표적의 방향으로 침착될 수 있다. 특히, 용어 "전기방사"는 하나 이상의 천연 생물학적 물질, 하나 이상의 합성 중합체 물질 또는 이들의 배합물을 포함하는 전기적으로 하전된 용액을 개구 또는 오리피스를 통해 접지된 표적을 향해 스트리밍함으로써 상기 하전된 용액으로부터 섬유가 형성되는 방법을 의미한다.
용어 "길쭉한"은, 예를 들면, 상기 근섬유가 너비에 비해 길이가 더 크다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 길쭉한 근섬유는 길이가 너비의 5배 이상이거나, 보다 바람직하게는 너비의 10배 이상, 너비의 50배 이상, 또는 너비의 100배 이상이다.
단백질 또는 기타 생물학적 마커가 "발현하다" 또는 이의 "발현"은 이의 동일한 전구체를 인코딩하는 유전자가 전사됨을, 바람직하게는 번역됨을 의미한다. 전형적으로, 본 발명에 따라, 유전자의 코딩 영역의 발현은 인코딩된 폴리펩티드를 제조하게 하여, 상기 새포는 상기 단백질 또는 기타 생물학적 마커에 대해 "양성"이 된다.
"섬유아세포"는 세포외 매트릭스 및 콜라겐을 합성하는 세포이고 몸 전체에 걸친 결합 조직에서 발견된다.
"이식편"은 (예를 들면, 수의용 또는 의학적 (사람) 용도를 위해) 피험자의 천연 조직(적어도 이의 일부)을 보수, 증가 또는 대체하기 위해 배치되는 제품을 지칭한다. 용어 "이식성"은 상기 장치가 환자에게 삽입, 임베딩, 그래프팅 또는 기타 임상적으로 부착 또는 배치될 수 있음을 의미한다. 이식편은 스캐폴드 또는 바이오스캐폴드(이는 스캐폴드 또는 바이오스캐폴드 상에 시딩된 세포를 추가로 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "단리된"은 상기 세포들이 이들의 천연 환경 이외의 조건 내로 놓여짐을 의미한다. 조직 또는 세포는 피험자로부터 초기에 단리된 경우, 예를 들면, 기본 외식편은 "수거"된다.
본원에서 사용되는 용어 "근육 결함"은 물리적 상해, 화상, 외과적 조직 절제, 근육 소모, 근육퇴행위축, 경색, 허혈성 사건 및 신경근 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 근육 기능을 불량하게 할 수 있는 장애, 질환, 결함 및 상해를 광범위하게 포함하는 것을 의도한다.
근육 세포는 근섬유 또는 근세포를 포함하지만 이로 제한되지 않으며, 임의의 적합한 종일 수 있고, 일부 양태에서 조직이 이식되는 피험자와 동일한 종이다. 포유동물 세포(마우스, 래트, 개, 고양이, 원숭이 및 사람 세포 포함)가 일부 양태에서 특히 바람직하다. 근세포는 골격 근세포, 평활근세포 및 심근세포를 포함한다.
상기 근섬유 단편은 동계(즉, 유전적으로 동일하거나 밀접하게 관련되어, 조직 이식 거부가 최소화되도록 함), 동종이계(즉, 동일한 종의 유전적으로 동일하지 않은 멤버(member)) 또는 이종(즉, 상이한 종의 멤버)일 수 있다. 동계 근섬유 단편은 자가 조직으로부터의 단편(즉, 치료되는 환자로부터의 단편) 및 동종 단편(즉, 유전적으로 동일하지만 상이한 피험자, 예를 들면, 일란성 쌍둥이로부터의 단편)을 포함한다. 근섬유 단편은, 예를 들면, 공여자(생체 또는 시체)로부터 수득할 수 있거나 확립된 세포주(cell strain 또는 cell line)에서의 세포로부터 유도된다. 예를 들면, 근섬유 단편은 당해 기술 분야에 공지된 표준 생검 기술을 사용하여 공여자(예: 생물스캐폴드 이식편의 잠재적 수용자)로부터 수거될 수 있다. 한 바람직한 양태에서, 상기 근섬유 단편은 자가 조직이다.
근육 섬유(또는 "근섬유")는 다핵화 단일 근세포이다. 물리적으로는, 이들은 매우 길쭉하며, 직경 100㎛ 이하 및 길이 수mm 내지 직경 수백㎛ 및 길이 수cm 크기의 범위이다. 상기 세포는 수축성 단백질, 에너지 저장소 및 신호 메카니즘으로 조밀하게 채워진다.
근섬유 세포는 발달하는 근모세포(근세포를 생성시키는 배아 전구 세포의 한 형태)의 융합으로부터 형성된다. 상기 근섬유는 근섬유의 기본 기능 단위인 근육원섬유마디로서 반복되는 액틴 및 미오신 근원섬유로 구성되고 골격근의 횡문 외관의 원인이 되고 근육 수축에 필요한 기본적인 기계조직(machinery)을 형성하는 긴 원통형 다핵 세포이다.
상기 근섬유는 최소형 완전 수축 시스템이다. 이와 같이, 이는 대사, 자극 및 수축을 위한 하위 시스템을 필요로 한다. 효과적인 힘 생성을 위해, 수축은 섬유의 전체 길이를 따라 동시에 자극되어야 한다. 상기 수축 신호는 T-세관 시스템에 의해 상기 섬유를 따라 신속하게 퍼지며, 이는 근소포체(SR)로부터 칼슘 이온의 신속한 방출을 신호화한다. 수축 신호가 종료되자마자, ATP-구동 칼슘 펌프는 상기 SR에서 거의 모든 세포내 칼슘을 봉쇄하기 시작한다.
각각의 근섬유 내에 근원섬유의 네트워크가 있다. 이들 원섬유은 실제적인 힘을 생성하는 단백질을 함유한다. 골격근이 이의 특징적인 횡문 패턴을 나타내는 이유는 바로 이들 원섬유 때문이다. 단백질들의 확장된 네트워크는 각각의 근원섬유는 이의 이웃하는 원섬유과 결합하고 세포막과 결합한다.
"근모세포"는 근육 줄기 세포의 한 형태이고, 일반적으로 척추가 있는 유기체에서 이의 생활 주기의 과정 동안 근섬유와 밀접하게 연관된다. 상기 근섬유가 손상된다면, 상기 근모세포는 이를 나누어 다시 채울 수 있다. 전형적으로, 근육이 손상된 후, 근섬유는 괴사되고 대식세포에 의해 제거된다[참조: Hurme et al. (1991) Healing of skeletal muscle injury: an ultrastructural and immunohistochemical study, Med. Sci Sports Exerc. 23, 801-810]. 이는 근모세포의 증식 및 용융을 유도하여 길쭉한 다핵화 근관을 형성하며, 이는 자체-어셈블링하여 보다 조직화된 구조, 즉 근섬유를 형성한다[참조: Campion (1984) The muscle satellite cell: a review, Int. Rev. Cytol. 87, 225-251].
"근세포"는 근육 세포, 근섬유, 또는 골격근 세포이다. 근세포는 근모세포가 함께 용융하는 경우 형성된다.
상기 언급한 바와 같이, "근원섬유"는 무수한 근미세섬유로 구성된 근섬유의 가느다란 쓰레드이다. 근원섬유는 상기 세포의 한 쪽 말단으로부터 다른 쪽 말단으로 이어지며, 각각의 말단에서 세포 표면 멤브레인에 부착된다.
"근관세포"는 일반적으로 근모세포의 융합에 의해 형성되는 길쭉한 다핵 세포이다. 근관세포는 성숙한 근섬유로 발달할 수 있으며, 이는 (예를 들면, 포유동물에서) 말단에 위치하는 핵과 이들의 세포질 내의 근원섬유를 갖는다. 저혈청 조건에서, 근모세포 주기를 퇴장하여 융합하여 다핵 근관세포를 형성하고, 이는 수축성이 된다.
용어 "나노입자", "나노구조물" 및 "양자점"은 1 또는 수nm 내지 수㎛ 정도, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 1000nm의 치수를 갖는 물질을 기술하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "천연 바이오구조"는 피험자 내에서 발견되는 생물학적 배열을 지칭하며, 예를 들면, 심장, 신장, 간, 췌장, 비장, 방광, 요관 및 요도를 포함하지만 이로 제한되지 않는 기관이다. 용어 "천연 바이오구조"는 또한 바이오구조의 일부, 예를 들면, 기관의 일부, 예를 들면, 신장의 신동맥을 포함하는 것을 의도한다. 천연 생물학적 물질은 포유동물의 신체, 식물 또는 기타 유기체에서 자연적으로 발견되는 임의의 물질을 포함하는 천연 유기 물질일 수 있다. 합성 중합체 물질은 인공 합성, 처리 또는 제조의 방법을 통해 제조되는 임의의 물질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 합성 물질은 생물학적으로 적합한 물질이다. 상기 천연 또는 합성 물질은 또한 전기장하에 하전될 수 있는 물질이다.
"배향된" 세포 및/또는 세포 기질은 전형적으로 1개(또는 그 이상의) 배향축(예: 종축)을 가지며, 이는 관심 영역 내의 임의의 바람직한 방향일 수 있다. 본원에서 사용되는 "배향하는"은 본원에서 기술된 방법을 특정하게 실행하고자 하는 효과 또는 이점을 생성하기 위해 조직화의 충분한 증가가 달성되기만 한다면 부분적 또는 전체 배향을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들면, 섬유 및/또는 세포는 종축을 따라 배향되어 상기 섬유 및/또는 세포의 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과 또는 그 이상이 임의 방향의 기준 축으로부터 50도, 40도, 30도, 20도 또는 10도 또는 그 이하의 각도로 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "환자"는 외상성 상해, 종양 절제, 또는 기능성 손상 등에 의해 손실된 근조직의 회복 또는 재구성을 필요로 하는 숙주 동물을 지칭한다. 바람직한 환자는 포유동물이다. 환자의 예는 사람, 말, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 래트, 소, 돼지, 염소 및 양을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 양태에서, "환자"는 일반적으로 사람 환자이다.
"일차 배양"은 분해된 세포 또는 1차 외식편을 배양 용기 내로 시딩한 후 확립되는 제1 배양이다. 본원에서 사용되는 "팽창하는" 또는 "팽창"은 생존 가능한 세포의 수의 증가를 지칭한다. 팽창은, 예를 들면, 하나 이상의 세포 주기를 통해 세포가 "성장"함으로써 달성될 수 있으며, 여기서 상기 세포의 적어도 일부가 나뉘어져서 추가의 세포를 생성한다. 본원에서 사용되는 "성장"은 상기 세포가 생존 가능하게 남아 있고 상기 세포의 팽창 및/또는 분화를 포함하거나 포함하지 않을 수 있도록 하는 세포의 배양을 포함한다.
본원에서 사용되는 "위성 세포"는 성숙한 근육에서 발견되는 세포질이 적은 소형 단핵 전구 세포이다. 이들은 개별 근육 근섬유의 기저막과 근섬유초(세포막) 사이에 위치한다. 위성 세포는 기존의 근섬유를 증가시키고 새로운 근섬유를 형성하기 위해 분화 및 융합할 수 있다. 손상되지 않은 근육에서, 대부분의 위성 세포는 휴지되고; 이들은 분화하지도 않고 세포 분할을 하지도 않는다. 기계적 변형에 대한 반응으로 위성 세포는 활성화된다. 활성화된 위성 세포는 초기에는 골격성 근모세포로서 증식하며 근관세포로 분화된 후 근원성 분화를 겪을 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 공여자 근섬유는 위성 세포를 함유한다. 일부 양태에서, 근섬유 단편은 평균 2 내지 3개의 위성 세포를 함유할 것이다. 기타 양태에서, 상기 근섬유 단편은 보다 많은 위성 세포를 함유할 것이다.
"스캐폴드"는 세포 또는 섬유가 부착될 수 있는 천연 또는 합성 매트릭스 분자의 어레이를 지칭한다. 상기 섬유는 엘라스틴, 탄성 스트랜드 또는 펩티드, 피브린, 콜라겐, 프로테오글리칸, 하이알루로난 또는 하이알루로난 올리고머, 합성 섬유 또는 원섬유, 또는 생활성 하이드로겔, 마이크로입자, 비드, 리포솜, 또는 소낭과 같은 세포외 매트릭스 분자 또는 성분을 포함할 수 있다. 스캐폴드는 엘라스틴, 엘라스틴형 또는 엘라스틴-유사 펩티드, 피브린, 프로테오글리칸, 시판 매트릭스 또는 매트릭스 대체물(미국 캘리포니아주 산호세 소재의 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)의 마트리겔(Matrigel)TM 매트릭스), 임의 형태의 콜라겐, 합성 섬유 또는 원섬유, 또는 생활성 하이드로겔과 같은 세포외 매트릭스 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 전문이 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 공보 제2010/0331980호에 기술된 바와 같은 스캐폴드가 사용된다. 일부 양태에서, 상기 스캐폴드는 고도로 배향된 기저 세포외 매트릭스를 반영하는 현저한 단축 기계적 특성을 나타내는 전기방사된 스캐폴드이다. 일부 양태에서, 상기 스캐폴드는 전기방사된 나노섬유 메쉬를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 메쉬는 단축 섬유 각을 갖는다.
근섬유 단편과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "크기"는 이들의 평균 직경을 따르는 단편의 길이를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "파열" 및 "파괴" 뿐만 아니라 이들의 파생어는 세포의 세포질의 적어도 일부를 세포외 환경에 노출시키는 세포막의 침해 또는 결함을 특징으로 한다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 50% 초과, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상이다. "실질적인 세포벽 파괴"라는 구절은 상기 세포벽이 상기 샘플 중의 세포의 50% 초과에서 파열 또는 파괴됨을 의미한다. 보다 바람직하게는, 상기 세포벽의 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 파괴된다.
본원에서 사용되는 용어 "표적 근육 위치"는 근조직의 회복 또는 재구성을 필요로 하는 위치이다. 상기 표적 근육 위치는 평활근, 심근, 골격근 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 표적 근육 위치는 외상성 상해, 종양 절제 또는 기능성 손상의 위치일 수 있다. 대안적으로, 상기 표적 근육 위치는 노화 근육 또는 위축성 근육의 위치일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "삼차원 스캐폴드"는 세포 시딩 및 성장에 적합한 합성 또는 대부분 무세포인 유기 매트릭스를 지칭한다. 특정한 바람직한 양태에서, "삼차원 스캐폴드"는 천연 바이오구조, 예를 들면, 기관 또는 조직이 탈세포화되는 경우 형성되는 잔여 하위구조를 지칭한다. 이러한 복잡한 삼차원 스캐폴드는 세포가 부착되어 그 위에서 성장하게 하는 고도의 지지성 프레임워크를 제공할 수 있다. 이어서, 세포의 배양된 군집은 삼차원 스캐폴드 상에서 성장될 수 있으며, 상기 스캐폴드는 세포-세포 상호작용에 필요한 정확한 간질 거리를 제공한다. 이는 원래의 생체내 기관 또는 조직과 유사한 재구성된 기관을 제공한다.
이러한 삼차원 스캐폴드는 배양된 세포, 예를 들면, 근세포의 군집으로 관류시킬 수 있다. 일부 양태에서, 상기 스캐폴드는 또한 내피세포와 같은 기타 세포 형태로 시딩될 수 있으며, 상기 내피세포는 성장하고 발달하여 하나 이상의 추가의 배양된 세포 군집, 예를 들면, 근세포의 성장 및 발달을 지지할 수 있는 내피 조직층을 제공한다.
"치료하다"는 피험자, 예를 들면, 질환(예: 근골격 질환)이 발병될 위험이 있거나 이를 겪는 환자에게 이점을 부여하는 임의 형태의 치료를 지칭한다. 치료는 환자의 상태를 개선(예를 들면, 하나 이상의 증상의 완화)시킬 목적으로 취해지는 조치 및 취해지지 않도록 제어되는 조치, 상기 질환의 개시 또는 진행의 지연 등을 포함한다. 일부 양태에서, 치료는 (근세포를 함유하거나 함유하지 않는) 이방성 스캐폴드를 이를 필요로 하는 피험자 내로 이식함으로써 골격 근조직(예를 들면, 이러한 조직이, 예를 들면, 상해 또는 질환에 의해 손상되거나 손실된 경우)을 재구성하는 과정을 포함한다. 스캐폴드는 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 예를 들면, 상해 위치에 또는 상해 위치와 인접하게 이식되고/되거나 피험자의 신체 중에서 상기 피험자에 유익을 줄 다른 위치에 이식될 수 있다.
특정한 이론에 제한되지는 않지만, 근세포 단편의 이식은 새로운 근조직의 생성을 신속하게 유도하는 일련의 사건을 유도한다. 이들 사건은 상기 단편들의 자기-지향성 회복 및/또는 새로운 근세포의 성장, 또는 단편을 회복하고/하거나 새로운 근세포의 성장을 유도하는 휴지 위성 세포의 활성화를 포함할 수 있다. 더욱이, 상기 단편 자체는 포착되어 기타 단편들을 재구성 및 회복하는데 사용되고/되거나 새로운 근세포의 성장을 촉진시킬 수 있는 액틴 및 미오신 근원섬유의 준비된 공급원을 제공하는 것으로 보인다.
방법 및 조성물
도 1은 근조직의 재생을 위해 긴 근섬유로부터 근섬유 단편을 형성하는 방법을 도식적으로 도시한 것이다. 도 1의 상부에는, 세포벽(12), 다수의 핵(14) 및 연관된 위성 세포(16)를 갖고 있는 손상되지 않은 길쭉한 근섬유 세포(10)가 도식적으로 도시되어 있다. 도 1의 하부에는, 본 발명에 따르는 치료에 따라 단편들(20)의 세트가 도시되어 있다. 상기 단편들은 파괴된 세포벽(22)을 특징으로 한다. 바람직하게는, 대부분의 단편은 하나 이상의 원래의 핵과 하나 이상의 연관된 위성 세포(16)를 보유한다.
도 2는 본 발명에 따라 형성된 근섬유 단편의 현미경 사진이다. 상기 단편들의 대부분은 크기가 100㎛ 정도이다. 상기 확대도에서 반드시 가시화되지는 않지만, 이들 단편은 파괴된 세포벽을 나타낸다. 파괴에도 불구하고, 위성 세포들은 상기 단편들과 연관된 채로 남아 있다.
도 3은 본 발명에 따르는 근조직 재생에서 단계들의 블록 다이어그램이다. 제1 단계에서, 공여자 근조직은, 예를 들면, 절제 또는 추출에 의해 수득된다. 다음 단계에서, 상기 조직은, 예를 들면, 상기 섬유들을 서로로부터 유리시키기 위해 잘게 다지고/다지거나 연결조직을 효소적으로 소화시킴으로써 개별 섬유로 분해된다. 다음 단계에서, 상기 개별 섬유들은, 예를 들면, 기계적 교반 및/또는 여과에 의해 단편화된다. 임의로, 상기 섬유 단편들은 스캐폴드 상에 시딩될 수 있다(이러한 기술의 추가의 세부사항에 대해서는, 예를 들면, 본원에서 인용에 의해 포함되는 리(Lee) 등의 미국 특허 출원 공보 제US 2010/0331980호를 참조한다). 최종적으로, 상기 단편들 또는 시딩된 매트릭스들은 근조직 재생이 바람직한 표적 위치에 주입 또는 이식될 수 있다. 방법 및 조성물에 대한 보다 자세한 사항은 하기 섹션에서 제공된다.
I. 섬유 제조
놀랍게도, 근육 결함 위치에 약 150㎛ 미만의 균일한 크기의 근섬유 단편을 이식함으로써, 상기 단편들이 생존 가능한 근조직을 생성하기 위한 빌딩 블록을 제공하고 이들 조직의 숙주 혈관 및 신경 네트워크 내로의 통합을 촉진시킨다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본원에 제공된 바와 같은 방법은 피험자 자신의 조직으로부터 유래된 자가 세포 군집을 효율적으로 사용하고 신속하게 제조될 수 있게 한다.
소형 근섬유 단편의 사용은 원래의 근육의 섬유 방향을 따라 숙주 근조직 내로 주입된 단편들(또는 스캐폴드 상의 단편들)의 효율적인 재-어셈블리를 유도한다. 이후, 이들 섬유 단편들은 숙주 혈관 및 신경 네트워크 내로 통합될 수 있다.
상기 균일한 근섬유 단편들을 제조하기 위해, 우선 근조직을 공여 위치로부터 추출한다. 상기 근조직은 생존 가능한 근세포 뿐만 아니라 위성 세포도 함유해야 한다. 이후, 근섬유 단편들은 효소적 소화, 기계적 단편화 및 여과에 의해 수득된다. 이와 같이 수득된 근섬유 단편들은, 예를 들면, 표적 위치 내로 직접 주입되거나, 입자/분말들로 형성된 후 상기 표적 위치 내로 주입되거나, 스캐폴드에 적용되어 배양된 후 표적 위치에 이식될 수 있다.
상기 근조직은 임의의 공지된 기술에 의해 공여 위치로부터 추출될 수 있다. 상기 공여자 근조직은 동계(자가 또는 동종), 동종이계, 또는 이종일 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 공여자 근조직은 자가 근조직이다. 자가 조직은 면역 시스템에 의해 거부되지 않으므로 특히 유리하다. 근조직은, 예를 들면, 사두근과 같은 사지 근육 또는 또다른 적합한 근육(예를 들면, 동물의 뒷다리 근육)으로부터 당해 기술 분야에 공지된 표준 생검 기술을 사용하여 추출될 수 있다.
상기 근조직을 잘게 다지면 분해를 위한 소형 조각들이 제공된다. 바람직하게는, 상기 근섬유는 소형으로 잘게 다져진다. 일부 양태에서, 상기 근조직은 멸균 겸자 및/또는 가위로 5mm, 4mm, 3mm, 2mm, 1mm 또는 0.5mm 미만의 크기로 잘게 다질 수 있다(상기 크기 분포는 불균일할 수도 있다).
잘게 다져진 후, 상기 근섬유는 바람직하게는 분해제로 분해된다. 상기 분해제는 바람직하게는 상기 근섬유를 소화해야 하지만, 상기 근섬유로부터 위성 세포를 분리하지 않아야 한다. 하나의 양태에서, 상기 분해제는 효소이고, 상기 근섬유는 소화된다. 한가지 바람직한 효소는 콜라게나제 타입 I이다. 사용될 수 있는 기타 분해제는 기타 콜라게나제, 트립신, 리파제, 하이알루로니다제, 데옥시리보누클레아제, 리베라제 HI 및 펩신, 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
상기 분해된 근섬유는 이후 단편화된다. 하나의 양태에서, 상기 소화된 근섬유는 기계적으로 단편화된다. 상기 근섬유를 기계적으로 단편화하는 한 가지 바람직한 방법은 반복된 피펫팅에 의해서와 같은 혼합을 통해서이다. 피펫 말단으로의 반복된 흡수 및 방출은 상기 근섬유를 혼합하여 단편화되게 할 것이다. 하나의 양태에서, 상기 소화된 근섬유 단편은 5회 이상, 10회 이상, 15회 이상, 20회 이상, 25회 이상, 30회 이상 또는 그 이상 피펫 말단 내로 흡수되어 방출된다. 상기 근섬유를 기계적으로 단편화하는 또다른 방법은 격렬한 교반을 통해서이다. 상기 근섬유를 기계적으로 단편화하는 또다른 방법은 상기 위성 세포가 실질적으로 융해되지 않도록 하는 주파수 및 출력에서의 초음파 처리를 통해서이다.
상기 단편화된 근섬유를 함유하는 용액을 이어서 150㎛ 미만의 직경을 갖도록 여과한다. 본 발명자들은 바람직한 필터 크기가 150㎛ 미만임을 발견하였다. 하나의 양태에서, 섬유 단편은 직경이 140㎛ 미만, 130㎛ 미만, 120㎛ 미만, 110㎛ 미만 또는 100㎛ 미만이다. 다른 양태에서, 상기 섬유 단편은 40 내지 150㎛, 50 내지 140㎛, 60 내지 130㎛, 70 내지 120㎛, 80 내지 110㎛ 또는 90 내지 100㎛이다. 기타 양태에서, 상기 섬유 단편은 60 내지 150㎛, 60 내지 140㎛, 70 내지 130㎛, 80 내지 120㎛, 80 내지 110㎛ 또는 80 내지 100㎛이다. 하나의 양태에서, 직경이 80 내지 100㎛인 섬유 단편들이 근조직을 이식 및 생성하기 위한 균일한 섬유 단편으로서 특히 유용한 것으로 보인다. 하나의 양태에서, 상기 필터는 100㎛ 필터이다. 임의로, 보다 작은 크기의 단편들은 소형 필터(즉, 80, 70, 60, 50, 40 또는 30㎛ 필터)를 통해 스크리닝하고 상기 여과물을 폐기함으로써 상기 근섬유로부터 제거될 수 있다. 용어 필터 및 여과기(strainer)는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 수득된 균일한 근섬유 단편들은 2개 이상의 성분들을 함유한다. 이들은 기능적 위성 세포와 근섬유 세포상 단편을 함유한다. 하나의 양태에서, 상기 위성 세포의 50% 이상이 기능성이다. 또다른 양태에서, 상기 위성 세포의 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이 기능성이다. 상기 균일한 근섬유 단편 중의 근섬유는 실질적으로 세포벽이 파괴되어 있다. 상기 세포벽은 상기 근섬유의 50% 초과, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 파괴되어 있다. 상기 균일한 근섬유 단편에서 위성 세포의 작용성은 당해 기술 분야에 공지된 바와 같은 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 상기 위성 세포는 바이브란트(Vybrant), GFP(녹색 형광성 단백질) 또는 Pax7 면역염색제와 같은 염료로 형광 표지될 수 있다.
균일한 근섬유 단편에서 근육 위성 세포의 양은 유효량인데, 즉, 상기 근섬유 단편은 위성 세포들이 이들의 근생성 역할을 수행하도록 하기에 충분한 위성 세포를 함유한다. 상기 섬유 단편 내부의 위성 세포의 정확한 양은 공여자 물질의 유형, 회복된 근육 손상의 유형, 투여 방식, 및 상기 섬유 단편 내에 제공되는 추가의 성분들과 같은 인자들에 따라 가변적일 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 근섬유 단편은 무세포 근섬유 단편일 수 있다. 또다른 양태에서, 상기 근섬유 단편은 무세포 근섬유-유래된 입자/분말일 수 있다. 면역 성분 없이 무세포 단편을 사용하는 것은 기능적 근육 재생을 위한 동종이계 이식에 대한 유망한 접근법일 수 있다. 세포 및 잔여 DNA와 같은 면역성 성분들을 제거함으로써 무세포 단편은 공여자 세포 함유된 근섬유에 비해 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 또한, 무세포 단편은 i) 내생 위성 세포 점착, 생존 및 증식을 위한 적합한 구조적 구성 및 세포외 매트릭스를 제공할 수 있는 근육 특이성 템플릿(template) 및 ii) 영양 인자 분비에 의한 근세포의 자극과 같은 중요한 역할을 수행한다.
II. 삼차원 재구성물
일부 양태에서, 상기 균일한 섬유 단편은 스캐폴드, 또는 조작된 근조직의 삼차원(3-D) 재구성물을 사용하여 근육 상해 위치에 이식된다. 3-D 재구성물을 사용하면 상기 근육 상해가 큰 결함 위치를 함유하는 경우 특히 유용하다. 3-D 근조직은, 근섬유 단편을, 주입 가능한 스캐폴드(콜라겐 겔, 피브린 겔, 알기네이트 겔, 또는 UV-유도된 가교결합성 겔 시스템) 또는 천연 및 합성 중합체 유래의 이식 가능한 스캐폴드와 같은 스캐폴드 시스템과 조합함으로써 제조될 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 스캐폴드는 전기방사를 사용하여 형성되어 매트릭스를 생성시킨다. 특히 유용한 전기방사된 매트릭스는, 예를 들면, 발명의 명칭이 "혼입된 치료제를 갖는 세포 스캐폴드 매트릭스"인 미국 특허 제7,531,503호, 발명의 명칭이 "전기방사된 세포 매트릭스"인 미국 특허 공보 제2010/0129450호, 및 발명의 명칭이 "골격근 재생을 위한 정렬된 스캐폴드 시스템"인 미국 특허 공보 제2010/0331980호에 기술되어 있으며, 상기 각각의 문헌은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함되어 있다.
상기 균일한 섬유 단편들이 이식될 수 있는 매트릭스는 생체적합성이며, 바람직하게는 생분해성이다. 상기 생분해성 물질을 형성하기 위한 대표적인 물질들은 조절된 속도에서 가수분해에 의해 분해되어 재흡수되는 콜라겐, 폴리(락테이트 산)과 같은 폴리(알파 에스테르), 폴리(글리콜산), 폴리오르토에스테르 및 폴리안하이드라이드 및 이들의 공중합체와 같은 천연 또는 합성 중합체를 포함한다. 이들 물질은 분해성, 처리 적성, 크기 및 배열을 최대로 조절한다. 바람직한 생분해성 중합체 물질은 흡수 가능한 합성 봉합 물질로서 개발된 폴리글리콜산 및 폴리글락틴을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 매트릭스는 하나 이상의 천연 생물학적 물질 성분 및 하나 이상의 합성 중합체 물질을 포함하는 전기방사된 매트릭스이다. 하나의 양태에서, 상기 천연 생물학적 물질 성분은 콜라겐(이는 생물학적 조직 공급원으로부터 유래되거나 합성될 수 있다)을 포함하고, 상기 합성 중합체 성분은, 예를 들면, 분자량이 1000 이상, 바람직하게는 2,000 내지 20,000인 고분자량 중합체일 수 있다. 상기 천연 성분는 상기 매트릭스가 고도의 생체적합성이 되게 하고/하거나 덜 면역성이 되게 하는 한편, 상기 분자량의 중합체 성분은 상기 매트릭스에 추가의 기계적 강도를 부여하고/하거나 전기방사 동안 용액의 점도 및 방사 특성을 증가시킴으로써 제조 용이성을 개선시킬 수 있다. 상기 전기방사된 매트릭스에서 사용되는 물질들은 하전될 수 있거나 하전된 용액 중에 전달될 수 있다.
상기 전기방사된 매트릭스는 탄성을 부여하기 위해 선택된 제2의 천연 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 천연 생물학적 물질 성분은 엘라스틴(이 또한 생물학적 조직 공급원으로부터 유래되거나 합성될 수 있다)을 포함할 수 있다. 전기방사에 이어서, 상기 매트릭스는 또한 다양한 공지된 가교결합법을 사용하여 안정성 및 강도 증가를 위해 가교결합될 수 있다.
상기 전기방사된 매트릭스에 포함될 수 있는 천연 물질의 예는 아미노산, 펩티드, 변성 펩티드(예: 변성 콜라겐으로부터의 젤라틴), 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 글리코단백질, 지질단백질, 글리코지질, 글리코사미노글리칸, 및 프로테오글리칸을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 바람직한 양태에서, 상기 물질 화합물은 콜라겐, 피브린, 엘라스틴, 라미닌, 피브로넥틴, 하이알루론산, 콘드로이친 4-설페이트, 콘드로이친 6-설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파린 설페이트, 헤파린, 케라탄 설페이트 및 프로테오글리칸을 포함하지만 이로 제한되지는 않는 세포외 매트릭스 물질이다. 이들 물질은 사람 또는 기타 동물 또는 세포로부터 단리될 수 있다. 바라직한 천연 화합물은 콜라겐이다. 콜라겐의 예는 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 콜라겐 VI, 콜라겐 VII, 콜라겐 VIII, 콜라겐 IX 및 콜라겐 X을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 또다른 바람직한 천연 화합물은 엘라스틴이다. 엘라스틴 섬유는 수개 조직의 탄성 특성의 원인이 된다. 엘라스틴은, 예를 들면, 피부, 혈관, 폐의 조직에서 발견되며, 강도, 탄성 및 가요성을 부여한다.
상기 전기방사된 매트릭스에 포함될 수 있는 합성 중합체의 예는 폴리(락트산) 중합체, 폴리(글리콜산) 중합체, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 폴리(우레탄), 폴리(실록산) 또는 실리콘, 폴리(에틸렌), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(비닐 알콜)(PVA), 폴리(아크릴산), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(메타크릴산), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 나일론, 폴리아미드, 폴리안하이드라이드, 폴리(에틸렌-코-비닐 알콜)(EVOH), 폴리카프로락톤, 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐하이드록사이드, 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO), 및 폴리오르토에스테르 중의 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 하나의 양태에서, 상기 합성 중합체 성분은 분자량이 약 1000 내지 약 20,000인 폴리(락트산) 중합체 또는 폴리(글리콜산) 중합체이거나 이들의 공중합체(예: 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드))이다.
하나의 양태에서, 상기 스캐폴드는 하나 이상의 다양한 용매 및 기공 유도 물질(porogen)을 사용하는 합성 중합체를 사용하여 형성된다. 하나의 양태에서, 상기 스캐폴드는 분자 자체-어셈블리를 사용하여 형성된다. 한 가지 바람직한 양태에서, 하이드로겔 스캐폴드가 형성된다.
본 발명의 방법 및 조성물은 균일한 섬유 단편들의 국부 전달에 사용될 수 있다. 추가의 치료제 및/또는 생물학적 제제가 또한 상기 매트릭스에 첨가될 수 있으며, 피험자의 상기 표적 위치에서 이러한 제제의 제어 방출이 계획된다. 상기 기능성 첨가는 이미지 증강 또는 콘트라스트 제제(예: 가돌리늄 또는 바륨), 또는 치료제 또는 기타 생물학적 제제를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 치료제 또는 기타 생물학적 제제는 나노입자, 예를 들면, 양자점 구조물에 커플링될 수 있으며, 이는 인가된 에너지에 의해, 예를 들면, 상기 나노입자에 의해 용이하게 흡수되는 파장 또는 파장 범위의 방사선 조사에 의해 활성화된다.
상기 3-D 재구성물은, 예를 들면, 이식후 새로운 조직의 형성을 촉진시키기 위해 이식 전에(상기 중합체성 기질이 균일한 근섬유 단편으로 이식되기 전 또는 후에) 첨가제 또는 약물로 처리될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 성장 인자, 시토킨, 세포외 매트릭스 성분 및 기타 생활성 물질들은 이식편 치유와 새로운 조직의 형성을 촉진하기 위해 상기 기질에 첨가될 수 있다. 이러한 첨가제는 일반적으로, 적합한 신규한 조직이 이식된 기관 또는 조직에 형성되도록 보장하기 위해, 재구성되거나 증가될 조직 또는 기관에 따라 선택될 것이다(뼈 치유의 촉진에 사용하기 위한 이러한 첨가제의 예로는, 예를 들면, 하기 문헌을 참조한다: Kirker-Head, C. A. Vet. Surg. 24 (5): 408-19 (1995)). 예를 들면, 혈관성 내피 성장 인자(VEGF, 예를 들면, 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,654,273호를 참조한다)는 신규한 혈관 조직의 형성을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 성장 인자 및 기타 첨가제(예를 들면, 표피 성장 인자 (EGF), 헤파린-결합 표피형 성장 인자(HBGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 시토킨, 유전자, 단백질 등), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래된 신경 영양 인자(BDNF), 뉴레귤린(NRG) 및 아그린은 상기 기질 상에 시딩된 세포에 의해 제조될 수 있는 임의 양의 이러한 성장 인자(존재하는 경우)보다 과량의 양으로 첨가될 수 있다. 이러한 첨가제는 바람직하게는 (예를 들면, 숙주 세포들을 이식편 내로 침투시키거나 이를 촉진시킴으로써) 회복되거나 증가될 조직 또는 기관에 적합한 형태의 신규한 조직의 형성을 촉진시키기에 충분한 양으로 제공된다. 기타 유용한 첨가제는 항생제와 같은 항박테리아제를 포함한다.
매트릭스는 저장되어 이를 균일한 근섬유 단편들로 시딩함으로써 이식하기 직전에 사용될 수 있다. 다수의 전기방사된 매트릭스는 일단 이들이 방사되면 건조하고, 건조 또는 동결 상태에서 저장될 수 있다. 저장 조건은 사용되는 전기방사된 화합물에 따라 좌우될 수 있고, 그리고 치료제가 상기 매트릭스 상부 또는 내부에 혼입되는지의 여부에 따라 좌우될 것이다. 치료제가 혼입되는 양태에서, 상기 매트릭스는 진공하에 0℃ 미만의 온도에서, 또는 동결건조된 상태에서 저장될 수 있다. 기타 저장 조건은, 예를 들면, 실온에서, 암실에서, 진공 또는 감압하에, 불활성 대기하에, 냉장고 온도에서, 수성 또는 기타 액체 용액에서, 또는 상기 매트릭스 내부 또는 상부에 있는 물질들에 따라 좌우되는 분말 형태로 사용될 수 있다.
상기 매트릭스는 방사선 및 열과 같은 당해 기술 분야에서 통상의 숙련가들에게 공지된 통상적인 수단을 통해 멸균처리될 수 있다. 상기 매트릭스는 또한 박테리아 성장을 억제하기 위해 티메로살과 같은 정균제와 배합될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 화학물질, 용액, 또는 저장 및 운송시 안정성을 부여하는 방법으로 처리될 수 있다.
III. 이식
본 발명에서, 상기 균일한 근섬유 단편은 환자에게 주입되도록 제조된다. 상기 섬유 단편들은 이식후 숙주 내에 용이하게 통합될 수 있는 세포의 생존 가능성을 유지한다. 따라서, 상기 섬유 단편은 장섬유로 재구성되어 원래의 근육을 따라 배향될 수 있다. 상기 섬유 단편들은 숙주 근섬유과 유사해지고 혈관 및 신경 시스템과 통합하여 재구성되거나 회복된 기능적 근육을 제공한다.
본원에 기술된 바와 같은 근섬유 단편들의 형성은 신경근 접합부를 보존하고, 이에 따라, 신경들이 근섬유 단편과 연결되도록 하여 숙주 내에서 근섬유를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 신경의 연결은 근육을 수축시키기 위해 필요하다. 따라서, 신경근 접합부의 보존은 본 발명의 하나의 양태에서 중요한 측면이다.
하나의 양태에서, 상기 균일한 근섬유 단편들은 환자의 표적 근육 위치 내로 직접 주입된다. 상기 섬유 단편들의 작은 크기와 균일성으로 인해 원래의 근육을 따라 배향된 장섬유 내에 상기 섬유 단편들이 재구성될 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 균일한 근섬유 단편들은, 3-D 재구성물이 형성되어 환자에게 이식되는 매트릭스 내로 이식 또는 시딩된다.
본 발명은 근섬유를 환자의 공여 위치로부터 수거하는 단계, 균일한 근섬유 단편을 제조하는 단계, 및 상기 균일한 근섬유 단편을 하루 과정 내에 환자 체내의 표적 위치(들)로 주입하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 따라서, 수거 및 주입이 짧은 시간 프레임 내에서 수행될 수 있으므로 환자가 병원 또는 유사한 장소에 여러번 방문할 필요가 없다. 하나의 양태에서, 상기 근섬유는 환자 체내의 공여 위치로부터 수거되고, 균일한 근섬유 단편이 제조되는 동안 상기 환자는 수술실에 남아 있고, 상기 균일한 근섬유 단편들은 수술실에서 표적 위치 내로 주입된다. 일부 양태에서, 수거와 주입 사이의 시간 프레임은 8시간 미만이다. 기타 양태에서, 상기 시간 프레임은 6시간 미만이다. 기타 양태에서, 상기 시간 프레임은 4시간 미만이다. 기타 양태에서, 상기 시간 프레임은 3시간 미만이다. 기타 양태에서, 상기 시간 프레임은 2시간 미만이다. 기타 양태에서, 상기 시간 프레임은 1시간 미만이다.
본 발명에 사용되는 기타 양태들은 본 명세서 및 본 명세서에 기술된 발명의 실시를 고려하여 당해 기술 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 본원에 언급된 모든 미국 특허 및 기타 참고문헌은 어떠한 이유로든 구체적으로 인용에 의해 포함된다. 본 명세서 및 실시예는 하기 특허청구범위에 의해 지시되는 발명의 진정한 범위 및 취지를 갖는 예시로서만 간주되어야 한다.
실시예
실시예 1 - 근섬유 단편의 제조
균일하게 구조화된 근섬유 단편은 C57BL6 마우스(수컷, 10-12주)의 전경골근(TA) 및 비복근(GN) 근육으로부터 단리하였다. 단리된 TA 또는 GN 근육을 2개의 1회용 외과용 메스로 잘게 다졌다. 상기 근조직을 상당히 작은 크기로 잘게 다졌다. 잘게 다진 후, 상기 단편을 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 무혈청 DMEM 중에서 0.2% 콜라게나제 타입 I로 소화되었다. 효소적 소화 후, 근섬유는 피펫팅되어 개별 단편들로 분리되었다. 후속적으로, 상기 근섬유 용액은 즉시 세포 여과기(100㎛ 크기, BD 팔콘)을 통해 여과하여 균일한 크기의 근섬유 단편들을 제공하였다.
소형 근섬유 단편들은 동물에 이식한 후 섬유 추적을 위해 바이브란트 형광성 염료(DiD, Invitrogen)로 표지되었다. 공초점 현미경에 의해, 표면 상의 세포들을 포함하는 단리된 섬유 단편들이 바이브란트로 형광 표지되었고 상기 섬유 단편의 크기가 대략 100㎛ 직경을 나타냄을 확인하였다.
실시예 2 - 근섬유 단편들의 이식
상기 처리된 근육 단편들이 주입 치료제로서 개발될 수 있는지를 결정하기 위해, 단리된 근섬유 단편들을 C57BL6 마우스(10-12주)의 둔근 영역에 주입하였다. PBS 중의 10㎕의 섬유 단편 용액(500개의 섬유 단편 개수/주입)을 해밀턴 시린지(26G, 10㎕)로 상기 둔근 영역 상의 절개 위치(0.5 내지 1cm)를 향해 2회 주입하였다. 이식 후, 상기 절개부는 봉합에 의해 밀봉하였다. 이식한지 1주, 2주, 3주 및 4주 후, 절개 위치와 함께 근조직을 수거하여 OCT 화합물 중에서 추가로 동결시켰다.
주입된 근섬유 단편들이 숙주 근섬유와 재-어셈블링되어 숙주 동물의 혈관 및 신경 시스템과 통합하는지를 조사하기 위해, 수거 조직을 사용하여 조직학 및 면역조직학적 연구를 수행하였다. 상기 동결된 조직들을 섹션으로 구분하여 H & E 염색을 위한 10% 포르말린 용액으로 고착하였다. 상기 수거된 조직들의 면역조직화학적 연구를 위해, 상기 섹션은 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고착하고 메탄올 처리에 의해 투과성이 되게 한 다음, 마우스 항-미오신 중쇄(MHC, MF20, 하이브리도마 은행), 래트 항-마우스 CD31(BD 파밍겐), 마우스 항-Pax7(하이브리도마 은행) 항체, 또는 α-분가로톡신(BTX) 염색된 항-신경미세섬유(NF) 항체와 같은 1차 항체로 배양한 다음, 알렉사(Alexa) 488 염소 항-마우스 및 FITC 토끼 항-래트 항체와 같은 2차 항체로 배양하였다. 핵 염색을 위해, 상기 면역염색된 섹션은 프로피듐 요오다이드(PI)를 함유하는 봉입(mounting) 매체로 봉입하였다.
조직학 및 면역조직학적 연구는 이식된 근섬유 단편들이 숙주 근조직 배향의 섬유로 재-어셈블링됨를 명백하게 나타내며, 또한 이식된 섬유의 표면 상의 근육 줄기 세포(위성세포)는 바이브란트 염색 및 MHC 또는 Pax7 면역염색의 이중 염색에 의해 증명되는 바와 같이 생존하고 증식함을 알 수 있다. 더욱이, 이식된 섬유와 숙주 동물의 혈관 네트워크와의 통합은 바이브란트 염색과 CD31 면역염색의 이중 염색에 의해 확인된다. 이식된 섬유의 숙주 동물과의 신경분포는 NF 면역염색 및 바이브란트 염색을 포함하는 α-BTX 염색의 삼중 염색에 의해 확인된다.
실시예 3 - 근섬유 단편, 장섬유 및 무세포화 조직 성분의 이식 효율 비교
탈세포화 단편 및 위성 세포 함유 단편의 생체내 효과를 비교하기 위한 연구가 수행되었다. 생체내 마우스 연구로부터의 유망한 결과에 의해 고무되어, 섬유 단편의 주입 용적 및 개수를 다양하게 사용하여 소형 섬유 단편의 효율적인 이식편 이식을 장섬유와 비교하여 측정하기 위해, 래트를 사용한 광범위한 동물 연구가 수행되었다. 추가로, 세포 성분들이 없는 무세포 단편들을 이식하여 동종이계 이식을 위한 "규격품(off-the shelf)" 성분으로서의 이들의 사용 가능성을 조사하였다. 래트(루이스 래트, 10 내지 12주)로부터의 근섬유 단편을 마우스에 대한 상술한 바와 동일한 프로토콜을 사용하여 단리하였다. 다양한 용적(100, 200 및 300μL)의 섬유 단편(7×104 섬유/ml)을 26G 니들을 갖는 시린지를 사용하여 어떠한 근육 결함도 없는 비복근(GN) 근육에 주입하였다. 장섬유 이식을 위해, 여과 처리 없이 단리된 300μL의 섬유(3×103 섬유/ml)[참조: Hall JK et al, Sci Transl Med 2011]를 주입하였다. 상기 주입된 장섬유의 수는 하나의 장섬유의 길이가 1 내지 3mm를 나타낸다는 관찰을 기준으로 하여 계산되었다. 무세포 단편은 어떠한 화학적 처리 및 효소 처리도 없이 PBS 중에서의 단순한 배양에 의해 제조되었다. 간단하게는, 단리된 섬유 단편을 37℃에서 밤새 배양하고 4℃에서 저장하였다. 세포 성분 및 DNA 성분의 제거는 상기 섬유 단편 상의 Live/Dead(Invitrogen) 세포 및 핵 염색에 의해 확인되었다. 무세포 단편의 이식은 상기 동일한 주입 프로토콜을 사용하여 300μL의 단편 용액으로 수행되었다. 이식한지 1주, 2주, 3주 및 4주 후, 상기 GN 근조직을 수거하고 계량하여 조직학적 및 면역조직학적 분석을 위해 추가로 처리하였다. 이식된 섬유 단편의 면적은 공초점 이미지에서의 NIR 포지티브 면적을 측정함으로써 준-정량화되었다.
GN 조직의 근육 질량의 비교에서, 섬유 단편 및 무세포 단편의 주입은 모의(sham), PBS 및 장섬유에 비해 체중당 GN 질량의 5% 증가를 유도하지만, 통계학적 차이는 없다. 상기 국부적인 섬유 단편은 공초점 이미지에서 NIR 포지티브 스팟에 의해 확인되었다. 섬유 단편 및 무세포 단편의 300μL 주입 그룹에서, 공초점 이미지는 숙주 근조직을 따른 섬유 단편의 탁월한 이식을 보여주는 반면, 장섬유는 그렇지 못함을 나타내고, 이는 근섬유의 단편화가 생체내에서 근섬유의 효율적인 전달을 촉진시킴을 강하게 시사한다. 마우스 연구 결과와 같이, 래트로부터의 이식된 섬유 단편은 상기 숙주 동물의 혈관 및 신경 네트워크와 통합되었다. 흥미롭게도, 무세포 단편의 주입은 이식된 위치로의 숙주 세포의 보충을 촉진시키고, 상기 숙주 동물과의 효율적인 통합에서 섬유 단편과 유사한 패턴도 보여주는데, 이는 기능적 근육 재생을 위한 동종이계 이식에 대한 또다른 유망한 접근법이다.
실시예 4 - 근위축의 치료를 위한 근섬유 단편의 직접 주입
본 연구의 목적은 근섬유 단편(MF)의 직접 주입이 근위축의 근육 기능 회복을 증강시킬 수 있는지를 측정하는 것이다. 상기 주입된 MF가 숙주 근조직 뿐만 아니라 상기 숙주의 혈관 및 신경 네트워크와 효율적으로 통합할 것이고 추가로 근육 상해의 기능적 근육 회복을 개선시킬 것을 가정하였다. 전체적인 연구 설계는 도 4a에 도시하였다.
래트에서 근위축 모델을 생성하기 위해, 300㎕의 3% BaCl2를 하나의 TA 근육에 주입하였다. BaCl2를 주입한지 3일 후, 300㎕의 PBS 용액 중에 현탁된 0.15 내지 0.2×106 MF를 26G 니들 시린지를 사용하여 상기 손상된 TA 근육 내로 직접 주입하였다. 대조군으로서, 동일한 용적의 PBS 용액을 투여하였다. 동물 연구 동안, 기능적 근육 재생은 기능적이고 형태학적인 분석에 의해 평가하였다. 기능적 근육 재생을 측정하기 위해, 근력 시험은 MF를 주입한지 소정 시간이 경과한 후에 수행되었다. 100Hz의 전기 자극에서 등척성 근육 강직수축력이 측정되고, 상대 강직수축력(%)은 MF 주입 후의 각각의 시점에서의 토르크를 상해 이전의 토르크로 표준화함으로써 계산하였다. 도 4b에 도시한 바와 같이, MF-주입된 TA 근조직은 대조군(PBS-주입)에 비해 더 높은 상대 강직수축력을 나타내며, MF를 주입한지 7일, 21일 및 28일 후에 통계학적으로 유의한 차이를 나타낸다.
MF-주입된 TA 근조직의 면역염색을 사용하는 형태학적 분석[도 5b]은 또한 개선된 근육 기능을 지지하며, 이는 상기 주입된 MF가 숙주 근조직[도 5a, 미오신 중쇄(MHC)] 뿐만 아니라 혈관 네트워크[도 5c, CD31] 및 신경 네트워크[도 5d, 신경미세섬유(NF) 및 α-분가로톡신(α-BTX)]과 효율적으로 통합함을 보여준다.
실시예 5 - 외상성 근육 결함의 치료를 위한 MF 함유 용적 측정 구축물의 이식
이러한 하위 연구의 목적은 대형 근육 결함 치료를 위한 MF 함유 3차원 구축물 이식의 실행가능성을 조사하는 것이다. MF를 함유하는 이식 가능한 구축물은 구조적 통합성을 유지하고 수술로 유도된 근육 결함의 기능적 근육 회복을 개선시킬 것으로 가정되었다. 전체적인 연구 설계는 도 6a에 도시하였다.
외상성 근육 결함 동물 모델을 생성하기 위해, 래트의 TA 근조직의 30 내지 40%를 외과적으로 절제하였다. MF/콜라겐 구축물의 총 용적(0.2 ml)[0.1ml의 0.8% 콜라겐 겔 중에 현탁된 MF(0.1 g
Figure pct00001
0.1 ml)]을 상기 근육 결함 위치에 이식하고, 근막 및 피부를 봉합함으로써 상기 이식편을 밀봉하였다. 이식하지 않은 경우(결함만 있는 경우)와 콜라겐만 있는 이식을 대조군으로 수행하였다. 이식한지 7일 14일, 21일 및 28일 후, TA의 강직수축력을 측정하고, 개선된 근육 기능에 대한 MF/콜라겐 구축물 이식의 효과는 상대 강직수축력(%)에 의해 측정하였다.
이식 후 각각의 시점에서, MF/콜라겐 이식 그룹은 결함만 있는 경우와 콜라겐만 있는 경우에 비해 더 높은 상대 강직수축력을 나타낸다. 특히, 상기 차이는 21일째와 28일째에 통계학적으로 유의하다((분산분석(ANOVA) 및 Tukey 분석, P < 0.05)(도 6b). 또한, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 상기 구축물의 이식은 이식한지 28일 후 결함만 있는 경우에 비해 근육 질량을 현저하게 개선시킨다. 본 발명의 결과는 MF/콜라겐 구축물을 외과적으로 유도된 근육 결함 내로 이식하는 것이 실현 가능하고 성공적이며 증가된 근육 질량 및 기능적 근육 회복을 유도함을 보여준다.
실시예 6 - 요도 괄약근 실금에 대한 MF 기술의 적용
요실금(UI)은 3명 중 한명이 일생 중 일부 시점에서 방광 조절이 다소 손실되어 겪는 주요한 건강 문제이다. 요실금 치료의 시장 크기는 200억 달러 이상이며, 2020년까지 300억 달러에 도달할 것으로 예측된다. 현재의 치료는 생체재료 유래의 메쉬인 슬링 이식을 포함하지만, 메쉬 부식, 요도 폐색, 인접 기관에 대한 상해, 괴상출혈, 내부 기관에 대한 상해, 흉터와 같은 합병증을 종종 일으킨다. 근육 전발생 세포를 사용하는 세포 치료가 요실금 치료에 유망한 기술임에도 불구하고, 이들을 치료에 사용가능하기 전에 세포 조작 및 장시간이 요구된다는 점에서 또한 제한이 있다.
본 연구의 목적은 요실금 치료에 근섬유 단편의 사용을 입증하는 것이다. 상기 주입된 MF가 상기 손상된 괄약근에서의 숙주 근조직 뿐만 아니라 상기 숙주의 혈관 및 신경 네트워크와 통합할 것이고 추가로 괄약근 골격근 기능을 증강시킴으로써 요역동학 기능을 개선시킬 것으로 가정하였다. 전체적인 연구 설계는 도 7a에 도시하였다. 요도 괄약근 실금 동물 모델을 생성시키기 위해, 래트의 요도 괄약근의 한쪽을 전기 응고에 의해 손상시켰다. 괄약근이 손상된지 1개월 후, PBS 용액 중에 현탁된 0.05g(
Figure pct00002
0.05ml)의 MF를 상기 손상된 괄약근 위치 내로 주입하였다. MF를 주입한지 1주 및 4주 후, 요도 괄약근 수축력은 전기 자극 부재(P1) 및 전기 자극 존재(P2) 뇨 누출압을 측정함으로써 결정하였다. 상기 결과는 도 7b에서 표로 제시하였다. P2와 P1 사이의 차이는 외부 괄약근이 견디는 최대 방광압이다. 괄약근이 손상된 후, 상기 괄약근의 전기 자극은 어떠한 시점에서도 방광의 누출점 압력을 증가시키지 않았다. 그러나, MF 주입된 그룹에서, 시차 누출점 압력은 MF를 주입한지 1개월 후 정상치(모의 그룹)의 67%로서 통계학적 차이를 가졌다(스튜던트 t-시험, p < 0.01, n = 3).
실시예 7 - MF를 수거하는 추가의 방법들
본 연구의 목적은 수율, 처리 시간 및 시약 이용도를 개선시키기 위해 사람 근섬유 단편화 방법을 개량하는 것이다. 도 8a는 근조직이 공여 위치로부터 수거되어 잘게 다져진 다음 GMP 등급 콜라게나제 용액(리베라제 MNP-S, Roche)으로 효소적으로 균질화되는 또다른 처리 기술을 도시한다. 이어서, 상기 생성물을 여과되고 노르모솔(Normosol)(GMP 등급 염수 용액)로 세척하였다. 균질한 크기의 MF 단편(예를 들면, 직경이 50 내지 150㎛임)이 수득될 때까지 균질화 단계 및 여과 단계를 반복하였다. 도 8b는 상기 생성된 MF를 도시하는 현미경 사진이며, 이는 약 30분의 처리 시간으로 수득되고 30 내지 40% 근육 중량 수율을 제공하였다.
본원에서 인용된 모든 논문, 문서, 특허, 특허 출원 및 기타 공보는 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.

Claims (61)

  1. 공여 위치로부터 근조직을 추출하는 단계,
    상기 추출된 조직으로부터 근섬유를 분해하는 단계 및
    분해된 근섬유를, 세포벽 파괴를 나타내고 평균 크기가 150㎛ 미만인 섬유 단편으로 단편화하는 단계
    를 포함하는, 근육 재생 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 조성물은 상기 단편으로부터 길쭉한 근섬유를 재구성(reconstructing)할 수 있고, 표적 근육 위치에 이식되는 경우, 원래의 근섬유와 정렬하여 배향될 수 있는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단편화 단계가, 생존 가능한 위성 세포(satellite cell)를 보유하여 상기 조성물이 상기 단편의 적어도 일부와 연결된 위성 세포를 포함하도록 하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 근섬유 단편의 평균 크기가 약 80㎛ 내지 120㎛, 또는 약 90㎛ 내지 110㎛인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 근섬유 단편의 종횡비가 2:1 내지 1:1인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 근조직 추출 단계가 자가 근조직을 추출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조직으로부터의 근섬유 분해 단계가 상기 근섬유를 효소로 분해하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 효소가 콜라게나제 타입 I인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단편화가 기계적 교반인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단편화가 유체 전달을 통해 수행되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단편화가 피펫팅을 통해 수행되는, 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 단편화가 초음파 처리를 통해 수행되는, 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 단편화 단계가 상기 단편화된 섬유 단편을 150㎛ 미만의 평균 크기로 여과하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 추출된 조직을 5mm 미만의 크기로 잘게 다지는(mincing) 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 근섬유 단편의 75% 이상이 세포벽 파괴를 나타내는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 조성물을 근육 결함 표적 위치에 전달하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 방법이 상기 조성물을 생리학적으로 적합한 유체 중에 현탁시키고, 상기 조성물을 근육 결함 표적 위치 내로 주입하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조성물을 주입하는 단계가 상기 근조직을 공여 위치로부터 추출하는 단계로부터 10시간 이내에 일어나는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 조성물을 스캐폴드(scaffold) 상에 시딩(seeding)하고 상기 시딩된 스캐폴드를 근육 결함 표적 위치에 이식하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 방법이 상기 스캐폴드-지지된 단편을 시험관내 배양한 다음, 상기 스캐폴드를 근육 결함 표적 위치에 전달하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 스캐폴드가 콜라겐 겔, 피브린 겔, 알기네이트 겔, 또는 UV-유도된 가교결합성 겔 시스템으로부터 선택된 주입 가능한 스캐폴드인, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 스캐폴드가 중합체성 매트릭스 또는 유기 매트릭스를 포함하는 이식 가능한 스캐폴드인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 중합체성 매트릭스가 (a) 콜라겐 및 엘라스틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 천연 중합체; 및 (b) 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-카프트로락톤)(PLCL) 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 합성 중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중합체를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 매트릭스가 하나 이상의 천연 중합체와 하나 이상의 합성 중합체의 배합물에 의해 형성된 전기방사된 섬유 매트릭스를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 매트릭스가 콜라겐 및 폴리카프로락톤(PCL)을 포함하는, 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 시딩된 스캐폴드가 골 형성 단백질(BMP), RUNX-2 단백질, LIM 무기화 단백질, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 표피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α, 형질전환 성장 인자-β, 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래된 신경 영양 인자(BDNF), 뉴레귤린(NRG), 아그린, 또는 이들의 배합물을 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 조성물을 보조제와 함께 동시투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 보조제가 줄기 세포, 근육 전구 세포 및 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 포함하는, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 보조제가 근육 전구 세포를 포함하는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 보조제가 골 형성 단백질(BMP), RUNX-2 단백질, LIM 무기화 단백질, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 표피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α, 형질전환 성장 인자-β, 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래된 신경 영양 인자(BDNF), 뉴레귤린(NRG), 아그린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 포함하는, 방법.
  30. 세포벽 파괴를 나타내고 평균 크기가 150㎛ 미만인 근섬유 단편의 군집을 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 조성물이 상기 단편으로부터 길쭉한 근섬유를 재구성할 수 있으며, 표적 근육 위치로 이식되는 경우 원래의 근섬유와 정렬하여 배향할 수 있는, 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 단편화 단계가, 생존 가능한 위성 세포를 보유하여 상기 조성물이 상기 단편의 적어도 일부와 연결된 위성 세포를 포함하도록 하는 것을 추가로 포함하는, 조성물.
  33. 제30항에 있어서, 상기 근섬유 단편의 평균 크기가 약 80㎛ 내지 120㎛, 또는 약 90㎛ 내지 110㎛인, 조성물.
  34. 제30항에 있어서, 상기 근섬유 단편의 종횡비가 2:1 내지 1:1인, 조성물.
  35. 제30항에 있어서, 상기 근섬유 단편이 자가 근조직으로부터 유래되는, 조성물.
  36. 제30항에 있어서, 상기 근섬유 단편의 75% 이상이 세포벽 파괴를 나타내는, 조성물.
  37. 제30항에 있어서, 상기 조성물이 생리학적으로 적합한 유체를 추가로 포함하고, 상기 조성물이 주입용으로 제형화되는, 조성물.
  38. 제30항에 있어서, 상기 조성물이 스캐폴드를 추가로 포함하고, 상기 근섬유 단편이 상기 스캐폴드 내로 혼입되는, 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 스캐폴드가 콜라겐 겔, 피브린 겔, 알기네이트 겔, 또는 UV-유도된 가교결합성 겔 시스템으로부터 선택되는 주입 가능한 스캐폴드인, 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 상기 스캐폴드가 중합체성 매트릭스 또는 유기 매트릭스를 포함하는 이식 가능한 스캐폴드인, 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 중합체성 매트릭스가 (a) 콜라겐 및 엘라스틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 천연 중합체; 및 (b) 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-카프트로락톤)(PLCL) 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 합성 중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중합체를 포함하는, 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 매트릭스가 하나 이상의 천연 중합체 및 하나 이상의 합성 중합체의 배합물에 의해 형성된 전기방사된 섬유 매트릭스를 추가로 포함하는, 조성물.
  43. 제40항에 있어서, 상기 매트릭스가 콜라겐 및 폴리카프로락톤(PCL)을 포함하는, 조성물.
  44. 제38항에 있어서, 상기 스캐폴드가 골 형성 단백질(BMP), RUNX-2 단백질, LIM 무기화 단백질, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 표피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α, 형질전환 성장 인자-β, 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래된 신경 영양 인자(BDNF), 뉴레귤린(NRG), 아그린, 또는 이들의 배합물 중의 하나 이상을 추가로 포함하는, 조성물.
  45. 제30항에 있어서, 상기 조성물이 보조제를 추가로 포함하는, 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 보조제가 줄기세포, 근육 전구 세포 및 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함하는, 조성물.
  47. 제45항에 있어서, 상기 보조제가 근육 전구 세포를 포함하는, 조성물.
  48. 제45항에 있어서, 상기 보조제가 골 형성 단백질(BMP), RUNX-2 단백질, LIM 무기화 단백질, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 표피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α, 형질전환 성장 인자-β, 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래된 신경 영양 인자(BDNF), 뉴레귤린(NRG), 및 아그린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자를 포함하는, 조성물.
  49. 근섬유 단편들과 생리학적으로 적합한 유체를 포함하는 조성물을 피험자의 요도 괄약근에 근접한 표적 위치에 주입하는 단계를 포함하는, 요실금의 치료 방법으로서,
    여기서, 근섬유 단편들은 세포벽 파괴를 나타내고 평균 크기가 150㎛ 미만인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 조성물이 상기 단편들의 적어도 일부와 연결되어 있는 위성 세포들을 포함하는, 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 근섬유 단편의 평균 크기가 약 80㎛ 내지 120㎛, 또는 약 90㎛ 내지 110㎛인, 방법.
  52. 제49항에 있어서, 상기 근섬유 단편의 종횡비가 2:1 내지 1:1인, 방법.
  53. 제49항에 있어서, 상기 근섬유 단편이 상기 피험자 자신의 근조직으로부터 유래되는, 방법.
  54. 제49항에 있어서, 상기 근섬유 단편들의 75% 이상이 세포벽 파괴를 나타내는, 방법.
  55. 제49항에 있어서, 상기 조성물이 스캐폴드를 추가로 포함하고, 상기 근섬유 단편이 상기 스캐폴드 내로 혼입되는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 스캐폴드가 콜라겐 겔, 피브린 겔, 알기네이트 겔, 또는 UV-유도된 가교결합성 겔 시스템으로부터 선택되는 주입 가능한 스캐폴드인, 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 스캐폴드가 골 형성 단백질(BMP), RUNX-2 단백질, LIM 무기화 단백질, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 표피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α, 형질전환 성장 인자-β, 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래된 신경 영양 인자(BDNF), 뉴레귤린(NRG), 아그린, 또는 이들의 배합물 중의 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
  58. 제49항에 있어서, 상기 조성물이 보조제를 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 보조제가 줄기세포, 근육 전구 세포 및 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함하는, 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 보조제가 근육 전구 세포를 포함하는, 방법.
  61. 제58항에 있어서, 상기 보조제가 골 형성 단백질(BMP), RUNX-2 단백질, LIM 무기화 단백질, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 표피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α, 형질전환 성장 인자-β, 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래된 신경 영양 인자(BDNF), 뉴레귤린(NRG) 및 아그린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 포함하는, 방법.
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