KR20140048307A - Ｎｉｋ 저해제 세포 기반의 스크리닝 검정 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 NIK 단백질의 저해제의 스크리닝 및 식별을 위한 세포 기반의 검정법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 IKK1 의 인산화와 연관된 NIK 활성을 저해하는 화합물의 식별을 가능케 한다. 검정은 형질주입된 인간 태아 신장 (HEK) 세포의 이용 및 "인수자 (acceptor)" 비드 및 "공여자 (donor)" 비드를 이용하는 비-방사활성의 균질 근접성 검정을 병용한다.

Description

ＮＩＫ 저해제 세포 기반의 스크리닝 검정 {NIK INHIBITORS CELL-BASED SCREENING ASSAY}
본 발명은 NIK 단백질의 저해제의 스크리닝 및 식별을 위한 세포 기반의 검정에 관한 것이다.
전사 인자의 핵의 인자-카파 B (NF-κB) 계열은 면역 응답, 염증, 세포 사멸 및 생존을 포함하는 다양한 생물학적 프로세스에 참여하는 구조적으로 연관된 단백질들의 집합으로 이루어진다 (Thu Y.M. and Richmond A. Cytokine & Growth Factor Rev 2010, 21:213-226).
포유류 NF-κB 계열은 κB 인핸서에 대한 결합을 통해 다양한 다운스트림 유전자 표적의 전사 및 발현을 조절할 수 있는 여러 이량체 복합체를 형성하는, p65 (RelA 로도 공지되어 있음), p50 (NF-κB1 로도 공지되어 있음), p52 (NF-κB2 로도 공지되어 있음), RelB 및 c-Rel 를 포함한 다섯가지 구성원을 포함한다. 전형적 형태의 NF-κB 는 p50/p65 이종이량체로 이루어져 있다. 그러한 복합체는 보통 κB 단백질의 저해제 (IκB) 의 구성원들, 특히 IκBα 에 결합되어 있는 한 불활성화된 형태로 세포질에 격리되어 있다 (Sun S.C., Cell Res 2011, 21:71-85).
NF-κB 의 활성화를 제어하는 두가지의 주된 경로, 즉 정규적 및 비정규적 경로가 현재 공지되어 있다. 널리 공지되어 있는 정규적 NF-κB 경로는 TNFα, IL-1β, IL-6 및 CD40L 과 같은 전-염증성 사이토카인을 포함한 광범위한 세포외 자극에 의해 촉발된다. 그러한 경로는 일반적으로 IκB 구성원들을 인산화시키는 κB 키나아제 삼량체 복합체 키나아제 (IKKα, -β 및 -γ) 의 저해제에 의해 중재되며, 이는 프로테아좀에 의한 IκB 의 유비퀴틴화 및 완전한 분해를 유도하여, 방출된 RelA/p50 이종이량체가 핵으로 이동하여 유전자 전사를 개시할 수 있도록 해 준다 (Hayden M.S. et al., Cell 2008, 132:344-362; Vallabhapurapu S. et al., Annu Rev Immunol 2009, 27:693-733).
널리 공지된 정규적 경로에 추가하고, 비정규적 경로 또한 존재한다. 그러한 대안적인 NF-κB 활성화 경로는 한 서브셋트의 종양 괴사 인자 리간드 (TNFL) 계열 구성원들, 예컨대 CD40 리간드 (CD40L), B-세포 활성화 인자 (BAFF) 또는 림프독소 β 수용체에 대한 리간드 (LTbR) 에 의해 유도된다. 실험적인 증거들은 상기 경로가 2 차적 림프구 장기 발생, B-세포 생존 및 성숙화 및 적응면역계에 수반되는 특이적 케모카인의 유도와 같은 수많은 생물학적 프로세스의 조절에서 중요하다는 점을 시사한다 (Dejardin E., Biochem Pharmacol 2006, 72:1161-1179).
상기 경로는 IKKα 및 NF-카파-B-유도 키나아제 (NIK) 단백질에 의한 p100 전구체 단백질의 성숙형 p52 로의 가공을 유도함으로써 RelB/p52 복합체의 활성화에 관여한다. 두 키나아제 모두 IκB-형 C-말단 부분을 포함하여, 결과적으로 NF-κB 저해제로 기능하는 p100 을 인산화하여, p100 단백질의 부분적 단백질가수분해를 유도해, 활성 형태 p52 를 수득하게 된다. 따라서, p100 의 가공은 p52 를 생성하고, RelB/p52 이종이량체의 핵 이동을 유도하게 된다 (Coope H.J. et al., EMBO J 2002, 15:5375-5385).
우성 음성 돌연변이의 공동발현을 이용하여, NIK 는 먼저 TNFα 및 IL-1 수용체의 근접 신호전달 다운스트림을 매개하는 키나아제로서 식별되었으며, NIK 의 키나아제 활성이 상기 프로세스에 필요하다 (Malinin N.L. et al., Nature 1997, 385:540-544). NIK 는 또한 CD27, CD30, CD40, LTβR 및 BAFFR 과 같은 타 수용체를 통한 자극을 중재한다. 과발현시, NIK 는 NF-κB 의 활성화를 유도하며, 따라서 세포가 TNFα-유도성 아폽토시스에 처하지 않도록 보호한다.
NIK 는 IKKα 및 IKKβ 와 상호작용하며 활성화하는 것으로 밝혀진 바 있다. 그러나, NIK 는 IKKα 를 IKKβ 보다 더 많이 인산화시킨다. 따라서, NIK 는 다양한 싸이토카인 수용체의 근접 신호전달에 관여하는 업스트림 IKK-복합체 키나아제로 제공된다.
IKKα (IKK1 로도 공지되어 있음) 은 NIK 에 대한 우선적 기질이다. NIK 는 Ser-176 상의 IKKα 를 직접 인산화하며, 상기 잔기의 알라닌으로의 돌연변이화는 IKKα 의 NIK 활성화를 방지하여, IL-1 및 TNFα 자극으로 인한 신호들을 무력화한다 (Ling L. et al., Proc Natl Acad Sci 1998, 95:3792-3797).
IKKα 와의 우선적 상호작용으로부터, NIK 가 IKKα 에 대해 IKKb 에 대해서 보다는 더욱 중요한 키나아제이며, NIK 가 비정규적 경로에 대해서만 필수적이란 점을 유추할 수 있다. 그러나, 유도물질 및 세포 유형에 따라서는, NIK 가 정규 및 비정규 NF-κB 경로의 두가지 모두에서 제 역할을 한다. NIK 넉아웃되거나 또는 자연 발생적으로 NIK 결핍 유전자를 갖고 돌연변이인, 림프조직형성부전 (aly/aly) 이 있는 마우스 태아 섬유아세포 (MEF) 를 이용한 연구로부터의 데이터는 이를 뒷받침해 준다 (Shinkura R. et al., Nature Genetics 1999, 22:74-77).
NIK 는 p100 의 p52 로의 프로세싱에 필요하며, 따라서 비정규 경로에서의 그의 역할을 확인하도록 해 준다 (Xiao G. et al., Mol Cell 2001, 7:401-409). NIK 또는 IKKα 의 키나아제 활성이 p100 의 두 키나아제로의 유인에 필수적인 것은 아니지만, 리간드-유도성 단백질가수분해가 일어나도록 하는데엔 필요하다 (Xiao G. et al., J Biol Chem 2004, 279:30099-30105). 놀랍게도, NIK 는 p100 의 p52 로의 구성적 프로세싱 (constitutive processing) 에는 필수적인 것이 아니다. NIK 가 p100 에서 p52 로의 프로세싱을 제어하는 메커니즘은 그의 안정성을 통한 것이다. CD40L 또는 BAFF 와 같은 리간드를 이용한 자극 시, 기본적으로 번역된 NIK 가 안정화되어 p100 에서 p52 로의 프로세싱을 유도한다 (Qing G. et al., J Biol Chem 2005, 280(49):40578-82).
요약하면, NIK 는 정규 경로에서 기능하는 키나아제이나, 특정 리간드에 대한 응답에서는 NF-κB 활성화에 대해서만 필수적이다. 그러한 선택적 필요성의 생리학적 의의는 아직 알지 못한다. 아마도, NIK 가 NF-κB 의 정규 및 비정규 경로의 교차로에 놓여 있어, 상기 두 경로 사이의 양성 및 음성 조절 균형을 유지하고 있는 것 같다. 예를 들어, NIK 는 정규 경로를 활성화시키고, 따라서 NF-κB 계열의 네번째 IκB 인 p100 의 생산을 유도할 가능성이 있다 (음성 피드백 메커니즘). 동시에, NIK 는 상기 IκB 의 프로세싱에 관여하는 키나아제로, NF-κB 이종이량체, 예컨대 RelA/p50 를 유리시켜 유전자 전사를 활성화한다 (양성 피드백 메커니즘). 따라서, NF-κB 활성화에서 동적인 역할을 하여, NF-κB 의 정규 및 비정규 조절 사이의 복잡한 균형을 맞춘다는 점이 대단히 명확해졌다.
수많은 질환들 및 특히 염증/면역 질환과 관련된 생물학적 프로세스 조절에서의 NIK 의 중대한 역할 때문에, NIK 에 대한 일련의 생화학적 및 세포 기반의 검정이 보고된 바 있다.
문헌 [Ling L. et al. (Proc Natl Acad Sci 1998, 95:3792-3797)] 은 FLAG-NIK-wt 및 FLAG-IKK-α (키나아제-데드; kinase-dead) 를 인코딩하는 발현 플라스미드를 이용해 일시적으로 형질주입된 HEK 세포의 용도를 개시한다. 형질주입 36 시간 후, 면역정제된 단백질을 γ-[32P]-ATP 와 함께 인큐베이션하고, SDS-PAGE 로 전개시키고, 자가방사법으로 분석했다. 그러한 연구는 FLAG-IKK-α (키나아제-데드; kinase-dead) 의 FLAG-NIK-wt 특이적 인산화가 일어남을 보여줬다. FLAG-IKK-α(kd)-S176A, FLAG-IKK-α(kd)-T179A 및 FLAG-IKK-α(kd)-S180A 을 기질로 이용해 추가 실험을 실시했고, 이것은 주된 NIK-매개 인산화 부위가 IKK-α(kd) 의 Ser-176 임을 보여줬다. 상기 검정은 FLAG-IKK-a(kd) 의 모든 인산화 이벤트를 검출하는 잠재성을 가져, 상기 검정이 고속 저해제 발견에 적합하긴 하지만, 단백질 발현 및 추가적인 신호전달 이벤트가 일어났을 때 FLAG-IKK-a(kd) 의 Ser-176 의 특이적 인산화가 36 시간 형질주입 동안 얼마나 일어났는지 분명하지 않다.
US 6,841,556 는 다양한 시험관내 검정 시스템에서 NIK 를 저해하는 일련의 피라졸로이소퀴놀린 유도체의 능력을 개시했다. 그러나, 시험관내 NIK 검정의 상세한 사항이 제공되지 않았다.
WO/2009/158011 는 화학발광 (CL) 및 균질 시간 분해 형광 (homogenous time resolved fluorescence) (HTRF) 포맷을 근거로 하는 일련의 시험관내 NIK 자가인산화 검정을 개시한다. 두 포맷 모두 전장 단백질에 비해 자가인산화 활성이 실질적으로 증가되어 있는 촉매 도메인만을 포함하는 NIK 의 절단된 형태를 이용한다. NIK 단백질은 바큘로바이러스 발현 시스템에서 발현되었으며, 정제 및 바이오틴화되었다. CL 검정을 위해, 50 nM 의 바이오틴화-NIK 를 화합물들 및 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 40 mM MgCl2, 및 1.5 mM DTT 를 함유하는 완충액 중의 50 μM ATP 와 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 반응 혼합물을 스트렙타비딘-코팅 플레이트에 고정시키고, NIK 의 자가인산화 활성은 항-포스포-세린/트레오닌 항체 및 서양고추냉이 퍼옥시다아제-컨쥬게이션된 2 차 항체를 이용해 검출했다.
HTRF 검정을 위해, 10 nM 의 NIK 를 화합물들과 함께, 20 mM 의 HEPES pH 7.5, 20 mM MgCl2, 0.2% Tween 20 및 1 mM DTT 를 포함하는 완충액 중의 20, 100, 200, 또는 500 μM 의 ATP 의 존재 하에 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 반응을 5 mM 의 EDTA, 12.5 ng/ml 의 Eu-표지된 항-포스포-세린/트레오닌 항체 및 1 nM 스트렙타비딘-Alexa647 를 첨가해 중단했다. 2 시간 인큐베이션 후, 형광을 615 nm 및 665 nm 에서 측정했고, 특이적 효과 활성은 665 nm 및 615 nm 에서의 신호 비율로 산출했다. 상기 검정은 절단된 NIL 단백질을 이용하기 때문에, 저해제 스크리닝은 상기 이벤트를 방해하는 분자만을 검출할 것이다.
문헌 [Mortier, J.et al. (Bioorg & Med Chem Lett 2010, 20:4515-4520)] 에서는 ProQinase 33PanQinase 기법을 이용한 시험관내 NIK 검정의 이용을 개시한다. NIK 는 인간 재조합 GST-융합 단백질로서 Sf9 곤충 세포에서 발현되며, GSH-아가로스를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제된다. NIK 의 순도는 SDS-PAGE/은 염색으로 체크하고, 그 정체는 질량 분광법으로 밝혀냈다. NIK 활성은 33P 의, 아미노산 S773-K928 에 이은 11 Arg 잔기 (ER) 로 이루어진 인간 망막아종 단백질 RB1 의 단편 유래의 트롬빈 절단 부위로 분리되어 있는 N-말단 GST-태그 및 펩티드 서열 KKKVRSGLYRSPSMPENLNRPR (CHKtide) 로 이루어진, 대장균 (E. coli) 에서 발현되는 인공 융합 단백질인 인공 기질 RBER-CHKtide 으로의 혼입에 의해 측정되었다. 상기 검정은 인공 기질을 이용하기 때문에, 저해제 스크리닝에서의 그의 이용이 생리적으로 관련있는 분자들을 검출할런지는 불명확하다.
문헌 [Hassan, N.J. et al. (Biochem J 2009, 419:65-73)] 은 Ser-176/Ser-180 의 그의 다운스트림 기질 FLAG-IKKα-(kd) 로의 FLAG-NIK-wt 매개 인산화를 모니터링하기 위한 바큘로바이러스-감염 Sf9 곤충 세포의 이용을 개시한다. 상기 검정은 IKKα 의 Ser-176/Ser-180 에 대한 특이적 항체를 이용하는 384 웰 마이크로타이터 플레이트에서의 시간-분할 형광 공명 에너지 이동 (time-resolved fluorescence resonance energy transfer) (TR-FRET) 포맷에서 한다. 상기 검정은 키나아제에 중점을 둔 소형 분자 라이브러리에 대한 스크리닝 목적으로 이용했다. 다수의 분명한 NIK 저해제들을 스크리닝 활동으로 밝혀내고, 그의 선별된 것들은 추가로 분석했으며, 이들 중 하나가 무독성인 것으로 나타났으며, 형광 분극 검정에서 NIK 와 직접 상호작용했고, 핵으로의 림프구독소-유도성 p52 이동을 억제했다. 이것은 곤충 세포 시스템이 진짜 NIK 저해제를 식별해 낼 수 있음을 강력히 뒷받침했지만, 세포 배경이 인간의 것이 아니었다.
NIK 저해제를 식별해 낼 강건하며 생리적으로 적절한 검정법이 필요하다. 그러한 검정법이 현재 이용가능한 분석 기기를 이용해 쉽고 빠르게 실시될 수 있기를 요망하고 있다. 이제까지의 접근법으로는 IKKα 를 기질로 이용하는 시험관내 활성을 가진 전장 NIK 효소를 제조하지 못했다. 절단된 형태의 NIK 가 자가인산화 하에 곤충 세포에서 생성될 수 있긴 하지만, 그러한 변이체들은 IKKα 를 인산화하지 않는다. 따라서, 상기 검정법에서의 저해제들이 생체내에서 적절한지 불분명하다.
강건한 NIK-특이적 검정법이 부재한 것은, 잠재적으로 중요한 질환 표적에 대한 공지된 저해제가 거의 없다시피 하며; 지금까지 오직 소수의 그러한 화합물들만이 보고될 수 밖에 없던 주된 이유이다 (Mortier J. et al., Bioorg & Med Chem Lett 2010, 20:4515-4520; WO/2009/158011). 예를 들어, 최초로 청구된 NIK 저해제들은 현재 NF-κB 신호전달 캐스캐이드에서 그 어느 곳에 있는 표적에도 영향을 주지 않는 것으로 공지되어, 그러한 화합물들은 세포-기반의 리포터 검정으로 찾아야 한다는 점을 시사한다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 NIK 저해제, 즉 NIK 활성을 저해하는 후보 분자들의 스크리닝 및 식별에 유용한 세포-기반의 검정법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 방법은 IKK1 의 인산화와 관련있는 NIK 활성을 저해하는 화합물들의 식별을 가능케 한다. 이 검정법은 형질주입된 인간 태아 신장 (HEK) 세포의 이용과 "인수자 (acceptor)" 비드 및 "공여자 (donor)" 비드를 이용한 비-방사활성의 균질 근접 검정법을 병용한다. HEK 세포는 전장 인간 NIK 단백질을 인코딩하는 DNA 및 IKK1 의 돌연변이 형태를 인코딩하는 DNA 를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질주입된다. 돌연변이화된 IKK1 단백질 기질은 KD (Kinase Dead) 돌연변이로도 명명되는 K11A 돌연변이를 포함한다. K44A 돌연변이는 전장 NIK 자연 기질 단백질인 IKK1 로 하여금 Ser-176 잔기에서의 자가인산화가 불가하도록 한다 (Nakano H. et al., Proc Natl Acad Sci1998, 95:3537-3542). 형질주입된 HEK 세포를 NIK 및 돌연변이화된 IKK1 단백질을 생산하도록 하는 조건에서 배양한다. NIK 가 IKK1 를 Ser-176 잔기에서 특이적으로 인산화하기 때문에, IKK1-KD 돌연변이화 단백질을 기질로서 이용하는 것은 기질의 오직 NIK-매개 인산화만을 초래하게 된다. 따라서, IKK1-KD 인산화의 저해는 NIK 에 대해 저해 유효성을 가진 화합물들의 식별을 가능케 한다.
본 발명에 따른 검정에서, NIK 및 IKK1-KD 를 포함하는 형질주입된 HEK 세포를 웰 플레이트에서 배양한다. 세포 배양은 바람직하게는 37℃ 에 근접한 온도에서 5% CO2 의 존재 하에 적합한 기간 동안 실시한다. 시험할 화합물 (후보 분자) 의 형질주입된 HEK 세포로의 침투를 촉진할 뿐만 아니라 살아있는 HEK 세포를 유지하기 위해 그 온도가 선택된다. IKK1-KD 의 NIK-매개 인산화를 저해하는 후보 분자들의 능력을 비드 기재의 발광 근접 시스템을 통해 검출한다.
비드 기재의 발광 근접 시스템에서, 시약-코팅된 (마이크로) 비드의 공여자 및 인수자 쌍을 상기 비드에 고정시킨 파트너 결합의 이분자성 상호작용에 의해 근접하게 만든다.
인수자의 공여자 비드에 대한 근접성은 이들에 결합되어 있는 분자들의 생물학적 상호작용에 좌우된다. 가장 통상적인 검정법은 공여자 비드 상에 결합하는 파트너 및 인수자 비드 상의 나머지 파트너를 포획하여 구축된다. 파트너들이 동일 기질과의 상호작용에 의해 근접하게 된다면, 레이저 여기시 전자기적 에너지가 공여자로부터 인수자 비드로 이동하게 되어, 신호가 제공된다. 이어서, 그 신호는 Envision 2103 Multilabel Reader 와 같은 적합한 수단을 통해 검출된다. 그러한 기법의 장점은 매우 높은 감도, 매우 낮은 신호 배경, 높은 신호/배경 비율, 소형화 및 비용 효율성이다.
본 발명의 검정법은 기질로서의 IKK1 에 대한 NIK 저해제를 식별하기 위한 후보자 분자들의 스크리닝을 실시하는 단순하며, 민감하도 신속한 방법을 제공하게 된다. 본 발명의 문맥상, 용어 "검정법" 및 "방법" 은 호환하여 사용된다.
약어들
- HEK: 인간 태아 신장
- Sf9 세포: 스포돕테라 프루기네르다 (Spodoptera frugiperda) 세포
- fl: 전장
- KD/kd: 키나아제 데드 (kinase dead)
- K44A: Lys-44-Ala 돌연변이 (키나아제 데드)
- NIK: NF-κB 유도 키나아제
- NIK-fl: 전장 NF-κB 유도 키나아제
- IKK-α: NF-κB 키나아제 서브유닛 알파의 저해제
- IKK-β: NF-κB 키나아제 서브유닛 베타의 저해제
- IKK1-KD: 키나아제 데드 전장 IKK-α
- FLAG-IKKα (kd): 키나아제 데드 FLAG 태그된 IKK-α
- FLAG-IKKα (kd)-S176A:
키나아제 데드 FLAG 태그된 IKKα Ser-176-Ala 돌연변이
- FLAG-IKKα (kd)-T179A:
키나아제 데드 FLAG 태그된 IKKα Thr-179-Ala 돌연변이
- FLAG-IKKα (kd)-S180A:
키나아제 데드 FLAG 태그된 IKKα Ser-180-Ala 돌연변이
- hNIK1-fl-wt-pFlagN: 야생형 FLAG 태그된 전장 인간 NIK 플라스미드
- hNIK1-fl-wt-FlagN: 야생형 전장 FLAG 태그된 인간 NF-κB 유도 키나아제
- IKK1-KD-pFlagN: 키나아제 데드 FLAG 태그된 IKK-1 플라스미드
- IKK1-KD-FlagN: 키나아제 데드 FLAG 태그된 IKK-α
- AlphaScreen: 증폭 발광 근접성 균질 검정
(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)
- AlphaScreen SureFire IKKα(phospho-Ser-176/180) 검정 키트:
세포에서 Ser-176/180 인산화된 IKKα 단백질을 정량하기 위한 AlphaScreen 키트
- Compound A 는 도 19 에 도시된 분자 (A) 와 관련된 것이다
- Compound B 는 도 19 에 도시된 분자 (B) 와 관련된 것이다
- Compound C 는 도 19 에 도시된 분자 (C) 와 관련된 것이다.
도면의 설명
도 1. (A) 단독, 이중 및 비-형질주입된 HEK 세포 (hNIK1-fl-wt-pFlagN 및 IKK1-KD-pFlagN 플라스미드) 에 대해 24 시간 후 AlphaScreen SureFire IKKα (phospho-Ser176/180) 검독 결과; (B) 형질주입 48 시간 후인 점을 제외하고 (A) 와 동일. AlphaScreen 신호는 HEK 세포에 hNIK1-fl-wt-pFlagN 및 IKK1-KD-pFlagN 플라스미드를 이용해 이중 형질주입시에만 관찰되었다.
도 2. hNIK1-fl-wt-pFlagN 및 IKK1-KD-pFlagN 플라스미드로 이중 형질주입된 HEK 세포의 면역세포화학.
도 3. (A) hNIK1-fl-wt-pFlagN 및 IKK1-KD-pFlagN 플라스미드를 이용해 24 시간 동안 이중 형질주입된 HEK 세포 JetPEI 에 대한, 전체 DNA 대비 인산화된-IKK1-KD-FlagN 에 대한 AlphaScreen 신호. (B) hNIK1-fl-wt-pFlagN 및 IKK1-KD-pFlagN 플라스미드를 이용해 24 시간 동안 이중 형질주입된 HEK 세포 JetPEI 에 대한, 전체 DNA mg 당 Compound A 를 0.0625 내지 10 ㎍ 로 할 때의 투여량-응답성.
도 4. 이중 jetPEI hNIK1-fl-wt-pFlagN 및 IKK1-KD-pFlagN 형질주입된 HEK 세포를 이용한 화합물들에 대한 투여량-응답성 곡선 (A) 실험 1: 인산화된-IKK1-KD-FlagN 에 대한 24 시간째의 AlphaScreen 신호; (B) 실험 1: 인산화된-IKK1-KD-FlagN 에 대한 48 시간째의 AlphaScreen 신호; (C) 실험 2: 인산화된-IKK1-KD-FlagN 에 대한 24 시간째의 AlphaScreen 신호; (D) CellTiter-Glo 검정을 이용한 세포 생존력 연구.
도 5. 형질주입된 HEK 세포의 DMSO 용인능.
도 6. AlphaScreen 검출 시약 첨가 후 3 및 16 시간 째의 AlphaScreen 시약 안정성 평가.
도 7. (A) 384 웰 마이크로타이터 플레이트에서의 HEK 세포 기반의 검정에서 중간, 낮은 및 높은 대조군의 전형적 성능; (B) 384 웰 마이크로타이터 플레이트의 352 DMSO 웰에 대한 통계.
도 8. (A) n=1 및 n=2 HEK 세포 기반의 검정 연구로부터의 14 개 마이크로타이터 플레이트에 대한 Z'. 9 개의 플레이트에 대해서는 Z' 가 0.5 초과, 10 개의 마이크로타이터 플레이트에 대해서는 Z' 가 0.4 초과; (B) 마이크로타이터 플레이트 4 에 대한 원 데이터; (C) 마이크로타이터 플레이트 5 에 대한 원 데이터. 컬럼 1 및 2, 및 컬럼 23 및 24 는 대조군 컬럼; 컬럼 3 내지 22 는 시험 화합물에 대해 이용되는 컬럼.
도 9. HEK 세포 기반의 검정에 대한 두개씩의 스크리닝 데이터 셋트 (n=1 및 n=2) 의 상관관계. 고, 저 및 중 대조군 집단이 예측 위치에 위치한다. A 정사각: n=2 데이터 셋트에서만 50% 를 초과하는 저해를 나타낸 7 가지 화합물; B 정사각: n=1 및 n=2 데이터 셋트에서 모두 50% 를 초과하는 저해를 나타낸 13 가지 화합물; C 정사각: n=1 데이터 셋트에서만 50% 를 초과하는 저해를 나타내는 1 가지 화합물.
도 10. HEK 세포 기반의 검정으로부터의 2,240 가지 시험 화합물 스크리닝 결과의 가시화. 플레이트 고유번호 (X-축), 저해 (n=1) (Y-축) 및 저해 (n=2) (Z-축).
도 11. 상이한 저해율% 컷-오프 값에서의 HEK 세포 기반의 검정의 힛 비율 산출.
도 12. HEK 세포 기반의 검정으로부터 밝혀진 21 힛의 CellTiter-Glo 검정 결과.
도 13. (A) HEK 세포 기반의 검정으로부터의 21 힛 및 CellTiter-Glo 검정으로부터의 결과 사이의 상관관계. 21 가지 화합물들 중, 5 가지는 HEK 세포 기반의 검정 및 CellTiter-Glo 검정 사이에 50% 초과 저해의 창을 제공함; (B) 도 8 내지 12 로부터의 결과 요약.
도 14. HEK 세포 기반의 검정에서 50% 를 초과하는 NIK 저해 및 50% 미만의 세포독성의 프로파일을 나타낸 9 가지 화합물들의 구조.
도 15. (A) 표 형식 및 (B) 그래프 형식에서의, n=3 HEK 세포 기반의 검정으로부터의 7 개의 마이크로타이터 플레이트에 대한 Z'.
도 16. (A) HEK 세포 기반의 검정에 대한 n=2 및 n=3 스크리닝 결과의 상관관계; (B) HEK 세포 검정 및 CellTiter-Glo 세포 생존력 검정에서 21 힛에 대한 결과 (n=1, n=2 및 n=3) 의 요약.
도 17. (A)-(G) Z', 검정 플레이트 상의 힛의 위치 (하나 이상의 시험 상황에서 화합물이 50% 를 초과하는 저해를 제공) 및 힛의 재현성을 수단으로 하여 HEK 세포 기반의 검정으로부터의 모든 21 개의 검정 마이크로타이터 플레이트 (n=1, n=2 및 n=3) 의 분석.
도 18. 스크리닝 검정에 사용한 시험 화합물, 고, 저 및 중 대조군의 레이아웃.
도 19. (A) 및 (B) NIK 저해제로서 보고된 화합물들의 예시 (WO 2009/158011); (C) NIK 저해제로서 보고된 화합물 (US 6,841,556).
발명의 상세한 설명
본 발명은 IKK1-KD 의 NIK-매개 인산화를 저해하는 화합물을 식별하기 위해 형질주입된 HEK 세포를 이용하는 세포 기반의 검정에 관한 것이다. IKK1-KD 의 NIK-매개 인산화를 저해함에 있어서 시험 화합물의 효능은 표준 마이크로타이터 플레이트 포맷에서 측정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 해당 검정은 High Throughput Screening (HTS) 배치에서 실시될 수 있다.
용어 "NIK-매개 인산화" 는 NIK 단백질의 기질 인산화 능력을 지칭한다. NIK 는 IKK1 단백질 기질을 특이적으로 Ser-176 잔기에서 인산화한다. 본 발명의 맥락에서, NIK 기질은 K44A 돌연변이가 있는, IKK1-KD 로도 명명되는 IKK1 단백질이다. 그러한 돌연변이화 기질의 이용은 IKK1 로 하여금 Ser-176 잔기에서의 자가인산화를 불가하게 만든다.
본 발명에서 사용시, "HEK 세포-기반의 검정" 은 NIK 를 포함하는 인간 태아 신장 (Human Embryonic Kidney) (HEK) 세포 및 상기 HEK 세포에 첨가되는 물질의 유효성 검정을 위해 본 발명에 따른 방법에 이용되는 그의 기질 IKK1-KD 를 이용하는 검정 시스템을 지칭한다.
본 발명에 따르면, "형질주입된 HEK 세포" 는 전장 인간 NIK 단백질을 인코딩하는 DNA 및 전장 NIK 기질 IKK1-KD 단백질을 인코딩하는 DNA 를 포함하는 인간 태아 신장 세포를 지칭한다. 본 발명의 검정은 "인수자 (acceptor)" 비드 및 "공여자 (donor)" 비드를 이용하는 비-방사활성의 균질 근접성 검정과 함께 형질주입된 HEK 세포의 이용을 병용한다.
바람직한 구현예에서, 전장 인간 NIK 단백질을 인코딩하는 DNA 및 IKK1-KD 단백질을 인코딩하는 DNA 는, 상기 HEK 세포를 전장 인간 NIK 단백질을 인코딩하는 DNA 를 포함하는 제 1 발현 벡터 및 전장 NIK 기질 IKK1-KD 단백질을 인코딩하는 DNA 를 포함하는 제 2 발현 벡터를 이용해 형질주입해 HEK 세포로 삽입된다.
대안적 구현예에서, HEK 세포는 전장 인간 NIK 단백질을 인코딩하는 DNA 및 전장 NIK 기질 IKK1-KD 단백질을 인코딩하는 DNA 를 포함하는 단일 발현 벡터를 이용해 형질주입될 수 있다.
HEK 세포를 형질주입하기 위해, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, jetPEI 형질주입 시약이 이용된다.
HEK 세포의 형질주입은 일시적이거나 또는 안정할 수 있다. 한 구현예에서, 형질주입은 일시적이다.
AlphaScreen 은 "인수자 (acceptor)" 및 "공여자 (donor)" 비드를 이용하는 비-방사활성 균질 근접성 검정의 적합한 예시이다. 두문자어 ALPHA 는 증폭 발광 근접성 균질 검정 (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) 을 나타낸다. AlphaScreen 은 마이크로플레이트 포맷에서의 생물분자 상호작용을 연구하기 위해 사용되는 비드-기반의 검출 시스템이다. 비드 상에 포획되는 분자의 결합은 한 비드로부터 다른 것으로의 에너지 이동을 유발하여, 궁극적으로 발광/형광 신호를 제공하게 된다. 모든 AlphaScreen 검정은 공여자 비드 및 인수자 비드의 두 비드 유형을 포함한다. 두 비드 유형 모두 비특이적 결합 및 자체응집을 최소화하며 생물분자를 비드 표면에 컨쥬게이션하기 위해 반응성 알데히드기를 제공하는 히드로겔로 코팅된다.
본 발명의 방법에서의 형질주입된 HEK 세포의 이용은 NIK-매개 인산화 활성을 저해하는 후보자 화합물 식별에 현재 이용 중인 검정법에 비해 더욱 생리학적으로 적절한데, 이는 이것이 인간 세포 배경을 이용하기 때문이다.
FLAG 서열의 첨가가 NIK 단백질 또는 NIK 기질로서 작용하는 IKK1-KD 단백질의 활성을 방해하지 않는 정도까지, NIK 및/또는 IKK1-KD 를 인코딩하는 DNA 가 추가적인 N-말단 FLAG 태그를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 형질주입된 HEK 세포는 적절한 기간 동안 임의의 적합한 배지에서 배양한다. 예시 배양 배지는 10% FBS 이 있는 DMEM 이다. 형질주입된 HEK 세포를 5% CO2 및 37℃ +/- 2℃ 에서 배양하는데, 상기 온도는 시험할 화합물이 세포에 침투할 최적의 조건이며, 활성이라면 NIK 활성을 저해할 뿐만 아니라 살아있는 세포를 유지하게끔 한다.
검정은 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트에서 실시되어, 여러 시험 화합물 또는 다양한 농도의 동일 시험 화합물을 동시에 평가할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 384 웰 마이크로타이터 플레이트가 이용된다. 대안적 구현예에서, 1536 웰 마이크로타이터 플레이트가 이용될 수 있다.
시험할 화합물은 디메틸 술폭시드 (DMSO) 와 같은 적합한 용매에 용해시키고, 형질주입된 HEK 세포가 배양될 배양 배지에 첨가한다. 이어서, 세포를 시험 화합물과 37℃ +/- 2℃ 및 5% CO2 에서, 바람직하게는 24 시간 동안 인큐베이션한다. 당업자라면, 본 발명의 검정에서 형질주입된 HEK 세포 셋트를 이용한 시험의 인큐베이션 조건이 시험할 화합물의 세포막을 통과하는 수동적 확산을 촉진한다는 것을 알 수 있을 것이다. 그러한 확산은 20 내지 37℃ 범위에서 극적으로 변동하며, 최대 확산은 37℃ 일 때이다 (Garrick R.A. et al., Am J Physiol1982, 243:C285-C292). 능동 수송이 개입되면, 온도에 대한 확산의 의존성은 더욱더 극적으로 된다. 그러한 배양 조건은 NIK 저해제 식별을 위한 선행기술의 스크리닝 방법, 특히 일반적으로 22 내지 25℃ 에서 실시되는 곤충 Sf9 세포 기반의 검정에서 눈에 띄는 개선을 나타낸다.
한 구현예에서, 시험 화합물과 함께 배양된 형질주입된 HEK 세포에 추가하여, 시험 화합물 없이 오직 형질주입된 HEK 세포만을 포함하는 웰은 마이크로타이터 검정 플레이트에 포함된다. 그러한 웰은 시험 화합물에 대한 세포의 노출시 NIK 활성의 저해를 결정하기 위해 이용될 수 있는 음성 대조군을 제공한다.
추가 구현예에서, 기질의 NIK-매개 인산화를 저해하는 것으로 공지된 화합물의 존재 하에 배양된 형질주입된 HEK 세포만을 포함하는 추가적인 웰이 마이크로타이터 검정 플레이트에 포함된다. NIK 저해제인 것으로 공지된 화합물과 함께 형질주입된 HEK 세포를 포함하는 웰은 NIK 활성 저해에 대한 양성 대조군을 제공한다.
형질주입된 HEK 세포의 시험 화합물에 대한 노출시 음성 대조군에 비교하여 NIK 활성의 저해 또는 감소가 NIK 저해제인 시험 화합물의 표식이다. NIK 활성을 양성 대조군의 수준으로까지 감소시킨 시험 화합물은 유효한 NIK 저해제로 예측된다.
시험 화합물의 형질주입된 HEK 세포 배양과의 적정 기간 인큐베이션 후, 세포 배양 배지를 웰로부터 제거하고, 형질주입된 HEK 세포를 해리시킨다. 형질주입된 HEK 세포를 해리하기 위해, 해리 완충액을 형질주입된 HEK 세포을 포함하는 웰에 첨가하고, 이로써 형질주입된 HEK 세포로부터 세포 해리물을 수득하게 된다.
본 발명에 따라 IKK1-KD 단백질의 NIK-매개 인산화를 저해할 수 있는 후보자 화합물들을 식별해 내기 위해, 비드-기반의 발광 근접성 검출 시스템, 예컨대 AlphaScreen 시스템이 이용된다.
AlphaScreen 은 마이크로타이터 플레이트 포맷에서 생물분자 상호작용을 연구하기 위해 사용되는 비드-기반의, 비-방사활성 증폭 발광 근접성 균질 검정이다. 신호가 제공되는 방법을 이해하기 위해서는, 비드를 먼저 이해해야 한다. 모든 AlphaScreen 검정은 두가지 유형의 비드, 즉 공여자 비드 및 인수자 비드를 포함한다. 각 비드 유형은 상이한 화합물 조합을 포함하는데, 이는 AlphaScreen 기법의 중요한 요소이다. 공여자 비드는 680 nm 에서의 레이저 발광시 주변 산소를 여기된 형태의 O2 인 단일항 산소 (1O2) 로 변환시키는 광감작제, 프탈로시아닌을 포함한다. 여타 여기된 분자와 마찬가지로, 단일항 산소는 바닥 상태로 떨어지기 전 제한된 수명을 갖고 있다. 그의 4 초 반감기 이내에, 단일항 산소는 용액 중에 약 200 nm 확산할 수 있다. 인수자 비드가 그와 근접하게 존재한다면, 에너지는 단일항 산소로부터 인수자 비드 내의 티옥센 유도체로 이동할 것이며, 후속하여 520 내지 620 nm 에서의 광 제공에서 극에 달한다. 인수자 비드의 부재시, 단일항 산호는 바닥 상태로 떨어지고, 신호는 생성되지 않는다.
첫번째 유형의 비드는 "인수자 비드" 로 지칭된다. 인수자 비드는 직경이 약 250 nm 인 라텍스-기재의 비드이다. 인수자 비드는 티옥센 유도체 및 형광소를 포함하며, 결합 파트너와 상호작용할 수 있는 분자와 컨쥬게이션되어 있다. "결합 파트너" 는 예를 들어 단백질에 특이적으로 결합하며, 인수자 비드 및 제 2 종들과 접촉하게 되는 항체와 같은 분자이다. 분자-컨쥬게이션된 인수자 비드 및 결합 파트너가 사용되어 분석할 시료에 첨가되는 믹스를 형성한다.
본 발명에 따르면, 인수자 비드의 결합 파트너는 항-phospho-Ser-176/180 항체이다. 그러한 항체는 IKK1-KD 를 인식한다. 특히, 항체는 IKK1-KD 단백질의 인산화된 형태의 Ser-176 잔기에 결합한다. 또한, 본 발명에 따르면, 인수자 비드에 컨쥬게이션되어 있는 분자는 Protein-A 이다. Protein-A 은 항-phospho-Ser-176/180 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합할 수 있다. Protein-A 컨쥬게이션된 인수자 비드 및 항-phospho-Ser-176/180 항체는 결과적으로 함께 혼합시 인수자 복합체 (이후, "제 1 믹스" 로 정함) 를 만들어 낸다.
또한 본 발명에 따르면, "제 1 믹스" 는 Protein-A 코팅된 비드 및 항-phospho-Ser-176/180 항체로 이루어진 믹스이다. 본 발명의 방법에서, 제 1 믹스는 첨가되고 2 시간 동안 24℃ 에서 NIK 저해 활성에 대해 시험할 후보자 화합물의 존재 하에 배양되는 형질주입된 HEK 세포로부터 수득되는 세포 해리물과 인큐베이션된다.
두번째 유형의 비드는 "공여자 비드" 로 지칭된다. 공여자 비드도 또한 직경이 약 250 nm 인 라텍스-기재의 비드이다. 공여자 비드는 680 nm 에서의 레이저 발광시 주변 산소를 여기된 형태의 O2, 단일항 산소로 변환시키는 광개시제, 프탈로시아닌을 포함한다. 공여자 비드는 여러 유형의 분자들과 컨쥬게이션되어 분자-코팅된 공여자 비드를 형성한다. 그러한 컨쥬게이션은 공여자 비드와 결합 파트너의 상호작용을 가능케 한다. 그러한 결합 파트너는 공여자 비드 및 제 2 종들과 저하게 되는 분자이다. 결합 파트너는 예를 들어 제 2 종들을 특이적으로 인식하고, 특이적 상호작용에 의해 분자-코팅된 공여자 비드와 상호작용하는 항체일 수 있다. 분자-컨쥬게이션된 공여자 비드 및 결합 파트너가 사용되어 분석할 시료에 첨가되는 믹스를 형성한다.
본 발명에 따르면, 공여자 비드의 결합 파트너는 바이오틴화된 항체이다. 그러한 바이오틴화된 항체는 IKK1-KD 를 특이적으로 인식한다. 특히, 바이오틴화된 항체는 Ser-176 잔기를 포함하지 않는 단백질 부분에서 IKK1-KD 단백질에 특이적으로 결합한다. 또한, 본 발명에 따르면, 공여자 비드에 컨쥬게이션되어 있는 분자는 스트렙타비딘이다. 스트렙타비딘은 항-IKK1-KD 바이오틴화된 항체를 인식하고, 그와 높은 친화성을 갖고 특이적으로 상호작용할 수 있다. 스트렙타비딘-코팅된 공여자 비드 및 항-IKK1-KD 바이오틴화된 항체는 결과적으로 함께 혼합시 공여자 복합체 (이후, "제 2 믹스" 로 정함) 를 만들어 낸다.
또한, 본 발명에 따르면, "제 2 믹스" 는 스트렙타비딘-코팅된 공여자 비드 및 IKK1-KD 단백질에 결합하는 바이오틴화된 항체로 이루어진 믹스이다. 본 발명의 방법에서, 제 2 믹스를 첨가해, 1 시간 동안 24℃ 에서, 제 1 믹스를 먼저 첨가했던 NIK 저해제 활성을 시험하기 위한 후보자 화합물의 존재 하에 배양된 형질주입된 HEK 세포로부터 수득되는 해리물과 인큐베이션한다.
본 발명의 방법에 따르면, 제 1 믹스 및 제 2 믹스와의 인큐베이션 후 형질주입된 HEK 세포로부터 수득되는 세포 해리물을, 스트렙타비딘-코팅된 공여자 비드의 표면에서 단일항 산소의 형성을 유도하는 680 nm 의 고강도 레이저를 이용해 여기시킨 후, 공여자 비드에 존재하는 프탈로시아닌 광개시제에 의해 주변 산소를 더욱 여기된 단일항 상태로 변환시킨다. 공여자 비드는 약 60,000 개의 단일항 산소 분자를 생성하여, 상당히 증폭된 신호를 제공하게 된다.
인수자 비드가 공여자 비드에 근접하게 존재하는 경우, 에너지는 단일항 산소로부터 인수자 비드 내 티옥센 유도체로 이동하며, 520 내지 620 nm 범위에서 광이 제공된다. 인수자 비드가 공여자 비드에 근접하게 존재하지 않으며, 에너지가 전이되지 않아, 신호는 생성되지 않는다.
IKK1-KD 단백질의 NIK-매개 인산화를 저해할 수 없는 시험 화합물의 존재시, 형질주입된 HEK 세포 해리물은 Ser-176 인산화된 형태의 IKK1-KD 단백질을 포함할 것이다. 결과적으로, 제 1 믹스에 존재하는 항-phospho-Ser-176/180 항체는 IKK1-KD 와 상호작용할 것이며, 인수자 복합체는 공여자 복합체에 가까운 근접성을 갖게 되어, 세포 해리물의 레이저 여기시 AlphaScreen 검출 시스템에서 검출가능한 신호를 제공할 것이다.
IKK1-KD 단백질의 NIL-매개 인산화를 저해하거나 또는 감소시킬 수 있는 시험 화합물의 존재 하에, 형질주입된 HEK 세포 해리물은 더 적은 Ser-176 인산화된 형태의 IKK1-KD 단백질을 함유할 것이다. 결과적으로, 제 1 믹스에 존재하는 더 적은 항-phospho-Ser-176/180 항체가 IKK1-KD 와 상호작용할 것이고, 감량된 인수자 복합체가 공여자 복합체와 근접하게 존재하게 되어, 결과적으로 세포 해리물의 레이저 여기시 AlphaScreen 검출 시스템에서 검출가능한 신호는 줄어들거나 또는 없게 될 것이다.
AlphaScreen 분석의 강건성을 분석하기 위해, Z' 값을 산출하는 것이 유용하다. Z' 값은 상이한 시약, 포맷 및 기기를 이용하는 상이한 검정 기법의 성능을 비교 및 평가하도록 하는 차원이 없는 파라미터이다. Z' 값은 두 계수 집단의 표준 편차를 고려하며, 따라서 신호/배경 비율만 이용하는 것보다 더욱 유용한 검정 신호 창 평가를 제공한다. 일반적으로, 0.5 를 초과하는 Z' 값은 검정의 강건성에서 우수한 지수로 간주된다.
분명한 NIK 저해 활성을 가진 후보자 분자가 일단 검출되면, 이들을 세포독성 효과때문에 저해 활성을 나타내는지 또는 여타 이유 (분명한 저해제) 로 인해 재조합 NIK 의 발현 및 기질 단백질을 방해하기 때문에 저해 활성을 나타내는지 구분하는데 도움이 되는 발현 세포독성 "카운터스크린" 검정에 적용시켜 진짜 저해제를 찾아낸다. 적합한 검정은 CellTiter-Glo 세포 생존력 검정일 수 있다.
따라서, 본원에서는 하기 단계를 포함하는, NIK 활성을 저해하는 화합물의 식별 방법을 제공한다:
(a) NIK 를 인코딩하는 DNA 및 IKK1-KD 를 인코딩하는 DNA 를 포함하는 HEK 세포 (이후, "형질주입된 HEK 세포" 로 언급) 를 배양 배지에 제공하는 단계;
(b) 상기 형질주입된 HEK 세포를 시험할 후보자 분자의 존재 및 부재 하에 37℃ +/- 2℃ 의 온도에서 5% CO2 의 존재 하에 24 시간 동안 인큐베이션하는 단계;
(c) 배양 배지를 제거하는 단계;
(d) 세포를 해리하는 단계;
(e) 세포 해리물에 인수자 복합체에 이어 공여자 복합체를 첨가하는 단계;
(f) 세포 해리물을 레이저 발광을 이용해 여기시키는 단계, 및
(g) 세포 해리물의 레이저 여기시 나오는 신호를 비드-기반의 발광 근접성 검출 시스템을 이용해 측정하는 단계,
여기서, 시험 화합물의 존재 하에 배양된 형질주입된 HEK 세포로부터 유도된 세포 해리물로부터 수득되는 신호의 감소 또는 부재는 IKK1-KD 의 NIK-매개 인산화 저해의 표식이며, 여기서 인수자 복합체는 분자-코팅된 비드 및 IKK1-KD 단백질에 결합하는 결합 파트너를 포함하고, 공여자 복합체는 분자-코팅된 비드 및 IKK1-KD 단백질에 결합하는 결합 파트너를 포함함.
대안적 구현예에서, 시험 화합물의 부재 하에 배양된 형질주입된 HEK 세포로부터 유도되는 세포 해리물로부터 수득되는 신호에 비해, 시험 화합물의 존재 하에 배양된 형질주입된 HEK 세포로부터 유도된 세포 해리물로부터 수득되는 신호의 감소는 IKK1-KD 의 NIK-매개 인산화 감소의 표식이다.
바람직한 구현예에서, NIK 를 인코딩하는 DNA 및 IKK1-KD 를 인코딩하는 DNA 는 상기 HEK 세포를 NIK 를 인코딩하는 DNA 를 포함하는 제 1 발현 벡터 및 IKK1-KD 를 인코딩하는 DNA 를 포함하는 제 2 발현 벡터를 이용해 형질주입하여 HEK 세포로 삽입된다.
한 구현예에서, 인수자 복합체의 분자-코팅된 비드는 Protein-A 코팅된 비드이고, 인수자 복합체의 결합 파트너는 IKK1-KD 의 Ser-176 잔기의 인산화된 형태에 특이적으로 결합하는 항체이다.
한 구현예에서, 공여자 복합체의 분자-코팅된 비드는 스트렙타비딘-코팅된 비드이고, 공여자 복합체의 결합 파트너는 IKK1-KD 단백질에 결합하는 바이오틴화된 항체이다.
한 구현예에서, 비드-기반의 발광 근접성 검출 시스템은 AlphaScreen 검출 시스템이다.
한 구현예에서, 상기 방법은 세포독성 검정에서 NIK 저해 활성을 나타내는 후보자 분자들을 시험하여, NIK 저해 활성을 갖고 있지만 세포독성 효과와 연관되어 있는 후보자 분자들을 세포독성 효과와 무관하면서 NIK 저해 활성을 가진 후보자 분자와 구분하도록 하는 단계를 추가로 포함한다.
실시예
실시예 1: 시약 확인 파일럿 연구
재료 및 방법
HEK 세포 (HEK293A, Invitrogen R705-07) 를 jetPEI 형질주입 시약 (PEQLAB Biotechnologie GmbH) 을 이용해 hNIK1-fl-WT-pFlagN 및/또는 IKK1-KD-pFlagN 플라스미드 (이스라엘의 David Wallach Weizmann Institute 교수님 제공) 로 이중 또는 단독 형질주입했다. 형질주입 대조군은 완충액 및 비-형질주입 대조군을 포함했다. 공급사로부터의 jetPEI 의 프로토콜을 이용해 10 ml 배지를 포함하는 T75 플라스크 내 20 g 전체 DNA 에서, 각 조건 (단독 형질주입, 이중 형질주입 또는 비-형질주입 대조군) 에 대해 약 1x106HEK 세포를 형질주입했다. 이어서, 세포를 37℃ 및 5% CO2 에서 24 시간 및 48 시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 세척하고, 트립신처리하고, 384 웰 마이크로타이터 플레이트 (25 ㎕, 5,000 세포/웰) 에 넣었다. IKK1-KD 단백질의 NIK-매개 인산화의 검출을 AlphaScreen IgG Detection Kit (Protein-A) (PerkinElmer, 카탈로그 번호 6760617M) 와 함께 AlphaScreen SureFire IKKα (phospho-Ser-176/180) Assay Kit (PerkinElmer, 카탈로그 번호 TGRKAS10K) 를 이용해 실시했다. 배지 제거 및 HEK 형질주입된 세포의 해리 후, 5 ㎕/웰 인수자 믹스 (acceptor mix) (항-phospho-Ser-176/180 항체 및 Protein-A 컨쥬게이션된 인수자 비드를 포함) 를 첨가하고, 플레이트를 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 2 ㎕/웰 공여자 믹스 (스트렙타비딘 코팅된-공여자 비드 및 바이오틴화된 항체 포함) 를 첨가하고, 마이크로타이터 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 검독했다 (PerkinElmer, Envision 2103 Multilabel Reader). 추가 대조군에서, 두가지 단독 형질주입된 제제 (hNIK1-fl-WT-pFlagN 또는 IKK1-KD-pFlagN 플라스미드) 유래의 HEK 세포 해리물을 혼합한 후, 상기 기재된 바와 같이 분석했다.
결과
상기 실험으로부터의 결과를 도 1 에 제시한다.
그 결과는 IKK1-KD-FlagN 가 24 시간 및 48 시간 형질주입시 hNIK1-fl-wt-FlagN 매개 인산화 하에 있게 된다는 점을 명확하게 증명한다. hNIK1-fl-wt-FlagN 또는 IKK1-KD-FlagN 단백질의 부재시, AlphaScreen 신호는 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 2: 면역세포화학에 의한 IKK1 - KD - pFlagN 의 존재성 확인
IKK1-KD-FlagN 가 hNIK1-fl-wt-FlagN 매개 인산화 하에 있는지 증명하기 위해, 형광 영상확인 (fluorescence imaging) 을 실시해 NIK 및 IKK-1 의 두가지 모두 존재함을 확인했다.
재료 및 방법
HEK 세포를 상기 기재된 바와 같이 이중 형질주입했다. 30 시간 후, 세포를 아세톤으로 고정했다. 면역세포화학 연구에서 항-NIK-T559 항체 (Santa Cruz, 카탈로그 번호 sc-12957) 및 항-IKKα-C-말단 항체 (Santa Cruz, 카탈로그 번호 sc-7121) 및 Alexa-488-2 차 항체 (Invitrogen) 를 이용했다. 핵을 DAPI 로 염색했다.
결과
도 2 에 제시된 결과는 IKK1-KD-FlagN 의 존재성을 증명해준다. 상기 결과들이 비-최적화 실험으로부터 유래하긴 했지만, 이들은 HEK 세포 기반의 검정이 실현가능한 것임을 조기에 알려줬다.
실시예 3: jetPEI 를 이용한 형질주입 효율 확인
재료 및 방법
HEK 세포를 0 내지 10 mg/ml 범위의 전체 DNA 상에서 이중으로 형질주입했다 (hNIK1-fl-WT-pFlagN 및 IKK1-KD-pFlagN 플라스미드를 1:1 비율로 이용). 사용된 jetPEI 형질주입 시약의 양은 일정했다 (2 ㎕/ml 세포 현탁액). 형질주입시, 세포를 즉시 37℃ 및 5% CO2 에서 24 시간 인큐베이션한 384 웰 마이크로타이터 플레이트에 넣었다 (10,000 세포/웰을 포함하도록 한, 50 ㎕/웰). 인산화된 IKK1-KD-FlagN 을 상기 기재된 바와 같이 AlphaScreen SureFire IKKα(phospho-Ser-176/180) 검독값을 이용해 검출했다. AlphaScreen SureFire 검독값을 이용한 투여량-응답성 실험을 NIK 를 저해하는 것으로 공지된 분자인 Compound A 에 대해 실시했다.
결과
상기 실험 결과를 도 3 에 제시한다.
HEK 세포에 대한 Dual jetPEI 형질주입 결과, AlphaScreen 검정으로 검출되는 바와 같이 IKK1-KD-FlagN 의 인산화가 제공된다. DNA 하중이 증가할수록, 필시 jetPEI 의 양은 제한되어 가므로 불충분한 형질주입으로 인해 높은 DNA 농도에서는 AlphaScreen Signal 에서 감소가 관찰된다. Compound A 는 DNA 하중을 0.125 ㎕/ml 로 하여 형질주입을 실시할 때 허용가능한 프로파일을 제공한다.
실시예 4: jetPEI 형질주입된 HEK 세포를 이용한 화합물 프로파일
재료 및 방법
첫번째 실험에서, 네가지 화합물의 일련의 희석물을 검정 플레이트에 옮겼다 [수니티닙 (Sunitinib), Compound A, Compound B and Compound C]. JetPEI 이중 형질주입된 HEK 세포 (10,000 세포/웰을 포함하는 50 ㎕) 를 마이크로타이터 플레이트에 넣고, 37℃ 및 5% CO2 에서 24 시간 및 48 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 플레이트를 프로세싱하고, 인산화된 IKK1-KD-FlagN 는 실시예 1 에 기재된 바와 같이 AlphaScreen SureFire IKKα(phospho-Ser-176/180) 검독값을 이용해 검출했다. Compound C, Compound A 및 Compound B 에 대한 제 2 의 실험은 24 시간의 시점에서만 실험했다. 동일한 화합물에 대해, 세포 생존력 검정을 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, 카탈로그 번호 G7570) 을 이용해 실시했다. 간략하게, 형질주입된 HEK 세포는 NIK 저해제 활성에 대해 시험할 후보자 화합물의 존재 하에 배양했다. 배지 제거 후, 형질주입된 HEK 세포를 해리시켰다. 검정 키트에 제공된 10 ㎕ 의 CellTiter-Glo 시약을 세포 해리물을 포함하는 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30 분간 인큐베이션했다. 이어서, 플레이트를 Envision 2103 Multilabel Reader 를 이용해 검독했다. CellTiter-Glo 검정은 대사적으로 활성인 세포가 존재함을 나타내는 ATP 의 존재량을 정량함으로써 배양 내 살아있는 세포 수를 결정할 수 있게 해 준다.
결과
첫번째 실험의 결과를 도 4(A) 및 (B) 에 제시한다. Compound C 는 해당 검정에서 불활성인 반면, Compound A 및 Compound B 는 hNIK1-fl-wt-FlagN 저해제로 나온 것에 유의할 만하다. 수니티닙 (Sunitinib) 은 AlphaScreen Signal 을 저해하는 것으로 나타나지 않았다. 상기 결과는 실험 2 에서 확인되었다, 도 4(C) 참조. 상기 화합물들에 대한 투여량-응답 곡선은 기울기, 최소 및 최대 AlphaScreen 신호에서 명확하다.
화합물들을 또한 도 4(D) 에 제시된 세포 생존력 검정에서 평가했다. 10 μM 미만의 시험 화합물 농도에서는 신호 변화가 관찰되지 않아서, 도 4(A), (B) 및 (C) 에 제시된 유효성은 화합물 세포독성 때문이 아니라는 점을 시사한다.
실시예 5: jetPEI 형질주입된 HEK 세포의 DMSO 용인능
37℃ 및 5% CO2 에서 24 시간 동안 인큐베이션하여 DMSO 에 노출되었을 때의 HEK 세포의 생존력을 조사했다.
재료 및 방법
형질주입된 HEK 세포 (10,000 세포/웰로 50 ㎕) 를 37℃ 및 5% CO2 에서 24 시간 동안 384 웰 마이크로타이터 플레이트 중의 0 내지 10% v/v DMSO 에 노출시켰다. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay 을 실시예 4 에 기재된 바와 같이 실시했다.
결과
상기 실험으로부터의 결과를 도 5 에 제시한다.
도 5 에 제시된 결과는 형질주입된 HEK 세포가 세포 생존력 손실을 최소화하여 24 시간 동안 0.5% v/v 까지의 DMSO 에 대한 노출을 용인할 수 있음을 보여준다.
실시예 6: Z' 및 AlphaScreen 신호 안정성 결정
Z' 및 AlphaScreen 신호 안정성을 결정했다.
재료 및 방법
HEK 세포 기반의 검정을 384 웰 마이크로타이터 플레이트에서 실시했다. 각 플레이트는 총 2,240 가지의 스크리닝할 시험 화합물 (ChemBridge Library) 을 10 μM 로 포함하는 4 개의 대조군 컬럼 (64 웰) 및 20 개의 컬럼 (320 웰) 을 포함했다.
음성 대조군 (높은 대조군) 으로서, 0.1% v/v DMSO 를 32 개의 웰에 첨가했다. 도 18 에 도시된 플레이트 레이아웃을 이용해 10 μM 의 Compound A 를 양성 저 대조군 (100% 저해) 으로서 16 개의 웰에 첨가하고, 1 M Compound A 를 양성 중 대조군 (50% 저해) 으로서 16 개의 웰에 첨가했다.
신호 검출을 3 시간 및 16 시간 후 상기에 기재된 바와 같이 AlphaScreen SureFire 검독값을 이용해 수득했다.
결과
상기 실험 결과를 도 6 에 제시한다.
Z' 는 AlphaScreen 검출 시약의 첨가 3 시간 및 16 시간 후 모두 0.5 를 초과했다.
실시예 7: 마이크로타이터 플레이트에서의 DMSO 및 대조군 화합물
HEK 세포 기반의 검정을 2,240 가지 시험 화합물에 노출시키기 전에, 검정 성능을 중, 저 및 고 대조군과 함께 DMSO 웰을 포함하는 마이크로타이터 플레이트에서 시험했다.
재료 및 방법
실시예 6 에 기재된 검정 프로토콜을 실시했다. 플레이트 레이아웃은 도 18 에 제시한다. 중 및 저 대조군 웰은 각각 1 mM 및 10 mM 의 Compound A 를 포함했다. 고 대조군 웰 및 352 개의 시험 웰은 0.1% v/v DMSO 를 포함했다.
결과
도 7(A) 에 제시된 결과는 HEK 세포 기반의 검정 성능이 Z' 이 0.5 를 초과하여 허용가능하다는 점을 증명한다. 마이크로타이터의 DMSO 웰의 분석은 액체 취급에서의 변동으로 인한 거짓 양성이 비교적 적다는 것을 보여준다, 도 7(B) 참조.
실시예 8: 2,240 개 시험 화합물의 미니스크린 (n=1 및 n=2)
재료 및 방법
실시예 4 에 기재된 검정 프로토콜을 도 18 의 스크리닝 레이아웃을 이용해 따라갔다. 14 개의 384 웰 마이크로타이터 플레이트를 스크리닝하여 두 벌의 데이터 셋을 제공했다. 각각의 마이크로타이터 플레이트가 352 가지 시험 화합물을 포함했다. 동일한 날에 두번씩의 검정을 실시했고, 이들은 검정의 재현성 평가를 가능케 할 독립적 데이터였다.
결과
상기 실험 결과들을 도 8 내지 11 에 제시한다.
도 9 에 제시된 결과는 n=1 및 n=2 데이터 셋트 사이의 우수한 상관관계를 보여준다. 고 대조군에서는 중 및 저 대조군에서보다 더 높은 변동량이 관찰되었다. 모든 플레이트로부터의 데이터는 플레이트 (X-축), 저해 (n=1) (Y-축) 및 저해 (n=2) (Z-축) 의 3-D 플롯으로 가시화했으며, 도 10 을 참조.
도 11 에 제시된 결과는 백분율 저해 역치 증가가 두 시험 상황에서 활성인 힛의 가능성을 높여준다는 것을 나타낸다. 50% 저해 역치에서는, 65% 의 힛이 두 시험 상황에서 활성이었다. 70% 저해 역치에서는, 81% 의 힛이 두 시험 상황에서 활성이었다. 90% 저해 역치에서는, 모든 힛이 n=1 및 n=2 시험 상황에서 모두 활성이었다.
실시예 9: CellTiter - Glo 검정에서의 힛 화합물 평가
세포독성 및 검정 간섭 유효성으로 인한 힛트를 식별해 내기 위해 스크리닝을 실시했다. 총 21 개의 힛 (50% 초과의 저해를 제공하는 화합물) 을 CellTiter-Glo 검정에서 프로파일링했다.
재료 및 방법
CellTiter-Glo Luminescent 세포 생존력 검정을 실시예 4 에 기재된 바와 같이 실시했다.
결과
CellTiter-Glo 검정에서, 21 가지의 힛 화합물들이 일정 범위의 세포독성 프로파일을 나타냈다 (도 12 참조). HEK 세포 기반의 검정 결과에서의 평균 NIK 저해와 세포독성 사이의 상관관계를 도 13(A) 에 제시한다.
도 13(B) 에 제시한 결과는 HEK 세포 기반의 검정에서 힛이었던 21 개 화합물 대부분이 유의할 세포독성 효과를 나타냈음을 보여준다. 따라서, 상기 화합물들은 진짜 NIK 저해제가 아닐 것이다.
NIK 저해가 50% 를 초과하며, 세포독성이 50% 미만인 프로파일을 나타낸 9 가지 화합물들의 구조를 도 14 에 제시한다.
결론적으로, 평가한 21 가지 화합물들 중, 9 가지 화합물들은 hNIK1-fl-wt-FlagN 저해가 50% 초과이며, 세포독성이 50% 미만인 프로파일을 나타냈다. 현 HEK 세포 기반의 검정은 세포독성을 나타내지 않는 것으로 나타난 NIK 활성 (IKK1-KD-FlagN 기질에 대한 것임) 의 추정 저해제를 검출할 수 있다.
실시예 10: 2,240 개의 화합물 스크리닝에서의 HEK 세포 기반의 검정 (n=3)
재료 및 방법
스크리닝을 상기 기재된 바와 같이 반복했다.
결과
상기 실험들로부터의 결과를 도 15 내지 17 에 제시한다.
스크리닝한 7 개의 마이크로타이터 플레이트 중에서 한 개가, 플레이트의 좌측/우측 상의 대조군 집단에서 예측된 변량보다 더 커서 예측보다 더 낮은 Z' 0.35 를 나타냈다. 나머지 여섯 플레이트는 0.59 를 초과하는 Z' 를 나타냈다. 도 13(B) 에서 활성으로 나타났던 전체 21 가지의 힛 화합물 (hit compounds) 은 n = 3 인 데이터 셋트에서 유사한 경향성을 나타냈다, 도 16(B) 참조.
힛 (hits) 의 재현성을 결정하기 위해 세개씩 있는 데이터 셋트에 대해 플레이트별로 분석을 실시했다, 도 17 참조.
도 17 에서의 데이터는 5 개의 플레이트에 대해 기대하던 Z' 보다 낮긴 했지만, 대부분의 활성 화합물들이 일반적으로 재현가능하다는 점을 시사한다.
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Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Lys Pro Leu Pro Arg Thr Pro Glu Gln Glu Ser Cys Thr Ile 165 170 175 Pro Val Gln Glu Asp Glu Ser Pro Leu Gly Ala Pro Tyr Val Arg Asn 180 185 190 Thr Pro Gln Phe Thr Lys Pro Leu Lys Glu Pro Gly Leu Gly Gln Leu 195 200 205 Cys Phe Lys Gln Leu Gly Glu Gly Leu Arg Pro Ala Leu Pro Arg Ser 210 215 220 Glu Leu His Lys Leu Ile Ser Pro Leu Gln Cys Leu Asn His Val Trp 225 230 235 240 Lys Leu His His Pro Gln Asp Gly Gly Pro Leu Pro Leu Pro Thr His 245 250 255 Pro Phe Pro Tyr Ser Arg Leu Pro His Pro Phe Pro Phe His Pro Leu 260 265 270 Gln Pro Trp Lys Pro His Pro Leu Glu Ser Phe Leu Gly Lys Leu Ala 275 280 285 Cys Val Asp Ser Gln Lys Pro Leu Pro Asp Pro His Leu Ser Lys Leu 290 295 300 Ala Cys Val Asp Ser Pro Lys Pro Leu Pro Gly Pro His Leu Glu Pro 305 310 315 320 Ser Cys Leu Ser Arg Gly Ala His Glu Lys Phe Ser Val Glu Glu Tyr 325 330 335 Leu Val His Ala Leu Gln Gly Ser Val Ser Ser Gly Gln Ala His Ser 340 345 350 Leu Thr Ser Leu Ala Lys Thr Trp Ala Ala Arg Gly Ser Arg Ser Arg 355 360 365 Glu Pro Ser Pro Lys Thr Glu Asp Asn Glu Gly Val Leu Leu Thr Glu 370 375 380 Lys Leu Lys Pro Val Asp Tyr Glu Tyr Arg Glu Glu Val His Trp Ala 385 390 395 400 Thr His Gln Leu Arg Leu Gly Arg Gly Ser Phe Gly Glu Val His Arg 405 410 415 Met Glu Asp Lys Gln Thr Gly Phe Gln Cys Ala Val Lys Lys Val Arg 420 425 430 Leu Glu Val Phe Arg Ala Glu Glu Leu Met Ala Cys Ala Gly Leu Thr 435 440 445 Ser Pro Arg Ile Val Pro Leu Tyr Gly Ala Val Arg Glu Gly Pro Trp 450 455 460 Val Asn Ile Phe Met Glu Leu Leu Glu Gly Gly Ser Leu Gly Gln Leu 465 470 475 480 Val Lys Glu Gln Gly Cys Leu Pro Glu Asp Arg Ala Leu Tyr Tyr Leu 485 490 495 Gly Gln Ala Leu Glu Gly Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Arg Ile Leu 500 505 510 His Gly Asp Val Lys Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Ser Asp Gly Ser 515 520 525 His Ala Ala Leu Cys Asp Phe Gly His Ala Val Cys Leu Gln Pro Asp 530 535 540 Gly Leu Gly Lys Ser Leu Leu Thr Gly Asp Tyr Ile Pro Gly Thr Glu 545 550 555 560 Thr His Met Ala Pro Glu Val Val Leu Gly Arg Ser Cys Asp Ala Lys 565 570 575 Val Asp Val Trp Ser Ser Cys Cys Met Met Leu His Met Leu Asn Gly 580 585 590 Cys His Pro Trp Thr Gln Phe Phe Arg Gly Pro Leu Cys Leu Lys Ile 595 600 605 Ala Ser Glu Pro Pro Pro Val Arg Glu Ile Pro Pro Ser Cys Ala Pro 610 615 620 Leu Thr Ala Gln Ala Ile Gln Glu Gly Leu Arg Lys Glu Pro Ile His 625 630 635 640 Arg Val Ser Ala Ala Glu Leu Gly Gly Lys Val Asn Arg Ala Leu Gln 645 650 655 Gln Val Gly Gly Leu Lys Ser Pro Trp Arg Gly Glu Tyr Lys Glu Pro 660 665 670 Arg His Pro Pro Pro Asn Gln Ala Asn Tyr His Gln Thr Leu His Ala 675 680 685 Gln Pro Arg Glu Leu Ser Pro Arg Ala Pro Gly Pro Arg Pro Ala Glu 690 695 700 Glu Thr Thr Gly Arg Ala Pro Lys Leu Gln Pro Pro Leu Pro Pro Glu 705 710 715 720 Pro Pro Glu Pro Asn Lys Ser Pro Pro Leu Thr Leu Ser Lys Glu Glu 725 730 735 Ser Gly Met Trp Glu Pro Leu Pro Leu Ser Ser Leu Glu Pro Ala Pro 740 745 750 Ala Arg Asn Pro Ser Ser Pro Glu Arg Lys Ala Thr Val Pro Glu Gln 755 760 765 Glu Leu Gln Gln Leu Glu Ile Glu Leu Phe Leu Asn Ser Leu Ser 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Gln His Arg Glu Leu Asp Leu Lys Ile Ala Ile Ala Ser Cys Arg Leu 35 40 45 Glu Leu Ser Thr Lys Asn Arg Glu Arg Trp Cys His Glu Ile Gln Ile 50 55 60 Met Lys Lys Leu Asn His Ala Asn Val Val Lys Ala Cys Asp Val Pro 65 70 75 80 Glu Glu Leu Asn Ile Leu Ile His Asp Val Pro Leu Leu Ala Met Glu 85 90 95 Tyr Cys Ser Gly Gly Asp Leu Arg Lys Leu Leu Asn Lys Pro Glu Asn 100 105 110 Cys Cys Gly Leu Lys Glu Ser Gln Ile Leu Ser Leu Leu Ser Asp Ile 115 120 125 Gly Ser Gly Ile Arg Tyr Leu His Glu Asn Lys Ile Ile His Arg Asp 130 135 140 Leu Lys Pro Glu Asn Ile Val Leu Gln Asp Val Gly Gly Lys Ile Ile 145 150 155 160 His Lys Ile Ile Asp Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Val Asp Gln Gly Ser 165 170 175 Leu Cys Thr Ser Phe Val Gly Thr Leu Gln Tyr Leu Ala Pro Glu Leu 180 185 190 Phe Glu Asn Lys Pro Tyr Thr Ala Thr Val Asp Tyr Trp Ser Phe Gly 195 200 205 Thr Met Val Phe Glu Cys Ile Ala Gly Tyr Arg Pro Phe Leu His His 210 215 220 Leu Gln Pro Phe Thr Trp His Glu Lys Ile Lys Lys Lys Asp Pro Lys 225 230 235 240 Cys Ile Phe Ala Cys Glu Glu Met Ser Gly Glu Val Arg Phe Ser Ser 245 250 255 His Leu Pro Gln Pro Asn Ser Leu Cys Ser Leu Val Val Glu Pro Met 260 265 270 Glu Asn Trp Leu Gln Leu Met Leu Asn Trp Asp Pro Gln Gln Arg Gly 275 280 285 Gly Pro Val Asp Leu Thr Leu Lys Gln Pro Arg Cys Phe Val Leu Met 290 295 300 Asp His Ile Leu Asn Leu Lys Ile Val His Ile Leu Asn Met Thr Ser 305 310 315 320 Ala Lys Ile Ile Ser Phe Leu Leu Pro Pro Asp Glu Ser Leu His Ser 325 330 335 Leu Gln Ser Arg Ile Glu Arg Glu Thr Gly Ile Asn Thr Gly Ser Gln 340 345 350 Glu Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Ser Leu Asp Pro Arg Lys Pro Ala 355 360 365 Ser Gln Cys Val Leu Asp Gly Val Arg Gly Cys Asp Ser Tyr Met Val 370 375 380 Tyr Leu Phe Asp Lys Ser Lys Thr Val Tyr Glu Gly Pro Phe Ala Ser 385 390 395 400 Arg Ser Leu Ser Asp Cys Val Asn Tyr Ile Val Gln Asp Ser Lys Ile 405 410 415 Gln Leu Pro Ile Ile Gln Leu Arg Lys Val Trp Ala Glu Ala Val His 420 425 430 Tyr Val Ser Gly Leu Lys Glu Asp Tyr Ser Arg Leu Phe Gln Gly Gln 435 440 445 Arg Ala Ala Met Leu Ser Leu Leu Arg Tyr Asn Ala Asn Leu Thr Lys 450 455 460 Met Lys Asn Thr Leu Ile Ser Ala Ser Gln Gln Leu Lys Ala Lys Leu 465 470 475 480 Glu Phe Phe His Lys Ser Ile Gln Leu Asp Leu Glu Arg Tyr Ser Glu 485 490 495 Gln Met Thr Tyr Gly Ile Ser Ser Glu Lys Met Leu Lys Ala Trp Lys 500 505 510 Glu Met Glu Glu Lys Ala Ile His Tyr Ala Glu Val Gly Val Ile Gly 515 520 525 Tyr Leu Glu Asp Gln Ile Met Ser Leu His Ala Glu Ile Met Glu Leu 530 535 540 Gln Lys Ser Pro Tyr Gly Arg Arg Gln Gly Asp Leu Met Glu Ser Leu 545 550 555 560 Glu Gln Arg Ala Ile Asp Leu Tyr Lys Gln Leu Lys His Arg Pro Ser 565 570 575 Asp His Ser Tyr Ser Asp Ser Thr Glu Met Val Lys Ile Ile Val His 580 585 590 Thr Val Gln Ser Gln Asp Arg Val Leu Lys Glu Leu Phe Gly His Leu 595 600 605 Ser Lys Leu Leu Gly Cys Lys Gln Lys Ile Ile Asp Leu Leu Pro Lys 610 615 620 Val Glu Val Ala Leu Ser Asn Ile Lys Glu Ala Asp Asn Thr Val Met 625 630 635 640 Phe Met Gln Gly Lys Arg Gln Lys Glu Ile Trp His Leu Leu Lys Ile 645 650 655 Ala Cys Thr Gln Ser Ser Ala Arg Ser Leu Val Gly Ser Ser Leu Glu 660 665 670 Gly Ala Val Thr Pro Gln Thr Ser Ala Trp Leu Pro Pro Thr Ser Ala 675 680 685 Glu His Asp His Ser Leu Ser Cys Val Val Thr Pro Gln Asp Gly Glu 690 695 700 Thr Ser Ala Gln Met Ile Glu Glu Asn Leu Asn Cys Leu Gly His Leu 705 710 715 720 Ser Thr Ile Ile His Glu Ala Asn Glu Glu Gln Gly Asn Ser Met Met 725 730 735 Asn Leu Asp Trp Ser Trp Leu Thr Glu 740 745

Claims (7)

  1. 하기 단계를 포함하는, NIK 활성을 저해하는 화합물의 식별 방법:
    (a) NIK 를 인코딩하는 DNA 및 IKK1-KD 를 인코딩하는 DNA 를 포함하는 HEK 세포 (형질주입된 HEK 세포) 를 배양 배지에 제공하는 단계;
    (b) 상기 형질주입된 HEK 세포를 시험할 후보자 분자의 존재 및 부재 하에 37℃ +/- 2℃ 의 온도에서 5% CO2 의 존재 하에 24 시간 동안 인큐베이션하는 단계;
    (c) 배양 배지를 제거하는 단계;
    (d) 세포를 해리하는 단계;
    (e) 세포 해리물에 인수자 복합체에 이어 공여자 복합체를 첨가하는 단계;
    (f) 세포 해리물을 레이저 발광을 이용해 여기시키는 단계, 및
    (g) 세포 해리물의 레이저 여기시 나오는 신호를 비드 기반의 발광 근접성 검출 시스템을 이용해 측정하는 단계,
    여기서, 시험 화합물의 존재 하에 배양된 형질주입된 HEK 세포로부터 유도된 세포 해리물로부터 수득되는 신호의 감소 또는 부재는 IKK1-KD 의 NIK-매개 인산화 저해의 표식이며, 여기서 인수자 복합체는 분자-코팅된 비드 및 IKK1-KD 단백질에 결합하는 결합 파트너를 포함하고, 공여자 복합체는 분자-코팅된 비드 및 IKK1-KD 단백질에 결합하는 결합 파트너를 포함함.
  2. 제 1 항에 있어서, 시험 화합물의 부재 하에 배양된 형질주입된 HEK 세포로부터 유도된 세포 해리물로부터 수득된 신호에 비해, 시험 화합물의 존재 하에 배양된 형질주입된 HEK 세포로부터 유도되는 세포 해리물로부터 수득되는 신호의 감소가 IKK1-KD 의 NIK-매개 인산화 감소의 표식인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, NIK 를 인코딩하는 DNA 및 IKK1-KD 를 인코딩하는 DNA 가 상기 HEK 세포를 NIK 를 인코딩하는 DNA 를 포함하는 제 1 발현 벡터 및 IKK1-KD 를 인코딩하는 DNA 를 포함하는 제 2 발현 벡터를 이용해 형질주입함으로써 HEK 세포로 삽입되는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 인수자 복합체의 분자-코팅된 비드가 Protein-A 코팅된 비드이고, 인수자 복합체의 결합 파트너가 IKK1-KD 의 Ser-176 잔기의 인산화된 형태에 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 공여자 복합체의 분자-코팅된 비드가 스트렙타비딘-코팅된 비드이고, 공여자 복합체의 결합 파트너가 IKK1-KD 에 결합하는 바이오틴화된 항체인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 비드 기재의 발광 근접성 검출 시스템이 AlphaScreen 검출 시스템인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 검정에서 NIK 저해 활성을 나타내는 후보자 분자들을 시험하여, NIK 저해 활성을 갖고 있지만 세포독성 효과와 연관되어 있는 후보자 분자들을 세포독성 효과와 무관하면서 NIK 저해 활성을 가진 후보자 분자와 구분하도록 하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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