KR20140044325A - 삭시톡신 생성 와편모조류의 검출 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 삭시톡신 분야 및 삭시톡신을 생성할 수 있는 미생물의 동정에 관한 것이다. 특히, 촉매 도메인 서열들인 삭시톡신 A1(sxtA1) 및 삭시톡신 A4(sxtA4)를 포함하는 삭시톡신 A(sxtA) 유전자는 다수의 와편모조류 종에서 동정된다. 본 발명은 sxtA 유전자의 증폭 및 검출에 의해(특히 PCR에 의해) 삭시톡신 생성 와편모조류를 검출하는 방법에 관한 것이며, 이 방법에서 사용하기 위한 키트 및 프라이머도 개시된다. 본 방법에 의해 검출되는 삭시톡신 생성 와편모조류 속은 알렉산드륨(Alexandrium), 피로디늄(Pyrodinium) 또는 김노디늄(Gymnodinium)을 포함한다.

Description

삭시톡신 생성 와편모조류의 검출{DETECTION OF SAXITOXIN-PRODUCING DINOFLAGELLATES}
교차 참조에 의한 포함
본 출원은 2011년 5월 16일에 출원된 미국 가출원 제61/486,633호의 우선권을 주장하는데, 상기 미국 가출원의 전체 내용은 본원에 교차 참조에 의해 포함된다.
일반적으로 본 발명은 삭시톡신 분야 및 이를 생성할 수 있는 미생물의 동정에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 와편모조류(dinoflagellate)에서 삭시톡신을 코딩하는 유전자의 동정 및 삭시톡신의 생성자인 와편모조류의 특정 검출 방법에 관한 것이다.
삭시톡신(STX: saxitoxin)은 전세계의 수생 환경에서 나타나는 강한 신경독소이며, 상당한 경제적, 환경적 및 인간 건강적 영향을 미친다. 벡터 종의 섭취는 마비 및 사망을 초래할 수 있는 중증 인간 질병인 마비성 패독을 초래할 수 있다. 사망률이 15%인 인간 마비성 패독의 추정된 2000가지의 사례가 전새계적으로 매년 일어난다. STX의 모니터링 및 경감 비용은 미국 달러화로 8억 9500만달러로 계산되는, 유해 플랑크톤 대발생에 의한 연중 경제적 손실을 초래하였다. 담수 환경에서, STX는 원핵생물 시아노박테리아(시아노박테리아)에 의해 주로 생성된다. 그러나, 해양 환경에서, 진핵생물 와편모조류가 STX의 존재와 결부되었다. 다수의 와편모조류 종과 STX 생성의 결부에도 불구하고, 이들 미생물에서의 STX의 생성에 대한 유전적 기초는 여전히 알기 어렵다.
해양 샘플에서 STX 생성 와편모조류의 존재(또는 부재)를 검출하는 방법이 필요하다.
발명의 개요
효소적 특성화, PCR 접근법, 발현 서열 태그(expressed sequence tag, EST) 라이브러리의 인실리코(in silico) 분석, 또는 다른 공개적으로 이용가능한 뉴클레오티드 서열의 이용에 의해 와편모조류에서 STX 경로의 유전자 및/또는 효소를 확인하려고 시도된 다수의 연구는 성공적이지 못하였다. 게다가, 이전의 몇몇의 연구는 STX가 실제로는 와편모조류에 의해서가 아니라 이것 대신 동시 배양된 박테리아에 의해 생성될 수 있음을 시사하였다.
본 발명자는 와편모조류가 실제로 STX의 생성자임을 결정하였으며, 이들 미생물에서 STX 생성에 책임이 있는 유전자를 동정하였다. STX 생성에 책임이 있는 유전자의 확인은 담수 환경 및 해양 환경 둘 모두에 있어서 STX 생성 와편모조류를 검출하는 다수의 분자적 테스트의 기초를 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명은 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류를 검출하는 방법을 제공하며, 본 방법은
본 방법에서 사용하기 위한 샘플을 수득하는 단계, 및
와편모조류 삭시톡신 A 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 중 하나 이상의 존재에 대하여 샘플을 분석하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 존재는 샘플에서의 삭시톡신 생성 와편모조류의 존재를 나타낸다.
제2 측면에서, 본 발명은 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류의 부재를 결정하는 방법을 제공하며, 본 방법은
본 방법에서 사용하기 위한 샘플을 수득하는 단계, 및
와편모조류 삭시톡신 A 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 중 하나 이상의 존재에 대하여 샘플을 분석하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 부재는 샘플에서의 삭시톡신 생성 와편모조류의 부재를 나타낸다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5-197, 224-227, 230-242 및 247 중 임의의 하나에 개시된 것으로부터 선택되는 삭시톡신 A 뉴클레오티드 서열 또는 상기 서열들 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함한다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 삭시톡신 A1 촉매 도메인 서열, 삭시톡신 A4 촉매 도메인 서열, 또는 이들의 단편을 포함한다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 삭시톡신 A4 촉매 도메인 서열 또는 이의 단편은 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3115-4121, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3597-3721, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함한다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 삭시톡신 A4 촉매 도메인 서열 또는 이의 단편은 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3115-4121, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3597-3721, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 삭시톡신 A1 촉매 도메인 서열은 서열 번호 1에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 160-1821, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 277-2022, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함한다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 삭시톡신 A1 촉매 도메인 서열은 서열 번호 1에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 160-1821, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 277-2022, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 상기 분석 단계는 폴리머라아제 연쇄 반응에 의해 샘플로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 것을 포함한다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 폴리머라아제 연쇄 반응은 서열 번호 198 또는 서열 번호 199에 개시된 서열, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함하는 하나 이상의 프라이머를 이용한다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 폴리머라아제 연쇄 반응은 서열 번호 198 또는 서열 번호 199에 개시된 서열, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 하나 이상의 프라이머를 이용한다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 폴리머라아제 연쇄 반응은 서열 번호 198-199, 200-211, 220-223, 228-229, 및 243-244 중 임의의 하나에 개시된 서열, 또는 상기 서열들 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 하나 이상의 프라이머를 이용한다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 개시된 삭시톡신 A의 아미노산 서열, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함한다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 개시된 삭시톡신 A의 아미노산 서열, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 삭시톡신 생성 와편모조류는 알렉산드륨(Alexandrium), 피로디늄(Pyrodinium) 또는 김노디늄(Gymnodinium) 속 유래의 것이다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 삭시톡신 생성 와편모조류는 에이. 카테넬라(A. catenella), 에이. 푼디엔세(A. fundyense), 에이. 루시타니쿰(A lusitanicum), 에이. 미누툼(A. minutum), 에이. 오스텐펠디이(A. ostenfeldii), 에이. 타마렌세(A. tamarense), 지. 카테나툼(G. catenatum), 및 피. 바하멘세 바 콤프레숨(P. bahamense var compressum)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1 또는 제2 측면의 일 실시양태에서, 상기 분석은 제11 또는 제12 측면의 프라이머쌍을 이용하여 수행된다.
제3 측면에서, 본 발명은 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류를 검출하는 키트를 제공하며, 본 키트는 와편모조류 삭시톡신 A 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 존재를 검출하는 하나 이상의 에이전트(agent)를 포함한다.
제4 측면에서, 본 발명은 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류의 부재를 결정하는 키트를 제공하며, 본 키트는 와편모조류 삭시톡신 A 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 존재를 검출하는 하나 이상의 에이전트를 포함한다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 에이전트는 서열 번호 5-197, 224-227, 230-242 및 247 중 임의의 하나에 개시된 것으로부터 선택되는 삭시톡신 A 뉴클레오티드 서열 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 에이전트는 삭시톡신 A1 촉매 도메인 서열, 삭시톡신 A4 촉매 도메인 서열 또는 이들의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 삭시톡신 A4 촉매 도메인 서열 또는 이의 단편은 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3115-4121, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3597-3721 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함한다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 삭시톡신 A4 촉매 도메인 서열 또는 이의 단편은 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3115-4121, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3597-3721 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 삭시톡신 A1 촉매 도메인 서열은 서열 번호 1에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 160-1821, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 277-2022 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함한다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 삭시톡신 A1 촉매 도메인 서열은 서열 번호 1에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 160-1821, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 277-2022 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 에이전트는 프라이머, 프로브 또는 항체이다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 에이전트는 서열 번호 198 또는 서열 번호 199에 개시된 서열 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함하는 프라이머이다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 에이전트는 서열 번호 198 또는 서열 번호 199에 개시된 서열 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체로 이루어진 프라이머이다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 에이전트는 서열 번호 198-199, 200-211, 220-223, 228-229, 및 243-244 중 임의의 하나에 개시된 서열, 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 프라이머이다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 에이전트는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 개시된 삭시톡신 A 아미노산 서열, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체에 특이적으로 결합한다.
제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 키트는 2가지의 에이전트를 포함하며, 여기서, 상기 2가지의 에이전트는 제11 또는 제12 측면의 프라이머쌍이다.
제1, 제2, 제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 샘플은 환경 샘플이다.
제1, 제2, 제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 해수 샘플이다.
제1, 제2, 제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 샘플은 담수 샘플이다.
제1, 제2, 제3 또는 제4 측면의 일 실시양태에서, 샘플은 해양 샘플이다.
제5 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1에 개시된 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
제5 측면의 일 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1에 개시된 서열 또는 이의 변이체 또는 단편으로 이루어진다.
제6 측면에서, 본 발명은 서열 번호 3에 개시된 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
제6 측면의 일 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3에 개시된 서열 또는 이의 변이체 또는 단편으로 이루어진다.
제7 측면에서, 본 발명은 서열 번호 5-197, 224-227, 230-242 및 247 중 임의의 하나에 개시된 서열 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 변이체 또는 단편을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
제7 측면의 일 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5-197, 224-227, 230-242 및 247 중 임의의 하나에 개시된 서열 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 변이체 또는 단편으로 이루어진다.
제8 측면에서, 본 발명은 제5, 제6 또는 제7 측면에 따른 폴리뉴클레오티드 중 임의의 하나에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
제9 측면에서, 본 발명은 제5, 제6 또는 제7 측면에 따른 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 제공한다.
제10 측면에서, 본 발명은 제8 측면에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
제11 측면에서, 본 발명은 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류를 검출하는 프라이머쌍을 제공하며, 여기서, 상기 프라이머쌍은 서열 번호 198의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 번호 199의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 제2 프라이머를 포함한다.
제11 측면의 일 실시양태에서, 프라이머쌍은 서열 번호 198의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편 또는 변이체로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호 199의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편 또는 변이체로 이루어진 제2 프라이머를 포함한다.
제12 측면에서, 본 발명은 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류를 검출하는 프라이머쌍을 제공하며, 여기서, 상기 프라이머쌍은 하기를 포함한다:
서열 번호 198의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 199의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
서열 번호 200의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 201의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
서열 번호 202의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 203의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
서열 번호 204의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 205의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
서열 번호 206의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 207의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
서열 번호 208의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 209의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
서열 번호 210의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 211의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
서열 번호 220의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 221의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
서열 번호 222의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 223의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
서열 번호 228의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 229의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
서열 번호 243의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 244의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머.
이제, 본 발명의 바람직한 실시양태를 첨부된 도면을 참고하여 단지 예로서 설명하며, 여기서,
도 1은 와편모조류 및 시아노박테리아에서의 sxtA의 구조를 나타내는 다이어그램이다. A. 에이. 푼디엔세 CCMP1719에서의 sxtA 전사체의 전사체 구조. B. 씨. 라시보르스키이(C. raciborskii) T3의 게놈 sxtA 구조. C. 볼드체로 마킹된 sxtA에 의해 도입된 분자 및 결합을 갖는 STX의 구조.
도 2는 에이. 푼디엔세 sxtA 전사체 및 시아노박테리아 sxtA 유전자의 GC 함량을 나타내는 그래프이다. GC 함량은 윈도(window) 크기를 1000 bp로 하여 매 10 bp마다 계산하였다.
도 3은 SxtA1 계통수를 나타낸다. 축척으로 그려진 개략도(완전한 계통수에 대해서는 도 5 참조). 최대 가능성의 토폴로지(topology)가 도시되어 있다. 노드 상의 숫자는 각각 최대 가능성 및 베이지안 분석(Ba예ian analysis)의 부트스트랩(bootstrap) 값을 나타낸다.
도 4a는 SxtA4 계통수를 나타낸다. 축척대로 그려진 계통수의 개략도(완전한 계통수에 대해서는 도 6 참조). 최대 가능성의 토폴로지가 도시되어 있다. 노드 상의 숫자는 각각 최대 가능성 및 베이지안 분석의 부트스트랩 값을 나타낸다.
도 4b는 성장 주기 동안 3개의 상이한 시점에서의 에이. 카테넬라 ACSH02에서의 sxtA4의 게놈 카피수를 나타내는 그래프이다.
도 5는 SxtA1 계통수를 나타낸다. 최대 가능성의 토폴로지가 도시되어 있다. 노드 상의 숫자는 각각 최대 가능성 및 베이지안 분석의 부트스트랩 값을 나타낸다. 볼드체의 서열은 전사체 유래된 서열이거나; RACE를 이용하여 생성되거나 또는 454 판독 어셈블리(assembly)로부터의 콘틱(contig)이다.
도 6은 SxtA4 계통수를 나타낸다. 최대 가능성의 토폴로지가 도시되어 있다. 노드 상의 숫자는 각각 최대 가능성 및 베이지안 분석의 부트스트랩 값을 나타낸다. 볼드체의 서열은 전사체 유래된 서열이거나; RACE를 이용하여 생성되거나 또는 454 판독 어셈블리로부터의 콘틱이다.
도 7은 실시예 2로 언급되는 식물 플랑크톤 및 에스. 글로메라타(S. glomerata)의 샘플링 장소를 나타내는 지도이다. A. 호주 뉴사우스웨일즈, 및 대발생체가 샘플링된 3군데의 어귀: B. 브리즈번 워터, C. 조지스 리버(Georges River) 및 D. 와공가만. D에서의 축척 막대는 삽도 지도 B, C 및 D에서 1 km를 나타낸다.
도 8은 공지된 수의 3가지의 대수기 성장 알렉산드륨 카테넬라 주의 세포로부터의 DNA의 희석을 기초로 한 sxtA4 프라이머쌍의 표준 곡선을 나타내는 그래프이다. 분석물은 상이한 주들에 있어서 30-2600개의 세포를 나타내는 DNA 농도를 사용하여 테스트되었다.
도 9는 2010년 11월 동안 A. 조지스 리버 및 B. 와공가만 샘플링 장소에서의 현미경에 의한 세포 동정 계수치와, LSU rDNA 프라이머쌍을 사용한 qPCR을 기초로 하여 sxtA4 유전자 카피의 풍부함 (일차 y축) 및 알렉산드륨 카테넬라 세포의 개산치(이차 y축)를 나타내는 두 그래프를 제공한다.
도 10은 상기 샘플링 장소에서의 매주의 광학 현미경 하에서의 수동 계수를 이용하여 결정된 리터당 알렉산드륨 카테넬라의 세포 및 sxtA4의 수 또는 카피를 나타내는 그래프를 제공한다.
도 11은 알렉산드륨 카테넬라 세포의 풍부함과 sxtA4 카피 사이의 회귀 방정식을 나타내는 그래프를 제공한다.
도 12는 알렉산드륨 타마렌세 ATNWB01의 SEM 영상을 나타낸다. A) 복면도, 이때 세포막은 온전하며, 일반적인 세포 크기 및 형상을 나타냄, 축척 막대 = 5 ㎛, B) 배면도(Dorsal view), 이때 세포막은 온전하며, 세포 형상을 나타냄, 축척 막대 = 10 ㎛, C) 첨부 단면도(apical view)에서의 에피콘(epicone), 1개의 판 상에서 APC 및 기공을 나타냄, 축척 막대 = 5 ㎛, D) 반대쪽 첨부 단면도에서의 하각(hypocone), 판 패턴을 나타냄, 축척 막대 = 10 ㎛, E) 첨부 기공 복합체, 콤마의 형상을 나타냄, F) 후측 열구 판, 기공을 나타냄, 축척 막대 = 2 ㎛.
도 13은 알렉산드륨 타마렌세 ATCJ33, ATEB01, 및 ATBB01 주의 SEM 영상을 나타낸다(비교를 위하여, 문헌[Hallegraeff et al 1991]으로부터 취해짐). A-D, ATCJ33, A) 2개의 세포의 사슬, 및 일반적인 세포 크기 및 형상을 나타내는 ATCJ33, 축척 막대 = 10 ㎛, B) 복측 기공을 나타내는 제1 정판, C) APC, 콤마의 형상을 나타냄, D) 복측 기공을 나타내는 제1 정판, E, F, H ATEB01. E) 일반적인 크기 및 형상의 세포를 나타내는 ATEB01, 축척 막대 = 10 ㎛, F) ATEB01, 복측 기공을 나타내는 제1 정판, G) 복측 기공 및 APC를 나타내는 ATBB01, H) APC를 나타내는 ATEB01.
도 14는 18S+ITS1-5.8S-ITS2+28S rDNA 결부된, 에이. 타마렌세 복합군(2821 캐릭터(character))의 계통발생을 나타낸다. 계통수는 베이시안 추론(Bayesian inference)(필로베이예스(Phylobayes))을 이용하여 재구성된다. 내부 노드 상의 숫자는 필로베이예스 및 RAxML (순서: 필로베이예스/RaxML)의 사후 확률 및 부트스트랩 값(>50%)을 나타낸다. 흑색 원은 1.00의 사후 확률 값 및 >90%의 부트스트랩을 나타낸다. 제1군 내지 제4군의 클레이드(clade)는 확장된 버전의 계통수 관찰에 있어서 붕괴되었다.
도 15는 HPLC를 이용한 ATNWB01의 독소 프로파일이며, 나타낸 피크는 PSP 독소 표준물에 대하여 결정되었다.
도 16은 18S+ITS1-5.8S-ITS2+28S rDNA 결부된, 에이. 타마렌세 복합군(2821 캐릭터)의 계통발생을 나타낸다. 계통수는 베이시안 추론(필로베이예스)을 이용하여 재구성된다. 내부 노드 상의 숫자는 필로베이예스 및 RAxML (순서: 필로베이예스/RaxML)의 사후 확률 및 부트스트랩 값(>50%)을 나타낸다. 흑색 원은 1.00의 사후 확률 값 및 >90%의 부트스트랩을 나타낸다.
정의
본 출원에서 사용될 때, 단수형("a", "an" 및 "the")은 그 문맥이 달리 명백하게 진술하지 않으면, 복수형 언급 대상을 포함한다. 예를 들어, "와편모조류"라는 용어는 복수형의 와편모조류를 또한 포함한다.
본원에서 사용될 때, "포함하는"이라는 용어는 "함유하는"을 의미한다. "포함하는"이라는 단어의 변이형, 예컨대 "포함하다" 및 "포함하고 있다"는 이에 상응하게 변화된 의미를 갖는다. 따라서, 예를 들어, 단백질을 코딩하는 서열을 "포함하는" 폴리뉴클레오티드는 배타적으로 이 서열로 이루어질 수 있거나 하나 이상의 추가의 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "삭시톡신"이라는 용어는 순수한 삭시톡신 및 이의 유사체를 포함하며, 이의 비제한적 예는 네오삭시톡신(neoSTX), 고니오톡신(GTX), 데카르바모일삭시톡신(dcSTX), 비술페이트화 유사체, 모노술페이트화 유사체, 디술페이트화 유사체, 데카르바모일화 유사체 및 소수성 유사체를 포함한다.
본원의 종래 기술 문헌의 임의의 설명, 또는 상기 문헌으로부터 유래되거나 상기 문헌을 기초로 한 본원의 진술은 상기 문헌 또는 유래된 진술이 관련 업계의 보통의 일반적인 지식의 일부임을 인정하는 것은 아니다.
설명의 목적을 위하여, 본원에서 언급된 모든 문헌 및 젠뱅크(GenBank) 서열은 그 전체가 참고로 포함된다.
발명의 상세한 설명
본 발명자는 와편모조류가 삭시톡신(STX)의 생성자임을 결정하였으며, 이들 미생물에서 STX 생성에 책임이 있는 유전자를 동정하였다. 이 발견에 기초하여, 본 발명자는 STX 생성 와편모조류 종과 STX를 생성하지 않는 와편모조류 종을 식별할 수 있는 분석법을 개발하였다.
따라서, 본 발명의 특정 측면은 와편모조류에 존재하는 STX 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 서열에 관한 것이다.
또한 제공되는 것은 샘플에서 본 발명의 하나 이상의 서열의 존재(또는 부재)를 검출하는 것에 기초하여 주어진 샘플에서 STX 생성 와편모조류를 검출하는 방법이다.
또한 제공되는 것은 샘플에서 본 발명의 하나 이상의 서열의 존재(또는 부재)를 검출하는 에이전트(들)를 포함하는, 주어진 샘플에서 STX 생성 와편모조류를 검출하는 키트이다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
본원에서 개시된 것은 와편모조류 삭시톡신 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 서열(각각 "본 발명의 폴리뉴클레오티드" 및 "본 발명의 폴리펩티드)이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 또는 상보성 데옥시리보핵산(cDNA)일 수 있다.
특정 실시양태에서, 서열은 삭시톡신 A 유전자(sxtA) 폴리뉴클레오티드 서열 또는 삭시톡신 A 폴리펩티드(STXA) 서열이다.
sxtA 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 하나 이상의 sxtA 유전자 촉매 도메인(들)(즉, sxtA1, sxtA2, sxtA3, 또는 sxtA4 촉매 도메인(들)), 또는 이의 단편(들)을 포함할 수 있다. 단지 비제한적 예로서, sxtA1 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 1)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 160-1821 또는 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 277-2022로 정의될 수 있다. sxtA2 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 1)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 1837-2415 또는 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 2038-2604로 정의될 수 있다. sxtA3 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 1)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 2479-2694 및 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 2722-2949로 정의될 수 있다. sxtA4 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3115-4121 또는 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3597-3721로 정의될 수 있다.
본 발명의 sxtA 유전자 폴리뉴클레오티드 서열의 다른 비제한적 예는 젠뱅크 접근 번호 JF343238 및 JF343239(서열 번호 1 및 서열 번호 3)에 제공된 것을 포함한다.
STXA 폴리펩티드 서열은 임의의 하나 이상의 STX 단백질 촉매 도메인(들)(즉, STXA1, STXA2, STXA3, 또는 STXA4 촉매 도메인(들)) 또는 이의 단편(들)을 포함할 수 있다. 단지 비제한적 예로서, STXA1 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 2)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 1-554 또는 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 4)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 1-582로 정의될 수 있다. STXA2 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 2)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 560-752 또는 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 4)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 588-776으로 정의될 수 있다. STXA3 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 2)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 774-845 또는 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 4)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 816-891로 정의될 수 있다. STXA4 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 4)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 947-1281로 정의될 수 있다.
본 발명의 STX 폴리펩티드 서열의 다른 비제한적 예는 젠뱅크 접근 번호 JF343238 및 JF343239(서열 번호 2 및 서열 번호 4)에 제공된 것을 포함한다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 삭시톡신 생성 와편모조류 유래의 것이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 고니아울락스목(Gonyaulacales) 또는 김노디니움목(Gymnodiniales)의 와편모조류 유래의 것일 수 있다. 바람직하게는, 와편모조류는 알렉산드륨속(이전에는 고니아울락스(Gonyaulax)속, 피로디늄속 또는 김노디늄속의 것이다.
바람직한 알렉산드륨 종의 비제한적 예는 에이. 카테넬라(예를 들어 주 ACCC01, ACSH02, ACTRA02 및 CCMP1493), 에이. 푼디엔세(예를 들어 주 CCMP1719 및 CCMP1979), 에이. 루시타니쿰, 에이. 미누툼(예를 들어 주 CCMP1888, CCMP113, ALSP01, ALSP02 및 AMD16/AMAD16), 에이. 오스텐펠디이, 및 에이. 타마렌세(예를 들어 주 CCMP1771, ATBB01, ATEB01, ATCJ33 및 ATNWB01)를 포함한다. 바람직한 김노디늄 종의 비제한적 예는 지. 카테나툼(예를 들어 주 GCTRA01 및 CS-395)을 포함한다. 바람직한 피로디늄 종의 비제한적 예는 피. 바하멘세 바 콤프레숨을 포함한다.
둘 모두의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 폴리펩티드의 단편도 본원에서 제공된다.
본원에서 고려되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 "단편"은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 구성요소인 폴리뉴클레오티드 분자 또는 이의 변이체이다. 폴리뉴클레오티드의 단편은 반드시 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩티드를 코딩할 필요는 없지만, 이것이 그러한 것에서 배제되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 단편은 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 유용할 수 있다. 단편은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 절단에 의해 유도될 수 있거나 대안적으로는 일부 다른 수단, 예를 들어 화학적 합성에 의해 합성될 수 있다. 본원에서 고려되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 단편은 길이가 약 5000개 미만의 뉴클레오티드, 길이가 약 4500개 미만의 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 4000개, 3500개, 3000개, 2500개, 2000개, 1500개, 1000개, 750개, 500개, 400개, 300개, 250개, 200개, 150개, 100개, 75개, 50개, 25개 또는 15개 미만의 뉴클레오티드일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본원에서 고려되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 단편은 길이가 약 15개 초과의 뉴클레오티드, 길이가 약 25개 초과의 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 400개, 500개, 750개, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개 또는 4000개 초과의 뉴클레오티드일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본원에서 고려되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 단편은 길이가 약 25 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 길이가 약 25 내지 약 75개의 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 25 내지 약 100개, 100 내지 250개, 100 내지 500개, 250 내지 500개, 100 내지 1000개, 500 내지 2000개, 1000 내지 2000개의 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 sxtA 유전자의 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 sxtA1, sxtA2, sxtA3, 또는 sxtA4 촉매 도메인(들) 중 임의의 하나 이상, 또는 이의 단편(들)을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 단편은 STX 단백질의 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 STXA1, STXA2, STXA3, 또는 STXA4 촉매 도메인(들) 중 임의의 하나 이상, 또는 이의 단편(들)을 포함할 수 있다.
본 발명의 sxtA 유전자 폴리뉴클레오티드 서열 단편의 특정한 그리고 비제한적인 예는 젠뱅크 접근 번호 JF343240 - JF343432(서열 번호 5 - 서열 번호 197)에 제공된 것, 및 서열 번호 224-227, 230-242 및 247에 개시된 것을 포함한다.
본 발명의 sxtA 유전자 폴리뉴클레오티드 서열 단편의 추가의 특정한 그리고 비제한적인 예는 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3115-4121 및 뉴클레오티드 3597-3721로 정의되는 것, 및 이의 단편 및 변이체를 포함한다.
sxtA1 촉매 도메인 서열의 특정한 그리고 비제한적인 예는 서열 번호 224-227 및 247에 개시된 것을 포함한다.
sxtA4 촉매 도메인 서열의 특정한 그리고 비제한적인 예는 서열 번호 230-242에 개시된 것을 포함한다.
본원에서 고려되는 바와 같이, 폴리펩티드 "단편"은 본 발명의 폴리펩티드의 구성요소 또는 이의 변이체이다. 전형적으로, 상기 단편은 이것이 구성요소인 폴리펩티드와 공통인 질적인 생물학적 활성을 보유하거나 또는 반드시 요구되는 것은 아닌 질적인 생물학적 활성을 보유한다. 본원에서 고려되는 바와 같이, 폴리펩티드 단편은 길이가 약 1500개 미만의 아미노산 잔기, 길이가 약 1400개 미만의 아미노산 잔기, 또는 길이가 약 1300개, 1200개, 1100개, 1000개, 900개, 800개, 700개, 600개, 500개, 400개, 300개, 250개, 200개, 150개, 100개, 75개, 50개, 25개 또는 15개 미만의 아미노산 잔기일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본원에서 고려되는 바와 같이, 폴리펩티드 단편은 길이가 약 15개 초과의 아미노산 잔기, 길이가 약 25개 초과의 아미노산 잔기, 또는 길이가 약 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 또는 1300개 초과의 아미노산 잔기일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본원에서 고려되는 바와 같이, 폴리펩티드 단편은 길이가 약 15 내지 약 25개의 아미노산 잔기, 길이가 약 15 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 또는 길이가 약 15 내지 75개, 15 내지 100개, 15 내지 150개, 25 내지 50개, 25 내지 100개, 50 내지 100개, 50 내지 150개, 100 내지 200개, 100 내지 250개, 100 내지 300개, 100 내지 500개, 500 내지 750개, 500 내지 1000개, 또는 1000 내지 1300개의 아미노산 잔기일 수 있다.
본 발명의 STXA 폴리펩티드 서열 단편의 특정한 그리고 비제한적인 예는 젠뱅크 접근 번호 JF343248(서열 번호 3)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 X-Y로 정의되는 것, 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 4)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 947-1281로 정의되는 것, 및 이들의 단편 및 변이체를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 폴리펩티드의 변이체, 및 이들의 단편도 본원에 제공된다.
본원에서 고려되는 바와 같이, "변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 나타낸다. 일반적으로, 두 서열은, 상기 두 서열이 특정한 영역에 걸쳐, 또는 특정되지 않을 때에는 전체 서열에 걸쳐 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정한 백분율("서열 동일성"의 백분율)을 가질 경우 "실질적으로 유사"하다. 따라서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 "변이체"는 기준 서열과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 83% 85%, 88%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있다.
일반적으로, 폴리펩티드 서열 변이체는 질적인 생물학적 활성을 공통적으로 보유한다. 일반적으로 폴리뉴클레오티드 서열 변이체는 일반적으로 질적인 생물학적 활성을 공통적으로 보유하는 폴리펩티드를 코딩한다. "변이체"라는 용어의 의미 내에 또한 포함되는 것은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 폴리펩티드의 상동체이다. 폴리뉴클레오티드 상동체는 전형적으로 상이한 와편모조류 종 유래의 것이지만, 본원에 개시된 상응하는 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 공유한다. 폴리펩티드 상동체는 전형적으로 상이한 와편모조류 종 유래의 것이지만, 본원에 개시된 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 공유한다. "변이체"라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드의 유사체도 포함한다. 폴리펩티드 "유사체"는 본 발명의 폴리펩티드의 유도체인 폴리펩티드이며, 이 유도체는 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 기능을 유지하도록 하는 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"이라는 용어는 폴리펩티드 사슬(단백질의 일차 서열) 내에서 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하거나 대체하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 하전된 아미노산인 글루탐산(Glu)을 유사하게 하전된 아미노산인 아스파르트산(Asp)으로 치환하는 것은 보존적 아미노산 치환이다.
전형적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 폴리펩티드는 "단리"된다. 이와 관련하여, "단리된"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가, 이의 자연 상태에서 이것과 함께 발견되는 다른 성분들 중 일부 또는 모두로부터 꺼내졌음을 의미하거나 상기 일부 또는 모두와 회합되어 있지 않음을 의미한다. 예를 들어, "단리된" 폴리뉴클레오티드는 더욱 큰 폴리뉴클레오티드 서열의 다른 폴리뉴클레오티드로부터 꺼내진 것일 수 있거나, 관련되지 않은 폴리뉴클레오티드와 같은 천연 성분으로부터 꺼내진 것일 수 있다. 이와 마찬가지로, "단리된" 폴리펩티드는 더욱 큰 폴리펩티드 서열의 다른 폴리펩티드로부터 꺼내진 것일 수 있거나, 관련되지 않은 폴리펩티드와 같은 천연 성분으로부터 꺼내질 수 있다. 명확함을 위하여, "단리된" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 자연으로부터 취해지지 않고 오히려 드노보(de novo)로 제조된, 예컨대 화학적으로 합성된 및/또는 재조합적 방법에 의해 제조된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 또한 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 더욱 긴 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 성분 파트로서 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 벡터는 예를 들어 DNA, RNA 또는 상보성 DNA(cDNA) 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 또는 외래 서열의 삽입, 외래 서열의 세포 내로의 도입 및 도입된 서열의 발현용으로 개조된 임의의 다른 적합한 비히클일 수 있다. 전형적으로, 벡터는 발현 벡터이며, 발현 조절 및 프로세싱 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 박테리아 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)를 형질전환시키는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 벡터의 구성 및 이의 숙주 세포의 형질전환 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York]; 및 문헌[Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc.]과 같은 표준 교재에 기술되어 있다.
프로브 , 프라이머 및 항체
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 프라이머 및 프로브로서 사용하기 위한 이의 유도체 및 단편을 포함한다.
본 유도체 및 단편은 올리고뉴클레오티드의 형태로 존재할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 PCR과 같은 핵산 증폭 반응에서 사용하기에 적합한 뉴클레오티드 잔기의 짧은 스트레치(stretch)이며, 이는 전형적으로 길이가 적어도 약 5개의 뉴클레오티드 내지 약 80개의 뉴클레오티드, 더 전형적으로, 길이가 약 10개의 뉴클레오티드 내지 길이가 약 50개의 뉴클레오티드, 훨씬 더 전형적으로는 길이가 약 15개의 뉴클레오티드 내지 길이가 약 30개의 뉴클레오티드이다.
일 실시양태에서, 프로브는 서열 번호 245 또는 서열 번호 246에 개시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
프로브는 전형적으로 혼성화에 의한 상동 서열의 검출에서 사용하기 위한, 예를 들어 약 10개의 뉴클레오티드 내지 수천개의 뉴클레오티드의 가변 길이의 뉴클레오티드 서열이다. 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편, 또는 다른 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머의 설계 및/또는 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 표준 교재, 예컨대 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York]; 및 간행물, 예컨대 문헌[Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323]; 문헌[Innis et al. (Eds) (1990) PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York; Innis and Gelfand, (Eds) (1995) PCR Strategies, Academic Press, New York]; 및 문헌[Innis and Gelfand, (Eds) (1999) PCR Methods Manual, Academic Press, New York.]에 기술되어 있다.
폴리뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 예를 들어 화학적 합성 기술, 예컨대 포스포디에스테르법 및 포스포트리에스테르법(예를 들어, 문헌[Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90]; 문헌[Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109]; 및 미국 특허 제4356270호 참조), 및 디에틸포스포르아미다이트법(문헌[Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862] 참조)에 의해 제조될 수 있다.
전술한 프로브 및 프라이머를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이의 검출을 용이하게 하기 위하여 마커의 혼입에 의해 표지될 수 있다. 핵산의 표지 및 검출 기술은 예를 들어 표준 교재, 예컨대 문헌[Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc.]에 기술되어 있다. 적합한 마커의 비제한적인 예는 형광 분자(예를 들어 아세틸아미노플루오렌, 5-브로모데옥시우리딘, 디그옥시제닌 및 플루오레세인) 및 방사성 동위원소(예를 들어 32P, 35S, 3H, 33P)를 포함한다. 마커의 검출은 예를 들어 화학적, 광화학적, 면역화학적, 생화학적 또는 분광법적 기술에 의해 달성될 수 있다.
프로브 및 프라이머는 예를 들어 관심있는 샘플에서 와편모조류를 검출하거나 단리하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로브 및 프라이머는 관심있는 샘플에서 STX 생성 와편모조류를 검출하는 데 사용될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 프로브 또는 프라이머는 예를 들어 다른 와편모조류 종을 포함하는 다른 유기체에서 상응하는 서열을 단리하는 데 사용될 수 있다. 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 혼성화 등과 같은 방법을 이용하여 본원에 개시된 서열에 대한 서열 상동성을 기초로 하여 그러한 서열을 동정할 수 있다. 본원에 개시된 전체 서열에 대한 또는 이의 단편에 대한 서열 동일성을 기초로 하여 선발된 서열은 본 실시양태에 포함된다. 그러한 서열은 개시된 서열의 오르토로그(ortholog)인 서열을 포함한다. "오르토로그"라는 용어는 공통 조상 유전자로부터 유래된 그리고 종분화의 결과로서 상이한 종에서 발견되는 유전자를 나타낸다. 상이한 종에서 발견되는 유전자는 그의 뉴클레오티드 서열 및/또는 그의 코딩된 단백질 서열이 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같이 상당한 동일성을 공유할 경우 오르토로그로 간주된다. 오르토로그의 기능은 종들 사이에서 흔히 고도로 보존된다.
혼성화 기술에서, 공지된 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부는 주어진 샘플에 존재하는 다른 상응하는 핵산 서열에 선택적으로 혼성화하는 프로브를 생성하는 데 사용된다. 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편, 또는 다른 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 검출가능한 마커로 표지될 수 있다. 따라서, 예를 들어 혼성화용 프로브는 본 발명의 서열을 기초로 한 합성 올리고뉴클레오티드의 표지에 의해 만들어질 수 있다. 프로브와 표적 서열 사이의 상동성(서열 동일성) 수준은 대체로 혼성화 조건의 엄격도에 의해 결정된다. 특히, 프로브로 사용되는 뉴클레오티드 서열은 낮은 엄격도, 중간 엄격도 또는 높은 엄격도의 조건 하에 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 상동체 또는 다른 변이체에 혼성화할 수 있다. 예를 들어 특정 핵산에 혼성화시킬 핵산의 길이 및 성질(DNA, RNA, 염기 조성); 염 및 다른 성분의 농도, 예컨대 포름아미드, 덱스트란 술페이트, 폴리에틸렌 글리콜 등의 존재 또는 부재; 및 혼성화 및/또는 세척 단계의 온도의 변경과 같은 혼성화 엄격도를 변경시키는 데 이용될 수 있는, 당업계의 숙련자에게 공지된 다수의 조건 및 인자가 있다.
PCR 접근법 하에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 관심있는 임의의 유기체로부터 추출된 cDNA 또는 게놈 DNA로부터 상응하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 반응에서의 사용용으로 설계될 수 있다. PCR 프라이머의 설계 방법 및 PCR 클로닝 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 공지된 PCR법은 쌍을 형성하는 프라이머, 네스티드(nested) 프라이머, 단일 특정 프라이머, 축퇴 프라이머, 유전자 특이적 프라이머, 벡터 특이적 프라이머, 부분 미스매치 프라이머 등을 사용하는 방법을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.
숙련자라면, PCR 또는 RT-PCR에서 사용하기 위한 본원에 기술된 프라이머가 와편모조류 sxt 유전자 서열의 검출용 프로브로서 또한 사용될 수 있음을 인식한다.
본 발명에 의해 또한 고려되는 것은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 본 항체는 주어진 샘플에서 하나 이상의 STX 폴리펩티드를 정성적으로 또는 정량적으로 검출 및 분석하는 데 사용될 수 있다. "특이적으로 결합하는"이라는 것은, 본 항체가, 관련되지 않은 단백질에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 표적 폴리펩티드 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본 항체는 폴리펩티드 또는 이의 단편에 적어도 약 10-4 M 내지 약 10-10 M의 범위의 결합 상수로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 상수는 적어도 약 10-5 M, 또는 적어도 약 10-6 M이다. 더 바람직하게는 상기 결합 상수는 적어도 약 10-7 M, 적어도 약 10-8 M, 또는 적어도 약 10-9M 이상이다. 본 발명의 문맥에서, 본 발명의 STX 폴리펩티드에 특이적인 항체의 언급은 이 폴리펩티드의 단편에 특이적인 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 예를 들어 전 항체로서의, 또는 이의 항체 단편, 또는 다른 면역학적 활성 단편, 예컨대 상보성 결정 영역으로서의 것을 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이와 유사하게, 항체는 기능성 항원 결합 도메인, 즉 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체 단편으로서 존재할 수 있다. 또한, 항체 단편은 하기로 이루어지지만 이로 한정되는 것은 아닌 군으로부터 선택되는 형태로 존재할 수 있다: Fv, Fab, F(ab)2, scFv(단쇄 Fv(single chain Fv)), dAb(단일 도메인 항체), 키메라 항체, 2특이성 항체, 디아바디(diabody) 및 트리아바디(tribody)
항체 "단편"은 전 항체의 변형에 의해 또는 요망되는 항체 단편의 합성에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편을 포함하는 항체의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 재조합 DNA 기술에 의한 합성을 포함한다. 당업자라면 예를 들어 미국 특허 제5296348호 및 표준 교재, 예컨대 문헌[Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc.]에 기술된 것과 같은 항체의 합성 방법을 알고 있다.
바람직하게는, 항체는 관심있는 STX 폴리펩티드의 별개의 영역 또는 단편으로부터 제조된다. 관심있는 폴리펩티드의 항원 부분은 약 5 내지 약 15개의 아미노산과 같은 임의의 적절한 길이의 것일 수 있다. 바람직하게는, 항원 부분은 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 아미노산 잔기를 함유한다.
본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 예를 들어 본 발명의 정제된 STX 폴리펩티드를 사용하여, 또는 본 발명의 STX 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 정제된 sxt 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 Fab 부분을 함유하는 단클론 항체는 문헌[Harlow and Lane (Eds) Antibodies - A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y]; 문헌[Coligan, Current Protocols in Immunology (1991)]; 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice (1986) 2nd ed]; 및 문헌[Kohler & Milstein, (1975) Nature 256: 495-497]에 기술된 하이브리도마 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 기술은 토끼 또는 마우스를 면역화함에 의한 다클론 및 단클론 항체의 제조 뿐만 아니라 파지 또는 유사 벡터에서의 재조합 항체의 라이브러리로부터의 항체의 선발에 의한 항체의 제조도 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다(예를 들어, 문헌[Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281]; 문헌[Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546] 참조).
본 발명의 항체는 인간화 항체, 키메라 항체 및 완전 인간 항체를 포함함이 또한 이해된다. 본 발명의 항체는 하나 초과의 항원 또는 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 2특이성 항체일 수 있다. 예를 들어, 본 항체는 하나 이상의 STX 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대하여 특이성을 가질 수 있으며, 추가로, 또 다른 항원에 대하여 결합 특이성을 가질 수 있다. 인간화 항체, 키메라 항체, 완전 인간 항체 및 2특이성 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제6995243호에 기술된 것을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 STX 폴리펩티드를 잠재적으로 포함하는 샘플을 STX 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시킬 수 있다. 임의로, 본 항체는 항체를 샘플과 접촉시키기 전에 복합체의 세척 및 후속적인 단리를 용이하게 하기 위하여 고형 지지체에 고정될 수 있다. 고형 지지체의 예는 미세적정 플레이트, 비드, 틱(tick), 또는 미세비드를 포함한다. 항체는 또한 프로테인칩 어레이(ProteinChip array) 또는 프로브 기재에 부착될 수 있으며, 이는 상기에 기술된 바와 같다.
본 발명의 폴리펩티드에 결합되는 항체의 동정을 위한 검출가능한 표지체는 형광색소, 형광 염료, 방사성 표지체, 효소, 예컨대 서양 고추냉이 퍼옥시드, 알칼리 포스파타아제 및 당업계에서 일반적으로 사용되는 다른 것, 및 콜로이드성 금 또는 색유리 또는 플라스틱 비드를 비롯한 비색 표지체를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 대안적으로, 본 항체는 간접 분석법을 이용하여 검출될 수 있으며, 여기서, 예를 들어 제2 표지 항체를 결합된 폴리펩티드 특이적 항체의 검출에 사용한다.
항체-마커 복합체의 존재의 검출 방법, 또는 항체-마커 복합체의 양의 측정 방법은 예를 들어 형광, 화학발광, 발광, 흡광도, 복굴절, 투과율, 반사율 또는 굴절률의 검출, 예컨대 표면 플라스몬 공명, 편광 해석법, 공명 미러법(resonant mirror method), 격자 결합기 도파관법(grating coupler wave guide method), 또는 간섭법을 포함한다. 무선 주파수법은 다극성 공명 분광법을 포함한다. 전기화학적 방법은 전류 측정법 및 전압 측정법을 포함한다. 광학적 방법은 영상법 및 비영상법과 현미경법을 포함한다.
항체-마커 복합체의 존재를 검출하거나 항체-마커 복합체의 양을 측정하기에 유용한 분석법은 예를 들어 효소 결합된 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사성 면역 분석법(radioimmune assay; RIA), 또는 웨스턴 블롯(Western blot) 분석법을 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌[Stites & Terr, (Eds) (1991) Clinical Immunology, 7th ed]; 및 문헌[Asai, (Ed) (1993) Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37]에 기술되어 있다.
와편모조류의 검출 방법
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 폴리펩티드의 검출 및/또는 단리 방법("본 발명의 방법")을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 샘플에서 와편모조류를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본 방법에서 사용하기 위한 샘플을 수득하는 단계, 및 샘플에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 샘플에서의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 단편의 존재는 샘플 중 와편모조류를 나타내는 것이다.
본 발명자는 sxtA 유전자가 삭시톡신 생성 와편모조류에는 존재하지만 삭시톡신을 생성하지 않는 와편모조류에는 부재한다는 것을 결정하였다. 특히, sxtA 유전자의 sxtA1 및/또는 sxtA4 촉매 도메인(들)의 검출은 삭시톡신 생성 와편모조류를 나타내는 것임이 확인되었다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본 방법에서 사용하기 위한 샘플을 수득하는 단계, 및 샘플에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 샘플에서의 본 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편의 존재는 샘플 중 삭시톡신 생성 와편모조류를 나타내는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 샘플에서의 삭시톡신 생성 와편모조류의 분재의 결정 방법을 제공한다. 본 방법은 본 방법에서 사용하기 위한 샘플을 수득하는 단계, 및 샘플에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체의 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편의 부재는 삭시톡신 생성 와편모조류가 샘플에 존재하지 않음을 나타내는 것이다.
본 발명의 방법(이는 바로 위의 단락에서 언급된 것을 포함함)의 맥락에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 삭시톡신 A 유전자(sxtA) 서열일 수 있다. sxtA 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 하나 이상의 sxtA 유전자 촉매 도메인(들)(즉, sxtA1, sxtA2, sxtA3, 또는 sxtA4 촉매 도메인(들)), 또는 이의 단편(들)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, sxtA 폴리뉴클레오티드 서열은 sxtA1 및/또는 sxtA4 도메인, 또는 이의 단편(들)을 포함한다. 더 바람직하게는, sxtA 폴리뉴클레오티드 서열은 sxtA4 도메인, 또는 이의 단편(들)을 포함한다. 폴리펩티드 서열은 삭시톡신 A 폴리펩티드(STXA) 서열일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 뱅크 접근 번호 JF343238 및 JF343239(서열 번호 1 및 서열 번호 3) 중 임의의 하나에 제공된 서열, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체에 상응한다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343240 - JF343432(서열 번호 5 - 서열 번호 197) 중 임의의 하나에 제공된 서열, 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체에 상응한다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 224-227 및 247 중 임의의 하나에 제공된 sxtA1 촉매 도메인 서열, 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함한다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 230-242 중 임의의 하나에 제공된 sxtA4 촉매 도메인 서열의 서열, 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함한다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 1)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 160-1821; 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 277-2022; 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 1)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 1837-2415; 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 2038-2604; 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 1)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 2479-2694; 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 2722-2949; 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3115-4121; 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3597-3721; 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법(이는 상기 단락에서 언급된 것을 포함함)의 맥락에서, 폴리펩티드 서열은 삭시톡신 A 단백질(STXA) 서열일 수 있다. STXA 폴리펩티드 서열은 임의의 하나 이상의 STXA 단백질 촉매 도메인(들)(즉, STXA1, STXA2, STXA3, 또는 STXA4 촉매 도메인(들)), 또는 이의 단편(들)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, STXA 폴리펩티드 서열은 STXA1 또는 STXA4 도메인, 또는 이의 단편(들)을 포함한다. 더 바람직하게는, STXA 폴리펩티드 서열은 STXA4 도메인, 또는 이의 단편(들)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343238 또는 JF343239(서열 번호 2 및 서열 번호 4)에 제공된 서열, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체에 상응한다.
다른 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 2)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 1-554; 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 4)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 1-582; 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 2)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 560-752; 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 4)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 588-776; 젠뱅크 접근 번호 JF343238(서열 번호 2)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 774-845; 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 4)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 816-891; 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 4)에 개시된 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 947-1281; 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하여 샘플에서 검출되거나 샘플에 부재한 것으로 결정되는 와편모조류는 삭시톡신 생성 와편모조류일 수 있다. 어떠한 특정한 제한도 부과함이 없이, 와편모조류는 고니아울락스목 또는 김노디니움목 유래의 것일 수 있다. 와편모조류는 알렉산드륨속(이전에는 고니아울락스(Gonyaulax)속, 피로디늄속 또는 김노디늄속 유래의 것일 수 있다. 알렉산드륨 종의 적합한 예는 에이. 카테넬라(예를 들어 주 ACCC01, ACSH02, ACTRA02 및 CCMP1493), 에이. 푼디엔세(예를 들어 주 CCMP1719 및 CCMP1979), 에이. 루시타니쿰, 에이. 미누툼(예를 들어 주 CCMP1888, CCMP113, ALSP01, ALSP02 및 AMD16/AMAD16), 에이. 오스텐펠디이 및 에이. 타마렌세(예를 들어 주 CCMP1771, ATBB01, ATEB01, ATCJ33 및 ATNWB01)를 포함한다. 김노디늄 종의 적합한 예는 지. 카테나툼(예를 들어 주 GCTRA01 및 CS-395)을 포함한다. 피로디늄 종의 적합한 예는 피. 바하멘세 바 콤프레숨을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 샘플은 임의의 수단에 의해 "수득될" 수 있다. 예를 들어, 샘플은 이것을 자연 발생 상태로부터 꺼냄으로써(예를 들어, 호수, 바다 또는 강으로부터의 샘플), 또는 이것을 "비천연" 상태로부터 꺼냄으로써(예를 들어, 실험실 세팅, 댐, 저장체, 탱크 내의 배양물 등) 수득될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 샘플은 하나 이상의 와편모조류, 또는 하나 이상의 삭시톡신 생성 와편모조류를 포함하는 것으로 의심될 수 있다. 샘플은 비교용 샘플 또는 대조 샘플, 예를 들어, 공지된 농도 또는 밀도의 와편모조류 또는 삭시톡신 생성 와편모조류를 포함하는 샘플, 또는 와편모조류 또는 삭시톡신 생성 와편모조류의 하나 이상의 공지된 종 또는 주를 포함하는 샘플일 수 있다. 샘플은 임의의 소스로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 환경 샘플일 수 있다. 환경 샘플은 예를 들어 염수, 담수, 강, 호수, 바다, 또는 해안의 물로부터 유래될 수 있다. 환경 샘플은 와편모조류 대발생물로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 샘플은 실험실 소스, 예컨대 배양물, 또는 상업적 소스로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 샘플은 예를 들어 조직 또는 생물학적 유체와 같은 생물학적 소스로부터 유래될 수 있다. 샘플은 예를 들어 임의의 다른 성분(들)의 정제, 희석 또는 첨가에 의해 그의 원래 상태로부터 변형될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 테스트되는 샘플은 동물에서의, 샘플의 소스에 있는 삭시톡신의 존재 또는 부재에 관한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 샘플을 테스트하여 예를 들어 어류(예를 들어 복어), 특히 패류(예를 들어 홍합, 조개, 굴, 가리비 등)와 같은 동물성 해산물에서의 삭시톡신의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 혼합 배양에 있어서 또는 개별 종 또는 속의 단리체로서 미생물로부터 단리될(즉, 추출될) 수 있다. 따라서, 샘플의 미생물은 추출 전에 배양될 수 있거나, 추출은 주어진 샘플에서 직접적으로 수행될 수 있다. 본 발명의 방법을 이용한 분석에 적합한, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 단리(즉, 추출) 및 정제 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 표준 교재, 예컨대 문헌[Ausubel (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc]; 문헌[Coligan et al. (Eds) Current Protocols in Protein Science (2007), John Wiley and Sons, Inc]; 문헌[Walker, (Ed) (1988) New Protein Techniques : Methods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, N.J]; 및 문헌[Scopes, R. K. (1987) Protein Purification : Principles and Practice , 3rd. Ed., Springer-Verlag, New York, N.Y.]에 기술되어 있다. 추가의 방법은 문헌[Neilan (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61:2286-2291]에 기술되어 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한, 폴리펩티드의 적합한 정제 기술은 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 원심분리, 겔 여과, 황산암모늄 침전 및 이온 교환을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
대안적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 샘플로부터의 핵산 및/또는 폴리펩티드의 단리 없이 수행될 수 있다.
주어진 샘플에서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 존재의 검출(또는 부재의 결정)은 임의의 적합한 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 적합한 기술은 전형적으로 본 발명의 임의의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 임의의 하나 이상의 폴리펩티드에 대하여 특이적인 프라이머, 프로브 또는 항체의 사용을 수반할 수 있다. 적합한 기술은 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 및 이 기술의 관련된 변이형(예를 들어, 정량적 PCR), 항체 기재 분석법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블로팅, 유동 세포 분석법, 형광 현미경법 등을 포함한다. 이들 및 다른 적합한 기술은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 표준 교재, 예컨대 문헌[Coligan et al. (Eds) Current Protocols in Protein Science (2007), John Wiley and Sons, Inc]; 문헌[Walker, (Ed) (1988) New Protein Techniques : Methods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, N.J]; 및 문헌[Scopes (1987) Protein Purification : Principles and Practice , 3rd. Ed., Springer-Verlag, New York, N.Y.]에 기술되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 주어진 샘플에서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재의 검출(또는 부재의 결정)은 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화하는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응에 의해 관심있는 샘플로부터 추출된 핵산을 증폭시키고, 증폭된 서열을 검출함으로써 달성된다. PCR 접근법 하에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예를 들어 RNA(예를 들어, mRNA), DNA 및/또는 cDNA 폴리뉴클레오티드와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위한 PCR 반응에서의 사용용으로 설계될 수 있다. 적합한 PCR법은 쌍을 형성하는 프라이머, 네스티드 프라이머, 단일 특정 프라이머, 축퇴 프라이머, 유전자 특이적 프라이머, 벡터 특이적 프라이머, 부분 미스매치 프라이머 등을 사용하는 방법을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. PCR 및 RT-PCR 프라이머의 설계 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 표준 교재, 예컨대 문헌[Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc]; 문헌[Maniatis et al. Molecular Cloning (1982), 280-281]; 문헌[Innis et al. (Eds) (1990) PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)]; 문헌[Innis and Gelfand, (Eds) (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)]; 문헌[Innis and Gelfand, (Eds) (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)]; 및 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York]에 개시되어 있다.
당업자라면, PCR 및 RT-PCR 절차의 다양한 파라미터가 요망되는 생성물을 수득하는 능력에 영향을 주지 않고서 변경될 수 있음을 쉽게 인지한다. 예를 들어, 염 농도가 변화될 수 있거나, 변성, 어닐링 및 연장 단계 중 하나 이상의 시간 및/또는 온도가 변화될 수 있다. 이와 유사하게, DNA, cDNA, 또는 RNA 주형의 양도 효율적인 증폭에 요구되는 주형의 최적의 양 또는 이용가능한 핵산의 양에 따라 변화될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 방법 및 키트에 사용하기 위한 프라이머는 전형적으로 길이가 적어도 약 5개의 뉴클레오티드 내지 약 80개의 뉴클레오티드, 더 전형적으로 길이가 약 10개의 뉴클레오티드 내지 길이가 약 50개의 뉴클레오티드, 훨씬 더 전형적으로는 길이가 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다.
당업자라면, 본 발명의 프라이머가 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 검출용 프로브로서, 그리고 PCR, RT-PCR을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 다수의 상이한 응용에 유용할 수 있음을 인식한다. 이러한 프라이머는 예를 들어 적절한 서열의 직접적인 화학적 합성 또는 클로닝 및 제한을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 프라이머 내의 모든 염기가 이 프라이머가 혼성화될 주형 분자의 서열을 반영할 필요는 없다. 프라이머는 단지 프라이머가 주형에 혼성화될 수 있게 하기에 충분한 상보성 염기를 함유할 필요가 있다. 또한 프라이머는 주형 내의 염기에 상보성이 아닌 염기인, 하나 이상의 위치에서의 미스매치 염기를 포함할 수 있으며, 오히려 염기 연장 또는 증폭시에 DNA 내에 변화를 혼입하도록 설계된다. 프라이머는 예를 들어 5' 말단에서의 제한 효소 인식 서열의 형태의 추가의 염기를 포함하여 증폭 DNA의 클로닝을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 방법은 주어진 샘플에서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 폴리펩티드의 존재의 검출(또는 부재의 결정)을 수반한다. 상기에 나타낸 바와 같이, 서열은 삭시톡신 A1, A2, A3 또는 A4 촉매 도메인 서열(또는 이의 단편(들)) 중 임의의 하나 이상을 포함하는 삭시톡신 A 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 서열은 삭시톡신 A1 및/또는 삭시톡신 A4 도메인(또는 이의 단편(들))을 포함한다. 더 바람직하게는, 서열은 삭시톡신 A4 도메인(또는 이의 단편(들))을 포함한다.
당업자라면, 본 발명의 방법을 수행할 때 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 임의의 프라이머(들), 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 임의의 프로브, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 검출할 수 있는 임의의 항체가 사용될 수 있음을 인식한다. 바람직한 실시양태에서, 프라이머, 프로브 및 항체는 앞선 단락(즉, 바로 위의 단락)에서 언급된 삭시톡신 A 서열 중 임의의 하나 이상에 특이적으로 결합한다.
"특이적으로 결합하는"은 프라이머, 프로브 또는 항체가, 이것이 관련되지 않은 서열에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 표적 서열에 결합할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 잠재적인 결합 파트너로서 복수의 상이한, 그러나 동일하게 접근가능한 서열에 노출될 때, 표적 서열에 대하여 특이적인 프라이머, 프로브 또는 항체는 표적 서열에 선택적으로 결합하며, 다른 대안적인 잠재적인 결합 파트너는 프라이머, 프로브 또는 항체에 의해 실질적으로 여전히 결합되지 않는다. 일반적으로, 표적 서열에 대하여 특이적인 프라이머, 프로브 또는 항체는 표적 서열이 아닌 다른 잠재적인 서열에 결합하는 것보다 적어도 10배, 바람직하게는 50배, 더 바람직하게는 100배, 가장 바람직하게는 100배 초과로 더욱 빈번하게 표적 서열에 우선적으로 결합한다. 표적 서열에 대하여 특이적인 프라이머, 프로브 또는 항체는 약한, 그러나 검출가능한 수준으로 비표적 서열에 결합가능할 수 있다. 이는 일반적으로 배경 결합으로 공지되어 있으며, 예를 들어 적절한 대조구의 사용에 의해 특이적 결합과 쉽게 구별가능하다.
바람직한 실시양태에서, 프라이머, 프로브 또는 항체는 삭시톡신 A1 또는 A4 촉매 도메인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열, 또는 이의 단편에 특이적으로 결합한다. 더 바람직하게는 본 프라이머, 프로브 또는 항체는 삭시톡신 A4 촉매 도메인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열, 또는 이의 단편에 특이적으로 결합한다.
적합한 프라이머 및 프로브는 삭시톡신 A1 촉매 도메인 폴리뉴클레오티드 서열의 임의의 단편에 특이적으로 결합할 수 있다. 적합한 항체는 이러한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 삭시톡신 A1 촉매 도메인 폴리펩티드 서열의 단편에 특이적으로 결합할 수 있다.
적합한 프라이머 및 프로브는 삭시톡신 A4 촉매 도메인 폴리뉴클레오티드 서열의 임의의 단편에 특이적으로 결합할 수 있다. 단지 비제한적인 예로서, 적합한 프라이머 및 프로브는 젠뱅크 접근 번호 JF343239(서열 번호 3)에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3115-4121로 정의된 삭시톡신 A4 촉매 도메인 폴리뉴클레오티드 서열의 단편에 특이적으로 결합할 수 있다. 적합한 항체는 이러한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 삭시톡신 A4 촉매 도메인 폴리펩티드 서열의 단편에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 PCR 증폭을 이용한 샘플에서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재의 검출(또는 부재의 결정)을 수반할 수 있다. 삭시톡신 A 폴리뉴클레오티드 서열의 PCR 증폭에 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍은 sxt 유전자의 임의의 하나 이상의 촉매 도메인(들) 또는 이의 단편(들)의 증폭이 가능할 수 있다. 바람직하게는, 본 프라이머는 삭시톡신 A4 촉매 도메인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 서열, 또는 이의 단편을 증폭시킨다. 단지 비제한적인 예로서, 이 목적에 적합한 프라이머쌍은 서열 번호 198의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 또는 이의 단편 또는 변이체 및/또는 서열 번호 199의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 적합한 프라이머쌍의 다른 비제한적인 예는 서열 번호 200-211, 220-223, 228-229, 및 243-244 (이들 프라이머쌍 서열의 단편 및 변이체를 포함함)에 개시된 것을 포함한다.
당업자라면, 예시된 프라이머가 일반적으로 본 발명의 방법 또는 증폭되는 삭시톡신 A 유전자의 영역을 한정하고자 하는 것이 아님을 인식한다. 또한 당업자라면, 본 발명이 예시된 특정 프라이머의 용도에 한정되지 않으며, 대안적인 프라이머 서열도 사용될 수 있되, 단, 프라이머는 삭시톡신 폴리뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 삭시톡신 A 폴리뉴클레오티드 서열, 더 바람직하게는 삭시톡신 A1 및/또는 A4 도메인 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭이 가능해지도록 적절하게 설계됨을 인식한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 적합한 프로브의 이용에 의한 샘플에서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재의 검출(또는 부재의 결정)을 수반할 수 있다. 본 발명의 프로브는 본 발명의 sxt 폴리뉴클레오티드 서열을 기초로 한다. 프로브는 전형적으로 혼성화에 의해 상동 서열의 검출에서 사용하기 위한, 다양한 길이의, 예를 들어 약 10개의 뉴클레오티드 내지 수천개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다. 본 발명의 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편, 또는 다른 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 이의 검출을 용이하게 하기 위하여 마커의 혼입에 의해 표지될 수 있다. 적합한 마커의 예는 형광 분자(예를 들어 아세틸아미노플루오렌, 5-브로모데옥시우리딘, 디그옥시제닌 및 플루오레세인) 및 방사성 동위원소(예를 들어 32P, 35S, 3H, 33P)를 포함한다. 마커의 검출은 예를 들어 화학적, 광화학적, 면역화학적, 생화학적 또는 분광법적 기술에 의해 달성될 수 있다. 뉴클레오티드 프로브의 설계 및/또는 생성 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 표준 교재, 예컨대 문헌[Robinson et al. (Eds) Current Protocols in Cytometry (2007), John Wiley and Sons, Inc]; 문헌[Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc]; 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York]; 및 문헌[Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, 280-281]에 기술되어 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 항체를 이용한 샘플에서의 본 발명의 폴리펩티드의 존재의 검출(또는 부재의 결정)을 수반할 수 있다. 항체는 주어진 샘플에서 본 발명의 하나 이상의 STX 폴리펩티드를 정성적으로 또는 정량적으로 검출 및 분석하는 데 사용될 수 있다. 항체는 예를 들어 유동 세포 분석법, 면역조직화학적 방법, 또는 당업계에 공지된 다른 수단에 의한 검출을 허용하기 위하여 형광색소에 콘쥬게이션될(conjugated) 수 있다. 대안적으로, 본 항체는 비색 검출 또는 화학발광 검출을 허용하는 기질에 결합될 수 있다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체에 결합할 수 있는 이차 항체의 사용을 고려한다.
와편모조류 검출용 키트
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 폴리펩티드의 검출 및/또는 단리용 키트("본 발명의 키트")를 제공한다.
특정 실시양태에서, 키트는 샘플에서 와편모조류를 검출하는 데 사용된다.
다른 실시양태에서, 키트는 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류를 검출하는데 사용된다.
다른 실시양태에서, 키트는 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류의 부재를 결정하는 데 사용된다.
일반적으로, 본 발명의 키트는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 및/또는 이들의 변이체 또는 단편의 존재를 검출하는 하나 이상의 에이전트를 포함한다(표제가 "폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드"인 상기 섹션의 설명을 참조). 이 목적에 적합한 임의의 에이전트가 키트 내에 포함될 수 있다. 적합한 에이전트의 비제한적인 예는 프라이머, 프로브 및 항체, 예컨대 표제가 "프로브, 프라이머 및 항체" 및 "와편모조류의 검출 방법"인 섹션에서 상기에 기술된 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 키트는 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 것이다(표제가 "와편모조류의 검출 방법"인 상기 섹션의 설명을 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명은 샘플에서의 와편모조류의 검출용 키트를 제공하며, 본 키트는 샘플에서 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 및/또는 이들 중 어느 하나의 변이체 또는 단편의 존재를 검출하는 하나 이상의 에이전트를 포함한다. 바람직하게는, 와편모조류는 삭시톡신 생성 와편모조류이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 샘플에서의 와편모조류의 부재 결정용 키트를 제공하며, 본 키트는 샘플에서 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 및/또는 이들 중 어느 하나의 변이체 또는 단편의 부재를 결정하는 하나 이상의 에이전트를 포함한다. 바람직하게는, 와편모조류는 삭시톡신 생성 와편모조류이다.
일반적으로, 본 발명의 키트는 다수의 추가 구성요소를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 추가 구성요소는 샘플 수집 및/또는 보관용 구성요소, 세포 배양용 시약, 기준 샘플, 완충제, 표지체, 및/또는 본 발명의 방법(들)을 수행하는 것에 대한 서면으로 된 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트를 이용하여 샘플에서 검출되거나 샘플에 부재하는 것으로 결정되는 와편모조류는 삭시톡신 생성 와편모조류일 수 있다. 어떠한 특정한 제한도 부과함이 없이, 와편모조류는 고니아울락스목 또는 김노디니움목 유래의 것일 수 있다. 와편모조류는 알렉산드륨속(이전에는 고니아울락스속), 피로디늄속 또는 김노디늄속 유래의 것일 수 있다. 알렉산드륨 종의 적합한 예는 에이. 카테넬라(예를 들어 주 ACCC01, ACSH02, ACTRA02 및 CCMP1493), 에이. 푼디엔세(예를 들어 주 CCMP1719 및 CCMP1979), 에이. 루시타니쿰, 에이. 미누툼(예를 들어 주 CCMP1888, CCMP113, ALSP01, ALSP02 및 AMD16/AMAD16), 에이. 오스텐펠디이 및 에이. 타마렌세(예를 들어 주 CCMP1771, ATBB01, ATEB01, ATCJ33 및 ATNWB01)를 포함한다. 김노디늄 종의 적합한 예는 지. 카테나툼(예를 들어 주 GCTRA01 및 CS-395)을 포함한다. 피로디늄 종의 적합한 예는 피. 바하멘세 바 콤프레숨을 포함한다.
당업계의 숙련자라면, 광범위하게 기술된 본 발명의 사상 또는 범주로부터 벗어남이 없이 특정 실시양태에 기술된 바와 같이 다수의 변화 및/또는 변형이 본 발명에 대하여 이루어질 수 있음을 안다. 따라서 본 발명의 실시양태는 모든 점에서 예시적인 것으로 그리고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
이제 본 발명을 특정 실시예를 참고로 하여 설명하며, 실시예는 어떠한 방식으로든지 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 와편모조류에서의 핵 코딩된 신경독소 삭시톡신 유전자의 동정
재료 및 방법
- 배양 및 독소 측정
삭시톡신 생성 및 비생성 와편모조류 배양물을 다양한 배양 콜렉션(collection)으로부터 수득하였다(표 1).
Figure pct00001
GSe (문헌[Doblin et al. (1999), Growth and biomass stimulation of the toxic dinoflagellate Gymnodinium catenatum (Graham) by dissolved organic substances. J Exp Mar Biol Ecol 236: 33-47]의 방법 참조) 또는 L1 배지 (문헌[Guillard and Hargraves (1993) Stichochrysis immobilis is a diatom, not a chrysophyte. Phycologia 32, 234-236]의 방법 참조)에서, 16 - 20℃에서, 12/12의 광주기, 및 대략 100 마이크로몰의 광자 m-2 s-1의 광자 조사량 하에서 배양물을 유지하였다. 주의 독성을 HPLC 또는 LCMS를 이용하여 결정하였다. HPLC법의 검출 한계는 C1 및 C3의 경우 약 0.07 ㎍의 STXeq/ 100 g으로부터 GTX1의 경우 4.1 ㎍의 STXeq/ 100 g까지의 범위였다. LCMS법의 검출 한계는 NEO의 경우 약 0.1 pg/ 세포로부터 C1 및 C2의 경우 0.5 pg/ 세포까지의 범위였다.
- RNA 및 DNA 추출
454-라이브러리 구성(하기 참조)의 전체 RNA를 단리하기 위하여, 알렉산드륨 푼디엔세 발레크(Balech) CCMP1719 및 알렉산드륨 미누툼 할림(Halim) CCMP113의 배양물을 원심분리(1 min, 1000 x g, 12℃)를 통하여 대수기에 수확하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 1.4 mm 비드(메디노르(Medinor))를 사용하여 메디노르로부터의 패스트 프렙 비드비터(Fast Prep bead-beater)(20 s, 속도 4)를 이용하여 드라이아이스 상에스 비드비팅에 노출시키고, 제조업자의 프로토콜에 따라 차지스위치(ChargeSwitch)(등록상표) 토탈 RNA 셀 키트(Total RNA Cell kit)(인비트로겐(Invitrogen))를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다.
RACE 분석에 있어서, 폴리A 풍부화 mRNA를 다이나비즈 디렉트 키트(Dynabeads DIRECT kit)(인비트로겐)를 사용하여 단리하였다. 세포를 원심분리(2 min, 4℃, 16000 x g)에 의해 수확하고, PBS로 2회 세척하고, 용해/결합 완충제를 첨가하고, 이를 비드비터를 이용하여 균질화하였다(20 s, 단계 4). 원심분리(1 min, 4℃, 16000 x g) 후, 투명한 균질물을 다이나비즈 믹스로 옮기고, mRNA를 프로토콜에 따라 단리하였다. 마지막으로, mRNA를 공급된 프로토콜에 따라 터보(TURBO)TM DNase(암비온(Ambion))로 처리하였다.
게놈 DNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 게놈 DNA 플랜트 차지스위치(등록상표) 키트(인비트로겐)를 사용함에 의해 또는 CTAB법에 의해 표 1에 열거된 모든 와편모조류 주로부터 단리하였다.
RNA 및 DNA의 품질 및 양은 나노드롭(Nanodrop) 분광광도계(서모사이언티픽)를 사용하여, 대조 와편모조류 유전자(시토크롬 b, 액틴)를 증폭시킴으로써 및/또는 에티듐 브로마이드 염색된 아가로스 겔 상에서 이들을 가시화함으로써 결정하였다.
- cDNA 라이브러리 구성, 454 서열결정, 조립 및 분석
각각의 말단에 454 어댑터가 부착된 정규화된 폴리A 풍부화 cDNA 라이브러리는 베르티스 바이오테크놀로지에 아게(Vertis Biotechnologie AG; http://www.vertis-biotech.com/)에 의해 상업적으로 구성되었다. 노르웨이 고처리량 서열결정 센터(Norwegian High-Throughput Sequencing Centre; http://www.sequencing.uio.no/)에서 로슈(Roche) 454 서열결정 타이탄(TITAN) 기술을 이용하여 플레이트의 절반의 각각의 에이. 푼디엔세 CCMP 1719 및 에이. 미누툼 CCMP113 라이브러리를 서열결정하였다. 적어도 하나의 cDNA 어댑터를 보유하는 454 판독만을 추가로 고려하였다. 어댑터, 및 존재할 경우 전체 및 부분 와편모조류 스플라이싱 리더(spliced-leader; SL) 서열은 내부 PERL 스크립트를 사용하여 조립하기 전에 제거하였는데, 상기 스크립트는 이제 바이오인포매틱 도구 CLOTU 내에 통합된다. 판독은 주요 스위치 'denovo', 'est', 'accurate', 및 '454'를 이용하여 소프트웨어 프로그램 미라(Mira) v3.0.5를 사용하여 조립하였다.
두 454 라이브러리 내에서 추정 sxt 유전자 서열을 동정하기 위하여, 구입 BLAST 검색을 자유롭게 이용가능한 온라인 데이터 포털 'Bioportal'(www.bioportal.no)에서 수행하였다. 하기의 두 전략을 이용하였다: 시아노박테리아 sxt 유전자를 조립된 알렉산드륨 데이터세트 또는 조립되지 않은 454 판독 데이터세트 중 어느 하나에 대하여 질의하였다. e값 < 0.1인 모든 히트(hit)를 추출하고, 각각의 유전자에 대하여 최저 e값을 갖는 서열을 NCBI에서 비중복(non-redundant) 단백질 데이터베이스에 대하여 블라스트하였다(blasted).
sxtA에 있어서, 모든 검색한 서열을 10 bp의 최소 중첩 및 낮은 또는 높은 정렬 엄격도를 이용하여 소프트웨어 프로그램 CLC 바이오 메인 워크벤치(Bio Main Workbench)에서 재조립하였다. 생성된 콘틱 서열을 알고리즘 blastn, blastx 및 tblastx를 사용하여 NCBI에서 비중복 및 EST 데이터베이스에 대하여 블라스트하였다. sxtA 전사체의 구조는 보존 도메인 검색(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)에 의해서 뿐만 아니라 그의 번역된 서열을 시아노박테리아 유래의 sxtA에 대하여 정렬함에 의해서도 결정하였다. 시아노박테리아 유래의 sxtA의 촉매 잔기 및 기질 결합 잔기는 이전에 결정되었다. 전사체를 시그널(Signal)-3L(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Signal-3L/)의 3층 접근법 및 SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)에서 구현되는 신경망 및 은폐 마르코프(Markov) 모델을 이용하여 가능한 신호 펩티드의 존재 및 상응하는 절단 부위에 대하여 검색하였다. 막관통 나선을 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 플롯에 의한 소수성 프로파일 및 TMHMM 서버 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)을 사용하여 탐구하였다.
- RACE 분석
Primer3 소프트웨어(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/; 표 2)를 사용하여 sxtA에 대하여 유사성이 높은 콘틱의 보존된 영역 내에서 프라이머를 설계하였다.
Figure pct00002
GC 함량이 높은 전사체에 있어서 제조업자의 지시에 다라 어댑터 프라이머 AP를 사용하여 대략 95 ng의 폴리A 풍부화 mRNA를 이용하여 제1 가닥 cDNA를 합성하였다(3' RACE 시스템(System), 인비트로겐). RNase H 처리 후, 상기 RACE 생성물을 1:10으로 희석시키고, PCR용 주형으로 사용하였다. 전사체의 5' 말단을 증폭시키기 위하여, 3가지의 상이한 프로토콜을 이용하였다. 첫째, 장(Zhang)의 방법(문헌[Zhang et al . (2007) Spliced leader RNA trans-splicing in dinoflagellates. Proc Natl Acad Sci USA 104: 4618-4623])을 다음과 같이 약간 변형시켜 이용하였다: 상기에 설명한 3'RACE 라이브러리를 프라이머 AUAP(키트와 함께 공급된 어댑터 프라이머) 및 dinoSL을 이용하여 증폭시켜 전체 전사체를 풍부화하였다(PCR 프로그램: 94℃ - 60 s; 30 x (94℃ - 30 s, 68℃ - 5 min); 68℃ - 10 min; 8℃ 유지; PCR 화학은 하기를 참조). PCR 생성물을 1:10으로 희석시키고, 네스티드 PCR에서 주형으로 사용하였는데, 이는 정방향 및 몇몇 상이한 내부 역방향 프라이머로서 dinoSL 프라이머를 이용하여 증폭시켰다(표 2). 또한, 이들 실험은 2개의 키트, 5'RACE 시스템(인비트로겐) 및 진레이서(GeneRacer) 키트(인비트로겐)를 사용하였으며, 이는 제공된 5' 어댑터 프라이머 및 몇몇 상이한 내부 역방향 프라이머(표 2)를 사용하였다. 모든 생성물을 클로닝하고, 서열결정하였으며, 이는 하기에 기술된 바와 같았다.
- PCR 및 서열결정
모든 PCR 반응은 주형, 1 단위의 10X BD 어드밴티지(Advantage) 2 PCR 완충제(비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)), 0.2 mM dNTP, 0.5 μM의 각각의 정방향 및 역방향 프라이머(표 2), DMSO (10%의 최종 농도) 및 0.25 단위의 50X BD 어드밴티지 2 폴리머라아제 믹스(비디 바이오사이언시즈)를 함유하는 25 ㎕의 체적에서 실시하였다. 달리 언급되지 않으면, PCR은 하기와 같이 증폭시켰다: 94℃ - 2.5 min; 5 x (94℃ - 30 s; 68℃ - 가변적); 5 x (94℃ - 30 s; 66℃ - 30 s; 68℃ - 가변적); 25x (94℃ - 30 s; 64℃ - 30 s; 68℃ - 가변적); 68℃ - 10 min; 8℃ - 유지. PCR 생성물을 1% 에티듐 브로마이드 염색된 아가로스 겔 상에서 가시화하고, 잘라내고, 위자드(Wizard)(등록상표) SV 겔 및 PCR 클린업 시스템(Clean-up System)(프로메가(Promega))을 이용하여 세정하고, TOPO TA(등록상표) 클로닝 키트를 이용하여 클로닝하였으며, 이는 제조업자의 지시에 따른 것이었다(인비트로겐; pCR(등록상표)2.1-TOPO(등록상표) 벡터; 원TITOne Shot)(등록상표) Mach1TM T1 파지 내성의 화학적 적격 이. 콜라이 세포). 1 단위의 10 X 표준 PCR 완충제(퀴아젠(Qiagen)), 0.4 μM의 프라이머 TopoF 및 TopoR(표 2), 0.2 mM dNTP, 및 1 단위의 핫스타탁(HotStarTaq)(퀴아젠)을 함유하는 25 ㎕ PCR 반응물에 개별 콜로니를 직접적으로 첨가하였다. 사이클링 조건은 95℃ - 15 min, 30 x (94℃ - 30 s; 60℃ - 30 s; 72℃ - 90 s), 72℃ - 5 min, 8℃ - 유지였다. PCR 생성물을 희석시키고, 클로닝 키트와 함께 공급된 프라이머 M13F 및 M13R을 사용하여 양쪽으로부터 직접적으로 생거(Sanger) 서열결정하였다.
- SxtA1 및 sxtA4 게놈 증폭
모든 와편모조류 주(표 1)를 추정 sxtA1 및 sxtA4 유전자의 존재에 대하여 테스트하였다. 상기에 기술된 프로토콜에 따라 gDNA를 사용하여 PCR을 실행하였다. sxtA1 단편을 프라이머 sxt001 및 sxt002(대략 550 bp)를 이용하여 증폭시키고, sxtA4 단편을 프라이머 sxt007 및 sxt008(대략 750 bp)(표 2)을 이용하여 증폭시켰다.
- 계통발생적 분석
와편모조류 뉴클레오티드 서열들은 상응하는 아미노산 서열로 번역되기 전에 올바른 판독 프레임의 코딩 서열을 고려하여 맥클레이드(MacClade) v4.07(문헌[Maddison and Maddison (1992) MacClade. 3 ed: Sinauer Associates] 참조)을 사용하여 수동으로 정렬하였다. 와편모조류 아미노산 서열들은 후속적으로 MAFFTv6 L-INS-I 모델을 이용하여 시아노박테리아의 오르토로그 sxt 서열에 대하여 정렬하였으며, 이외에도 외군을 구성하는, 밀접하게 관련된 NCBI nr Blastp 히트를 선발하였다. 생성된 정렬을 수동으로 체크하고, 열등하게 정렬된 위치를 맥클레이드 v4.07(상기 문헌[Maddison and Maddison (1992)] 참조)을 사용하여 배제시켰다.
ProtTest v2.4(문헌[Abascal et al . (2005) ProtTest: selection of best-fit models of protein evolution. Bioinformatics 21: 2104-2105] 참조)는 모든 추론된 정렬의 최적 진화 모델로서 WAG를 결정하였다. 최대 가능성(Maximum Likelihood; ML) 분석을 RAxML-VI-HPCv7.2.6, 25가지의 등급 카테고리(rate category)를 갖는 PROTCATWAG 모델(문헌[Stamatakis (2006) RAxML-VI-HPC: Maximum likelihood-based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics 22: 2688-2690] 참조)을 이용하여 수행하였다. 가장 유망한 토폴로지(topology)를 100회의 별도 검색으로부터 확립하고, 부트스트랩 분석을 100회의 허위 복제를 이용하여 수행하였다. 베이시안 추론을 필로베이예스(Phylobayes) v3.2e(문헌[Lartillot and Philippe (2004) A Bayesian mixture model for across-site heterogeneities in the amino-acid replacement process. Mol Biol Evol 21: 1095-1109]; 및 문헌[Lartillot and Philippe (2006) Computing Bayes factors using thermodynamic integration. Syst Biol 55: 195-207] 참조)를 사용하여, 4개의 카테고리 하의 개별 교차 부위 변동 및 혼합 카테고리의 가상 번호를 이용하여 동일 치환 모델 하에서 수행하였다. 계통수는 이심렬들(partitions)(사슬들) 사이의 가장 큰 최대 차이가 <0.1일 때 추론되었다. 모든 모델의 추정 및 계통발생적 분석을 자유롭게 이용가능한 '바이오포털'(http://www.bioportal.uio.no/)에서 행하였다.
- 카피수 결정
알렉산드륨 카테넬라 주 ACSH02의 삼중 200 ml 배치(batch) 배양물을 이전에 기술한 바와 같이 성장시켰으며, 도립 광학 현미경(라이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems)) 및 세지위크-라프터(Sedgewick-Rafter) 챔버를 사용하여 3일마다 풍부함을 계수하였다. gDNA 추출용의 10 ml 샘플을 초기 대수기, 후기 대수기 및 정지기에 취하였다.
qPCR에 적합한 프라이머는 프라이머 3 소프트웨어를 사용하여 sxtA4 영역을 포함하는 에이. 푼디엔세 및 에이. 미누툼 454 판독의 정렬에서의 보존된 영역을 기초로 하여 설계하였으며, 이는 161 bp 생성물을 증폭시켰다. qPCR 사이클을 SYBR 그린(Green) PCR 마스터 믹스(인비트로겐)를 사용하여 로터 진(Rotor Gene) 3000(코베트 라이프 사이언스(Corbett Life Science))에서 실시하였다. 12.5 ㎕의 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스, 1 ㎕의 주형 DNA, 1 ㎕의 각각의 프라이머쌍, 1 ㎕의 BSA 및 8.5 ㎕의 밀리큐(MilliQ) 물로 이루어진 25 ㎕ 체적의 최종 체적에서 qPCR 분석을 수행하였다. qPCR 분석을 하기 프로토콜을 이용하여 삼중으로 수행하였다: 95℃, 10 s, 및 95℃, 15 s 및 60℃, 30 s의 35회 사이클. 용융 곡선 분석을 각각의 프로그램의 마지막에 수행하여 증폭 특이성을 확인하고, 선택된 PCR 생성물을 서열결정하였다. 표준 곡선은 2 - 2 x 10-5 ng의 범위의, 공지된 농도의 신선 PCR 생성물의 10배 희석 시리즈로부터 작성하였다. PCR 생성물의 분자를 결정하였다:
PCR 생성물의 분자를 결정하였다: (A x 6.022 x 1023) x (660 x B)-1, 이때 A: PCR 생성물의 농도, 6.022 x 1023: 아보가드로수(Avogadro's number), 660: 염기쌍당 평균 분자량 및 B: PCR 생성물의 길이. qPCR 주형에 있어서 공지되지 않은 샘플 중 분자의 수를 결정하고, 이를 공지된 수의 세포로 나누어 세포당 카피수를 수득하였다. 검출 한계는 대략 5000 카피의 유전자 서열 (즉, 분석당 대략 20 - 30개의 세포, 각각은 대략 200 카피의 서열을 포함함)이었다. 그러나, 상기 분석을 이 수의 10 - 100배의 세포를 이용하여 실행하였으며, 따라서 검출 한계에서 또는 검출 한계에 가깝게 실행한 것은 아니었다.
결과
- 에이. 미누툼 및 에이. 푼디엔세의 트랜스크립톰(transcriptome)에서의 sxt 서열의 확인
454 서열결정에 의해, 에이. 미누툼의 경우 589,410개의 미가공(raw)판독, 및 에이. 푼디엔세의 경우 701,870개의 미가공 판독을 생성하였다(SRA028427.1: 각각 샘플 SRS151150.1 및 SRS151148.1). 품질 조절 후, 판독들을 에이. 미누툼의 경우 44,697개의 콘틱 및 539개의 싱글톤(singleton)으로 조립하고, 에이. 푼디엔세의 경우 51,861개의 콘틱 및 163개의 싱글톤으로 조립하였다. 콘틱의 길이 및 GC 함량은 둘 모두의 라이브러리에 있어서 유사하였으며: 669 bp(±360) 및 678 bp(±361)의 평균 서열 길이(±SD) 및 59% 및 58%의 GC 함량이 각각 에이. 미누툼 및 에이. 푼디엔세에 대하여 계산되었다.
시아노박테리아 sxtA 유전자에서의 조립되지 않은 454개의 cDNA 라이브러리 판독의 검색에 의해 각각 에이. 푼디엔세의 경우 94개의 히트, 및 에이. 미누툼의 경우 88개의 히트를 생성하였다. 조립된 데이터세트에서의 동일 검색은 에이. 푼디엔세로부터의 10개의 콘틱 및 에이. 미누툼 라이브러리로부터의 9개로 되돌아왔다. 모든 서열의 풀링(pooling) 및 재조립 후, 2개의 콘틱은 시아노박테리아 유래의 sxtA에 대하여 높은 유사성을 나타냈는데, 하나는 도메인 도메인 sxtA1 (콘틱 길이 = 1450 bp, GC = 60.1%, 비트 스코어(bit score) = 213, e값 = 5e-61), 그리고 다른 하나는 sxtA4 (콘틱 길이 = 1059 bp, GC = 65%, 비트 스코어 = 195, e값 = 1e-47)에 대하여 그러하였다. 둘 모두의 콘틱은 둘 모두의 알렉산드륨 라이브러리로부터의 서열을 함유하였지만, 어떠한 것도 전체 ORF, 와편모조류의 스플라이싱되는 리더 서열 또는 폴리A-테일(tail)을 함유하지 않았다. 상기 두 콘틱을 사용하여 게놈 증폭, RACE 분석 및 서열결정을 위한 sxtA1 및 sxtA4 프라이머를 설계하였다.
나머지 코어 sxt 유전자에 대한 인실리코 검색 결과가 표 3에 요약되어 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005

sxtA와는 별도로, 우수한 정렬 스코어(비트 스코어 > 55) 및 고도로 유의한 e값(< e-20)을 갖는 콘틱을 둘 모두의 라이브러리에서의 아미디노트랜스퍼라아제 유전자 sxtG에 대하여 회복하였다. NCBI nr 단백질 데이터베이스에 대하여 e값이 최저인 콘틱을 재블라스팅하였더니, 가장 유사한 유전자가 악티노박테리아(actinobacterial) 글리신 아미노트랜스퍼라아제인 반면 시아노박테리아 유래의 sxtG에 대한 유사성은 더 적었지만 여전히 고도로 유의함이 밝혀졌다(표 3). 코어 생합성 유전자 sxtB, sxtF /M, sxtH /T, sxtI, sxtR 및 sxtU에 있어서, e값 ≤ 0.1인 콘틱을 둘 모두의 알렉산드륨 라이브러리로부터 회복한 반면, sxtS만이 에이. 미누툼 라이브러리에서 히트를 가졌다(표 3). 상기 라이브러리들 중 어느 하나에서 어떠한 매치도 sxtC, sxtD 및 sxtE에 대하여 회복되지 않았다. SxtC 및 sxtE는 공지되지 않은 단백질이며, sxtD은 스테롤 데새츄라아제 유사 단백질이다. 시아노박테리아 유전자에 대하여 유사성이 전혀 없는 와편모조류 단백질이 그의 기능을 수행하는 것이 가능하다. 대안적으로, 이러한 유전자들은 생성된 데이터세트에 존재하지 않았다. 데이터세트는 포괄적인 것이지만, 이것은 완전한 것은 아니다. 예를 들어, sxtA 전사체의 일부 영역도 454 데이터세트에서 회복되지 않았으며, 단지 RACE 분석을 통하여 수득하였다(상기 참조). NCBI nr 단백질 데이터세트에 대한 재블라스팅은, 상응하는 시아노박테리아 sxt 유전자에서 코딩된 것과 유사한 sxtB (단지 에이. 푼디엔세), sxtF /M, sxtH/T, sxtI, 및 sxtU의 단백질에 대한 히트를 검색하였다. 실제 서열 유사성은 덜 보존되어 있었으며, 알렉산드륨 콘틱과 시아노박테리아 sxt 유전자 사이의 유의한 히트는 전혀 관찰되지 않았다.
- 에이. 푼디엔세에서의 sxtA 의 전사체 구조
RACE 실험에 의해 2가지의 상이한 sxtA 유사 전사체 패밀리를 생성하였다. 이들 둘 모두는 와편모조류의, 5' 말단의 스플라이싱되는 리더 서열 및 3' 말단의 폴리A-테일을 갖지만, 이들은 서열, 길이, 및 이들이 코딩하는 sxt 도메인의 수가 달랐다. 더욱 짧은 전사체는 도메인 sxtA1, sxtA2 및 sxtA3을 코딩하는 반면, 더욱 긴 전사체는 모든 4가지 sxtA 도메인을 코딩하는데, 이는 시아노박테리아 sxtA 유전자에 의해서도 코딩된다(도 1).
상기 더욱 짧은 전사체의 콘센서스(consensus) 서열은 폴리A-테일을 제외하고서 3136 bp였다. SL 리더를 갖는 8개의 클론을 서열결정하고, 3개의 상이한 5'UTR을 알아냈다. 상기 서열들은 거의 동일하였지만, 하나의 클론은 15 bp를 가졌으며, 또 다른 것은 정확하게 SL-서열 이후에 19 bp 인서트를 가졌다. 상기 두 서열 인서트들은 길이와는 별도로, 동일하였다. 각각의 클론에 있어서, 서열결정한 9개의 3'UTR은 거의 동일하였으며, 폴리A-테일은 동일 위치에서 출발하였다. 이러한 더 짧은 sxtA 전사체의 도메인 구조는 하기와 같았다: 아미노산 잔기 1-27은 신호 펩티드를 코딩한다. 잔기 28-531은 sxtA1에 상응하며, 이는 3개의 보존된 모티프(I: VDTGCGDGSL(서열 번호 214), II: VDASRTLHVR(서열 번호 215), III: LEVSFGLCVL(서열 번호 216))를 함유한다. 잔기 535-729는 촉매 도메인 557-W, 648-T, 663-H, 711-R을 포함하는 sxtA2에 상응하는 반면, 상기 짧은 전사체의 마지막 도메인인 sxtA3은 포스포판테테이닐 부착 부위 783-DSL-785를 포함하는 잔기 750-822에 상응한다.
더욱 긴 sxtA 전사체의 콘센서스 서열은 4613 bp였다(다수결 원칙, 가장 긴 3'UTR, 폴리A-테일을 포함하지 않음, 도 1). SL-서열을 포함하는 5개의 클론을 특성화하였다. 이들 중 하나는 일반적인 G 대신 위치 15에서 A를 갖는 약간 다른 SL-서열을 가졌다. 모든 5'UTR은 길이가 97 bp였으며(SL 서열을 제외함) 서열 면에서 거의 동일하였다. 서열결정한 4개의 3' 클론 각각은 길이가 상이하였다(342, 407, 446 및 492 bp). 더욱 긴 sxtA 전사체의 도메인 구조는 하기와 같았다: 아미노산 잔기 1-25는 신호 펩티드를 코딩한다. 잔기 26-530은 하기 3개의 보존된 모티프: I: VVDTGCGDG(서열 번호 217), II: VDPSRSLHV(서열 번호 218) 및 III: LQGSFGLCML(서열 번호 219)을 갖는 도메인 sxtA1에 상응하며; 잔기 535-724는 촉매적 잔기 556-W, 661-T, 693-H, 708-R을 갖는 도메인 sxtA2에 상응하며; sxtA3은 799-DSL-801이 포스포판테테이닐 부착 부위인 잔기 763-539에 상응하며; 마지막으로, 도메인 sxtA4는 잔기 894-1272에 상응한다.
상기 두 알렉산드륨 sxtA 전사체의 GC 함량은 시아노박테리아 sxtA 유전자보다 일관되게 더 높았다(도 2). GC 함량은 69%(긴 전사체), 62%(짧은 전사체) 및 43%(모든 시아노박테리아 sxtA 유전자)였다.
모든 알고리즘은 둘 모두의 전사체에 있어서 신호 펩티드(SP)의 존재 및 상응하는 절단 부위를 예측하였다. 그러나, 와편모조류에 있어서 클래스 I 막관통 나선 수송 펩티드를 나타낼 수 있는 막관통 나선은 예측되지 않았다. 전사체들 중 어떠한 것도 클래스 II 및 클래스 III 수송 펩티드에 대한 기준에 매칭되지 않았다.
젠뱅크 접근 번호는 짧은 것의 경우 JF343238이고 긴 sxtA 전사체의 경우 JF343239이며(다수결 원칙의 콘센서스 서열), 에이. 푼디엔세 CCMP 1719의 나머지의 클로닝된 RACE 서열의 경우 JF343357 - JF343432이다.
- 와편모조류의 sxtA1 및 sxtA4 서열의 계통 발생
이 연구에서 설계된 sxtA1 및 sxtA4 프라이머(표 2)는 일련의 독성을 갖는, 5가지의 종을 포함하는 18가지의 알렉산드륨 주 및 2가지의 김노디늄 카테나툼 주에 있어서 길이가 대략 550 bp(sxtA1) 및 대략 750 bp(sxtA4)인 단일 밴드를 증폭시켰다(표 1). 어떠한 sxtA1 또는 sxtA4 PCR 생성물도 5가지의 STX 비생성 알렉산드륨 아피네 및 알렉산드륨 안데르소니이 주에 있어서 증폭되지 않았으며, 감비에르디쿠스(Gambierdicus)속, 오스트레옵시스속, 프로로센트룸속, 암피디늄속의 STX 비생성 와편모조류에 있어서도 증폭되지 않았다(표 1). 이러한 PCR 기반의 결과는 일반적으로 독소 측정과 일치한다. 그러나, sxtA1 및 sxtA4 단편은 STX가 검출되지 않은 4가지의 에이. 타마렌세 주(ATCJ33, ATEB01, CCMP1771, ATBB01)의 게놈 DNA로부터 증폭되었다(표 1).
sxtA1의 계통발생적 분석(도 3; 도 5)는 모든 sxtA1 서열이 하나의 완전히 지원된 클러스터를 형성하였으며 이는 2개의 하위 클러스터로 나누어짐을 보여준다. 동일한 주의 일부 클론은 동일하였지만, 약간 상이한 클론들이 대부분의 주에 있어서 관찰되었다. 이러한 상이한 클론들은 계통발생 전체에 걸쳐 분포하였으며, 이는 일반적으로 종 관련 패턴 또는 주 관련 패턴이 없었다. 지. 카테나툼으로부터의 서열들만이 상기 하위 클러스터들 중 하나 내에서 단단한 분지를 형성하였다. 와편모조류 클러스터에 가장 가까운 친척은 시아노박테리아 sxtA 유전자 및 프로테오박테리아 폴리케티드 신타아제였다(도 3; 도 5).
모든 sxtA4 서열은 동일한 주로부터의 클론들이 전체에 걸쳐 분포된 하나의 잘 지원된 클러스터를 형성하였다(도 4a; 도 6). 시아노박테리아 sxtA 유전자 및 악티노박테리아 아미노트랜스퍼라아제는 가장 가까운 자매 클레이드를 형성하였다.
게놈 sxtA1 및 sxtA4 단편의 젠뱅크 접근 번호는 JF343240 - JF343356이다.
- sxtA4 의 카피수 및 다형성
qPCR 분석을 기초로 하면, 에이. 카테넬라에 있어서 상이한 성장 속도에서 3개의 시점에서 수집한 ACSH02의 삼중 배치 배양물에서 sxtA4의 100 - 240개의 게놈 카피가 발견되었다(도 4b).
sxtA4 도메인을 포함하고 에이. 푼디엔세 454 판독을 기초로 한 987 bp 콘틱의 분석에 의하면, 적어도 20가지의 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)가 나타났으며, 이 중 15가지는 사일런트(silent)하였다. SNP는 상기 판독 중 적어도 2개에서 나타나는 염기쌍 변화로서 정의하였다. 단일중합체 스트레치 및 인델(indel)을 무시하였다.
토론
- Sxt 유전자는 와편모조류 게놈에서 코딩된다
와편모조류 게놈은 대단히 크며[세포당 1.5 - 200 pg의 DNA; 52] 고도로 분기성이다. 최근의 추정에 의하면, 와편모조류 게놈이 38,000 내지 거의 90,000개의 단백질 코딩 유전자를 함유하는 것으로 예상되는데, 이는 인간 게놈에서 코딩되는 유전자의 수의 1.5 - 4.5배에 상응한다. 이 연구에 있어서 >120만개의 EST의 서열결정 결과는 시아노박테리아에서 STX 생합성에 연루된 유전자의 가까운 상동체가 STX 생성 와편모조류에 또한 존재함을 입증한다(표 3). 이의 와편모조류 기원을 추가로 확인하기 위하여 sxtA를 조사하였으며, 이는 상기 생합성 경로의 독특한 출발 유전자였다. 에이. 푼디엔세 CCMP 1719의 트랜스크립톰은 시아노박테리아에서 sxtA와 동일한 도메인 아키텍쳐(architecture)를 갖는 2가지의 상이한 전사체 패밀리를 함유하였다. 상기 두 전사체 패밀리는 길이, 서열, 및 그가 코딩하는 촉매 도메인의 수가 달랐다. 더욱 긴 전사체는 공지된 시아노박테리아 sxtA 유전자에 존재하는 모든 4개의 도메인을 함유하였지만, 더욱 짧은 전사체는 말단 아미노트랜스퍼라아제 도메인이 결여되었다(도 1). 박테리아 전사체와는 대조적으로, 상기 둘 모두의 전사체 패밀리는 3' 말단에 진핵 폴리A-테일을 보유하고 5' 말단에 와편모조류의 스플라이싱되는 리더 서열을 보유하였다. 따라서, 이들 결과는 적어도 sxtA, 및 가능하게는 다른 sxt 유전자가 와편모조류의 핵 게놈에서 코딩되며, 와편모조류에서의 STX 합성은 동시배양된 박테리아로부터 기원한 것이 아님을 명백하게 보여준다. 그러나, 이들 박테리아는 여전히 와편모조류에서의 STX 생합성의 조정에서 중요한 역할을 할 수 있다.
둘 모두의 전사체에서 확인된 신호 펩티드는 둘 모두의 Sxt 생성물의 특이적 표적화를 나타낸다. 와편모조류의 핵 게놈 내의 많은 유전자는 색소체 유래되며, 그 생성물은 색소체로 표적화되었다. 이들 단백질은 시토졸에서 번역되며, 그 후 색소체 막을 통하여 색소체로 수송된다. 알렉산드륨과 같은 페리디닌 함유 와편모조류에서, 이 과정은 신호 및 이전 펩티드 모티프의 존재를 요구한다. 둘 모두의 sxtA 전사체는 신호 펩티드를 함유하는 것으로 예측되지만, 이전 펩티드 구조는 확인되지 않았다. 따라서, 둘 모두의 sxtA 단백질은 시토졸 외부로 표적화되는 것으로 보이지만, 표적의 영역은 실험적으로 조사될 필요가 있다.
와편모조류 sxtA 전사체는 신호 펩티드, SL 서열 및 폴리A-테일의 존재에 의해서뿐만 아니라 그의 GC 함량 면에서도 시아노박테리아 상대방과 달랐다. 에이. 푼디엔세 EST는 GC 함량이 상당히 더 높았다(도 2). 알렉산드륨 종 유래의 전사 유전자는 평균 GC 함량이 > 56%인 것으로 보고된 반면, 사상 시아노박테리아, 예컨대 STX 생성 속인 실린드로스페르몹시스(Cylindrospermopsis), 아나베나(Anabaena), 아파니조메논(Aphanizomenon) 및 링비아(Lyngbya)는 게놈 GC 함량이 대략 40%이다. 이는 sxtA의 GC 함량이 이들 미생물에서의 나머지 게놈과 함께, 선조 sxtA 보유 조상에서 유의하게 벗어났음을 나타낸다.
STX 합성에 있어서의 상기 두 상이한 sxtA 전사체의 연루 및 이들의 역할은 현재 명백하지 않지만, GC 함량의 차이(도 2)는 이들이 상이한 선발 압력 하에 있음을 나타낸다.
- sxtA 의 동일하지 않은 카피: 게놈 및 트랜스크립톰 수준에서의 변동
와편모조류 게놈의 하나의 전형적인 특징은 유전자가 다수의 카피로 나타날 수 있다는 것인데, 이는 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있다. 이는 아마도 프로세싱된 cDNA의 재활용과 같은 고도로 특이한 유전자적 기작에 관련될 것이다. sxtA도 와편모조류 게놈 내에서 다수의 카피로 나타나는 것으로 보인다. 100 - 240 카피의 sxtA4 도메인이 에이. 카테넬라 ACSH02(온대 아시아 리보타입(temperate Asian ribotype))의 게놈 DNA에 존재하는 것으로 추정되었다. 세포 주기 전체에 걸쳐 검출되는 카피수 차이는 다양한 세포 주기 시기의 세포의 비율 및 배치 배양물의 성장 속도에 관련될 가능성이 있다. 15가지의 상이한 알렉산드륨 및 하나의 지. 카테나툼 주 유래의 모든 게놈 sxtA4 서열은 하나의 잘 지원된 계통발생적 클러스터를 형성하였으며, 이때 동일한 주의 약간 상이한 몇몇 클론 서열이 계통수 전체에 걸쳐 분포하였다. SxtA1도 분석한 모든 주에서 다수의 동일하지 않은 카피로 나타나는 것으로 밝혀졌다(도 5). 또한, 와편모조류 sxtA1 클러스터의, 2개의 하위 클레이드로의 분리는 sxtA1이 적어도 일부 주에서 2가지의 별도 유전자 클래스에 의해 코딩될 수 있음을 나타낸다..
sxtA의 게놈 변이가 알렉산드륨 트랜스크립톰에 또한 존재한다. 트랜스크립톰 데이터를 sxtA1 계통수에 부가하였더니, 상부 클레이드가 더욱 긴 sxtA 전사체에 상응하며, 반면에 더욱 낮은 클레이드는 더욱 짧은 전사체에 상응함이 나타났다(도 3, 도 5). 에이. 푼디엔세의 트랜스크립톰에서의 sxtA4 영역의 뉴클레오티드 수준에서의 분석에 의하면, 많은 SNP 부위가 나타났으며, 이 중 2/3은 사일런트하였다.
- sxtA1 , sxtA4 및 삭시톡신 생성 사이의 상관
이 연구 동안 확인된 sxtA1 및 sxtA4 게놈 서열은 에이. 카테넬라, 에이. 미누툼, 에이. 푼디엔세 및 에이. 타마렌세 종의 14가지의 알렉산드륨 주 및 2가지의 지. 카테나툼 주를 비롯하여 분석한 모든 STX 생성 와편모조류 주에 존재하였다. 상기 두 sxt 단편 중 어느 것도 2가지의 에이. 안데르소니 및 3가지의 에이. 아피네 주로부터 증폭되지 않았다. 상동체도 감비에르디스쿠스 아우스트랄레스, 암피디늄 마사르티이, 프로로센트룸 리마, 오스트레옵시스 시아멘시스 및 오스트레옵시스 오바타에서 검출되지 않았는데, 이들 중 어떠한 것도 STX를 생성하는 것으로 공지되어 있지 않다(표 1).
sxtA1 및 sxtA4의 존재와 분석한 대부분의 주의 STX 함량 사이의 매우 우수한 상관에도 불구하고, 어떠한 STX 생성도 검출되지 않은 에이. 타마렌세 주로부터 둘 모두의 단편이 증폭되었다(표 1). 에이. 타마렌세 주 CCMP1771의 RACE 분석에 의하면, sxtA1 및 sxtA4가 이 주에서 전사됨이 나타났다(데이터는 예시하지 않음). 에이. 타마렌세에 의해 생성되는 STX의 양은 사용한 HPLC/MS 독소 측정법의 검출 한계보다 더 낮다고 상정된다. 매우 민감한 삭시필린 분석법을 이용하여 에이. 타마렌세 주 ATBB01을 조사하였기 때문에, 이는 유독한 것으로 밝혀졌다. 전사체 풍부는 와편모조류 게놈에 존재하는 유전자 카피의 수에 양의 관련성을 가짐을 시사하였다. 따라서, 저수준의 STX를 포함하는 주는 더욱 큰 STX 생성을 갖는 것과 비교하여 더욱 적은 카피의 sxt 유전자를 갖는 것이 가능하다. 이것이 사실이라면, sxtA1 및 sxtA4의 존재는 독성을 나타내며, 분자적 방법을 개발하여 환경에서 STX 생성 세포를 검출할 수 있다.
- 진핵생물에서의 STX 합성의 진화 및 알렉산드륨의 다양화에서의 이의 역할
시아노박테리아 sxt 유전자는 시아노박테리아 종들 사이에서 고도로 보존되어 있으며, 유전자 클러스터는 적어도 21억년 전에 생긴 것으로 생각된다. 본원의 결과는, 시아노박테리아 sxtA 서열 및 다른 박테리아의 추정 독소 관련 유전자(도 3 및 도 4)의 클레이드에 계통발생적으로 밀접하게 관련된 와편모조류 sxtA 전사체가 시아노박테리아 sxtA 유전자(도 1)와 동일한 도메인 구조를 또한 가짐을 보여준다.이러한 두드러진 유사성은 조상 STX 생성 박테리아와 와편모조류 사이의 수평적 유전자 이전(horizontal gene transfer; HGT) 이벤트로 인한 것일 가능성이 가장 크다고 제안된다. 와편모조류 내에서, STX는 고니아울락스목 내의 고니아울라카세아에(Gonyaulacaceae)과에 속하는 알렉산드륨속 및 피로디늄속의 종에 의해 생성되며, 이외에도 김노디니움목 내의 김노디니아세아에(Gymnodiniaceae)과에 속하는 김노디늄속의 하나의 종에 의해 생성된다. 따라서, 이들 독소는 하나의 과 내의 2가지의 속에 의해, 그리고 먼 와편모조류 목 유래의 단일 종에 의해 생성된다. 와편모조류 내에서의 STX 합성의 이러한 분포와, 이외에도 알렉산드륨 및 김노디늄 카테나툼 sxtA 서열 사이의 가까운 유연 관계(도 3, 도 4, 도 5, 및 도 6)는 박테리아-와편모조류 HGT가 알렉산드륨속 및 피로디늄속의 기원 이전에 일어났을 가능성이 있으며, 이어서 지. 카테나툼 내로의 와편모조류-와편모조류 전달이 있었음을 시사한다. 진핵생물-진핵생물 HGT의 정도는 흔히 이러한 이벤트의 검출에서의 어려움으로 인하여 과소평가되지만, 최근의 연구는 이러한 유전자 전달의 중요성 및 유행을 강조한다.
이 연구에 있어서 와편모조류 sxtA 서열들 사이의 유연 관계는 해명되지 않았으며, 그 이유는 대부분의 내부 노드가 통계적으로 지원되지 못했기 때문이었다(도 5 및 도 6). 따라서, sxtA 유전자의 진화가 알렉산드륨속의 것을 반영하는지를 확신을 가지고 결정하는 것이 가능하지 않았거나, 알렉산드륨으로부터 지. 카테나툼으로의 추정 HGT의 기원을 결정하는 것이 가능하지 않았다. 그러나, 지. 카테나 툼, 에이. 미누툼, 및 에이. 카테넬라의 다수의 주 유래의 sxtA1 및 sxtA4 유전자 카피는 종에 의해 클러스터링되는 경향이 있었으며, 이는 이들의 역사가 이들 종의 진화를 반영함을 나타내는 것이었다. STX 비생성 종인 에이. 아피네 및 에이. 안데르소니 유래의 sxtA1 및 sxtA4의 비증폭은 sxtA 유전자가 이들 계열로부터 상실되었거나 너무나 많이 돌연변이되어서 본원에서 개발된 프라이머는 이들을 증폭시킬 수 없었음을 나타낼 수 있다.
2개의 알렉산드륨 EST 데이터세트는 시아노박테리아로부터 확인된 코어 sxt 유전자의 대다수에 대한 상동체를 코딩하는 전사체를 함유하였다(표 3). 시아노박테리아 sxt 유전자에 대한 유사성이 흔히 유의하더라도, 이것은 sxtA에 대하여 관찰된 것보다 훨씬 덜하였다. 가장 가까운 히트는 데이터베이스에 존재하는 다른 박테리아 또는 진핵생물 유전자에 대한 것이었다. 이는, sxt 경로 내의 상이한 유전자들이 와편모조류에서 별도의 기원을 가질 수 있음을 나타낸다. 추가의 연구가 이 유전자 클러스터의 복합적인 기원을 설명하는 데 요구되며, 상기 연구는 이들 고대의 그리고 중요한 미생물의 게놈 및 분자 생물학에 관한 추가의 진보를 초래할 것이다.
실시예 2: 와편모조류에서의 STX 생성의 정량적 검출 및 정량화 방법
재료 및 방법
- 배양물 유지
와편모조류 배양물(표 4)을 GSe(문헌[Doblin et al., 1999, supra ]) 또는 L1 배지(문헌[Guillard & Hargraves, 1993 supra ])에서 16-20℃에서 유지하였다. 광을 백색 형광 전구(크롬턴 라이트(Crompton Light))로 제공하였으며, 이때 12시간/12시간의 암/명 주기에서 광자속을 60-100 ㎛ol의 광자 m-2 sec-1로 하였다. 사용한 주는 유니버시티 오브 타스마니아(University of Tasmania)(엠. 드 살라스(M. de Salas)에 의해 단리됨), 호주 국립 해양 미세조류 배양 수집 센터(Australian National Culture Collection of Marine Microalgae), 프로바솔리-길라드 컬쳐 콜렉션(Provasoli-Guillard Culture Collection; CCMP) 및 코트론 인스티튜트 컬쳐 콜렉션(Cawthron Institute Culture Collection)에 의해 제공되었다.
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- DNA 추출 및 PCR
배양물 밀도를 세지위크-라프터 셀(프로쉬테크(Proscitech)) 및 도립 광학 현미경(라이카 마이크로시스템즈)을 사용하여 정기적으로 결정하였다. 공지된 수의 배양된 세포를 대수 성장기 동안 수확하였다. DNA를 CTAB법을 이용하여 세포 펠렛으로부터 추출하였으며 (문헌[Doyle and Doyle, 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19:1-5] 참조), 이때 추가로 하룻밤 동안 DNA를 -20℃에서 침전시켰다. DNA의 품질 및 양을 나노드롭(Nanodrop)(서모사이언티픽)을 이용하여, 그리고 440 bp 단편을 증폭시키는 프라이머쌍 4f 및 6r, 또는 대략 1780 bp를 증폭시키는 18S r DNA 프라이머 18SF08 (5'-TTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTG-3'(서열 번호 220)) 및 R0ITS (5'-CCTTGTTACGACTTCTCCTTCCTC-3'(서열 번호 221))를 사용하여 문헌[Lin et al. (2009)]의 프로토콜에 따라 대조 와편모조류 유전자(cytb 또는 SSU rRNA)를 증폭시킴으로써 결정하였다
- sxt qPCR 분석법 개발 및 카피수 결정
알렉산드륨 카테넬라, 에이. 타마렌세, 에이. 미누툼, 에이. 푼디엔세 및 김노디늄 카테나툼 종 (젠뱅크 접근 번호 JF343238 - JF343239, JF343259-JF343265)의 9가지의 주 유래의 sxtA4 게놈 서열의 정렬을 구성하였다. 상기 유전자 서열의 보존의 정도를 sxtA4 도메인의 440 bp 분획물에 대하여 체크하였더니, 알렉산드륨 종 사이에서는 94-98%이고 김노디늄 카테나툼과 알렉산드륨 종 사이에서는 89%임이 밝혀졌다. sxtA4에 특이적인 프라이머를 프라이머3(Primer3) 소프트웨어 및 콘센서스 서열을 이용하여 설계하였다. 그 후, 상기 프라이머 서열의 특이성을 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Centre for Biotechnology Information; NCBI)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 확인하였다. 프라이머들의 서열은 sxtA4F 5' CTGAGCAAGGCGTTCAATTC 3'(서열 번호 198) 및 sxtA4R 5' TACAGATMGGCCCTGTGARC 3'(서열 번호 199)이었으며, 이는 125 bp 생성물을 생성하였다.
STX 생성 주 또는 잠재적 STX 생성 주에 대한 이들의 특이성을 결정하기 위하여, 알렉산드륨의 6가지의 종, 김노디늄 카테나툼, 고니아울락스목의 3가지의 다른 독소 생성 종: 오스트레옵시스 오바타, 감비에르디스쿠스 아우스트랄레스, 오스트레옵시스 시아멘시스, 추가의 와편모조류, 암피디늄 마사르티이, 및 6가지의 동정된 와편모조류 종(표 4)을 포함하는 혼합 식물 플랑크톤 군집을 함유하는 환경 샘플로부터 상기 sxtA4 프라이머쌍을 증폭시켰다. PCR 증폭은 주형, 0.5 μM의 각각의 프라이머, 3 mM의 MgCl2, 1 ㎕의 BSA (엔이비(NEB)), 및 dNTP, 임몰라아제(Immolase) Taq 폴리머라아제 및 반응 완충액을 함유하는 10 ㎕의 임모믹스(Immomix)(바이오라인)를 함유하는 20 ㎕의 반응물 또는 주형, 0.2 μM의 각각의 프라이머, 3 mM의 MgCl2, 1 ㎕의 BSA, dNTP를 함유하는 2 ㎕의 마이탁(MyTaq) 반응 완충액(바이오라인), 0.2 ㎕의 마이탁(바이오라인) 고온 시작 폴리머라아제 및 H2O를 함유하는 20 ㎕에서 수행하였다. 고온 시작 PCR은 95℃, 5-10 min의 초기 변성 단계, 및 95℃, 30 s, 55 또는 60℃, 30 s(각각 cytb 및 sxtA4 프라이머의 경우), 72℃, 30 s의 35 사이클, 이어서 72℃, 7 min의 최종 연장 단계를 이용하여 수행하였다. 18S 단편을 주형, 1 유닛의 10X BD 어드밴티지(Advantage) 2 PCR 완충액(비디 바이오사이언시즈), 5 mM의 dNTP, 0.2 μM의 각각의 프라이머, DMSO(10%의 최종 농도) 및 0.25 유닛의 50X BD 어드밴티지 2 폴리머라아제 믹스(비디 바이오사이언시즈)를 함유하는 25 ㎕의 반응물에서 증폭시켰다. PCR을 하기와 같이 증폭시켰다: 94℃ - 1 min; 30 x (94℃ - 30 s; 57℃ - 30 s; 68℃ - 120 s); 68℃ - 10 min; 8℃ - 유지. 생성물을 3% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 분석하고, 에티듐 브로마이드로 염색하고, 가시화하였다.
또한, 큰 서브유닛(large subunit; LSU)의 리보좀 RNA 영역의 영역(문헌[Hosoi Tanabe and Sako, 2005])을 기초로 한, 160 bp 단편을 증폭시키는, 호주 온대 수역에서 발견되는, 알렉산드륨 카테넬라의 온대 아시아 리보타입에 특이적인 프라이머쌍, catF (5'-CCTCAGTGAGATTGTAGTGC-3'(서열 번호 222)) 및 catR (5'-GTGCAAAGGTAATCAAATGTCC-3'(서열 번호 223))을 사용하여 qPCR을 수행하였다. 분석을 환경 샘플에서 수행하고, 이 LSU rRNA 프라이머쌍의 새로운 표준 곡선을 엠. 드 살라스(UTAS)에 의해 호주 수역으로부터 단리된 하기 주를 기초로 하여 작성하였다: 대략적으로 브리즈번 워터 위치로부터 20 km, 그리고 조지스 리버 위치로부터 50 km의 NSW, 코완 크릭으로부터 단리된 ACCC01, 대략적으로 조지스 리버 위치의 북쪽 35 km의 시드니 하버로부터 단리된 ACSH02, 및 호주 타스마니아로부터 단리된 ACTRA02.
SSOFast 에바그린 수퍼믹스(Evagreen supermix)(바이오라드(Biorad))를 사용하여 로터 진(Rotor Gene) 3000 (코베트 라이프 사이언스)에서 qPCR 사이클링을 실시하였다. qPCR 분석은 10 ㎕의 에바그린 마스터 믹스(DNA 삽입 염료, 완충액 및 Taq 폴리머라아제를 함유함), 1 ㎕의 주형 DNA, 0.5 μM의 각각의 프라이머 및 1 ㎕의 BSA로 이루어진 20 ㎕의 최종 체적으로 수행하였다. qPCR 분석을 삼중으로, 하기 사이클을 이용하여 수행하였다: 95℃, 10 s, 및 95℃, 15 s 및 60℃, 30 s의 and 35회 반복. 용융 곡선 분석을 각각의 사이클의 마지막에 수행하여 증폭 특이성을 확인하고, 선택된 PCR 생성물을 서열결정하였다.
sxtA4 및 LSU rRNA 둘 모두의 표준 곡선을 하기의 2가지 방법으로 작성하였다: (1) 5.7 - 5.7 x 10 -5 ng (n=6)의 범위의, 공지된 농도의 신선 PCR 생성물의 희석 시리즈의 이용. PCR 생성물을 사용한 표준 곡선을 이용하여 분석의 효율을 결정하였으며 (문헌[Pfaffl, (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR Nucleic Acids Res. 2001 May 1;29(9):e45]의 방법 참조), 이외에도, 카피수를 결정하였다. PCR 생성물의 분자를 결정하였다: (A x 6.022 x 1023) x (660 x B)-1, 이때 A: PCR 생성물의 농도, 6.022 x 1023: 아보가드로수, 660: 염기쌍당 평균 분자량 및 B: PCR 생성물의 길이. DNA의 qPCR 주형에 있어서 공지되지 않은 샘플 중 분자의 수를 결정하고, 이를 공지된 수의 세포로 나누어 세포당 카피수를 수득하였다. (2) 대수 성장기 동안 취해진 알렉산드륨 카테넬라 주(ACCC01, ACSH02, ACTRA02)의 공지된 수의 세포의 이중 샘플로부터의 DNA의 추출, 및 이 DNA를 3의 크기 차수(n=6)에 걸쳐 50%로 희석시킴.
LSU rRNA 분석에 기초하여 샘플에서의 에이. 카테넬라의 환경적 풍부함을 개산하기 위하여, (2)로부터의 방정식을 외삽하고, 이들 샘플에 대하여 측정된 CT값에 적용하였다. 일부 악렉산드륨 종의 주들 사이에서 rRNA 유전자의 카피수에서의 변이성이 발견되었으며, 이외에도 세포의 성장 및 세포 주기 조건에서의 변이성으로 인한 2의 기대 요인까지의 변이성이 발견되었기 때문에, 상기 3가지의 주 각각의 이중 샘플에서의 LSU rRNA 유전자 영역의 카피수를 결정하였다. 환경 샘플에서의 최종적인 에이. 카테넬라 풍부성을 6개의 독립적인 개산치의 평균 및 표준 편차로서 결정하였다.
- 식물 플랑크톤 및 굴 샘플의 수집
호주, NSW -36' 13" E 150' 6" S, 나루마, 와공가만 및 NSW -34' 1" E 151' 8" S 조지스 리버의 시드니 바위 굴(사코스트레아 글로메라타(Saccostrea glomerata)) 농장에 가까운 표준 모니터링 장소에서, 2010년 11월 15일-20일 동안 중간 조수에서 매일 식물 플랑크톤 군집을 샘플링하였다(도 7). 또한 샘플을 2010년 7월 22일에 NSW -33' 28" E 151' 18" S 브리즈번 워터에서 취하였다.
분자적 분석을 위하여 매일 4 L 병의 삼중 샘플을 취하였다. 추가의 500 ml 병을 취하고, 현미경적 동정 및 계수를 위하여 즉각적으로 루골 요오다이드(Lugol's iodide)로 고정하였다. 샘플을 3 μm 밀리포어(Millipore) 필터를 사용하여 여과하고, DNA를 추출할 때까지 -20℃에서 냉동시켰다. 10개의 개별 에스. 글로메라타 샘플을 2010년 11월 17일 및 2010년 11월 19일에 식물 플랑크톤 샘플링 장소의 바로 근처의 농장으로부터 취하였다. 에스. 글로메라타 샘플을 독소 테스트용으로 풀링하였다(pooled).
혼합 환경 샘플에서의 상기 프라이머쌍의 특이성을 결정하기 위하여, 공지된 STX 생성 종이 존재하지 않는 식물 플랑크톤 군집을 샘플링하였다. 저비스 베이에서의 표면 군집 1 L를 2011년 1월 19일에 샘플링하고, 보존하고, 농축하고, 상기와 같이 500 ml로부터 존재하는 종을 동정 및 계수하였다. 존재하는 와편모조류는 프로토세라티움 레티쿨라툼, 카를로디늄 cf 베네피쿰(Karlodinium cf veneficum), 카레니아(Karenia) 종, 프로로센트룸 미칸스(Prorocentrum micans), 폴라렐라 글라시알리스, 피에스테리아 슈뫄야에(Pfiesteria shumwayae), 및 심비오디늄(Symbiodinium) 종으로 동정되었다. 500 ml의 나머지 샘플을 여과하고, DNA 추출 및 PCR을 수행하였으며, 이는 상기에 기술된 바와 같다.
- 현미경법을 이용한 알렉산드륨 세포 계수
대략 300 ml의 루골 보존 샘플 중 식물 플랑크톤을 5 μm 셀룰로오스 에스테르 필터(어드밴텍(Advantec)) 상으로의 중력 보조 막 여과에 의해 농축시킨 후 4 ml 내로 세척하고 계수하였다. 알렉산드륨 종들을 위상차 광학 기기를 갖춘 차이스 악시오랩(Zeiss Axiolab) 현미경 및 세지위크 라프터 셀을 사용하여 동정 및 계수하였다. 계수된 세포의 수는 알렉산드륨 풍부성에 따라 샘플들 사이에서 다양하였으며, 표준 오차율을 하기 방정식: 오차 = 2/√n을 사용하여 계산하였고, 상기 방정식에서 n은 샘플에서 관찰된 세포의 수이다.
- 굴 및 배양물에서의 독소의 측정
뉴질랜드 소재의 코트론 인스티튜트에서 조개에서의 마비성 패독 독소에 대하여 문헌[AOAC Official Method 2005.06]에 따라 HPLC를 사용하여 조개 샘플 및 와편모조류 세포 펠렛을 테스트하였다. 원래 프로토콜에 기술된 것과 같은 매트릭스 변형자를 사용하지 않았으며, 대신, 각각의 별도의 화합물에 대한 사용된 평균 스파이크 회수율을 사용하였다. HPLC 분석은, 워터스(Waters) 어퀴티(Acquity) FLR 검출기에 결합된 워터스 어퀴티 UPLC 시스템(워터스)에서 수행하였다. 30℃에서 워터스 어퀴티 C18 BEH 1.7 μm 2.1 x 50 mm 컬럼에서 분리를 달성하고, 0.2 mL min- 1으로 용출시켰다. 이동상은 0.1 M 포름산암모늄(A) 및 5% 아세토니트릴 중 0.1 M 포름산암모늄(B)이었으며, 이들 둘 모두는 pH 6으로 조정하였다. 구배는 0.5 min 동안 100% A, 3.5 min에 걸친 80% B로의 선형 구배, 그 후 0.1 min에 걸친 초기 조건으로의 되돌아감, 및 1.9 min 동안의 유지로 이루어졌다. 형광 검출기는 340 nm로의 여기 설정치 및 395 nm로의 방출 설정치를 가졌다. STX 유사체의 분석 표준물을 캐나다 국립 연구 위원회(National Research Council)로부터 획득하였다. 세포 배양물의 HPLC의 검출 한계는 NEO 및 STX의 경우 세포당 0.1 pg, GTX1/4, GTX6(B2) 및 GTX5(B1)의 경우 세포당 0.2 pg, C1,2의 경우 세포당 0.5 pg 및 유사체 C3,4의 경우 세포당 <0.3 pg인 것으로 간주되었다.
결과
- 프라이머쌍의 특이성, 민감성 및 효율
이 연구에서 설계한 프라이머는 하기 종: 알렉산드륨 미누툼, 에이. 카테넬라, A 푼디엔세, 에이. 타마렌세 및 김노디늄 카테나툼(표 4)의 모든 테스트한 STX 생성 와편모조류에서 올바른 크기의 단편을 증폭시키는 것으로 밝혀졌다. 게다가, 이것은 이용한 HPLC법의 검출 한계 초과의 수준으로 STX를 생성하는 것으로 밝혀진 것이 아닌, 에이. 타마렌세 종, ATCJ33 주 타스마니안 리보타입으로부터 올바른 크기의 단편을 증폭시켰다. 상기 생성물의 서열결정은 이것이 sxtA4의 상동체임을 확인해 주었다.
sxtA4 프라이머쌍은 STX 비생성 관련 고니아울라칼레안(Gonyaulacalean) 종인 알렉산드륨 안데르소니이, 알렉산드륨 아피네, 감비에르디스쿠스 아우스트랄레스, 오스트레옵시스 오바타 또는 오스트레옵시스 시아멘시스로부터 DNA를 증폭시키지 않았으며, 더욱 멀리 관련된 와편모조류 종인 암피디늄 마사르티이로부터도 DNA를 증폭시키지 않았다. 게다가, sxtA4 프라이머쌍은 박테리아, 규조류, 초미세 플랑크톤 및 와편모조류 와편모조류 프로토세라티움 레티쿨라툼, 카를로디늄 cf 베네피쿰, 카레니아 종, 프로로센트룸 미칸스, 폴라렐라 글라시알리스, 피에스테리아 슈뫄와에, 및 심비오디늄 종(표 4)을 포함하는 혼합 플랑크톤 군집을 함유하는 식물 플랑크톤 샘플로부터 DNA를 증폭시키지 않았다. 이와는 대조적으로, 모든 샘플로부터의 DNA를 양성 대조 프라이머쌍을 이용하여 증폭시켜 반응 주형이 온전하고 저해자가 없음을 보장하였다.
이 프라이머쌍을 기초로 한 sxtA4 분석의 효율은 6의 크기 차수에 걸친 신선 PCR 생성물의 희석 시리즈를 이용하여 계산할 경우 97%였다. 에이. 카테넬라의 3가지의 주로부터의 gDNA의 이중 50% 희석 시리즈를 이용하여 계산할 때 상기 분석법은 93-107% 효율적이었다(도 8). 둘 모두의 PCR 생성물을 기초로 한 그리고 gDNA를 기초로 한 표준 곡선에 있어서, 회귀 방정식의 r 2 값들은 0.95 이상이었다(도 8). 상기 분석법은 에이. 카테넬라의 3가지의 주의 대략 30 내지 >2000개의 세포를 나타내는 DNA 양에 대하여 민감하였다. 따라서, 이용한 것과 유사한 프로토콜에 따라 샘플 수집을 실시하고, 4 L의 해수를 수집하고, 추출하고, 15 μL로 용출시키고, 이 중 1 μL를 분석한다면, 상기 분석법은 L당 대략 110개의 세포의 하한치로 에이. 카테넬라의 환경중 농도를 검출한다.
- sxtA4 유전자의 카피수
알렉산드륨 카테넬라의 3가지의 배양된 주에서의 sxtA4의 카피수는 평균이 세포당 178-280이었다(표 5). 이들 주의 독성은 세포당 3.1-6.6 pg의 STX 등가물이었다(표 5). 환경 샘플에 있어서, sxtA4의 카피수는 각각 조지스 리버 및 와공가만 샘플에 있어서 세포당 226 및 376인 것으로 개산되었으며, 개산치들 사이에서 가장 가변적인 것은 와공가만 샘플을 기초로 한 것이었다.
Figure pct00007
환경 샘플
sxtA4를 조지스 리버 및 와공가만 샘플 세트에서 뿐만 아니라 단일 브리즈번 워터 샘플에서 검출하였다(도 9). 서열결정 및 용융 곡선 분석에 의하면, 이것은 알렉산드륨 카테넬라 주 유래의 상응하는 유전자에 대하여 평균 동일성이 99% 이상인 sxtA4인 것으로 확인되었다. 현미경법으로부터 개산된 세포수, LSU rDNA로부터 개산된 세포수 및 sxtA4 카피수 사이의 양의 관계가 환경 샘플의 둘 모두의 세트에서 관찰되었다. LSU rRNA 유전자 qPCR로부터 개산된 세포수와 개산된 sxtA4 유전자 카피수 사이의 상관성은 조지스 리버 샘플의 경우 매우 높았으며(r 2 =0.97, 기울기=0.0059, p<0.001), 와공가만 샘플의 경우 더 낮았다(r 2 =0.70, 기울기= 0.001, p<0.07) (도 9).
풀링된 에스. 글로메라타 샘플 중의 STX를 이들 세 장소 각각으로부터 검출하였으며, 이때 최고 농도가 조지스 리버 장소에 대하여 보고되었고(조개 1 kg당 200 ㎍의 STX 등가물), 더욱 낮은 수준이 와공가만 및 브리즈번 워터에 대하여 보고되었다(각각 조개 1 kg당 48 및 145 ㎍의 STX 등가물, 표 5).
토론
본원에 제공된 것은 해양 환경 샘플에서의 STX 생성에 대한 잠재력을 검출 및 정량화하는 새로운 방법이다. 본 분석법은 sxt 경로에 추정적으로 연루된 독특한 효소를 코딩하는 유전자 sxtA의 검출을 기초로 한다. 기술된 방법은 모든 STX 생성 배양물에서 sxtA 유전자를 검출하였으며, STX 비생성 배양물 또는 공지된 STX 생성 종을 함유하지 않는 환경 샘플에서는 이것을 검출하지 않았다. 그러나, sxtA 유전자는 또한 알렉산드륨 타마렌세의 비생성 주, 타스마니안 리보타입, ATCJ33에서 검출되었다. 이 종의 타스마니안 리보타입의 매우 밀접하게 관련된 주는 STX를 생성하는 것으로 밝혀졌기 때문에(공개되지 않은 데이터), 주 ATCJ33은 특정한 환경 하에서 STX를 생성하는 잠재력을 갖는다. 이 연구에서의 주 및 알렉산드륨 및 김노디늄 카테나툼 종으로부터의 sxtA4의 증폭은 상기 실시예 1에서의 발견과 비슷한데, 여기서, sxtA1 및 sxtA4의 대략 550 bp 및 750 bp 단편이 테스트한 상기 주로부터 증폭되었으며, 알렉산드륨 아피네 종 및 에이. 안데르소니이 종으로부터의 이들 단편의 증폭은 검출되지 않았다.
- sxtA4 의 카피수 및 STX 의 함량
sxtA4의 풍부함은 테스트한 주 및 환경 샘플 사이에서 비교적 유사한 것으로 밝혀졌으며, 이때 범위는 세포당 178-376 카피였다(표 5). 이는 qPCR을 사용하여 알렉산드륨 카테넬라 주 ACSH02의 성장 전체에 걸쳐 세포당 100-240 카피를 발견한 상기 실시예 1에서의 결과를 지지한다. 알렉산드륨 카테넬라의 상기 3가지의 주의 전체 STX 등가물 독성은 세포당 3.1-6.6 pg의 STX 등가물이었다(표 5). 이는 영양소 공급 및 배양물 성장에 따라, 에이. 미누툼, 에이. 카테넬라 및 에이. 타마렌세의 주와 같은 다른 STX 생성 조의 것 이내에 있지만(세포당 0.66-9.8 pg의 STX 등가물), 김노디늄 카테나툼(세포당 26-28 pg의 STX 등가물) 및 알렉산드륨 오스텐펠디이(Alexandrium ostenfeldii )(세포당 217 pg 이하의 STX 등가물)과 같은 가장 유독한 주보다는 더 낮았다.
- 호주 남동부에서의 sxtA4 , 에이. 카테넬라 및 STX
알렉산드륨 카테넬라를 이 연구 기간 전체에 걸쳐 호주 남동부 하구퇴적지에서 세 번 샘플링하였으며, 각각의 경우에 sxtA4를 검출하였다(표 4). 조지스 리버 샘플 세트의 경우, LSU rDNA에 의해 결정되는 바와 같이, L당 sxtA4 카피와 L당 세포의 풍부함 사이의 상관성은 고도로 유의하였다(도 9). 조지스 리버 샘플링 장소에서, L당 3150-26450개의 세포의 평균적인 풍부함이 LSU rDNA 분석법의 개산치를 기초로 하여 5일간의 샘플링 기간 전체에 걸쳐 보고되었으며, 이는 선택된 일수로부터의 현미경 세포 계수를 기초로 하면 7900-38000개였다. 마지막 샘플링날에, 세포 계수치의 가변성이 상기 장소에서 취해진 삼중 샘플들 사이에서 발견되었으며, 이는 에이. 카테넬라의 분포에서의 고르지 못함을 반영하는 것이었다. 이것에도 불구하고, rRNA qPCR을 기초로 한 알렉산드륨 카테넬라 세포수와 L당 sxtA4 카피 사이의 상관성은 매우 강하였으며(r 2 =0.97, 기울기=0.0059, p<0.001), 이러한 주 동안 취해진 굴 샘플에서의 전체 STX 로드(load)는 조개 1 kg당 200 ㎍의 STX 등가물이었으며, 이는 공중 위생 모니터링의 규제 수준(조개 1 kg당 800 ㎍의 STX)보다는 낮았지만 이 연구 동안 취해진 상기 3가지 샘플의 최고치였다.
와공가만에서, 샘플링 기간 전체에 걸쳐, LSU rDNA qPCR 분석법의 개산치를 기초로 하여 L당 30-288개의 세포의 평균적인 풍부함이 발견되었고 현미경 세포 계수치를 기초로 하여 80-540개의 세포가 발견되었다(도 9). LSU rDNA qPCR 분석법으로부터 계산되는 바와 같이, L당 sxtA4 카피와 세포수 사이의 상관성은 조지스 리버 샘플의 것(r 2 =0.70, 기울기= 0.001, p=0.07)보다 더 낮았다. 이는 둘의 이러한 샘플들이 L당 110개 미만의 세포를 함유하였으며, 따라서 이 분석법의 신뢰성 있는 검출 하한치였다는 사실을 반영할 수 있다. 대안적으로, 이 샘플링 세트의 더욱 낮은 상관 계수는 sxtA의 카피수가 달랐던 알렉산드륨 카테넬라의 상이한 주들의 존재에 기인할 수 있다.
- STX 및 알렉산드륨 종의 검출 방법
일반적으로, HAB 형성 식물 플랑크톤 및 산업용 및 생물학적 해양학적 연구용의 이의 독소의 계수는 종의 현미경 기반 계수 및 직접적인 독소 검출 방법에 의존한다. STX의 정량화는 일반적으로 마우스 생물학적 정량, HPLC 기기, LC-MS 또는 항체 기반 면역분석법, 예컨대 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)에 의해 행해진다. HPLC는 시간이 많이 걸리며 비싼 공정이며, 이는 잘 갖추어진 분석 실험실 및 STX의 순수 표준물과 이의 다수의 유사체를 요구한다. 새롭게 개발된 ELISA법은 이러한 결점들 중 일부를 극복하였지만, 상기 방법은 몇몇 일반적인 STX 유도체에 대해서는 이용가능하지 않으며, 교차 반응성의 문제점을 갖는데, 그 이유는 독소 프로파일이 흔히 꽤 복잡하기 때문이다.
해양 식물 플랑크톤 종의 동정 및 계수의 분자 유전학적인 그리고 항체 기반의 방법은 현미경 기반의 계수 및 직접적인 독소 검출 방법과 비교할 때 하기의 많은 이점을 갖는다: 현미경 기반의 분류적 동정과 비교하여 훈련 및 경험에 대한 요구가 훨씬 더 낮은 상기 방법의 간편성, 비용 효율성(qPCR 시약은 일반적으로 샘플당 미국 달러로 1달러 미만의 비용이 듦), 속도 및 자동화 잠재성(30가지 이하의 샘플을 96웰 플레이트를 사용하여 표준 qPCR 기계에서 2시간 안에 삼중으로 실행할 수 있음). 실시간 qPCR 기계는 최근에 가격이 실질적으로 감소하였으며, 상기 기계를 분자 생물학 기술에 있어서의 기본적인 훈련으로 작동시키는 것이 가능하다.
알렉산드륨 카테넬라의 L당 대략 110개의 세포의 신뢰성 있는 검출 한계는 본원에 보고된 qPCR법을 이용하여 달성가능하다. 알렉산드륨의 검출을 위한, qPCR을 기반으로 한 분석법은 낮은 세포 풍부함에서, 그리고 관심있는 종이 식물 플랑크톤의 부성분일 수 있는 경우에 현미경법 기반의 방법보다 더 민감할 수 있다. 대다수의 식물 플랑크톤 모니터링 프로그램에서 적용되는 세지위크-라프터 계수 챔버법은 L당 1000개의 세포의 신뢰성 있는 검출 한계를 갖는 것으로 간주된다. 그러나, 이는 관찰되는 샘플의 체적에 의존적이다. 본 발명의 연구에서, L당 <20개의 세포까지 내려가는 검출 수준은 더 큰 체적의 샘플이 관찰되도록 샘플을 여과함으로써 세지위크-라프터 계수 챔버법을 이용하여 달성하였다. 현미경 기반의 계수의 표준 오차는 관찰되는 세포의 수에 의존적이며, 세포수가 증가함에 따라 감소한다. 분자 유전학 기반의 방법에 있어서, 세포 계수치와 결부된 표준 오차는 세포의 풍부함과 관계가 없으며, 그 이유는 세포 풍부함이 상기 분석법의 검출 역치보다 더 크기 때문이다. 분자 유전학적 동정 및 계수 방법에서는 이들 방법을 사용하여 샘플링되는 물의 체적(전형적으로 1-8 L)에 따라 qPCR 및 FISH 프로브를 사용하여 알렉산드륨 종의, L당 대략 10-100개의 세포의 검출 역치가 보고되었다. 알렉산드륨 종의, L당 200개의 세포만큼 낮은 농도가 조개에서의 STX 흡수성과 결부되었기 때문에, 낮은 세포 풍부함에서의 종의 신뢰성 있는 검출은 대다수의 식물 플랑크톤 모니터링 프로그램에서 현재 실시되는 현미경에 의한 계수에 비하여 qPCR 기반의 계수법의 중요한 이점이다.
많은 이점이 분자 유전학 기반의 모니터링 방법에서 주지되었지만, 현재의 방법은 몇몇 결점이 있다. 마커 유전자를 사용한 종 계수용 qPCR은 몇몇 종의 알렉산드륨, 피로디늄 바헤멘세(Pyrodinium bahamense) 및 김노디늄 카테나툼이 나타나고 STX를 생성하는 서식지에서의 다수의 프로브의 사용을 요구한다. 특정 서식지에서, 이전에 문서로 되어 있지 않은 종이 때때로 동정되며, 상기 종은 적합한 프로브가 이의 동정에 이용가능하지 않을 경우 인지되지 못할 수 있다. 게다가, 특정 표적 종의 계수는 국소적 STX 생성 종을 배양하여 상기 종의 독성을 결정하는 연구를 요구하며, 그 이유는 이것이 영역들 사이에서 달라질 수 있기 때문이다. 알렉산드륨 카테넬라 종이 일반적으로 STX를 생성하는 영역에서의 이 종의 높은 풍부함은 항상 조개에서 STX와 상관되는 것은 아니었으며, 이는 STX의 생성에 있어서의 집단의 수준의 차이가 일어날 수 있음을 시사하는 것이다.
대부분의 qPCR 기반의 계수법의 마지막 단점은 검출에 일반적으로 사용되는 리보좀 RNA 유전자가, 상기 유전자의 비교적 빠른 분기 속도가 종 특이적 마커의 설계를 허용함에 따라, 알렉산드륨의 일부 종의 주들 사이에서, 그리고 일부의 경우에 종의 성장 동안 카피수를 유의하게 변화시킬 수 있다는 것이다. 이는 일부 알렉산드륨 종에서의 불안정한 rDNA 슈도유전자의 존재, 및 가능하게는 가외 염색체 rDNA 분자의 존재로 인한 것일 수 있다. 이러한 변동의 영향은 개산된 유전자 수와 세포 수 사이의 상이함, 및 결과적으로 현미경법을 기반으로 한 풍부함의 개산치와 qPCR을 기반으로 한 것 사이의 불일치를 야기하는 것이다. 이러한 이유로, 본 연구에서, LSU rDNA 유전자의 카피수를 국소적 물로부터 단리한 에이. 카테넬라의 3가지의 주의 반복체에서 결정하여, LSU rDNA 카피수를 기초로 한 세포수의 신뢰성 있는 개산치를 수득하였다.
본원에 제시된 신규한 방법은 STX의 합성에 연루된 유전자(sxtA)의 직접적인 검출에 의존한다. 따라서, 이것은 임의의 특정 종의 풍부함보다 더 밀접하게 STX 생성과 상관될 수 있다. 게다가, 분석 기기를 사용할 경우 실제 독소보다 sxtA를 검출하는 것이 상당히 더 빠르고 더 저렴하다. 개시된 프라이머쌍을 사용하면, sxtA4는 테스트한 2가지의 STX 비생성 알렉산드륨 종으로부터 증폭되지 않았지만, 비교적 멀리 관련된 STX 생성 종 김노디늄 카테나툼으로부터 증폭시켰다. 이는 특정 장소로부터의 이전에는 공지되지 않은 잠재적인 STX 생성 종을 비롯하여 몇몇 상이한 STX 생성 속을 동시에 검출하는 단일 분석법의 이용을 허용한다. 그러나, 상기 분석법도 STX를 생성하는 것으로는 밝혀지지 않은 알렉산드륨 타메렌세 ATCJ33 주로부터의 생성물을 증폭시켰으며, 이는 상기 실시예 1에서 이 주가 sxtA1 및 sxtA4를 보유한다는 발견을 반영하는 것이고, 이 분석법이 작은 백분율의 사례에서 STX의 존재를 나타내는 것이 아닐 수 있음을 보여주는 것이다.
전사 수준 조절은 많은 와편모조류 유전자의 발현에 있어서, 다른 유기체에서의 조절과 비교하여 비교적 중요하지 않은 역할을 할 수 있으며, 그 이유는 상향 조절되는 유전자가 표준 성장 동안의 수준과 비교하여, 대략 5배 이하만큼 전사체의 풍부함을 증가시키는 것으로 보고되었기 때문이다. 이는 와편모조류에서의 고도 발현 유전자의 게놈 카피의 중복이 상기 유전자의 전사의 증가 수단으로서 기능할 수 있다는 이론을 초래하였다. 이것이 사실이라면, 세포당 sxtA의 카피수와 특정 주에 의해 생성되는 STX의 양 사이에 유연 관계가 있을 수 있다. 이 연구에서, 테스트한 종은 비교적 유사한 STX 세포 한도량을 가지며, 세포당 sxtA에서의 유의한 차이는 없었다.
실시예 3: 삭시톡신 생성 및 비생성 와편모조류 종에서의 sxtA 서열의 조사
목적
이의 목적은 삭시톡신을 생성하는 것으로 공지된 와편모조류 및 STX를 생성하는 것으로는 공지되지 않은 것에서 삭시톡신(STX)의 합성에 연루된 유전자를 증폭시키고 서열결정하는 것이다.
재료 및 방법
와편모조류 주를 GSe 배지에서 성장시키고, 18도에서, 그리고 12/12의 광 주기에서 배양 캐비넷에서 유지하였다. DNA는 3000 g에서 5분 동안 원심분리하여 수확하고 그 후 CTAB법을 사용함으로써 대수기 성장 배양물 20 ml로부터 추출하였다.
DNA 주형을 하기 PCR 조건을 이용하여 서모 사이클러(Thermo Cycler)에서, 10% BSA를 함유하는 어드밴티지(Advantage) GC 풍부 PCR 폴리머라아제(클론테크(Clontech))를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 95℃, 5분의 초기 변성 후 (1) 94℃, 30 sec의 변성, (2) 30 sec의 어닐링(가변 온도), 및 (3) 72℃, 1-2 min의 연장의 35회의 사이클, 이때 72℃의 온도에서의 최종 10 min의 연장. PCR 생성물을 프로메가 위자드(Wizard) SV 겔 및 PCR 클린업 시스템(Clean-Up System)(프로메가)을 사용하여 겔에서 잘라낸 후, 하기 프라이머를 사용하여 ABI3730 DNA 분석기(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)를 이용하여 직접적으로 서열결정하였다.
Figure pct00008
이 연구에 있어서 새롭게 조사한 종은 STX 생성 종, 알렉산드륨 타마렌세, 주 CAWD121, 및 비생성 종, 알렉산드륨 종, AAKT01 주, 암피디늄 마사르티이 CS-259, 암피디늄 무토노룸(Amphidinium mootonorum) CAWD161, 쿨리아 모노티스(Coolia monotis) CAWD98, 감비에르디스쿠스 아우스트랄레스 CAWD148, 프로로센트룸 리마 CAWD, 프로토세라티움 레티쿨라툼 CAWD, 고니아울락스 스피니페라(Gonyaulax spinifera) CAWD였다.
결과
올바른 크기의 sxtA1 도메인 유전자를 삭시톡신 생성 알렉산드륨 타마렌세 종 CAWD121 주(서열 번호 224), 및 가정된 삭시톡신 생성 알렉산드륨 카테넬라 종, ACNC50 주(서열 번호 225-226은 ACNC50 주의 2개의 클론으로부터의 sxtA1 도메인 서열을 나타냄)로부터 동정하였다. 이는 알렉산드륨 카테넬라 주 ACSH02 유래의 상응하는 유전자와 99% 유사한 것으로 밝혀졌다.
sxtA1의 유전자(서열 번호 227)도 알렉산드륨 주 AAKT01로부터 증폭시켰는데, 상기 주는 이전에는 삭시톡신을 생성하는 것으로 보고되지 않았다.
와편모조류의 나머지 비생성 종들 중 어떠한 것으로부터도 유전자를 증폭시킬 수 없었다.
결론
와편모조류에서의 삭시톡신의 합성에 추정적으로 연루된 유전자의 존재를 삭시톡신을 생성하는 모든 종에서 확인하였다. 이 연구에서, 상기 유전자는 뉴질랜드에서 삭시톡신을 함유하는 유해한 조류 대발생을 야기하였으며 CAWD121로 단리된 추가의 생성 주에서 발견되었다. 게다가, 알렉산드륨의 하나의 종, AAKT01 주는 삭시톡신을 생성하는 종에 밀접하게 관련된 것으로서, sxtA1 유전자를 보유하는 것으로 밝혀졌다. 이 종은 이전에는 삭시톡신을 생성하는 것으로 보고되지 않았지만, 지금은 특정한 상황 하에서 이것을 생성하는 잠재력을 갖는 것으로 제안되고 있다. 더욱 민감한 검출 기술을 이용한 독소 분석이 이 가설의 검증을 위하여 요구될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Negri et al (2003)]에는 에이. 타마렌세 주, ATBB01이 삭시필린 분석법에 의해 테스트될 때 STX 활성을 나타내지만, HPLC법에 의해 테스트될 때에는 검출가능한 독소가 전혀 없음이 보고되었다(문헌[Negri, et al. (2003). "Paralytic shellfish toxins are restricted to few species among Australia`s taxonomic diversity of cultured microalgae ", J. Phycol. 39(4), 663-667] 참조).
삭시톡신을 생성하는 것으로 공지되지 않은, 그리고 삭시톡신 생성 종에 밀접하게 관련되지 않은, 이 연구에서 조사한 다른 와편모조류 목의 종 중 어떠한 것도 sxtA1 유전자를 보유하지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4: sxtA 를 기반으로 한 qPCR 분석에 의해 모니터링한 , 뉴질랜드 오푸아 베이로부터의 알렉산드륨 카테넬라
목적
이의 목적은 해양 와편모조류에서 삭시톡신의 합성에 연루된 sxtA 유전자의 카피수가 해양 환경 샘플 중 알렉산드륨 카테넬라 세포의 수의 수동 계수치와 상관되는지를 결정하는 것이다.
방법
뉴질랜드 사우스 아일런드 퀸 샬로트 사운드의 오나푸아 베이의 남동쪽 영역에서 샘플을 수집하였다. 4주(2012년 2월 22일 - 2012년 3월 13일)에 걸쳐 주 1회, 물기둥으로부터 0-15 m 깊에서 통합된 샘플의 삼중 500 ml 샘플을 취하고, -80℃에서 보관하였다. 해동 후, 200 ml의 각각의 샘플을 0.45 μm 밀리포어 필터를 통하여 여과하였다. 필터를 대략 50 ㎕의 해수로 에펜도르프 튜브(eppendorf tube) 내로 헹구어서 넣고, 와동시키고, 원심분리시켰다. 펠렛을 제조업자의 지시에 따라 모비오(Mobio) DNA 토양 키트를 사용하여 추출하였다. DNA를 100 ㎕에서 2회 용출시켰다(동일 용출물을 필터를 통하여 2회 헹굼). DNA를 높은 염/에탄올 침전을 이용하여 20 ㎕의 샘플로 농축시켰다.
프라이머의 서열은 sxtA4F 5'-CTGAGCAAGGCGTTCAATTC-3'(서열 번호 198) 및 sxtA4R 5'-TACAGATMGGCCCTGTGARC-3'(서열 번호 199)이었으며, 이는 125 bp 생성물을 생성하였다.
sxtA4의 표준 곡선을 5.7-5.7 x 10 -5 ng(n=6)의 범위의, 공지된 농도의 신선 PCR 생성물의 희석 시리즈를 이용하여 작성하였다. PCR 생성물을 이용한 표준 곡선을 사용하여 상기 분석법의 효율을 결정하였으며, 이외에도 카피수를 결정하였다. PCR 생성물의 분자를 결정하였다: (A x 6.022 x 1023) x (660 x B)-1, 이때 A: PCR 생성물의 농도, 6.022 x 1023: 아보가드로수, 660: 염기쌍당 평균 분자량 및 B: PCR 생성물의 길이.
qPCR 사이클링을 SOS 패스트 에바그린(Fast Evagreen) 슈퍼믹스(바이오라드)를 사용하여 로터 진 3000(코베트 라이프 사이언스)에서 실시하였다. 10 ㎕의 에바그린 마스터 믹스(DNA 삽입 염료, 완충액 및 Taq 폴리머라아제를 함유함), 1 ㎕의 주형 DNA, 0.5 μM의 각각의 프라이머, 및 1 ㎕의 BSA로 이루어진 20 ㎕의 최종 체적에서 qPCR 분석을 수행하였다. qPCR 분석을 하기 사이클로 삼중으로 수행하였다: 95℃, 10 s, 및 95℃, 15 s 및 60℃, 30 s의 35회 사이클. 용융 곡선 분석을 각각의 사이클의 마지막에 수행하여 증폭 특이성을 확인하고, 선택된 PCR 생성물을 서열결정하였다.
결과
검출된 L당 sxtA4의 카피수는, 알렉산드륨 카테넬라 세포의 풍부함의 변화와 유사하게, 세 번째의 샘플링 주에서 피크에 도달하고 그 후 강하되는 것으로 밝혀졌다(도 10). 삼중 물 샘플에서의 L당 sxtA4의 카피수는 L당 알렉산드륨 카테넬라 세포의 평균적인 풍부함과 유의하게 상관되는 것으로 밝혀졌다(도 11, R2 = 0.86).
결론
sxtA 유전자를 기초로 한 정량적 qPCR 분석법은, 알렉산드륨 카테넬라를 함유하는 해양 환경 샘플에서의 삭시톡신 존재 잠재력을 결정하는 신뢰성 있는 방법임이 밝혀졌다. sxtA 유전자의 카피의 풍부함은 알렉산드륨 카테넬라 종의 풍부함과 유의하게 상관되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 5: ' 비독성 ' 알렉산드륨 타마렌세 제V군 클레이드에 있어서 삭시톡신 생성 및 sxtA 의 조사와 sxtA1 및 sxtA4 서열의 증폭
요약
3가지의 알렉산드륨 종인 에이. 타마렌세. 에이. 푼디엔세 및 에이. 카테넬라는 마비성 패독(PSP)의 원인이 되는 에이전트인 신경독소 삭시톡신(STX) 및 그 유사체의 강한 생성자일 수 있는 주를 포함한다. 이러한 3가지의 종은 형태적으로 고도로 유사하며, 복측 기공의 보유, 또는 사슬 형성 능력 면에서만 서로와 상이하다. 종 경계 결정에 대한 이러한 형태적 특성의 적절함은 광범위하게 토론되어 왔다. 이 종의 복합군, 제V군의 특유한 클레이드, 타스마니안 클레이드가 호주 남부에서 발견되며, 때때로 대발생의 크기로 나타난다. 이 클레이드는 비독성인 것으로 간주되어 왔으며, 이 종의 대발생 이후 조개에서 어떠한 PSP 독소도 발견되지 않았다. 본 연구에서, 타스마니안 알렉산드륨 타마렌세 주, 제V군이 동정되었으며, 이는 STX를 생성하고, STX 생성에 추정적으로 연루된 유전자, sxtA를 보유한다. 독소 프로파일을 결정하였으며, 이는 높은 비율의 GTX5 및 소량의 STX를 비롯하여 특이하고, 동시에 나타나는 에이. 카테넬라(제IV군)의 것과는 상이하다. 2010년 10월에 나타난 에이. 타마렌세의 추정적 대발생, 및 시드니 바위 굴(사코스트레아 글로메라타)에서의 STX의 후속적인 발견은 이 종의 일부 자연 발생 주가 STX를 생성할 수 있었음을 시사할 수 있다.
개론
와편모조류 알렉산드륨 속의 일반적인 그리고 널리 퍼진 3가지 종, 에이. 카테넬라, 에이. 타마렌세 및 에이. 푼디엔세는 고도로 유사한, 때로 중첩되는 형태적 특징을 보유한다(문헌[Balech, 1995]; 문헌[Fukuyo, 1985]; 문헌[Steidinger, 1990]). 이 클레이드는 '종 복합군'을 포함하는 것으로 간주되며, 그 이유는 이것이 5가지의 유전적으로 특유한 군으로 이루어지기 때문이다(문헌[John et al., 2003]; 문헌[Orr et al., 2011]; 문헌[Scholin et al., 1994]; 문헌[Lilly et al., 2007]). 이들 종의 동정에 사용되는 특성은 세포 형상, 첨부 기공 복합체(apical pore complex; APC), 제 정판 상의 복측 기공의 존재(에이. 타마렌세) 또는 부재(에이. 카테넬라/에이. 푼디엔세), 및 세포가 사슬 형성 경향을 나타내는지(에이. 카테넬라) 또는 그렇지 않은지(에이. 타마렌세/에이. 푼디엔세)를 포함한다(문헌[Balech, 1995]). 이러한 3가지 종들 사이의 중간의 형태를 갖는 일부 형태도 관찰되었다(문헌[Cembella et al., 1988]; 문헌[Gayoso and Fulco, 2006]; 문헌[Orlova et al., 2007]; 문헌[Sako et al., 1990]; 문헌[Orr et al., 2011]).
형태를 기반으로 한 정보와는 대조적으로, SSU, ITS/5.8s, 및 LSU 유전자를 포함하는 rRNA 오페론의 영역을 기반으로 한 알렉산드륨 종의 많은 계통발생적 연구는 클레이드들(제I군 내지 제V군)을 서로와 명확하게 구별하였다(문헌[John et al., 2003]; 문헌[Scholin et al., 1994]); (문헌[Kim and Sako, 2005]; 문헌[Leaw et al., 2005]; 문헌[Lilly et al., 2007]; 문헌[Montresor et al., 2004]; 문헌[Rogers et al., 2006]; 문헌[Orr et al., 2011]). 와편모조류 다양성 및 rDNA 서열에 대한 이의 유연 관계에 대한 개관을 기초로 하여, 문헌[Litaker et al., (2007)]에서는 와편모조류에서 보존적 "종 수준" 마커가 ITS1/5.8S/ITS2 rDNA의 정렬된 영역에서 차이가 4%(=0.04의 비보정된 유전적 거리)인 것으로 간주될 수 있음이 제안되었다. 알렉산드륨 타마렌세/카테넬라/푼디엔세의 이러한 클레이드들은 ITS1/5.8S/ITS2의 정렬된 서열에서 13-18%만큼 서로와 상이하며(문헌[Orr et al., 2011]), 따라서 일부 다른 와편모조류 종에서의 것의 3-4배의 수준으로 서로와 상이하다.
알렉산드륨 타마렌세/카테넬라/푼디엔세 주를 특정 유전자 클레이드(제I군 내지 제V군)로 동정하는 것은, 이들의 STX 생성 성향을 이들의 형태를 기반으로 한 종 동정보다 더욱 잘 예측하는 것으로 간주되었다(문헌[Scholin et al., 1994]; 문헌[John et al., 2003]; 문헌[Kim and Sako, 2005]; 문헌[Leaw et al., 2005]; 문헌[Montresor et al., 2004]; 문헌[Lilly et al., 2007]; 문헌[Rogers et al., 2006]). 지금까지 분석한 제I군 및 제IV군의 모든 주는 다양한 독소 프로파일을 갖는 다양한 양의 STX를 생성하는 반면(표 7, 문헌[Anderson et al., 1994]), 제II군의 주는 STX를 생성하지 않는 것으로 보고되었다(문헌[John et al., 2003]). 제III군 및 제V군의 주의 독성은 명백하지 않다. 이들은 일반적으로 비독성인 것으로 간주되었다(문헌[Lilly et al., 2007]; 문헌[Scholin et al., 1994]; 문헌[Genovesi et al., 2011]; 문헌[Bolch and de Salas, 2007]; 문헌[Hallegraeff et al., 1991]). 제III군 내에 배치되는 유전자 서열을 갖는 단일 주, CCMP116은 독성인 것으로 보고되었다(문헌[Penna and Magnani, 1999]). 일반적으로 제V군의 주는 비독성인 것으로 간주되었던 반면(문헌[Hallegraeff et al., 1991]; 문헌[Bolch and de Salas, 2007]), 타스마니아 벨 베이로부터의 ATBB01/CS298 주에 의해 매우 낮은 수준의 STX가 생성될 수 있음이 제안되었다(문헌[Scholin et al., 1994]; 문헌[Negri et al., 2003]). 독소 프로파일은 결정되지 않았다.
호주 해양수에서, 알렉산드륨 종, 에이. 카테넬라 및 에이. 미누툼이 STX를 생성하며, 대발생 크기로 나타났는데, 이는 조개에서 STX 흡수를 야기한다(문헌[Hallegraeff et al., 1988]; 문헌[Hallegraeff et al., 1991]; 문헌[Bolch and de Salas, 2007]). 에이. 타마렌세 종 복합군의 종 중, 하기 두 군이 상기 영역에서 일관되게 발견되었다: 제V군의 에이. 타마렌세 및 제IV군의 에이. 카테넬라(문헌[Bolch and de Salas, 2007]). 이 종 복합군의 다른 군은 지난 20년에 걸쳐 조사 동안 발견되지 않았다(문헌[Hallegraeff et al., 1988]; 문헌[Hallegraeff et al., 1991]; 문헌[Bolch and de Salas, 2007]). 호주 해양수 중의 이러한 이러한 에이. 타마렌세 '종 복합군' 주의 기원에 대하여 몇몇 이론이 주장되었으며, 이는 물 밸러스트(ballast water)에 의한 이들의 도입(제IV군), 또는 상기 영역에서의 이들의 장기간의 존재(제V군)를 포함한다(문헌[Bolch and de Salas, 2007]).
에이. 카테넬라(제IV군), 에이. 미누툼 및 김노디늄 카테나툼 종의 대발생은 호주 뉴사우스웨일즈, 사우스오스트레일리아, 빅토리아 및 타스마니아 내의 장소에서 많은 경우에 조개 벡터에서의 STX의 흡수와 결부되었다(문헌[Bolch and de Salas, 2007]에 개관됨). 호주 영해에서 실험적으로 또는 모니터링 중에 STX의 존재에 대하여 조사된 잠재적인 조개 벡터는 시드니 바위 굴(사코스트레아 글로메라타), 참굴(Pacific Oyster)(크라소스트레아 기가스(Crassostrea gigas)), 및 진주굴(Pearl Oyster) 핀크타다 임브리카타(Pinctada imbricata)이다(문헌[Murray et al., 2009]). 제V군의 에이. 타마렌세의 대발생은 상기 영역 전체에 걸쳐 간헐적으로 나타났지만, 조개에서 STX 흡수를 야기하는 것으로 보고된 적은 없다(문헌[Hallegraeff et al., 1991]).
STX 생성의 유전적 근거를 조사하는 중에, 추정 sxtA 도메인의 유전자, sxtA1 및 sxtA4를 제V군의 에이. 타마렌세의 3가지의 주에서 발견하였다(문헌 [Stueken et al., 2011]). 이들 주를 재조사하여 이들의 유전적 친화성 및 이들의 STX 생성 잠재력을 결정하였다.
이 연구는 STX를 생성하는 것으로 밝혀진 에이. 타마렌세 주의 독소 프로파일, 형태 및 분자적 계통발생을 설명한다. 더욱이, 이 종의 추정적 대발생 이후 2010년에 호주 뉴사우스웨일즈로부터의 에스. 글로메라타의 샘플에서의 STX 존재의 발견이 보고되어 있다.
재료 및 방법
배양물 유지
18℃ GSe 배지에서 와편모조류 배양물을 유지하였다. 광을 백색 형광 전구(크롬턴 라이트)로 제공하였으며, 이때 12시간/12시간의 암/명 주기에서 광자속을 60-100 ㎛ol의 광자 m-2 sec-1로 하였다. 사용한 주는 엠 드 살라스가 호주 사우스오스트레일리아 케이프 자파(-36.94,139.70)로부터 단리한 ATCJ33; 호주 타스마니아 노스웨스트 베이(-43.08,147.31)로부터 단리한 ATNWB01; 및 호주 타스마니아 부르니 에무 베이로(-41.05,145.91)부터 단리한 ATEB01이었다. 독소 결정용 벌크 배양물들을 동일 날짜에 2 L 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 내에 접종하고, 독소의 추출을 위하여 후기 로그기 또는 초기 정지기 동안 함께 수확하였다. 세포 풍부함은 라이카(Leica) DMIL 도립 광학 현미경 하에서 세지위크 라프터 계수 챔버를 이용하여 1 ml의 하위 샘플을 계수함으로써 결정하였다. 배양물들을 원심분리하고, -20℃에서 즉각적으로 냉동시킨 후 HPLC 분석 또는 DNA 추출을 하였다. HPLC 분석용 세포 펠렛은 1.25 - 2.25 x 106개의 세포를 함유하였다.
LM 및 SEM
라이카 DMIL 도립 광학 현미경을 이용하여 배율을 40 또는 100 x로 하여 세포의 크기 및 형상을 결정하였다. 주사 전자 현미경법에 있어서, 세포막을 여전히 온전하게 하기 위하여 또는 이것을 노출시키기 위하여 두 방법을 이용하였다. 배양물을 2% 사산화오스뮴에서 10분 동안, 또는 4% 글루타르알데히드에서 1-2시간 동안 고정시켰다. 상기 배양물들을 폴리리신 코팅된 커버글래스 상에 또는 5 ㎛ 밀리포어 필터 상에 두고, 증류수에서 헹구고, 일련의 증가하는 에탄올 농도(30, 50, 70, 90, 100%)에서 재수화시키고, 이어서 임계점 건조시켰다(발텍(Baltec)). 완전히 건조되었을 때, 상기 배양물들을 스터브(stub) 상에 탑재하고, 금으로 스퍼터 코팅하였다. 이를 유니버시티 오브 시드니(호주 현미경 및 미세분석 센터(Australian Centre for Microscopy and Microanalysis))에서 차이스 울트라 플러스 전계 방출 주사 전자 현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope; FESEM)을 사용하여 5-15 kV에서 조사하였다.
DNA 추출 및 PCR
DNA를 CTAB법을 이용하여 세포 펠렛으로부터 추출하였으며, 이때 추가로 하룻밤 동안 DNA를 -20℃에서 침전시켰다. DNA의 품질 및 양을 나노드롭(서모사이언티픽)을 이용하여, 그리고 440 bp 단편을 증폭시키는 프라이머쌍 4f 및 6r을 사용하여 문헌[Lin et al. (2009)]의 프로토콜에 따라 대조 와편모조류 유전자(cytb)를 증폭시킴으로써 결정하였다.
rRNA 유전자 LSU 및 SSU의 부분 서열 및 전 5.8s/ITS 유전자를 이전에 공개된 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다: SS3, SS5(문헌[Medlin et al., 1988]), D1R, D3b(문헌[Scholin et al., 1994]) 및 Alex5.8s(문헌[Orr et al., 2011]). PCR의 전형적인 사이클링 조건은 94℃, 2 min의 초기 변성 단계, 이어서 94℃, 20 s, 56℃, 30 s, 및 72℃, 1 min의 35회 사이클, 이어서 7 min의 최종 연장 단계로 이루어졌다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 에티듐 브로마이드로 염색시키고, UV 광선 투과에 의해 가시화하였다. 서열결정할 단편을 상기 겔로부터 잘라내고, DNA를 바이오라인(Bioline) 겔 정제 키트(미국 소재의 바이오라인)를 사용하여 정제하고, 용출 완충액 10 ㎕로 2회 용출시키고, 나노드롭을 이용하여 농도를 체크하였다. 그 후, 대략 40 ng의 PCR 생성물을 이 생성물의 초기 증폭에 사용한 것과 동일한 프라이머를 이용한 직접적 서열결정에 사용하였다.
독소 측정
뉴질랜드 소재의 코트론 인스티튜트에서 조개에서의 마비성 패독 독소에 대하여 문헌[AOAC Official Method 2005.06]에 따라 HPLC를 사용하여 와편모조류 세포 펠렛을 테스트하였다. 원래 프로토콜에 기술된 것과 같은 매트릭스 변형자를 사용하지 않았으며, 대신, 각각의 별도의 화합물에 대하여 평균 스파이크 회수율을 사용하였다. HPLC 분석은, 워터스 어퀴티 FLR 검출기에 결합된 워터스 어퀴티 UPLC 시스템(워터스)에서 수행하였다. 30℃에서 워터스 어퀴티 C18 BEH 1.7 μm 2.1 x 50 mm 컬럼에서 분리를 달성하고, 0.2 mL min- 1으로 용출시켰다. 이동상은 0.1 M 포름산암모늄(A) 및 5% 아세토니트릴 중 0.1 M 포름산암모늄(B)이었으며, 이들 둘 모두는 pH 6으로 조정하였다. 구배는 0.5 min 동안 100% A, 3.5 min에 걸친 80% B로의 선형 구배, 그 후 0.1 min에 걸친 초기 조건으로의 되돌아감, 및 1.9 min 동안의 유지로 이루어졌다. 형광 검출기는 340 nm로의 여기 설정치 및 395 nm로의 방출 설정치를 가졌다. STX 유사체의 분석 표준물을 캐나다 국립 연구 위원회로부터 획득하였다. 세포 배양물의 HPLC의 검출 한계는 NEO 및 STX의 경우 세포당 0.1 pg, GTX1/4, GTX6(B2) 및 GTX5(B1)의 경우 세포당 0.2 pg, C1,2의 경우 세포당 0.5 pg 및 유사체 C3,4의 경우 세포당 <0.3 pg인 것으로 간주되었다.
계통발생적 분석
이 연구에서 생성한 새로운 제V군 알렉산드륨 타마렌세 서열; (1) 18S(작은 서브유닛) rDNA, (2) 내부 전사 영역(Internal Transcribed Region; ITS) 1 및 2 플러스 5.8S rDNA, 및 (3) 28S(큰 서브유닛) rDNA를 연쇄시켜서 ATNWB01 주(젠뱅크 접근 번호 JQ991015, JQ991016, JQ991017)를 위한 rDNA 오페론의 2,821개 문자의 영역을 구성하였다. 게다가, 새로운 LSU rDNA 서열을 ATCJ33 주(874 bp) 및 ATEB01 주(678 bp의 길이, 젠뱅크 접근 번호 JQ991018 및 JQ991019)로부터 생성하였다. 이를 NCBInr 뉴클레오티드 데이터베이스 http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/ (2010년 10월자로)에서의 제V군 서열 데이터 및 에이. 아피네 외군으로부터의 모든 오르토로그와 함께 정렬하였다. 이차 RNA 구조를 고려하여, MAFFTv6 Q-INS-I 모델(문헌[Hofacker et al., 2002]; 문헌[Katoh and Toh, 2008]; 문헌[Kiryu et al., 2007])을 사용하여 데이터세트(사용한 디폴트 파라미터들)을 정렬하였으며, 생성된 정렬을 맥클레이드 v4.07(문헌[Madison and Madison, 1992])을 사용하여 수동으로 체크하였다. 그 후, 상기 정렬을 최소의 엄격한 파라미터 하에서 지블록스(Gblocks) v0.91b(문헌Castresana, 2000])를 사용하여 추측하여 불량하게 정렬된 위치 및 분기 영역을 계통발생적 추측으로부터 배제시켰다. 모델테스트(MODELTEST)(문헌[Posada and Crandall, 1998])는 뉴클레오티드 진화의 최적 모델을 확립하였으며; 모든 정렬에 있어서 GTR이 아카이케(Akaike) 및 베이예시안(Bayesian) 정보 기준(AiC 및 BiC) 둘 모두에 바람직하였다. 최대 가능성(ML) 분석을 RAxML-VI-HPC v7.2.6, GTRCAT 모델을 이용하여 수행하였는데, 이는 25개의 등급 카테고리를 포함하였다(문헌[Stamatakis, 2006]). 가장 유망한 토폴로지를 100회의 별도 검색으로부터 확립하고, 부트스트랩 분석을 100개의 허위 복제를 이용하여 수행하였다. 베이시안 추론을 필로베이예스 v3.2e(문헌[Lartillot et al., 2007]; 문헌[Lartillot and Philippe, 2004])를 사용하여, GTRCAT 치환 모델 하에서 수행하였으며, 이때 자유로운 수의 혼합 카테고리 및 4개의 카테고리 하의 개별적 교차 부위 변이를 이용한다. 이심렬들(사슬들) 사이의 가장 큰 최대 차이가 <0.1일 때 추론되었다. 모든 모델의 추정 및 계통발생적 분석을 자유롭게 이용가능한, 유니버시티 오브 오슬로의 바이오포털(Kumar et al., 2009)(http://www.bioportal.uio.no/)에서 수행하였다.
식물 플랑크톤 및 조개 샘플의 수집, 계수 및 동정
2010년 10월 및 11월, 2010년 10월 25일 및 2010년 11월 9일의 연속 두 주에 걸쳐 호주 뉴사우스웨일즈 헤이스팅즈 리버(-31.42 E, 152.87 S)에서 NSW 조개 프로그램 격주 모니터링의 일부로서 식물 플랑크톤을 수집하였다. 두 번째 주에 시드니 바위 굴(사코스트레아 글로메라타)을 농장으로부터 수집하고, 제조업자의 지시에 따라 젤레트(Jellett) PSP 테스트(캐나다 소재의 젤레트 래피드 테스팅 리미티드(Jellett Rapid Testing Ltd))를 이용하여 테스트하였다.
병 샘플의 계수에 있어서, 루골 보존 샘플 500 ml 중 식물 플랑크톤을 5 μm 셀룰로오스 에스테르 필터(어드밴텍) 상으로의 중력 보조 막 여과에 의해 농축시킨 후 4 ml 내로 세척하고 계수하였다. 알렉산드륨 종들을 위상차 광학 기기를 갖춘 차이스 악시오랩 현미경 및 세지위크 라프터 셀을 사용하여 동정 및 계수하였다. 2003년 이래로 NSW 조개 프로그램의 일부로서 유해 식물 플랑크톤을 동정해 왔던 에스. 브레트(S. Brett) 박사가 종들을 동정하였다. 알렉산드륨 종은 NSW 수역에서 일반적으로 나타나며, 가장 일반적으로 동정되는 종은 에이. 카테넬라 및 에이. 슈도고니아울락스이다. 계수된 세포의 수는 알렉산드륨 풍부성에 따라 샘플들 사이에서 다양하였으며, 표준 오차율을 하기 방정식: 오차 = 2/√n을 사용하여 계산하였고, 상기 방정식에서 n은 샘플에서 관찰된 세포의 수이다.
결과
광학 현미경법 및 주사 전자 현미경법
ATNWB01의 세포는 둥글고, 길이가 25 - 45 ㎛이며(μ=34.2, n=20), 폭은 27 - 40 ㎛(μ=33.6, n=20)였다(도 12, A-B). 세포는 거의 항상 단일 세포였다. 두 세포의 사슬은 거의 관찰되지 않았다. 제1 정판은 첨부 기공 복합체까지 연장되었으며, 작은 기공, 복측 기공을 포함하였다(도 12, C). 첨부 기공 판(Po)은 특징적인 콤마 형상을 가졌으며, 이는 작은 주변 기공으로 둘러싸여 있다(도 12, E). 가끔, 후측 열구 판 내에 기공을 갖는 세포가 관찰되었다(도 12, F). 대부분의 세포는 후측 열구 판에서 기공이 결여되었다.
배양물 ATCJ33의 세포(도 13, A-D), ATEB01의 세포(도 13, E, F, H) 및 ATBB01의 세포(도 13, G)는 둥근 세포를 가졌다. 세포는 대부분 단일 세포였고, 때때로 2개의 세포의 사슬 형태였다(도 13, A). ATCJ33의 세포는 길이가 23-38 ㎛(μ= 30.6, n=20), 폭이 23 - 38 ㎛(μ= 29.5, n=20)이고, ATEB01의 세포는 길이가 25-40 ㎛(μ= 33.5, n=20), 폭이 23 - 35 ㎛(μ= 31.6, n=20)였다. 제1 정판은 첨부 기공까지 연장되었으며, 복측 기공을 포함하였다(도 13, B, D, H). 첨부 기공 판은 특징적인 콤마 형상을 나타냈다(도 13, C, G, H).
계통발생적 분석
새로운 rDNA 서열(도 14, 도 16), SSU rDNA, ITS/5.8s 및 독소 생성주 ATNWB01의 부분 LSU rDNA 서열 및 2가지의 비독성 주 ATCJ33 및 ATEB01의 LSU 서열을 포함하는 계통발생적 분석에 의하면, 이들 모두가 에이. 타마렌세 제V군의 다른 주와 함께, 잘 지원된 클레이드(1.00/100, PP/BS 지원의 경우)를 형성함이 나타난다. 가장 가변적인 ITS 영역을 포함하여 전장 rDNA를 기반으로 한 이 클레이드에서 차이가 관찰될 수 없었다.
주에 있어서의 sxtA 유전자의 sxtA1 도메인 및 sxtA4 도메인의 비교
에이. 타마렌세 제5군의 주에 있어서의 sxtA의 상기 두 도메인의 서열의 뉴클레오티드 함량은 비교되었으며, 이전에 서열결정되었다(문헌[Stueken et al., 2011]). 도메인 sxtA4의 440 bp 서열은 ATNWB01 주가 단지 2개의 뉴클레오티드에서 분석된 제5군 에이. 타마렌세의 다른 두 주, ATEB01 및 ATCJ33과 상이함을 나타냈다(99.5%의 서열 동일성). 이와는 대조적으로 이들 3가지의 주는 김노디늄 카테나툼 및 알렉산드륨의 다른 종 유래의 이들 유전자와 89-98%의 서열 동일성을 나타냈다. 도메인 sxtA1의 450 bp 영역의 비교에서, ATNWB01 주는 sxtA1 도메인의 다른 알렉산드륨 및 김노디늄 카테나툼의 서열에 있어서의 70-93%의 서열 동일성과 비교하여 제5군의 다른 2가지의 주와 2-2.5%만큼 상이하였다(97.5-98%의 서열 동일성).
독소
제V군의 에이. 타마렌세의 3가지의 주 중, 대략 1.5 - 2.2 x 106개의 세포를 HPLC를 사용하여 독성에 대하여 테스트하였다. 2가지의 주, ATCJ33 및 ATEB01은 음성 프로파일을 가졌으며, 이때 검출가능한 독소가 없었다. 하나의 주, ATNWB01은 양성 결과를 나타냈으며, 이때 프로파일은 대부분 GTX5로 이루어졌고, STX, C1,2 및 deSTX가 약간 있고(도 15, 표 7), 세포 한도가 세포당 15.3 fmol이었다.
환경 샘플
2010년 10월 25일에 헤이스팅즈 리버로부터 수집한 샘플의 일상적인 모니터링에서 L당 350개의 세포의 수준으로 알렉산드륨 세포를 검출하였다(표 6). 2010년 11월 9일에 수집한 상기 장소로부터의 굴 샘플에서의 후속적인 젤렛 테스트는 PSP 독소에 대하여 양성이었다. 샘플 중 알렉산드륨 세포는 단일 세포였으며, 일반적으로 둥근 형상을 가졌다. 세포는 길이가 35 ㎛이고, 폭이 32-35 ㎛였다. 알렉산드륨 포자낭의 조사에 의하면, 에이. 타마렌세의 크기 및 형상의 1' 판인 1' 판에서 복측 기공이 나타났고, APC에서 연결 기공의 부재가 나타났다.
호주 수역에서 관찰되는 알렉산드륨의 종 중, 세포의 크기 및 형상, 1' 판의 형상, 1' 판 상에서의 복측 기공의 존재, 및 APC의 형상은 알렉산드륨 타마렌세와 가장 일치하는 것으로 보인다. 그러나, 배양물은 이러한 대발생 이벤트로부터 확립되지 않았으며, 분자적 서열도, 독소 프로파일도 확인될 수 없었다.
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토론
일반적으로 알렉산드륨 속의 독성 종의 주들 사이에서, 극도의 영양소 고갈의 상황 외에도(문헌[Boczar et al., 1988]), 독소 프로파일은 시간이 지남에 따라 대체로 일정하게 남아 있는 것으로 보인다(문헌[Cembella and Destombe, 1996]). 생성되는 독소의 양과는 대조적으로 (세포 한도는) 시간이 지남에 따라 달라지는 것으로 밝혀졌다. 독소 프로파일은 주 내에서 안정한 것으로 보이는 반면, 특정 독소 프로파일과 이 종의 복합군의 특정한 유전적 군(제I군 내지 제V군)으로의 주의 동정 사이의 유연 관계는 불명확하다. 독소 프로파일의 상당한 변동이 조사된 각각의 군의 주 사이에서 발견되었다(표 7).
이 연구는 알렉산드륨 타마렌세, 제V군의 주의 독소 프로파일의 첫 번째 보고이다. 이 연구는, 형태적 특징, 예컨대 복측 기공의 존재, 및 가변 ITS1/5.8s/ITS2 영역을 포함하는 rDNA 유전자의 긴 서열을 기초로 하여, ATNWB01의 주가 제V군의 구성원이었음을 보여준다. 이전에는, 이 군의 주는 HPLC에 의해 독성에 대하여 테스트되었으며, 비독성인 것으로 밝혀졌었다(문헌[Hallegraeff et al., 1991]; 문헌[Salas et al., 2001]; 문헌[Bolch and De Salas, 2007]). 문헌[Negri et al (2003)]에는 에이. 타마렌세 주, ATBB01이 삭시필린 분석에 의해 테스트될 때 STX 활성을 나타내지만, HPLC법에 의해 테스트될 때에는 검출가능한 독소가 없음이 보고되었다. 상기 연구에서, 호주 수역으로부터 에이. 타마렌세로 동정된 배양물(ATTRA03 주)은 STX를 생성하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Negri et al., 2003]). 후속적으로, ATTRA03 주는 그의 아이덴티티(identity)의 검증 없이 죽었으며, 따라서 이 주가 어떤 종 또는 군을 대표하였는지가 불명확하다. 이것은 도입된 낭포로부터 유래되었을 수 있으며, 그 이유는 이것이 수출에 사용되는 선적항으로부터 시스트(cyst)로서 단리되었기 때문이다(문헌[Bolch and de Salas, 2007]).
일본 미카와만으로부터 단리된, At304를 포함하는 일본으로부터의 3가지의 주는 계통발생적 분석에서 제V군 클레이드의 구성원인 것으로 밝혀졌다(도 14). 이는 북서 태평양 영역에 존재하는 제V군 주의 첫 번째 보고이며, 그 이유는 이것이 이전에는 호주 남부에 국한된 것으로 생각되었기 때문이다(문헌[Bolch and de Salas 2007]). 일본으로부터의 주의 독성은 결정되지 않았으며, 이는 조사될 필요가 있다.
ATNWB01 주는 표준 HPLC법을 이용하면 검출가능한 범위 내에 충분히 있는 STX 세포 한도를 가졌다(세포당 15.3 fmol, 표 7). 이는 이 종 복합군의 많은 일반적인 STX 생성 주에 대하여 보고된 독소 한도와 유사하다(표 7, 세포당 3.5-328 fmol, 세포당 0.66 - 9.8 pg의 STX 등가물). 이 주의 독소 프로파일은 비교적 특이하였으며, 그 이유는 GTX5RK 알렉산드륨 타마렌세 종 복합군의 주의 독소 프로파일의 주요한 일부인 것으로 일반적으로 보고되지 않았기 때문이었다(표 7; 문헌[Anderson et al., 1994]). 일반적으로, 호주 뉴사우스웨일즈에서 조개에 있어서 PST의 가장 일반적인 소스인 알렉산드륨 카테넬라(제IV군)의 주는 높은 비율의 C1/2 및 GTX1/4를 주요 성분으로 함유하였다(문헌[Murray et al, 2011]; 문헌[Negri et al 2003]; 문헌[Hallegraeff et al., 1991]). GTX5는 칠레로부터의 알렉산드륨 타마렌세 제I군의 소정의 주(33.7%, 문헌[Aguilera-Belmonte et al., 2011]), 및 프랑스로부터의 알렉산드륨 카테넬라(제IV군)의 2가지의 주(44-46%, 문헌[Lilly et al., 2002])의 주요 성분인 것으로 밝혀졌다.
어떠한 배양물도 헤이스팅즈 리버 샘플로부터 동정된 에이. 타마렌세 주로 만들어지지 않았으며, 어떠한 분자 서열도 결정되지 않았고, 따라서 이것을 에이. 타마렌세 제V군으로 명확하게 동정하는 것이 가능하지 않다. 격주로 식물 플랑크톤을 모니터링하는 것이 지난 7년 동안 호주 뉴사우스웨일즈에서 32군데의 하구퇴적지의 69군데의 장소에서 착수되었다. 알렉산드륨 카테넬라는 2010년 및 2011년에 8회 샘플링할 때 동정되었다. 이들 중 7회에서, 젤렛 PSP 테스트를 사용하여, 이웃하는 굴 수확 지역으로부터의 굴 샘플에서 PSP 독소가 후속적으로 발견되었다(NSW 식품 규격청(Food Authority), 공개되지 않은 데이터). 알렉산드륨 타마렌세는 2010년 및 2011년에 4가지의 샘플로부터 동정되었다. 헤이스팅즈 리버로부터의 샘플은 이것이 호주 굴에서 PSP 독성과 결부된다는 것의 첫 번째 보고이다. 특히, 알렉산드륨 타마렌세 제V군에 의해 생성되는 유사체, GTX5의 높은 비율은, STX와 같은 가장 유독한 유사체와 비교하여 낮은 등가의 독성을 가지며, 이는 STX의 약 10%만큼 유독한 것으로 추정된다(문헌[Oshima, 1995]). 이러한 낮은 STX 등가물 독성은 이것이 이 종의 대발생에 추정적으로 결합된 이 영역에서의 조개 독성의 사건의 첫 번째 보고인 이유를 설명할 수 있다. 국소 집단이 실제 독소를 생성할 수 있는지를 검증하기 위하여 NSW 연안수 중 알렉산드륨 타마렌세 제V군 집단의 추가의 샘플링이 요구된다.
에이. 타마렌세의 3가지의 주 모두는 sxtA 유전자를 보유하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Stueken et al., 2011]). sxtA 유전자는 모든 제V군 주에서 서로와 밀접하게 관련되는 것으로 밝혀졌다(sxtA1 도메인 및 sxtA4 도메인의 정렬된 서열에 있어서 0.5 - 2.5%의 차이). 따라서, 이들 주에서의 이들 유전자의 존재 또는 부재는 독소 생성과 관련되지 않는 것으로 보인다.
알렉산드륨 카테넬라, 알렉산드륨 타마렌세 및 알렉산드륨 미누툼 종에 있어서의 성장 및 독소 생성의 차이는 이전에 보고되었으며, 염도, 광 및 영양소와 같은 환경적 배양 조건, 및 배양물의 성장기와 관련이 있었다(문헌[Hamasaki et al., 2001]; 문헌[Hu et al., 2006]; 문헌[Lippemeier et al., 2003]; 문헌[Anderson et al. 1990]; 문헌[Grzebyk et al., 2003]). 본 연구에서, 상기 3가지의 에이. 타마렌세 주 각각을 동일한 광 조건 하에서, 동일한 배지 및 해수에서 배양하고, 접종하고, 그 후 동일 날짜에 수확하였다. 따라서, 다른 2가지의 알렉산드륨 타마렌세 제V군 주에서 발견된 독성의 결여는 STX 생성의 차별적 발현을 촉진하는 환경 조건의 차이의 결과일 가능성이 없는 것으로 보인다.
알렉산드륨의 일부 배양된 주는 배양 중, 예를 들어 알렉산드륨 미누툼(문헌[Martins et al., 2004]에서 에이. 루시타니쿰(A. lusitanicum)으로 보고됨)에서 시간이 지남에 따라 독성을 상실할 수 있다. 이는 처음에 항생제 노출에 관련된 것으로 생각되었으며, 그 이유는 동시배양된 공생 박테리아가 알렉산드륨 종에서 독소 생성을 매개하는 데 있어서 그 역할을 하는 것으로 밝혀졌기 때문이었다(문헌[Ho et al., 2006]). 이 연구에서, 조사된 제V군의 배양물은 단리 장소의 해수의 것과 함께 혼합 박테리아 커뮤니티를 함유할 가능성이 가장 크며, 어떠한 것도 항생제에 노출되지 않았다.
메이팅(mating) 실험에 의하면, 알렉산드륨 타마렌세(제V군)의 독성 클론 주의 서브클론이 비독성일 수 있음이 밝혀졌다(문헌[Cho et al., 2008]). 독성 주의 순수 배양 비독성 서브클론인 에이. 타마렌세의 1가지 주의 비독성 특성은 세포 수준에서 아토몰로 확인되었다. 이 동일 주의 9가지의 독성 서브클론 중 3가지는 비교적 짧은 기간의 시간(4-6년)에 걸쳐 비독성으로 된 반면, 다른 독성 서브클론은 그의 독성을 유지하였으며, 비독성 서브클론은 비독성인 채로 남아 있었다(문헌[Cho et al., 2008]).
높은 수준의 집단의 유전적 차이가 미소부수체 마커를 사용하여 알렉산드륨 카테넬라 제IV군 종(문헌[Masseret et al., 2009]), 알렉산드륨 타마렌세 제I군 종(문헌[Nagai et al., 2007]), (문헌[Alpermann et al., 2009]), 에이. 푼디엔세 제I군 종(문헌[Erdner et al., 2011]) 및 에이. 미누툼 종(문헌[McCauley et al., 2009]) 내에서 발견되었다. 이는 종내 메이팅 실험 후 독소 생성량이 상이한 주의 결과(문헌[Cho et al., 2008])와 조합되어, 독소 생성에서의 유의한 집단 수준 차이가 에이. 타마렌세(제V군) 내에 또한 존재할 수 있음을 시사한다. 이 주의 다수의 클론의 배양에 대한 미소부수체 마커를 이용한 추가의 연구는 독소 생성이 이 주의 1가지의 특정 집단에 제한적인지를 결정하는 것을 도울 수 있는데, 이는 이 집단의 동정을 위한 예측적 유전적 도구의 설계를 허용할 수 있다.
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실시예 6: sxtA4 의 검출을 위한 qPCR 반응 및 알렉산드륨 미누툼의 독성 주와 비독성 주의 구별
재료 및 방법
10 ㎕ 또는 20 ㎕의 qPCR 반응을 백색 96웰 플레이트에서 로슈(Roche) 라이트사이클러(LightCycler)(등록상표)480 시스템에서 실행하였다. 각각의 반응물은 5 또는 10 ㎕의 라이트사이클러(등록상표) 480 SYBR 그린(Green) I 마스터(Master), 125 nM의 각각의 프라이머(sxt072 및 sxt073) 및 주형(알렉산드륨 cDNA 또는 gDNA)을 함유하였다. 반응을 이중으로 실행하였다. 표준 곡선용 대조구 및 비주형 대조구를 각각의 플레이트 상에 포함시켰다. 표준 곡선을 프라이머 sxt007 및 sxt008을 이용하여 CCMP113 주로부터 생성한 겔 정제된 PCR 앰플리콘(amplicon)의 10x 연속 희석물을 이용하여 생성하였다(문헌[Stueken et al. 2011]에 기술된 바와 같이 앰플리콘을 얻기 위한 PCR, 플로스원(PlosOne)). qPCR 사이클링 파라미터는 다음과 같았다: 고온 시작: 1회 (95℃, 10 min); 증폭: 45회 (94℃, 10 s; 64℃, 20 s; 72℃, 10 s, 단회 획득; 용융 곡선: 1x (95℃, 5 s; 65℃, 1 min; 97℃까지 연속 측정); 냉각: 1회 (40℃, 10 s). 교차점 및 용융 곡선 분석을 로슈에 의해 공급된 소프트웨어를 사용하여 실시하였다.
이들 실험에서 sxtA의 검출에 사용한 qPCR 프라이머는 하기의 것이었다:
sxt072 CTTGCCCGCCATATGTGCTT(서열 번호 228)
sxt073 GCCCGGCGTAGATGATGTTG(서열 번호 229)
결과
하기 주를 상기에 약술한 qPCR에 의해 테스트하였다.
Figure pct00020
삭시톡신 생성 주의 서열을 하기와 같이 생성하였다:
알렉산드륨 미누툼 CCMP113_sxtA4_gDNA_콘센서스(서열 번호 230)
알렉산드륨 미누툼 CCMP113_sxtA4_cDNA_콘센서스(서열 번호 231)
알렉산드륨 미누툼 AL24V_sxtA4_gDNA_콘센서스(서열 번호 232)
알렉산드륨 미누툼 AL24V_sxtA4_cDNA_콘센서스(서열 번호 233)
알렉산드륨 미누툼 Min3_sxtA4_gDNA_콘센서스(서열 번호 234)
알렉산드륨 미누툼 Min3_sxtA4_cDNA_콘센서스(서열 번호 235)
알렉산드륨 미누툼 VGO650_sxtA4_gDNA_콘센서스(서열 번호 236)
알렉산드륨 미누툼 VGO651_sxtA4_gDNA_콘센서스(서열 번호 237)
알렉산드륨 미누툼 VGO651_sxtA4_cDNA_콘센서스(서열 번호 238)
알렉산드륨 미누툼 AL10C_sxtA4_cDNA_콘센서스(서열 번호 239)
알렉산드륨 카테넬라 CCMP1493_sxtA4_cDNA_콘센서스(서열 번호 240)
알렉산드륨 푼디엔세 CCMP1719_sxtA4_cDNA_콘센서스(서열 번호 241)
알렉산드륨 푼디엔세 MDQ1096_sxtA4_cDNA_콘센서스(서열 번호 242)
이용한 프라이머는 STX 생성 종에서 sxtA를 검출하였으며, 또한 알렉산드륨의 독성 주와 비독성 주를 구별할 수 있다. 비독성 에이. 미누툼은 그의 게놈 내에 2개의 상이한 sxtA 카피를 가지며, 이는 Sybr 그린 분석법을 이용할 때 이중모드 용융 곡선을 생성한다(도 17 참조: 독성 에이. 미누툼 AL1V, 2개의 곡선; 비STX 에이. 미누툼 VGO651, 1개의 곡선). 다른 종도 특징적인 용융 곡선을 갖지만, 용융 곡선을 기반으로 한 독성 종과 비독성 종의 구별은 에이. 미누툼에 대해서만 작용한다.
프라이머 sxt072 및 sxt073도 로슈로부터의 범용 프로브 라이브러리 프로브, #142에서 잘 작용하는 것으로 밝혀졌다(데이터는 예시하지 않음). 이 분석법은 환경 샘플 중 sxtA의 검출에 있어서 매우 특이적이고 유용하다.
실시예 7: sxtA1 및 sxtA4 는 삭시톡신을 생성하지 않는 와편모조류 주에 부 재함
재료 및 방법
sxtA1 및 sxtA4 PCR을 상기 실시예 1에 기술한 바와 같이 수행하였다.
결과
sxtA (1/4)는 하기에 열거된 와편모조류 주 중 어떠한 것에서도 검출되지 않았다:
Figure pct00021
SEQUENCE LISTING <110> NewSouth Innovations Pty Ltd Universitetet i Oslo <120> Detection of saxitoxin-producing dinoflagellates <130> 998829C <160> 247 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3166 <212> DNA <213> Alexandrium fundyense <400> 1 accgtagcca ttttggctca agccaaactc ggatcattcc tggccactgc gccgccatcc 60 gtgccggcgc cccgaccggg ggcacctcat gtccgtggag catgcgacga tcgcggacgc 120 ggtcccgaac gggatcgacc tggcgacaaa tgccttcatg ctcgtccacg gctggacggc 180 ggcgcccctg ctcctggagc tcgtggccaa cttcagcgcg cccctggagg ggcgggccca 240 gaccgcgggg gagctggccg cggagacggg cgccgaggag gggcccctgg cgatcctcct 300 ccgcgcctgc agcgtcctgg gctacgtgcg cttcgacgcc cagagcaggg cgtactccct 360 ggtcccgggg ccggagctgg acgagctcag gaccgtgctc caccctgcgt cggaggtcgc 420 gaggggcctg caggagctgt acagcgaggt cgcccccccc ttccagctgc cctcggagga 480 cgcggcgcgg tgcctggccc tctgggagga gcagcggccc tcctggagcc agtgcaggag 540 cagggccctg ggcgtcctgc tggacggcgc tgtgctggcg ccgctgcttg tgtccgtgac 600 gtactcctcg aggtgggacg aggagggcca ggagcacggc agggataacg tcatggagcg 660 cttcgacttc agcaagatgt tgccggcgca gcggtccgcg ctcggggaca tcttcgagca 720 gttgggcgtc ggcactatga acgcgaaggg cgtgatcatg atgtcgtcaa agggggccat 780 ggcgttgcag cgatgctact cctactacgt cccactgtcg tacgcaccgc tgatggccca 840 gatctcgccg atcctgtttg atgatgcggg ctgggggttc actgacgcgg ggacagactc 900 cttcgacgac gtggaggagc atgttgacag aatcttgaat gttgttggca gtggtgcgca 960 acaccggacc ctctttaagg atatgatgcg acacatcagt accgtgttca agggcgaggc 1020 atttgccttg cagccaagtt tcgttgtgga cactggctgt ggcgacggga gcctgctcat 1080 acatatctat gaacatatca aacagcacac accccggggg aaagtgcttg atcagttccc 1140 tctgacgatg gtcggcgttg acctcaatga ggatccgcga gtgacaacag ctgtgaatct 1200 gagcaagcag ggcgtcccgc acgtggtcat ctctggcgat gtgggtaagc ctgcggagat 1260 acttgccgcg ctgaagaaga agaaggtgga cgcgtcgagg acgcttcatg tccgctcctt 1320 cctagaccac gaccgtactt acatcccacc ggtcatgaga atagaggaag agagcagcac 1380 agccaggttt gcccgcactc agatggcaga ctttgtgcat ctggacaagc gtggaaagcc 1440 catcacggct ctggagctgt ttgcatccct ggtggaacat tttgaaagat gggctgatgc 1500 gctggaggtc tccttcggac tgtgtgtgct ggaggttatg atgctggatg tgcccacgac 1560 gcagcgctgg ttcaacgact gcgtgtcctt ccctctggac ttcgtccagt gtctttcgcg 1620 gcagtacatg gtatcggcgg cggcatttac aatgggagct gccatggcgg gcctcctgcc 1680 tgcggacttc cgcgccgtgg agacgtatcc tgagcatggg aggtacaacc gaatgttgag 1740 ccagcacctg gtcaagaggc cgttcaggct gcgccttgca gaggttgccg acctccagag 1800 cctcgttcat gtcgaagagc tggcatggcc caagcagatg cagggaagcc tggaggtgct 1860 ccgcagacga ctggaggcgt cccccaccac caacctggtc tgcgagctgg agggcagggt 1920 cgttgccgtg ctttacatgc aacggatcga gagtcttgcc gtcctcgatg gggtgcagtt 1980 catggacgta tcgtctgcgc actcccccag gggtcgtctg ctgcagctca tctcgatagc 2040 ggtccatccg gactttgcag gcatgaatct gggccgcgag ctgaaggagt ttggccttca 2100 cttggctcgg ttggacagca ccatcgagag ggtcatcggt gtcacaaggt gcagcaagga 2160 gtttcggcag tacgatggcc ccatgagtga gtacgtcaat gcgcacttct ctggggcccg 2220 gaccgacagc acgctggact tccactcctc cgccggagcg cagttcgtcc gcttggtgga 2280 gggcttccgc cccgaggaca ccgacaacgg cggcacagga gtggtcatcg cctacgacat 2340 caggagggct ctgcccaggg aggcggctgc gggcgcgccc ccgagcaggc cgccgccgag 2400 gacgaaggtc ccctcgctgc agctggtcca ggacgtcatg accagcatcg gctacccccc 2460 caacctcaat gacctcacca agggcttctt cgactacggc atggactccc tggagctcgt 2520 ccgcatccgg aacaagctga gcctcgccct gcagacggag ctccccgcga cgctgctcct 2580 cgacttcccc accgtgcacg acctcgtgga gcggctggac caggaccggg cccccgagtc 2640 cgatgaggag gaggaggtgc gggaggaggc caaggccacg gccagagccc cggccaaggc 2700 caaggccctg gccaagggcg gcgaggcgac ccagcgcttc gggccctcgg agatcatcag 2760 cgtgcagaag cgctgcctca acgtctacgc ccagcccatc taccagaagc ggttcacgga 2820 catggccaag aagtgcttcc cggacatgct caagtacatc ctcgccatag agtccatcct 2880 ggtcgaggtc gaggggccgg tcctgcagga gttccagctg atccaagatc tcgagtacaa 2940 gtcggtccag agaggccgcg agaatttgat gtactacatg tcaagctatt ggctggccca 3000 cccagagata cgcgatcaga gccagcagtt actcctcctc acgctgcagg accagtgctg 3060 gggcaataac cacttgtagg ctggcgctcc gcgggcacct cgaatctgcg gagccacata 3120 cgagagtctc agtgcgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3166 <210> 2 <211> 973 <212> PRT <213> Alexandrium fundyense <400> 2 Met Leu Val His Gly Trp Thr Ala Ala Pro Leu Leu Leu Glu Leu Val 1 5 10 15 Ala Asn Phe Ser Ala Pro Leu Glu Gly Arg Ala Gln Thr Ala Gly Glu 20 25 30 Leu Ala Ala Glu Thr Gly Ala Glu Glu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu 35 40 45 Arg Ala Cys Ser Val Leu Gly Tyr Val Arg Phe Asp Ala Gln Ser Arg 50 55 60 Ala Tyr Ser Leu Val Pro Gly Pro Glu Leu Asp Glu Leu Arg Thr Val 65 70 75 80 Leu His Pro Ala Ser Glu Val Ala Arg Gly Leu Gln Glu Leu Tyr Ser 85 90 95 Glu Val Ala Pro Pro Phe Gln Leu Pro Ser Glu Asp Ala Ala Arg Cys 100 105 110 Leu Ala Leu Trp Glu Glu Gln Arg Pro Ser Trp Ser Gln Cys Arg Ser 115 120 125 Arg Ala Leu Gly Val Leu Leu Asp Gly Ala Val Leu Ala Pro Leu Leu 130 135 140 Val Ser Val Thr Tyr Ser Ser Arg Trp Asp Glu Glu Gly Gln Glu His 145 150 155 160 Gly Arg Asp Asn Val Met Glu Arg Phe Asp Phe Ser Lys Met Leu Pro 165 170 175 Ala Gln Arg Ser Ala Leu Gly Asp Ile Phe Glu Gln Leu Gly Val Gly 180 185 190 Thr Met Asn Ala Lys Gly Val Ile Met Met Ser Ser Lys Gly Ala Met 195 200 205 Ala Leu Gln Arg Cys Tyr Ser Tyr Tyr Val Pro Leu Ser Tyr Ala Pro 210 215 220 Leu Met Ala Gln Ile Ser Pro Ile Leu Phe Asp Asp Ala Gly Trp Gly 225 230 235 240 Phe Thr Asp Ala Gly Thr Asp Ser Phe Asp Asp Val Glu Glu His Val 245 250 255 Asp Arg Ile Leu Asn Val Val Gly Ser Gly Ala Gln His Arg Thr Leu 260 265 270 Phe Lys Asp Met Met Arg His Ile Ser Thr Val Phe Lys Gly Glu Ala 275 280 285 Phe Ala Leu Gln Pro Ser Phe Val Val Asp Thr Gly Cys Gly Asp Gly 290 295 300 Ser Leu Leu Ile His Ile Tyr Glu His Ile Lys Gln His Thr Pro Arg 305 310 315 320 Gly Lys Val Leu Asp Gln Phe Pro Leu Thr Met Val Gly Val Asp Leu 325 330 335 Asn Glu Asp Pro Arg Val Thr Thr Ala Val Asn Leu Ser Lys Gln Gly 340 345 350 Val Pro His Val Val Ile Ser Gly Asp Val Gly Lys Pro Ala Glu Ile 355 360 365 Leu Ala Ala Leu Lys Lys Lys Lys Val Asp Ala Ser Arg Thr Leu His 370 375 380 Val Arg Ser Phe Leu Asp His Asp Arg Thr Tyr Ile Pro Pro Val Met 385 390 395 400 Arg Ile Glu Glu Glu Ser Ser Thr Ala Arg Phe Ala Arg Thr Gln Met 405 410 415 Ala Asp Phe Val His Leu Asp Lys Arg Gly Lys Pro Ile Thr Ala Leu 420 425 430 Glu Leu Phe Ala Ser Leu Val Glu His Phe Glu Arg Trp Ala Asp Ala 435 440 445 Leu Glu Val Ser Phe Gly Leu Cys Val Leu Glu Val Met Met Leu Asp 450 455 460 Val Pro Thr Thr Gln Arg Trp Phe Asn Asp Cys Val Ser Phe Pro Leu 465 470 475 480 Asp Phe Val Gln Cys Leu Ser Arg Gln Tyr Met Val Ser Ala Ala Ala 485 490 495 Phe Thr Met Gly Ala Ala Met Ala Gly Leu Leu Pro Ala Asp Phe Arg 500 505 510 Ala Val Glu Thr Tyr Pro Glu His Gly Arg Tyr Asn Arg Met Leu Ser 515 520 525 Gln His Leu Val Lys Arg Pro Phe Arg Leu Arg Leu Ala Glu Val Ala 530 535 540 Asp Leu Gln Ser Leu Val His Val Glu Glu Leu Ala Trp Pro Lys Gln 545 550 555 560 Met Gln Gly Ser Leu Glu Val Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Ser Pro 565 570 575 Thr Thr Asn Leu Val Cys Glu Leu Glu Gly Arg Val Val Ala Val Leu 580 585 590 Tyr Met Gln Arg Ile Glu Ser Leu Ala Val Leu Asp Gly Val Gln Phe 595 600 605 Met Asp Val Ser Ser Ala His Ser Pro Arg Gly Arg Leu Leu Gln Leu 610 615 620 Ile Ser Ile Ala Val His Pro Asp Phe Ala Gly Met Asn Leu Gly Arg 625 630 635 640 Glu Leu Lys Glu Phe Gly Leu His Leu Ala Arg Leu Asp Ser Thr Ile 645 650 655 Glu Arg Val Ile Gly Val Thr Arg Cys Ser Lys Glu Phe Arg Gln Tyr 660 665 670 Asp Gly Pro Met Ser Glu Tyr Val Asn Ala His Phe Ser Gly Ala Arg 675 680 685 Thr Asp Ser Thr Leu Asp Phe His Ser Ser Ala Gly Ala Gln Phe Val 690 695 700 Arg Leu Val Glu Gly Phe Arg Pro Glu Asp Thr Asp Asn Gly Gly Thr 705 710 715 720 Gly Val Val Ile Ala Tyr Asp Ile Arg Arg Ala Leu Pro Arg Glu Ala 725 730 735 Ala Ala Gly Ala Pro Pro Ser Arg Pro Pro Pro Arg Thr Lys Val Pro 740 745 750 Ser Leu Gln Leu Val Gln Asp Val Met Thr Ser Ile Gly Tyr Pro Pro 755 760 765 Asn Leu Asn Asp Leu Thr Lys Gly Phe Phe Asp Tyr Gly Met Asp Ser 770 775 780 Leu Glu Leu Val Arg Ile Arg Asn Lys Leu Ser Leu Ala Leu Gln Thr 785 790 795 800 Glu Leu Pro Ala Thr Leu Leu Leu Asp Phe Pro Thr Val His Asp Leu 805 810 815 Val Glu Arg Leu Asp Gln Asp Arg Ala Pro Glu Ser Asp Glu 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tccggacgca acgagctcga ggaggcttcc gccaagtcga 240 acatccacgg cctcgacctc ggcaccgatg ccttcatgct ggtgcacggg tggacttgcg 300 ggcccttgct cctggagttt gttgcgagct tcctgcagcc cttgcagcgg cagcccatga 360 ccgccgagca gctcgccgcg gagacaaacg cgggggaagg gcccgtggcg atcactctgc 420 ggacaatggc catcctcggg tacttggacc tggaccctga gaccgatgtg tatgccgtgg 480 tccccgggcc ggggattgag gcgctcgccg cgctcctccg gccagcggcg cccaccagcg 540 cggccttgcg aagcatctac cagcacgccc agccgccgtt cagggtgccc tcatccgagg 600 cggcgcactg cttgcggatt tgggcggagc accggcccac ctggagaagg gcggcttgca 660 agcggctggc cctcctgctc gacggggccg tcctcgtccc gttgttgacc tcgatcacat 720 actttgcgag gtgggacgag gaggggctgg attccggcaa ggagggcgcc ttggaccgcc 780 tcgacttcag caaggccaat gccgcggcaa gggcggccct cgggggcatc ttcggcgagt 840 tgggcgtggg cacagtggac ggcgagggca ccgtgacctt gaccgcggag ggctcgttcg 900 ccctgcagcg tcgctactcc tactacgtcc cgacgtccta cgccccactg ctggacaggt 960 accacagcat cctcttcgag aatcccggct gggggttcgc cggtgccggc cgggactcgc 1020 aggagcagga gatccacgtc caccggacgc tgaacgtggt gggcagcggg gcgcagcacc 1080 agacgctctt cacggacctc gtgcggctca ttgactcggt cttcgcgggc ggggacttcg 1140 cgtcgcagcc ggcgttcgtc gtggacacgg ggtgcggcga cggccgcttg ctcaggcgca 1200 tctacgagca cgtgaagagc aacacgccgc gcgggaaggc gctcgccgag cacccgctca 1260 cgatggtcgg cgtcgacttc aacaaggact ctcgggtggc gacggagctc aacctgagca 1320 ggcacgcagt cccgcacctg gtgctgttcg gggacgtcgg caagcccgcc gacatcatgg 1380 agatcctcgg gcggaagggg gtggacccga gcaggtccct ccacgtgcgc tccttcctgg 1440 accacgaccg gccgtacgtc cccccggccc gcgagatgga cccggacagc gcggccggga 1500 ggttcgcgag gctgcagctg tcggactgcg cccacctcga cggcgagggc aagcggatcg 1560 cgccgagcga gatgttcgcc tcgctggtgg agcacttcca gcgctggggc ggcgccctgc 1620 agggctcgtt cggcctctgc atgctggagg tcatgatgct ggacgtgccg acgacgaggg 1680 cgtccctgaa cgattgcgtc tcgctccact tcgacctcgt gcagtgcctc tcccggcagt 1740 acatggtgtc gccggcggcc ttcgccttgg gcctggccat ggccggcctc ctgcccggga 1800 gctacgaggg cgtccagacc cacccggcgc gggggcggta ctgccgcgtg atgagccagc 1860 acctcgtgcg ccggccgtac cagatccgcc 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ccgtcgggct gctcttcgag gcgtccacgc 2760 ccaggaagct ggccgcgcac ctccaccgcg agatgcagcg gctggccggc caggcggacg 2820 gggggccgcg cctcggcccc gcaccggccg ccgccgccgc gccgccgccc gctgcggcca 2880 gggaggaggc cgcggaggct ccgctggcct ccttcgactc ggtgtgcacc aagctcgagg 2940 ggtgctccgc gctggtcgac ggctgctggt gcatcgacgt ggcgaactgc agctacctcg 3000 gcttccagtg gcgggacgag atcgccgatg gcgtggaccg ggacgtgcgc acttggggcg 3060 tccacccccc gtggaccagg ctcgtctcgt ctccgaagct gtacgacgac gtcgaggcgc 3120 gctgttgcga gctgaccggc atctggaagt gcgttctgta cccgagcgtt accatgctca 3180 acatgggagt catcccgagc ctcgtgggcg agagcgggtt cctcctcctg gacataaacg 3240 cccacgactg cgtgcagacg gccgccaggc tctgcaagaa gggcgccacc gtggtgcgcc 3300 tgaggcacaa cgacgcggag cagctcgagc acatgctctc gtcgatcccg cagggggccg 3360 acatcaccta cgtgtgcgac ggcgtgtact ccacggacgg agagctcgcc gacttgcccg 3420 ccatatgtgc ttgtttgagg ccgcgcgggg ccaagatact cgtagacgac tcgcatggct 3480 gcggcgttct tggccgcaac cccgactcgg agcaaccctt cgggtatggt ggcggcggcg 3540 tcgtcgagta cttcgggctg gactacgcgg agaacaacat catctacgcc gggcagctga 3600 gcaaggcgtt caattcgccc ggcggattcg tcggctgtgc gcgcgagacc gacgagaagt 3660 tcggcattct gaacttggcc aagaactcga acacactcgt gttcacaggg ccgatctgta 3720 ctgccggcct gtcgagtgcg atgacgaccc tcgacctcaa cgccgccgag ggggaccttc 3780 agcgcaagcg gcttctggcg gcgaccctcg aattctgcga ggggctcaag gcgctcgggt 3840 gcccccacac ctaccacggg ttccccatcg tcaacatcta ctggaccccg gtcgaggtgt 3900 gcgcagaggt gtacagggag ctgatgagcg cgaggcaggg cgcgttccag cagggcgtcg 3960 tcacgacccc catgtggcac cccatcgccc cgaagggcca cgagatgctg cgcttccagt 4020 tcacgtcgct ccacgacgag gccgccgtgc gccacatcct cgtgatcctc gaggacctga 4080 tcaagcgcta cccgccctcc gccgtgccgc cgcgcatctg atcggccgcc cgagccgcag 4140 gaccagcgcc gctcatccca ggggttgttt aagggattgt tgagtctttt caatctagtc 4200 agcgtgtttt taatgtgcaa gcagcaaggg tcaggcggat tctgggcttg tacaccaagg 4260 gccaggcagg ttttggctgc cgccgttttg atcctgctgt gttgtcgtag cgtgcaagca 4320 gcaagggtca ggcggagtcc tgggcttgta caccaagggc caggcaggtt tggctgccgc 4380 cgttttgatc ctgctgtgtt gtggtagcat gcaagcagca agggtcaggc ggattttggg 4440 ctttgctgat cctgatccaa ggtatgacca gccatggcgc atcatcgcgt ctaaggtagc 4500 gcctgtccat gtctgccatc ttagctggtc actattcgca tcaacactcg caaggtacgc 4560 gtctgctacg cacaggtgac aattgacatt gtggatcgag ccacggaagg gagaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 4648 <210> 4 <211> 1281 <212> PRT <213> Alexandrium fundyense <400> 4 Met Leu Val His Gly Trp Thr Cys Gly Pro Leu Leu Leu Glu Phe Val 1 5 10 15 Ala Ser Phe Leu Gln Pro Leu Gln Arg Gln Pro Met Thr Ala Glu Gln 20 25 30 Leu Ala Ala Glu Thr Asn Ala Gly Glu Gly Pro Val Ala Ile Thr Leu 35 40 45 Arg Thr Met Ala Ile Leu Gly Tyr Leu Asp Leu Asp Pro Glu Thr Asp 50 55 60 Val Tyr Ala Val Val Pro Gly Pro Gly Ile Glu Ala Leu Ala Ala Leu 65 70 75 80 Leu Arg Pro Ala Ala Pro Thr Ser Ala Ala Leu Arg Ser Ile Tyr Gln 85 90 95 His Ala Gln Pro Pro Phe Arg Val Pro Ser Ser Glu Ala Ala His Cys 100 105 110 Leu Arg Ile Trp Ala Glu His Arg Pro Thr Trp Arg Arg Ala Ala Cys 115 120 125 Lys Arg Leu Ala Leu Leu Leu Asp Gly Ala Val Leu Val Pro Leu Leu 130 135 140 Thr Ser Ile Thr Tyr Phe Ala Arg Trp Asp Glu Glu Gly Leu Asp Ser 145 150 155 160 Gly Lys Glu Gly Ala Leu Asp Arg Leu Asp Phe Ser Lys Ala Asn Ala 165 170 175 Ala Ala Arg Ala Ala Leu Gly Gly Ile Phe Gly Glu Leu Gly Val Gly 180 185 190 Thr Val Asp Gly Glu Gly Thr Val Thr Leu Thr Ala Glu Gly Ser Phe 195 200 205 Ala Leu Gln Arg Arg Tyr Ser Tyr Tyr Val Pro Thr Ser Tyr Ala Pro 210 215 220 Leu Leu Asp Arg Tyr His Ser Ile Leu Phe Glu Asn Pro Gly Trp Gly 225 230 235 240 Phe Ala Gly Ala Gly Arg Asp Ser Gln Glu Gln Glu Ile His Val His 245 250 255 Arg Thr Leu Asn Val Val Gly Ser Gly Ala Gln His Gln Thr Leu Phe 260 265 270 Thr Asp Leu Val Arg Leu Ile Asp Ser Val Phe Ala Gly Gly Asp Phe 275 280 285 Ala Ser Gln Pro Ala Phe Val Val Asp Thr Gly Cys Gly Asp Gly Arg 290 295 300 Leu Leu Arg Arg Ile Tyr Glu His Val Lys Ser Asn Thr Pro Arg Gly 305 310 315 320 Lys Ala Leu Ala Glu His Pro Leu Thr Met Val Gly Val Asp Phe Asn 325 330 335 Lys Asp Ser Arg Val Ala Thr Glu Leu Asn Leu Ser Arg His Ala Val 340 345 350 Pro His Leu Val Leu Phe Gly Asp Val Gly Lys Pro Ala Asp Ile Met 355 360 365 Glu Ile Leu Gly Arg Lys Gly Val Asp Pro Ser Arg Ser Leu His Val 370 375 380 Arg Ser Phe Leu Asp His Asp Arg Pro Tyr Val Pro Pro Ala Arg Glu 385 390 395 400 Met Asp Pro Asp Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ala Arg Leu Gln Leu Ser 405 410 415 Asp Cys Ala His Leu Asp Gly Glu Gly Lys Arg Ile Ala Pro Ser Glu 420 425 430 Met Phe Ala Ser Leu Val Glu His Phe Gln Arg Trp Gly Gly Ala Leu 435 440 445 Gln Gly Ser Phe Gly Leu Cys Met Leu Glu Val Met Met Leu Asp Val 450 455 460 Pro Thr Thr Arg Ala Ser Leu Asn Asp Cys Val Ser Leu His Phe Asp 465 470 475 480 Leu Val Gln Cys Leu Ser Arg Gln Tyr Met Val Ser Pro Ala Ala Phe 485 490 495 Ala Leu Gly Leu Ala Met Ala Gly Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Glu Gly 500 505 510 Val Gln Thr His Pro Ala Arg Gly Arg Tyr Cys Arg Val Met Ser Gln 515 520 525 His Leu Val Arg Arg Pro Tyr Gln Ile Arg Leu Ala Glu Val Gly Asp 530 535 540 Leu Pro Arg Leu Ala Arg Leu Glu Glu Leu Ala Trp Gly Arg Leu Gly 545 550 555 560 Ala Thr Pro Glu Val Leu Arg Arg Arg Leu Glu Thr Ser Pro Thr Thr 565 570 575 Cys Leu Ala Val Glu Met Asp Gln Leu Val Val Ala Val Leu Tyr Thr 580 585 590 Gln Arg Val Asp Ser Ala Asp Val Val Asp Gln Gln Lys Phe Met Gln 595 600 605 Val Ser Asp Trp His Ser Pro Ser Gly Arg Ile Met Gln Leu Ile Ala 610 615 620 Ile Cys Ser Asp Pro Ala Ala Lys His Leu Gly Val Ala Ala Asp Leu 625 630 635 640 Leu Ala Phe Ala Leu His Leu Ala Arg Leu Ser Pro Asp Val Asp Ser 645 650 655 Val Ile Gly Val Thr Arg Cys Gln Asn Phe Glu Thr Phe Ala Gly Ser 660 665 670 Met Arg Asp Tyr Val Asp Glu His Ile Ala Gly Thr Arg Val Asp Pro 675 680 685 Ile Ile Gly Leu His Thr Gly Asn Gly Ala Arg Val Val Arg Leu Val 690 695 700 His Gly Phe Arg Pro Glu Asp Val Gly Asn Arg Gly Asp Gly Val Leu 705 710 715 720 Ile Gln Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Gly Ala Ala Thr Gly Glu Arg Ala 725 730 735 Ala Pro Gly Val Gly Pro Ala Ala Ala Pro Pro Pro Gly Pro Ala Pro 740 745 750 Ala Pro Cys Pro Thr Asp Tyr Glu His His Glu Ala Leu Val Leu Ala 755 760 765 Ala Leu Gly Ser Leu Met Leu Lys Asn Gly Gly Thr Glu Ala Ala Ala 770 775 780 Ala Gly Ser Ala Asp Val Arg Phe Val Asp Met Asp Leu Leu Asp Ser 785 790 795 800 Leu Asn Phe Thr Asp Phe Ala Gly Gln Leu Asp Ala Ala Leu Pro Val 805 810 815 Pro Val Ser Val Gly Leu Leu Phe Glu Ala Ser Thr Pro Arg Lys Leu 820 825 830 Ala Ala His Leu His Arg Glu Met Gln Arg Leu Ala Gly Gln Ala Asp 835 840 845 Gly Gly Pro Arg Leu Gly Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro 850 855 860 Pro Ala Ala Ala Arg Glu Glu Ala Ala Glu Ala Pro Leu Ala Ser Phe 865 870 875 880 Asp Ser Val Cys Thr Lys Leu Glu Gly Cys Ser Ala Leu Val Asp Gly 885 890 895 Cys Trp Cys Ile Asp Val Ala Asn Cys Ser Tyr Leu Gly Phe Gln Trp 900 905 910 Arg Asp Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp Arg Asp Val Arg Thr Trp Gly 915 920 925 Val His Pro Pro Trp Thr Arg Leu Val Ser Ser Pro Lys Leu Tyr Asp 930 935 940 Asp Val Glu Ala Arg Cys Cys Glu Leu Thr Gly Ile Trp Lys Cys Val 945 950 955 960 Leu Tyr Pro Ser Val Thr Met Leu Asn Met Gly Val Ile Pro 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tcggcgtcga cttcaacaag 360 gactctcggg tggccacgga gctcaacctg agcaggcacg cggtcccgca cctggtgctg 420 ttcggggacg tcggcaagcc cgccgacatc atggagctcc tcgggcggag gggggtggac 480 ccgagcaggt ccctccacgt gcgc 504 <210> 6 <211> 504 <212> DNA <213> Alexandrium catenella <400> 6 gtcccgacct cctacgcccc actgctggac aggtaccacc gcatcctctt cgagaatccc 60 ggctgggggt tcgccggcgc cggccgggac tcgcaggagc aggaggtcca cgtccaccgg 120 acgctgaacg tggtgggcag cggggcgcag caccagacgc tcttcacgga tctcgtgcgg 180 ctgattgact cagtcttcgc gggcggggac ttcgcggcgc agccggcgtt cgtcgtggac 240 acagggtgcg gcgacggccg cttgctcagg cgcatctacg agcacgtgaa gagcaacacg 300 ccgcgcggga aggcgctcgg cgagcacccg ctcacgatgg tcggcgtcga cttcaacaag 360 gactctcggg tggccacgga gctcaacctg agcaggcacg cggtcccgca cctggtgctg 420 ttcggggacg tcagcaagcc cgccgacatc atggagctcc tcgggcggaa tggggtggac 480 ccgagcaggt ccctccacgt gcgc 504 <210> 7 <211> 402 <212> DNA <213> Alexandrium catenella <400> 7 gaggagcatg ttgacagaat cttgaatgtc gttggcagtg gtgcgcaaca ccggaccctc 60 tttaaggatc 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agggggtgga 480 ccctagcagg tccctccacg tgcgc 505 <210> 9 <211> 504 <212> DNA <213> Alexandrium catenella <400> 9 gtcccgacct cctacgcccc actgctggac aggtaccacc gcatcctctt cgagaatccc 60 ggctgggggt tcgccggcgc cggccgggac tcgcaggagc aggaggtcca cgtccaccgg 120 acgctgaacg tggtgggcag cggggcgcag caccagacgc tcttcacgga tctcgtgcgg 180 ctcattgact cggtcttcgc gggcggggac ttcgcggcgc agccggcgtt cgtcgtggac 240 acggggtgcg gcgacggccg cttgctcagg cgcatctacg agcacgtgaa gagcaacacg 300 ccgcgcggga aggcgctcgg cgagcacccg ctcacgatgg tcggcgtcga cttcaacaag 360 gactctcggg tggccacgga gctcaacctg agcaggcacg cggtcccgca cctggtgctg 420 ttcggggacg tcggcaagcc cgccgacatc atggagctcc tcgggcggag gggggtggac 480 ccgagcaagt ccctccacgt gcgc 504 <210> 10 <211> 504 <212> DNA <213> Alexandrium catenella <400> 10 gtcccagtgt cgtacgcacc actgatggcc cagatctcac cgatcctctt tgatgatgcg 60 ggctgggggt tcactgacgc ggggacagac tccttcgacg tggaggagca tgttgacaga 120 atcttgaatg tcgtgggcag tggtgcgcaa caccggaccc tctttaagga tctgatgcga 180 cacatcagtg ccgtgttcaa 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ccctccacgt gcgc 504 <210> 12 <211> 448 <212> DNA <213> Alexandrium tamarense <400> 12 cccggttggg ggttcgccgg cgccggccgg gactcgcagg agcaggaggt ccacgtccac 60 cggacgctga acgtggtggg cagcggggcg cagcaccaga cgctcttcac ggatctcgtg 120 cggctcattg actcggtctt cgcgggcggg gacttcgcgt cgcagccggc gttcgtcgtg 180 gacacggggt gcggcgacgg ccgcttgctc aggcgcatct acgagcacgt gaagagcaac 240 acgccgcgcg ggaaggcgct cgccgagcac ccgctcacga tggtcggcgt cgacttcaac 300 aaggactctc gggtggcgac ggagctcaac ctgagcaggc acgcggtccc gcacctggtg 360 ctgttcgggg acgttcggca agcccgccga catcatggag atcctcgggc ggaagggggt 420 ggacccgagc aggtccctcc acgtgcgc 448 <210> 13 <211> 504 <212> DNA <213> Alexandrium tamarense <400> 13 gtcccgacgt cctacgcccc actgctggac aggtaccaca gcatcctctt cgagaatccc 60 ggctgggggt tcgctggtgc cggccgggac tcgcaggagc aggaggtcca cgtccaccgg 120 acgctgaacg tggtgggcag cggggcgcag caccagacgc tcttcacgga cctcgtgcgg 180 ctcattgact cggtcttcgc gggcggggac ttcgcatcgc agccggcgtt catcgtggac 240 acggggtgcg gcgacggccg cttgctcagg cgcatctacg 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ggtttttttt tttttcaaaa accaatcatc ccggaaccta 540 gtgggcgaga gcgggttcct cctcctgtac ataaacgccc acgactgcgt gcagacggcc 600 gccaggctct gcaagaaggg cgccaccgtg gtgcgcctga agcacaacga cacggaacag 660 cccgagcaca tgctctcgtc gatcccgcag ggggccgaca tcacctacgt gtgcgacggc 720 gtgtactcca cggacgaaga gctcgccgac ttgcccgcca tatgtgcttg tttgaggccg 780 cgcggggcca agatactcgt agacgactcg catggctgcg gcgttcttgg ccgcaacccc 840 aactcggagc aacccctcgg gtatggtggc ggcggcgtca tcgagtactt cgggctggac 900 tacgcggaga acaacatcat ctacgccggg cagctgagca aggcgttcaa ttcgcccggc 960 ggattcgtca gctgtgcgcg cgagaccgac aaaaatttcg gcgttctgaa cttggccaaa 1020 aactcgaaca cactcgtgtt cacagggccg atctgtactg ccggcctgtc gagtgcgaaa 1080 acaaccttcg acctcaacgc cgccgagggg gaccttcaac gcaagcggct tctggcggct 1140 accctcgaaa ttctgcgagg ggctcaaggc gctcgggtgc ccccacacct accacgagtg 1200 ccccatcgtc aatacggggg gggaacacac aagctacgca agcgcttctg ggtgagccat 1260 aggcgctccc gtggcccaca aatataacag gaaaccaccg cccacttctc tgctattca 1319

Claims (25)

  1. 샘플에서 삭시톡신(saxitoxin) 생성 와편모조류(dinoflagellate)를 검출하는 방법으로서,
    상기 방법에서 사용하기 위한 샘플을 수득하는 단계, 및
    와편모조류 삭시톡신 A 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 중 하나 이상의 존재에 대하여 샘플을 분석하는 단계
    를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 존재는 샘플에서의 삭시톡신 생성 와편모조류의 존재를 나타내는 방법.
  2. 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류의 부재를 결정하는 방법으로서,
    상기 방법에서 사용하기 위한 샘플을 수득하는 단계, 및
    와편모조류 삭시톡신 A 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 중 하나 이상의 존재에 대하여 샘플을 분석하는 단계
    를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 부재는 샘플에서의 삭시톡신 생성 와편모조류의 부재를 나타내는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5-197, 224-227, 230-242 및 247 중 임의의 하나에 개시된 것으로부터 선택되는 삭시톡신 A 뉴클레오티드 서열 또는 상기 서열들 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 삭시톡신 A1 촉매 도메인 서열, 삭시톡신 A4 촉매 도메인 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 삭시톡신 A4 촉매 도메인 서열 또는 이의 단편은 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3115-4121, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3597-3721, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 삭시톡신 A1 촉매 도메인 서열은 서열 번호 1에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 160-1821, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 277-2022, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 단계는 폴리머라아제 연쇄 반응에 의한 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드의 증폭을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리머라아제 연쇄 반응은 서열 번호 198-199, 200-211, 220-223, 228-229, 및 243-244 중 임의의 하나에 개시된 서열, 또는 상기 서열들 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함하는 하나 이상의 프라이머를 이용하는 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 개시된 삭시톡신 A의 아미노산 서열, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 삭시톡신 생성 와편모조류는 알렉산드륨(Alexandrium), 피로디늄(Pyrodinium) 또는 김노디늄(Gymnodinium) 속 유래의 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 삭시톡신 생성 와편모조류는 에이. 카테넬라(A. catenella), 에이. 푼디엔세(A. fundyense), 에이. 루시타니쿰(A lusitanicum), 에이. 미누툼(A. minutum), 에이. 오스텐펠디이(A. ostenfeldii), 에이. 타마렌세(A. tamarense), 지. 카테나툼(G. catenatum), 및 피. 바하멘세 바 콤프레숨(P. bahamense var compressum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 와편모조류 삭시톡신 A 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 존재를 검출하는 하나 이상의 에이전트(agent)를 포함하는, 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류를 검출하는 키트.
  13. 와편모조류 삭시톡신 A 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 존재를 검출하는 하나 이상의 에이전트를 포함하는, 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류의 부재를 결정하는 키트.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 에이전트는 서열 번호 5-197, 224-227, 230-242 및 247 중 임의의 하나에 개시된 것으로부터 선택되는 삭시톡신 A 뉴클레오티드 서열 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 것인 키트.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 에이전트는 삭시톡신 A1 촉매 도메인 서열, 삭시톡신 A4 촉매 도메인 서열 또는 이들의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 것인 키트.
  16. 제15항에 있어서, 삭시톡신 A4 촉매 도메인 서열 또는 이의 단편은 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3115-4121, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3597-3721, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함하는 것인 키트.
  17. 제15항에 있어서, 삭시톡신 A1 촉매 도메인 서열은 서열 번호 1에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 160-1821, 서열 번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 277-2022, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체를 포함하는 것인 키트.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 에이전트는 프라이머, 프로브 또는 항체인 키트.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 에이전트는 서열 번호 198-199, 200-211, 220-223, 228-229, 및 243-244 중 임의의 하나에 개시된 서열, 또는 상기 서열들 중 임의의 하나의 단편 또는 변이체를 포함하는 프라이머인 키트.
  20. 제12항 또는 제13항에 있어서, 에이전트는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 개시된 삭시톡신 A의 아미노산 서열, 또는 어느 하나의 서열의 단편 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 것인 키트.
  21. 서열 번호 1에 개시된 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  22. 서열 번호 3에 개시된 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  23. 서열 번호 5-197, 224-227, 230-242 및 247 중 임의의 하나에 개시된 서열 또는 상기 서열들 중 임의의 하나의 변이체 또는 단편을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드.
  25. 서열 번호 198의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 199의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
    서열 번호 200의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 201의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
    서열 번호 202의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 203의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
    서열 번호 204의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 205의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
    서열 번호 206의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 207의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
    서열 번호 208의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 209의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
    서열 번호 210의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 211의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
    서열 번호 220의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 221의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
    서열 번호 222의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 223의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
    서열 번호 228의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 229의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머; 또는
    서열 번호 243의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머 및 서열 번호 244의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머
    를 포함하는, 샘플에서 삭시톡신 생성 와편모조류를 검출하기 위한 프라이머쌍.
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