BR112013029635A2 - "método para a detecção de uma produção de dinoflagelados saxitoxina em uma amostra, kit para a detecção de dinoflagelados, kit para a determinação sa ausencia de um dinoflagelados, polinucleotídeo" - Google Patents

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Shaunna Ann Murray
Anke Stuken
Kjetill S. Jakobsen
Russel J. S. Orr
Ralf Kellmann
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Universitetet I Oslo
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Abstract

MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE UMA PRODUÇÃO DE DINOFLAGELADOS SAXITOXINA EM UMA AMOSTRA, KIT PARA A DETECÇÃO DE DINOFLAGELADOS, KIT PARA A DETERMINAÇÃO DA AUSÊNCIA DE UM DTNOFLAGELADOS, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO E PAR DE PRIMERS PARA A DETECÇÃO DE UMA PRODUÇÃO DE DINOFLAGELADOS A invenção relaciona-se ao campo das saxitoxinas e da identificação de microrganismos capazes de produzi-las. Mais especificamente, a invenção relaciona-se à identificação de genes que codificam saxitoxinas em dinoflagelados e métodos para a detecção específica de dinoflagelados que são produtores de saxitoxinas.

Description

MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE UMA PRODUÇÃO DE DINOFLAGELADOS SAXITOXINA EM UMA AMOSTRA, KIT PARA A DETECÇÃO DE DINOFLAGELADOS, KIT PARA A DETERMINAÇÃO DA AUSÊNCIA DE UM DINOFLAGELADOS E PAR DE PRIMERS PARA A DETECÇÃO DE UMA
PRODUÇÃO DE DINOFLAGELADOS Modalidade por referência cruzada Este pedido reivindica prioridade do pedido provisório de patente Norte-Americano No. 61/486,633, depositado em 16 de maio de 2011, cujo conteúdo integral é incorporado aqui como referência cruzada. Campo Técnico A invenção refere-se ao campo das saxitoxinas e da identificação de microrganismos capazes de produzi-las. Mais especificamente, a invenção refere-se à identificação de genes que codificam saxitoxinas em dinoflagelados e métodos para a detecção específica de dinoflagelados que são produtores de saxitoxinas.
Estado da Técnica Saxitoxina (STX) é uma potente neurotoxina que ocorre em ambientes aquáticos em todo mundo e tem impactos significantes sobre a economia, O meio ambiente e a saúde humana. A ingestão de espécies vetores pode levar a uma paralisia devido ào envenenamento por moluscos (paralytic shellfish poisoning), uma severa doença humana que pode levar à paralisia e morte. Um número estimado de 2000 casos desta doença, com taxa de mortalidade de 15 %, ocorre globalmente todos os anos. Os
2 /155 custos de monitoramento e mitigação de STX representaram uma perda econômica anual com o afloramento de plânctons prejudiciais calculada em US$ 895 milhões. Em ambientes com água fresca, a STX é predominantemente produzida por cianobactérias procarióticas. Entretanto, em ambientes marinhos, dinoflagelados eucarióticos têm sido associados à presença de STX. A despeito da associação de um número de espécies dinoflageladas com a produção de STX, a base genética para a produção de STX nestes microrganismos permanece elusiva.
Há a necessidade de métodos para detectar a presença (ou ausência) de dinoflagelados produtores de STX em amostras marinhas.
Sumário da invenção Um número de estudos tem se empenhado sem sucesso em identificar os genes geradores da STX e/ou enzimas em dinoflagelados por caracterização enzimática, técnicas de PCR (do inglês, polymerase chain reaction), análise in silico de bibliotecas de marcadores de sequência genética (EST) ou pelo uso de outra sequência de nucleotídeos disponível publicamente. Ademais, inúmeros estudos prévios têm sugerido que as STX podem não ser produzidas de fato por dinoflagelados, mas, ao invés disso, por cocultura de bactérias (co-cultured bactéria).
Os atuais inventores têm determinado que os dinoflagelados são de fato produtores de STX e têm identificado genes
3 /155 responsáveis pela produção de STX. A identificação de genes responsáveis pela produção de STX proporciona uma base para numerosos testes moleculares para detectar dinoflagelados produtores de STX em água fresca e ambientes marinhos.
Sob um primeiro aspecto, a invenção proporciona um método para detectar um dinoflagelado produtor de STX em uma amostra, sendo que o método compreende: obter uma amostra para uso no método e lo analisar a amostra para determinar a presença de um ou mais polinucleotídeos de saxitoxina A de dinoflagelado ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotideo propriamente dito, onde a presença do polinucleotideo ou polipeptídeo propriamente ditos indica a presença de um dinoflagelado produtor de saxitoxina na amostra. Sob um segundo aspecto, a invenção proporciona um método para determinar a ausência de um dinoflagelado produtor de saxitoxina em uma amostra, onde tal método compreende: obter uma amostra para uso no método «e analisar a amostra para determinar a ausência de um ou mais polinucleotídeos de saxitoxina A de dinoflagelado ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo propriamente dito, . onde a ausência do polinucleotídeo ou polipeptídeo propriamente ditos indica a ausência de dinoflagelados produtores de saxitoxina.
4 /155 .Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, O polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de saxitoxina A selecionada a partir de qualquer uma dentre as dispostas na SEQ ID NOS: 5-197, 224-227, 230-242 ou 247 ou um fragmento ou variante de uma dessas sequências.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, oO polinucleotídeo compreende uma sequência de domínio catalítico de saxitoxina Al, uma sequência de domínio catalítico de saxitoxina A4 ou um de seus fragmentos.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, a sequência de domínio catalítico de saxitoxina A4 ou fragmento desta compreende os nucleotídeos 3115-4121 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 3597- 3721 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, ou fragmento ou variante de qualquer sequência.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, a sequência de domínio catalítico de saxitoxina A4 ou fragmento desta consiste dos nucleotídeos 3115-4121 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 3597- 3721 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, ou fragmento ou variante de qualquer sequência.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, à sequência de domínio catalítico de saxitoxina Al compreende os nucleotídeos 160-1821 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 277-2022 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, ou fragmento ou variante de qualquer sequência. Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, a sequência de domínio catalítico de saxitoxina Al consiste dos nucleotídeos 160-1821 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 277-2022 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, ou fragmento Ou variante de qualquer sequência.
ÃO Em uma modalidade do prímeiro ou do segundo aspectos, a análise compreende a amplificação de polinucleotídeos da amostra por reação em cadeia de polimerase.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, a reação em cadeia de polimerase utiliza um ou mais primers compreendendo as sequências dispostas na SEQ ID NO: 198 ou SEQ ID NO: 199, ou fragmento ou variante de qualquer destas sequências.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, a reação em cadeia da polimerase utiliza um ou mais primers consitindo das sequências dispostas na SEQ ID NO: 198 ou SEQ ID NO: 199, ou fragmento ou variante de qualquer destas sequências.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, a reação em cadeia da polimerase utiliza um ou mais primers compreendendo ou consistindo de qualquer uma das sequências
6 /155 dispostas nas SEQ ID NOS: 198-199, 200-211, 220-223, 228-229, 243-244, ou fragmento ou variante de qualquer destas sequências.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, o polipeptídeo compreende uma sequência de amincácidos de saxitoxina A disposta na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou um fragmento ou variante de qualquer destas sequências.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, o polipeptídeo consiste de uma sequência de aminoácidos de saxitoxina A disposta na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou um fragmento ou variante de qualquer destas sequências.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, oO dinoflagelado produtor de saxitoxina é do gênero Alexandrium, Pyrodinium or Gymnodinium.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, o dinoflagelado produtor de saxitoxina é selecionado do grupo consistindo de A. catenella, A. fundyense, A lusitanicum, A. minutum, A. ostenfeldii, A. tamarense, G. catenatum e PP. bahamense var compressum.
Em uma modalidade do primeiro ou do segundo aspectos, a análise propriamente dita é realizada usando um par de primers do décimo primeiro ou décimo segundo aspectos.
Sob um terceiro aspecto, a invenção prescreve um kit para a detecção de dinoflagelado produtor de saxitoxina em uma amostra. O kit compreende pelo menos um agente para detecção da presença de um polinucleotiídeo de saxitoxina A de dinoflagelado ou polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo propriamente dito.
Sob um quarto aspecto, a invenção prescreve um Kit para a detecção de dinoflagelado produtor de saxitoxina em uma amostra. O kit compreende pelo menos um agente para detecção da presença de um polinucleotídeo de saxitoxina A de dinoflagelado ou polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo propriamente dito.
Em uma modalidade do terceiro ou quarto aspectos, o agente liga-se especificamente ao polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos de saxitoxína A selecionada a partir de qualquer uma das dispostas nas SEQ ID NOS: 5-197, 224-227, 230-242 e 247 ou um fragmento ou variante de qualquer uma dessas sequências.
Em uma modalidade do terceiro ou quarto aspectoss, o agente liga-se especificamente a um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de domínio catalítico de saxitoxina Al, uma sequência de domínio catalítico de saxitoxina A4 ou um fragmento destas.
Em uma modalidade do terceiro ou quarto aspectoss, à sequência de domínio catalítico de saxitoxina A4 ou fragmento
8 /155 desta compreende nucleotídeos 3115-4121 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 3597- 3721 da sequência de nucleotídeos disposta na SEQ ID NO: 3, ou um fragmento ou variante de qualquer uma das sequências.
Em uma modalidade do terceiro ou quarto aspectoss, a sequência de domínio catalítico de saxitoxina A4 ou fragmento desta consiste de nucleotídeos 3115-4121 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 3597- 3721 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, ou um fragmento ou variante de qualquer uma das sequências.
Em uma modalidade do terceiro Ou quarto aspectos, a sequência de domínio catalítico de saxitoxina Al compreende nucleotídeos 160-1821 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 1; nucleotídeos 277-2022 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, ou um fragmento ou variante de qualquer uma das sequências.
Em uma modalidade do terceiro ou quarto aspectos, a sequência de domínio catalítico de saxitoxina Al consiste de nucleotídeos 160-1821 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: l, nucleotídeos 277-2022 da sequência polinucleotídica disposta na SEQ ID NO: 3, ou um fragmento ou variante de qualquer uma das sequências.
Em uma modalidade do terceiro ou quarto aspectos, o agente é um primer, sonda ou anticorpo.
9 /155 Em uma modalidade do terceiro ou quarto aspectos, o agente é um primer compreendendo a sequência disposta na SEQ ID NO: 198 ou SEQ ID NO: 199, ou um fragmento ou variante de qualquer uma das sequências.
Em uma modalidade do terceiro ou quarto aspectos, o agente é um primer consistindo da sequência disposta na SEQ ID NO: 198 ou SEQ ID NO: 199, ou um fragmento ou variante de qualquer uma das sequências.
Em uma modalidade do terceiro ou quarto aspectos, o agente é um primer compreendendo a sequência disposta na SEQ ID NO: 198-199, 200-211,220-223,228-229 e 243-244 ou um fragmento ou variante de qualquer uma dessas sequências.
Em uma modalidade do terceiro ou quarto aspectos, o agente liga-se especificamente à sequência de aminoácidos da saxitoxina A disposta na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou um fragmento ou variante de qualquer uma das sequências.
Em uma modalidade do terceiro Ou quarto aspectos, o Kit compreende dois agentes, onde os dois ageéntes são um par de primer do décimo primeiro ou décimo segundo aspecto. Em uma modalidade do primeiro, segundo, terceiro ou quarto aspectos, à amostra é uma amostra ambiental. Em uma modalidade do primeiro, segundo, terceiro ou quarto aspectos, a amostra é uma amostra de água salgada.
10 / 155 Em uma modalidade do primeiro, segundo, terceiro ou quarto aspectos, a amostra é uma amostra ambiental. Em uma modalidade do primeiro, segundo, terceiro ou quarto aspectos, a amostra é uma amostra de água fresca. Em uma modalidade do primeiro, segundo, terceiro ou quarto aspectos, a amostra é uma amostra marinha.
" Sob um quinto aspecto, a invenção prevê um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência disposta na SEQ ID NO: 1, ou variante ou fragmento desta.
Em uma modalidade do quinto aspecto, o polinucleotídeo isolado consiste de uma sequência disposta na SEQ ID NO: 1, ou variante ou fragmento desta.
Sob um sexto aspecto, a invenção prevê um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência disposta na SEQ ID NO: 3, ou : variante ou fragmento desta. Em uma modalidade do sexto aspecto, o polinucleotídeo isolado consiste de uma sequência disposta na SEQ ID NO: 3, ou variante ou fragmento desta.
Sob um sétimo aspecto, a invenção prevê um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência disposta em qualquer uma das SEQ ID NOS: 5-197, 224-227, 230-242 e 247, ou variante ou fragmento de qualquer uma dessas sequências. .
11 / 155 Em uma modalidade do sexto aspecto, oO polinucleotídeo isolado consiste da sequência a partir de qualquer uma daquelas dispostas na SEQ ID NOS: 5-197, 224-227, 230-242 e 247, ou variante ou fragmento de qualquer uma dessas sequências. Sob um oitavo aspecto, a invenção prevê um polipeptídeo isolado codificado por qualquer um dos polinucleotídeos de acordo com o quinto, sexto ou sétimo aspectos. Sob um nono aspecto, a invenção prevê um primer ou sonda que se liga especificamente ao polinucleotídeo de acordo com o quinto, sexto ou sétimo aspectos.
Sob um décimo aspecto, a invenção prevê um anticorpo que se liga ao polipeptídeo de acordo com o oitavo aspecto. Sob um décimo primeiro aspecto, a invenção prevê um par de O primers para detectar dinoflagelados produtores de saxitoxina em uma amostra, onde o par de primers propriamente dito compreende um primeiro primer compreendendo uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 198, ou um fragmento ou variante desta, e um segundo primer compreendendo a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 199, ou um fragmento ou variante desta. Em uma modalidade do décimo primeiro aspecto, o par de primers compreende um primeiro primer consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 198, ou um fragmento
12 / 155 ou variante desta, e um segundo primer consistindo da sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 199, ou um fragmento ou variante desta,
Em um décimo segundo aspecto, a invenção prevê um par de primers para detectar dinoflagelados produtores de saxitoxina em uma amostra, onde o par de primers propriamente dito compreende:
um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 198 e um segundo primer compreendendo ou consistindo de de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 199; ou um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 200 e um segundo primer compreendendo ou consistindo de de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 201; ou um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 202 e um segundo primer compreendendo ou consistindo de de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 203; ou um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 204 e um segundo primer compreendendo ou consistindo de de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 205; ou um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 206 e um segundo primer "compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 207; ou
13 / 155 um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 208 e um segundo primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 209; ou um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 210 e um segundo primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO:211; ou um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 220 e um segundo primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO:221; ou um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 222 E um segundo primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 223; ou um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 228 e um segundo primer compreendendo ou consistindo de uma sequência !O polinucleotídica da SEQ ID NO: 229; ou um primeiro primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polínucleotídica da SEQ ID NO: 243 e um segundo primer compreendendo ou consistindo de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 244.
Breve descrição das figuras Modalidades preferenciais da presente invenção serão agora descritas, por meio de um exemplo único, com referência aos desenhos em anexo onde: :
14 / 155
A Figura 1 é um diagrama mostrando a estrutura de sxtA em dinoflagelados e cianobactérias.
A.
Estrutura transcrita de sStxA em A. fundyense CCMP1719. B.
Estrutura genômica de stxA de C. raciborskii T3. C.
Estrutura de STX com ligações e moléculas introduzidas por sxtA marcadas em negrito;
A Figura 2 é um gráfico mostrando o conteúdo de GC de transcritos stxA de A. fundyense e genes de cianobactérias.
O conteúdo de GC foi calculado cada 10 bp com um tamanho de janela de 1000 bp;
A Figura 3 mostra uma árvore filogenética de SxtAl.
A representação esquemática da árvore filogenética, desenhada em escala (para árvore completa veja figura 5). Máxima topologia de verossimilhança é apresentada.
Os números nos nós representam valores de máxima verossimilhança Dbootstrap e análise Bayesiana, respectivamente;
A Figura 4A mostra uma árvore filogenética de SxtA4. A
.. 20 representação esquemática da árvore filogenealógica é desenhada em escala (para árvore completa veja figura 6), onde a máxima topologia de verossimilhança é apresentada.
Os números nos nós representam valores de máxima verossimilhança bootstrap e análise Bayesiana, respectivamente;
A Figura 4B é um gráfico mostrando o número de cópia genômica de stxA4 em A. catenella ACSHO2 em diferentes pontos de tempo durante o ciclo de crescimento;
15 / 155
A Figura 5 mostra uma árvore filogenética de SxtAl onde a máxima topologia da real semelhança é apresentada.
Os números nos nós representam valores de bootstrap máximo real semelhança e análise Bayesiana, respectivamente.
As Sequências em negrito são sequências transcrito-derivadas; sendo Ou geradas usando RACE ou são contigs do conjunto 454 de leitura;
A Figura 6 mostra uma árvore filogenética de SxtA4 onde a máxima topologia de real semlehança é apresentada.
Os números nos nós representam valores de máxima verossimilhança bootstrap máximo real semelhança e análise Bayesiana, respectivamente.
As Sequências em negrito são sequências transcrito-derivadas; sendo ou geradas usando RACE ou são contigs do conjunto 454 de leitura;
A Figura 7 é um mapa mostrando as áreas de amostragem de Phytoplankton e S. glomerata relacionadas ao Exemplo 2. New South Wales, Austrália e três estuários nos quais os afloramentos foram coletados para amostragem: B.
Brisbane Water, C. the Georges River and D.
Wagonga Inlet.
Barra de
“O escala em D representaml Km nos mapas B, C e D;
A figura 8 é uma gráfico mostrando uma curva padrão do par de primer de stxA4 baseado na diluições de DNA a partir de números conhecidos de células de três cepas de Alexandrium catenella em crescimento exponencial.
O ensaio foi testada usando concentrações de DNA representando 30-2600 células em diferentes cepas;
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A figura 9 proporciona dois gráficos mostrando a abundância de cópias de genes de sxtA4 (eixo y primário) e estima células de Alexandrium catenella (eixo y secundário) baseado em contagem de identificações de célula em microscópio and gPCR e
LSU rDNA par de primer de A.
O George River e B.
Local de amostragem de Wagonga Inlet, durante novembro de 2010;
A figura 10 proporciona um gráfico mostrando o número ou cópias de sxtA4 L* e células de Alexandrium catenella, como “no determinada usando uma contagem manual sob micrsocópio de luz, cada semana no local do coleta de amostras;
A figura 11 proporciona um gráfico mostrando uma equação de regressão entre a abundância de células de Alexandrium catenella e cópias de sxtA4;
A figura 12 mostra imagens de MEV de Alexandrium tamarense ATNWBOl.
A) vista ventral, com membrana da célula intacta, mostrando o tamanho geral da célula e formato, barra de
070 escala = 5 pm, B) vista dorsal, com membrana da célula intacta, mostrando o formato da célula, barra de escala = 10 um, C) Epicone em vista apical, mostrando APC e poro sob prato de 1”, barra de escala = 5 pum, D) Hypocone em vista antapical, mostrando do prato, barra de escala = 10 um,
E) Complexo de poro apical, mostrando formato de vírgula, F) Prato sulcal posterior, mostrando poro, barra de escala = 2 um;
17 / 155 A figura 13 mostra imagens de MEV de cepas de Alexandrium tamarense ATCJ33, ATEBOl, e ATBBOl (para comparação, tirado de Hallegraeff et al 1991). A-D, ATCJ33, A) ATCJ33 mostrando uma cadeia de 2 células e um tamanho geral da célula e formato, barra de escala = 10 um, B) Primeiro prato apical, mostrando poro ventral, C) APC, mostrando formato de vírgula, D) Primeiro prato apical mostrando poro ventral, E, F, H ATEBO1., E) ATEBOl mostrando tamanho geral e formato das células, barra de escala = 10 um, F) ATEBOl, primeiro prato O apical mostrando poro ventral, G) ATBBOl mostrando o poro ventral e o APC, H) ATEBOl mostrando o APC; A figura 14 mostra a filogenia concatenada do 18S+ITS1-
5.8S-ITS2+28S rDNA do complexo da A, tamarense (2821 caracteres). A árvore é reconstruída com inferência bayesiana (Phylobayes). Os números dos nós internos representam valores de probabilidade posterior e de bootstrap (>50%) para Phylobayes e RAxML (ordenado; Phylobayes/RaxML). Círculos pretos indicam um valor de probabilidade posterior de 1.00 e . "O de bootstrap >90%. tamarense (2821 caracteres). A árvore é reconstruída com inferência bayesiana (Phylobayes). Os números dos nós internos representam valores de probabilidade : posterior e de bootstrap (>50%) para Phylobayes e RAXML (ordenado; Phylobayes/RaxML). Círculos pretos indicam um valor de probabilidade posterior de 1.00 e de bootstrap >90%, A figura 15 é um perfil de toxina de ATNWBOl usando CLAE (HPLC), picos como indicado foram determinados contra padrão de PSP toxina;
18 / 155 A figura 16 mostra a filogenia concatenada 18S+ITS1-5.8S- ITS2+28S 28S rDNA do complexo da A.
Definição Como usada neste pedido, a forma singular “um/uma” e “o/a” incluem referências no plural a menos que o contexto claramente dite de outra forma. Por exemplo, o termo “um dinoflagelado” também indica uma pluralidade de dinoflagelados.
Como usado aqui, o termo “compreendendo” significa “incluindo”. Variações da palavra “compreendendo”, tais como “compreendem” e “compreende”, têm significados correspondentemente variados, Portanto, por exemplo, um polinucleotídeo “compreendendo” uma sequência codificando uma proteína pode consistir exclusivamente daquela sequência Ou pode incluir uma ou mais sequências adicionais.
Como usado aqui, o termo “saxitoxina” engloba saxitoxina pura ou análogos desta; exemplos não limitantes destes incluem neosaxitoxina (neoSTX), gonvyautoxinas (ETX), decarbamoylsaxitoxina (desTX), análogos não sulfatados, análogos monossulfatados, análogos dissulfatados, análogos decarbamoilados e análogos hidrofóbicos.
Qualquer descrição dos documentos do estado da arte (prior art) referenciados aqui, ou afirmação feita aqui derivada ou baseada nesses documentos, não é uma admissão que os
19 / 155 documentos ou as afirmações derivadas sejam parte do conhecimento geral comum do relevante estado da arte.
Para fins de descrição, todos os documentos e as sequências do Genbank referenciadas aqui são incorporadas como referência na sua integralidade. Descrição Detalhada Os inventores atuais têm determinado que dinoflagelados são O produtores de saxitoxina (STX) e identificaram genes responsáveis pela produção de STX nesses microorganismos. Baseando-se nesta descoberta, os inventores têm desenvolvido um ensaio capaz de discernir entre espécies de dinoflagelados produtores de STX e espécies de dinoflagelados que não produzem STX.
Certos aspectos da invenção referem-se à provisão de sequências de polinucleotídeo e polipeptídeos de STX presentes em dinoflagelados.
o Também providos são os métodos para a detecção de dinoflagelados produtores de STX em uma dada amostra baseada na detecção da presença (ou ausência) de uma ou mais sequências da invenção na amostra.
Também providos são os kits de detecção de dinoflagelados produtores de saxitoxina em uma dada amostra compreendendo agente(s) para a detecção da presença (ou ausência) de uma ou mais sequências da invenção na amostra,
20 / 155 Polinucleotídeos e polipeptídeos Aqui são descritas sequências polinucleotídicas e polipeptídeos de saxitoxina de dinoflagelados (“polinucleotídeos da invenção” e “polipeptídeos da invenção”, respectivamente). Os polinucleotídeos da invenção podem ser ácidos desoxirribonucleicos (DNA), ácidos ribonucleicos (RNA) -O ou ácidos desoxirribonucleicos complementares (cCDNA).
Em certas modalidades, as sequências são sequências polinucleotídicas de gene A de saxitoxina (STXA) ou sequências de polipeptídeo A de saxitoxina.
As sequências polinucleotídicas podem compreender qualquer um ou mais domínio(s) catalítico(s) do gene sxtA (i.e. o(s) domínio(s) catalítico(s) sxtAl, sxtA2, sxtA3, ou sxtA4) ou fragmento(s) deste(s). Apenas para fins de exemplificar, não -—O limitando a invenção, a sequência sSsxtAl pode ser definida pelos nucleotídeos 160-1821 da sequência polinucleotídica contida no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 1) ou nucleotídeos 277-2022 da sequência polinucleotídica contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 3). A sequência sxtA2 pode ser definida por nucleotídeos 1837- 2415 da sequência polinucleotídica contida no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 1) ou nucleotídeos 2038- 2604 da sequência polinucleotídica contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 3). A sequência sSxtA3
21 / 155 pode ser definida por nucleotídeos 2479-2694 da sequência polinucleotídica contida no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 1) ou nucleotídeos 2722-2949 da sequência polinucleotídica contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 3). A sequência sxtA4 pode ser definida por nucleotídeos 3115-4121 da sequência polinucleotídica contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 3) ou nucleotídeos 3597-3721 da sequência polinucleotídica contida no GenBank com número de acesso -O JF343239 (SEQ ID NO: 3).
Outros exemplos não limitantes de sequências polinucleotídicas de gene sxtA da invenção incluem aqueles providos no Genbank com número de acesso JF343238 e JF343239 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3).
A sequência polipeptídica de STXA pode compreender qualquer um ou mais domínio(s) catalítico(s) da proteína STX (i.e. o(s) domínio(s) catalítico(s) STXAIl, STXA2, STXA3, ou STXM) ou .o fragmento(s) deste(s). Por meio somente de exemplo não limitante, a sequência STXAl pode ser definida por resíduos de aminoácidos 1-554 da sequência polipeptídica contida no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 2) ou resíduos de aminoácidos 1-582 da sequência polipeptídica contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 4). A sequência STXA2 pode ser definida por resíduos de aminoácidos 560-752 da sequência polipeptídica contida no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 2) ou resíduos de aminoácidos 588-776 da sequência
22 /155 polipeptídica contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 4). A sequência STXA3 pode ser definida por resíduos de aminoácidos 774-845 da sequência polipeptídica contida no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 2) ou resíduos de aminoácidos 816-891 da sequência polipeptídica contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 4). A sequência STXA4 pode ser definida por * resíduos de aminoácidos 947-1281 da sequência polipeptídica contida no GenBank com número de acesso JF343239 o (SEQ ID NO: 4).
Outros exemplos não limitantes de sequências polipeptídicas STX da invenção incluem aqueles providos no Genbank com números de acesso JF343238 e JF343239 (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4).
Preferencialmente, as sequências polinucleotídicas e os polipeptídeos são as dos dinoflagelados produtores de saxitoxina. Por exemplo, as sequências polinucleotídicas e -O polipeptídica podem ser de dinoflagelados da ordem Gonyaulacales ou Gymnodiniales. Preferencialmente, os dinoflagelados são dos gêneros Alexandrium (anteriomente Gonyaulax), Pyrodinium ou Gymnodinium.
Exemplos não limitantes de espécies Alexandrium preferíveis incluem A. catenella (e.g. cepas ACCCO01, ACSHO2, ACTRAO2 e CCMPl493), A. fundyense (e.g. cepas CCMP1719 e CCMP1979), A lusitanicumy A. minutum (e.g. cepas CCMPI1888, CCMP113, ALSPO1, ALSPO2 e AMDI6/AMADI6), A. ostenfeldii, e A.
23 / 155 tamarense (e.g. cepas CCMP1771, ATBBOl, ATEBOl, ATCJ33 e ATNWBO1). Exemplos não limitantes de espécies Gymnodinium preferíveis incluem G. catenatum (e.g. cepas GCTRAOl e CS- 395). Exemplos não limitantes de espécies Pyrodinium preferíveis incluem P. bahamensê var compressum.
Fragmentos de ambos os polinucleotídeos da invenção e os polipetídeos da invenção são também providos aqui.
Um “fragmento” de polinucleotídeo como contemplado aqui é uma molécula de polinucleotídeo que é um constituinte de um polinucleotídeo da invenção ou variante deste. Fragmentos de um polinucleotídeo não necessariamente precisam codificar polipeptídeos que retêm atividade biológica, e apesar disso não são excludentes, se esse for o caso. Em certas modalidades o fragmento pode ser útil como uma sonda hibridizada ou PCR primer. O fragmento pode ser derivado da clivagem de um polinucleotídeo da invenção ou alternativamente pode ser sintetizado por outros meios, por exemplo, por síntese química. Um fragmento de polinucleotídeo como contemplado aqui pode ser menor que cerca de 5000 nucleotídeos em comprimento, menor que cerca de 4500 nucleotídeos em comprimento ou menor que cerca de 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25 ou 15 nucleotídeos em comprimento. Adicionalmente ou alternativamente, Um fragmento de polinucleotídeo como contemplado aqui pode ser maior que cerca de 15 nucleotídeos em comprimento, mais de cerca de 25 nucleotídeos em comprimento, ou mais de cerca de 50, 75, 100, 150, 200, 250,
24 / 155 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 ou 4000 nucleotídeos em comprimento. Adicionalmente ou alternativamente, um fragmento de polinucleotídeo como contemplado aqui pode ser entre cerca de 25 e cerca de 50 nucleotídeos em comprimento, entre cerca de 25 e cerca de 75 nucleotídeos em comprimento ou entre cerca de 25 e cerca de 100, 100 e 250, 100 e 500, 250 e 500, 100 e 1000, 500 e 2000, 1000 e 2000 nucleotídeos em comprimento.
Fragmentos de polinucleotídeo da invenção compreendem fragmentos de gene SsxtA. Por exemplo, fragmentos de polinucleotídeo da invenção podem compreender qualquer um ou mais do(s) domínio(s) catalítico(s) sxtaAl, SxtA2, sxtA3, ou SxtA4 ou fragmento(s) deste(s). Fragmentos de polinucleotídeo da invenção compreendem fragmentos da proteína STX. Por exemplo, fragmentos de polinucleotídeo da invenção podem compreender qualquer um ou mais do(s) domínio(s) catalítico(s) STXAl, STXA2, STXA3, ou STXA4 ou fragmento(s) deste(s).
-20 Exemplos específicos e não limitantes do fragmento da sequência polinucleotídica do gene sxtA incluem aqueles providos no GenBank com número de acesso JF343240 - JF343432 (SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 197), e aqueles contidos na SEQ ID NOs: 224-227, 230-242 e 247.
Exemplos adicionais específicos e não limitantes de fragmento da sequência polinucleotídica do gene sxtA da invenção incluem aqueles definidos por nucleotídeos 3115-4121 e nucleotídeos 3597-3721 da sequência polinucleotídica contida
25 / 155 no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 3) e fragmentos e variantes desses.
Exemplos específicos e não limitantes de sequência de domínio catalítico de sxtal incluem aqueles dados na SEQ ID NOs: 224-227 e 247.
Exemplos específicos e não limitantes de sequência de domínio catalítico de sxtAa4 incluem aqueles dados na 40 SEQ ITD NOs: 230-242, Um “fragmento” de polipeptídeo como contemplado aqui é uma molécula de polipeptídeo que é um constituinte de um polipeptídeo da invenção ou variante desta. Tipicamente o fragmento possui atividade biológica qualitativa com oO polipeptídeo do qual esse é um constituinte apesar disso não ser necessariamente necessário. Um fragmento de polipeptídeo como contemplado aqui pode ser menor que cerca de 1500 resíduos de aminoácidos em comprimento, menor que cerca de 1400 resíduos de aminoácidos em comprimento ou menor que cerca de 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25 ou 15 resíduos de aminoácidos em comprimento. Adicionalmente ou alternativamente, Um fragmento de polipeptídeo como contemplado aqui pode ser mais que cerca de 15 resíduos de aminoácidos em comprimento, mais de cerca de 25 resíduos de aminoácidos em comprimento, ou mais de cerca de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 200, 1000, 1100, 1200, ou 1300 resíduos de aminoácidos em comprimento. Adicionalmente ou
26 / 155 alternativamente, Um fragmento de polipeptídeo como contemplado aqui pode ter entre cerca de 15 e cerca de 25 resíduos de amincácidos em comprimento, entre cerca de 15 «é cerca de 50 resíduos de aminoácidos em comprimento ou entre cerca de 15 e 75, 15 e 100, 15 e 150, 25 e 50, 25 e 100, 50 e 100, 50 e 150, 100 e 200, 100 e 250, 100 e 300, 100 e 500, 500 e 750, 500 e 1000 ou 1000 e 1300 resíduos de aminoácidos em comprimento.
0 Exemplos específicos e não limitantes de fragmentos da sequência de polipeptídeo de STXA incluem aqueles definidos por resíduos de aminoácidos X-Y da sequência de polipeptídeo contidas no GenBank com número de acesso JF343248 (SEQ ID NO: 3), aqueles definidos por resíduos de aminoácidos 947-1281 da sequência de polipeptídeo contidas no GenBank com número de acesso JF343249 (SEQ ID NO: 4), fragmentos ou variantes desses.
Variantes de polinucleotídeos da invenção e polipeptídeos da invenção e fragmentos desses são também providos aqui.
A “variante” como contemplado aqui refere-se a uma sequência substancialmente similar. Em geral, duas sequências são “substancialmente similares” se as duas sequências têm uma porcentagem específica de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos (percentagem de “identidade de sequência”), em uma região específica, ou quando não especificado, na sequência inteira. Por conseguinte, uma “variante” de uma sequência de um polipeptídeo ou
27 / 155 polinucleotídeo revelada aqui pode compartilhar pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 83% 853, 88%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de referência.
Em geral, variantes de uma sequência de polipeptídeo possuem atividade biológica qualitativa em comum. Variantes de uma sequência de polipeptídeo geralmente codificam polipeptídeos os quais geralmente possuem atividade biológica qualitativa em comum. Também, incluídas dentro do significado do termo “variante” são homólogos dos polinucleotídeos da invenção e polipeptídeos da invenção. Um homólogo de polinucleotídeo é tipicamente de uma espécie de dinoflagelados diferente, mas compartilhando substancialmente a mesma função biológica ou atividade como o polinucleotídeo correspondente revelados aqui. Um homólogo de polipeptídeo é tipicamente de uma espécie de dinoflagelados diferente, más compartilhando substancialmente a mesma função biológica ou atividade como o polipeptídeo correspondente revelados aqui. O termo “variante” também inclui análogos dos polipeptídeos da invenção. Um “análogo” de polipeptídeo é um polipeptídeo que é derivado de um polipeptídeo da invenção no qual a derivada compreende adição, supressão, substituição de um ou mais aminoácidos, de tal forma que o poliípeptídeo retenha substancialmente a mesma função. O termo “substituição conservativa de aminoácidos” refere-se a uma substituição ou realocação de um ou mais aminoácidos por outro aminoácido com propriedades similares dentro de uma cadeia polipeptídica (sequência primária de uma proteína). Por exemplo, à substituição do aminoácido carregado
28 / 155 ácido glutâmico (Glu) pelo aminoácido carregado similar ácido aspártico (Asp) seria uma substituição conservatida de um aminoácido.
Tipicamente, polinucleotídeos da inveção e polpeptídeos da invenção estão “isolados”. Entenda-se que o termo “isolado” nesse contexto significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo foi removido ou não está associado com alguns ou todos os outros componentes com os quais ele seria encontrado no seu estado natural. Por exemplo, um polinucleotídeo “isolado” pode ser removido à partir de outros polinucleotídeos de uma sequência maior de polinuceleotídeos, ou pode ser removido a partir de componentes naturais tais como polinucleotídeos desconexos. Igualmente, um polipeptídeo “isolado” pode ser removido a partir de outros polipeptídeos de uma sequência maior de polipeptídeos, ou pode ser removido a partir de componentes naturais tais como polipeptídeos desconexos. Por questões de clareza, um polinucleotídeo “isolado” de polipeptídeo também inclui um polinucleotídeo ou polipeptídeo o qual não foi tirado da natureza, mas ao invés foi preparado de novo, tal como sintetizado quimicamente e/ou preparado por métodos recombinantes. Como descrito aqui um polipeptídeo isolado da invenção pode ser incluído como uma parte constituinte de um polipeptídeo maior ou proteína de fusão (proteína híbrida). Em certas modalidades, os polinucleotídeos da invenção podem ser clonados em um vetor. O vetor pode compreender, por exemplo, uma sequência de DNA, RNA, ou sequência de DNA
29 / 155 complementar (CDNA). O vetor pode ser um vetor plasmídeo, vetor viral, ou qualquer outro veículo apropriado adaptado para a inserção de sequências estrangeiras (externas), sua introdução dentro das células e a expressão das sequências introduzidas.
Tipicamente o vetor é um vetor de expressão e pode incluir controle de expressão e sequências de processamento tais como um promotor, inibidor, locais de ligação de ribossomo (ribosome biding site-RBS), sinais de poliadenilação e sequência de transcrição terminais.
A invenção também contempla células hospedeiras transformadas por tais vetores.
Por exemplo, os polinucleotídeos da invenção podem ser clonados dentro de um vetor que é transformado dentro de uma célula bacteriana hospedeira, por exemplo, E.
Coli. os métodos para construção de vetores e sua transformação dentro de células hospedeiras são geralmente conhecidos e descritos em textos de referência tais como, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York; e Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc.. Sondas, primers e anticorpos.
Os polinucleotídeos da invenção incluem derivados ou fragmentos desses para uso como primer ou sonda.
Os derivados ou fragmentos podem estar na forma de oligonucleotídeos.
Oligonucleotídeos são pequenos alongamentos (extensões) de resíduos de nucleotídeos apropriados ao uso em
30 / 155 reações de amplificação do ácido nucleico tais como PCR, tipicamente sendo pelo menos cerca de 5 nucleotídeos até cerca de 80 nucleotídeos em comprimento, mais tipicamente cerca de 10 nucleotídeos em comprimento até 50 nucleotídeos em comprimento e ainda mais tipicamente cerca de 15 nucleotídeos em comprimento até 30 nucleotídeos em comprimento. Em uma modalidade, à sonda compreende e consiste de uma sequência contida na SEQ ID NO: 245 ou SEQ ID NO: 246.
Sondas são sequências de nucleotídeos de comprimento variável, por exemplo, entre cerca de 10 nucleotídeos e vários milhares de nucleotídeos, para uso em detecção de sequências homólogas, tipicamente por hibridização. Sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA de genômico, fragmentos de CDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos, Métodos para o desenvolvimento e/ou produção de sondas de nucleotídeos e/ou primer são conhecidos e descritos em textos de referência tais como as Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York; and publications such as Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Innis et al. (Eds) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York; Innis and Gelfand, (Eds) (1995) PCR Strategies, Academic Press, New York; and Innis and Gelfand, (Eds) (1999) PCR Methods Manual, Academic Press, New York.
31 / 155 Primers e sondas de polinucleotídeos podem ser preparados, por exemplo, por técnicas de síntese química tais como os métodos de fosfodiéster e fosfotriéster (veja, por exemplo, Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109; e Patente Norte-Americana No. 4356270) e o método de dietilfosforamidite (veja Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862).
Polinucleotídeos da invenção, incluindo às sondas e primer supracitados podem ser rotulados por modalidade de um marcador para facilitar sua detecção. Técnicas de rotulação e detecção de ácidos nucleicos são descritos, por exemplo, em textos de referência tais como Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc.. Exemplos não limitantes de marcadores apropriados incluem moléculas fluorescentes (e.g. acetilaminafluoreno, S-bromodeoxuridina, digoxigenina e fluoresceína) e isótopos radioativos (e.g. 32P, 358, 3H, 33P). Detecção do marcador pode ser atingida, por exemplo, por técnicas químicas, fotoquímicas, imunoquímicas, bioquímicas ou espectroscópicas.
As sondas e os primer podem ser usados, por exemplo, para detectar ou isolar dinoflagelados em uma amostra de interesse.
Em certas modalidades, as sondas e primers podem ser usados para determinar dinoflagelados produtores de STX em uma amostra de interesse. Adicionalmente ou alternativamente, as sondas ou primers podem ser usadas para isolar sequências correspondentes em outros organismos incluindo, por exemplo,
32 / 155 outros espécies de dinoflagelados.
Métodos tais como reação em cadeia de polimerase (PCR), hibridização e semelhantes podem ser utilizados para identificar tais sequências com base na sua homologia de sequência com as sequências aqui contidas.
As sequências que são selecionadas com base em sua identidade de sequência para as sequências inteiras aqui contidas Ou fragmentos dos mesmos são abrangidos pelas modalidades.
Tais sequências incluem sequências que são ortólogos das sequências descritas.
O termo "ortólogos" refere-se a genes derivados a partir de um gene ancestral comum e que são encontradas em diferentes espécies, como resultado de especiação.
Os genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando as suas sequências de nucleotídeos e/ou as suas sequências de proteínas codificadas compartilham identidade substancial, tal como definido aqui em outra seção.
As funções de ortólogos são muitas vezes altamente conservadas entre as espécies.
Nas técnicas de hibridização, a totalidade ou parte de uma .20 sequência de nucleotídeos conhecida é usado para gerar uma sonda que hibridiza seletivamente à outras sequências de ácidos nucleicos correspondentes presentes numa dada amostra.
As sondas de hibridação podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de CDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotideos e podem ser rotulados com um marcador detectável.
Desta forma, por exemplo, as sondas para a hibridização podem ser feitas por marcação de oligonucleotideos sintéticos com base nas sequências da invenção.
O grau de homologia (identidade de sequência) entre
33 / 155 a sonda e a sequência alvo vai ser largamente determinado pela severidade das condições de hibridização. Em particular, a sequência nucleotídica utilizada como uma sonda pode hibridizar para um homólogo ou outra variante de um polinucleotídeo aqui revelado sob condições de baixo rigor, rigor médio ou elevado rigor. Existem numerosas condições e fatores, bem conhecidos pelos peritos na arte, que podem ser utilizadas para alterar o rigor da hibridação, tais como, por exemplo, o comprimento e a natureza (DNA, RNA, composição da base) do ácido nucleico a ser hibridizado com um ácido nucleico específico; a concentração de sais e de outros componentes, tais como a presença ou à ausência de formamida, sulfato de dextrana, polietileno glicol, etc; e alteração da temperatura da hibridização e/ou das etapas de lavagem.
Sob uma abordagem de PCR, os primer de oligonucleotídeos podem ser concebidos para utilização em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes a partir de DNAC ou DNA genômico extraído a partir de qualquer organismo de interesse. Os métodos para conceber primer de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na arte. Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não estão limitados a, os métodos que utilizam pares de primers, primers aninhados, primers-nestes), primer únicos específicos, primers degenerados, primers específicos de gene, primers específicos de vetor, primers parcialmente incompatíveis, e assim por diante. O leitor especializado irá reconhecer que os primers aqui descritos para uso em PCR ou RT- PCR podem também ser
34 / 155 utilizados como sondas para a detecção de sequências de genes sxt de dinoflagelados.
Também são contemplados pela invenção os anticorpos que são capazes de se ligar especificamente a polipeptídeos da invenção.
Os anticorpos podem ser utilizados para detectar qualitativa ou quantitativamente e analisar um ou mais polipeptídeos de STX numa determinada amostra.
Por "ligar especificamente" deve-se entender que o anticorpo é capaz de se ligar ao polipeptídeo alvo ou seu fragmento, com uma afinidade maior do que se liga à uma proteína desconexa (não relacionada). Por exemplo, o anticorpo pode ligar-se ao polipeptídeo ou seu fragmento com uma constante de ligação na faixa de pelo menos cerca de 10 M até cerca de 10º*M.
De preferência, a constante de ligação é pelo menos cerca de 10 ºM, ou pelo menos cerca de 10 *M.
Mais preferencialmente, a constante de ligação é pelo menos cerca de 10"M, pelo menos cerca de 10 M, ou pelo menos cerca de 10ºM ou mais.
No contexto da presente invenção, a referência à um anticorpo específico para um polipeptídeo de STX da invenção inclui um anticorpo que é específico para um fragmento do polipeptídeo.
Os anticorpos da invenção podem existir em uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, como um anticorpo completo, ou como um fragmento de anticorpo, ou outro fragmento imunologicamente ativo deste, tal como regiões determinantes de complementaridade.
Da mesma forma, o anticorpo pode existir como um fragmento de anticorpo tendo domínios de ligação ao antígeno funcional, ou seja, domínios variáveis de cadeia leve
35 / 155 e pesada. Além disso, o fragmento de anticorpo pode existir sob uma forma selecionada a partir do grupo consistindo de, mas não limitados a: Ev, Far F(ab),, scFv (Fv de cadeia única), daãb (anticorpo de domínio único), anticorpos quiméricos, anticorpos bi-específicos, diacorpos e triacorpos. Um "fragmento" de anticorpo pode ser produzido por modificação de um anticorpo completo ou por síntese do fragmento de anticorpo desejado. Métodos de geração de -O anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpo, são conhecidos na arte e incluem, por exemplo, a síntese por tecnologia de DNA recombinante. O leitor especializado estará ciente de métodos de síntese de anticorpos, tal como os descritos em, por exemplo, na patente norte-americana No. 5296348 e textos padrões, tais como Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc.. De preferência, os anticorpos são preparados a partir de regiões discretas ou fragmentos do polipeptídeo de interesse £O de STX. Uma porção antigênica de um polipeptídeo de interesse pode ser de qualquer comprimento adequado, tais como de cerca de 5 a cerca de 15 aminoácidos. De preferência, uma porção antigênica contém, pelo menos, cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 resíduos de aminoácidos.
os anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo da invenção podem ser preparados, por exemplo, usando polipeptídeos de STX da invenção purificados ou sequências polinucleotídicas sxt purificados do invento que
36 / 155 codificam polipeptídeos de STX do invento, utilizando quaisquer métodos adequados conhecidos na arte.
Por exemplo, um anticorpo monoclonal, tipicamente contendo as porções Fab, pode ser preparado utilizando a tecnologia de Hibrídoma descrita em Harlow and Lane (Eds) Antibodies - A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y; Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (1986) 2nd ed; and Kohler & Milstein, (1975) Nature 256: 495-497, Tais técnicas incluem, O mas não estão limitadas a, preparação de anticorpos por seleção de anticorpos à partir de bibliotecas de anticorpos recombinantes em vetores fágicos ou semelhantes, bem como a preparação de anticorpos monoclonais e policlonais por imunização de coelhos ou ratos (ver, por exemplo, Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281 , Ward et ai (al ( 1989) Nature
341; 544-546), Irá também ser entendido que os anticorpos da invenção incluem anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos totalmente humanos.
Um anticorpo do invento pode ser um anticorpo bi-específico, tendo especificidade de ligação à mais do que um antígeno ou epítopo.
Por exemplo, o anticorpo pode ter especificidade para um ou mais polipeptideos de STX ou seus fragmentos, e, adicionalmente, ter especificidade de ligação para um outro antígeno.
Os métodos para a preparação de anticorpos humanizados, anticorpos — quiméricos, anticorpos “totalmente humanos e anticorpos bi-específicos são conhecidos na arte e incluem,
37 / 155 por exemplo, aqueles descritos na Patente Norte-Americana No. 6.995.243. Geralmente, uma amostra potencialmente compreendendo um polipeptídeo de STX da invenção pode ser posta em contato com um anticorpo que liga especificamente o polipeptídeo de STX ou fragmento do mesmo. Opcionalmente, o anticorpo pode ser fixado a um suporte sólido para facilitar a lavagem e o isolamento subsequente do complexo, antes de pôr em contato o anticorpo com uma amostra. Exemplos de suportes sólidos incluem, por 1O exemplo, placas de microtitulação, pérolas, cacos, ou micro pérolas. Os anticorpos também podem ser anexados a uma matriz de um Chip Proteico ou um substrato de sonda, tal como descrito acima.
Os marcadores detectáveis para a identificação de anticorpos ligados a polipeptídeos da invenção incluem, mas não estão limitados a, fluorocromos, corantes fluorescentes, marcadores radioativos, enzimas, tais como peróxido de raiz- forte, fosfatase alcalina e outros comumente utilizados na arte, e Os marcadores colorimétricos incluindo ouro coloidal ou vidro colorido ou pérolas. Alternativamente, o anticorpo pode ser detectado utilizando um ensaio indireto, em que, por exemplo, um segundo anticorpo marcado é usado para detectar um anticorpo ligado a um polipeptídeo específico.
Os métodos para detectar a presença de, ou medição da quantidade de, um complexo anticorpo-marcador incluem, por exemplo, a detecção de fluorescência, quimiluminescência, luminescência, absorbância, birrefringência, transmitância,
38 / 155 reflexão, ou o índice de refração, como ressonância de plasma de superfície, elipsometria, um método de espelho ressonante, um método de guia de onda acoplador, ou interferometria. Métodos de frequência de rádio incluem espectroscopia de ressonância multipolar. Métodos eletroquímicos incluem métodos de amperometria e voltametria. Métodos ópticos incluem métodos de imagem e métodos de não imagem e microscopia. Ensaios úteis para a detecção da presença de, ou medição da IO quantidade de, um complexo anticorpo - marcador incluem, por exemplo, ensaio imunossorvente ligado por enzimas (enzyme- linked immunosorbent assay; ELISA), um ensaio radio-imune (RIA) ou um ensaio de Manchas Ocidentais (Western blot). Tais métodos são descritos em, por exemplo, Stites & Terr, (Eds) (1991) Clinical Immunology, T7th ed; and Asaí, (Ed) (1993) Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume
37. Os métodos para a detecção de dinoflagelados A invenção proporciona métodos para a detecção «e/ou isolamento de polinucleotideos da invenção e/ou polipeptídeos da invenção ("métodos da invenção"). Em uma modalidade a invenção proporciona um método para detectar um dinoflagelado numa amostra. O método compreende obter uma amostra para utilização no método, e a detecção da presença do polinucleotídeo e/ou polipeptídeo, ou variante ou fragmento desse na amostra. A presença de polinucleotideo,
39 / 155 polipeptideo, ou variante ou fragmento desse em uma amostra é indicativo do dinoflagelados na amostra. A presença do polinucleotídeo, polipeptídeo, ou variante ou fragmento deste na amostra é indicativo do dinoflagelado na amostra.
Os atuais inventores têm determinado que o gene sxtA está presente em dinoflagelados produtores de saxitoxina, mas ausente em dinoflagelados que não produzem saxitoxina. Em : particular, tem sido identificado que a detecção de domínio(s) catalítico(s) de sxtAl e/ou sxtA4 do gene sxtA são indicativos de dinoflagelados produtores de saxtoxina.
Por conseguinte, em outra modalidade, a invenção proporciona um método para detectar um dinoflagelado produtor de saxitoxina numa amostra. O método compreende obter uma amostra para utilização no método, e detectar a presença de um polinucleotídeo da invenção e/ou um polipeptídeo da invenção, ou variante ou fragmento deste na amostra. A presença do ' polinucieotídeo, polipeptídeo, ou variante ou fragmento deste, em uma amostra é indicativo de de um dinoflagelado produtor de ' saxitoxina na amostra.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para detectar a ausência de dinoflagelado produtor de saxitoxina numa ' amostra. O método compreende obter uma amostra para utilização no método, e detectar a ausência de um polinucleotídeo da invenção e/ou um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento ou variante deste na amostra. A ausência do
40 / 155 polinucleotídêo, polipeptídeo, ou variante ou fragmento deste, em uma amostra é indicativo de que dinoflagelados produtores de saxitoxina não estão presentes na amostra.
No contexto dos métodos da presente invenção (incluindo os referidos nos parágrafos imediatamente acima), a sequência de polinucleotídeo pode ser uma sequência de gene de saxitoxina A (SXtA). A sequência de polinucleotídeo de SXtA pode compreender qualquer um ou mais domínio(s) catalítico(s) do O gene sxtA (isto é, os domínio(s) catalítico(s) sxtAl, sxtA2, SxtA3 ou sxtA4), ou fragmento(s) deste. Preferencialmente, sequência de polinucleotídeo de sxtA compreende um domínio sxtAl e/ou um domínio sxtA4, ou fragmento(s) deste. Mais preferencialmente, a sequência de polinucleotídeo de sxta compreende um domínio sxtA4d, ou fragmento(s) deste. A sequência polipeptídica pode ser uma sequência polipeptídica de saxitoxina A (STXA).
Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo corresponde a uma sequência contida no GenBank com qualquer um dos números de acesso JF343238-JF343239 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3), ou um fragmento ou uma variante de qualquer uma das sequências.
Em outras modalidades, a sequência de polinucleotídeo corresponde a uma sequência contida no GenBank com qualquer um dos números de acesso JF343240 - JF343432 (SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 197), ou um fragmento ou uma variante de qualquer uma das sequências.
41 / 155 Em outras modalidades, a sequência de polinucleotídeo compreende uma sequência do domínio catalítica de sxtaAl fornecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 224-227 e 247, ou um fragmento ou uma variante de qualquer uma das sequências.
Em outras modalidades, a sequência de polinucleotídeo compreende uma sequência do domínio catalítica de sxta4 fornecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 230-242, ou um O fragmento ou uma variante de qualquer uma das sequências.
Em outras modalidades, a sequência de polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos 160-1821 da sequência contida no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 1); 15 nucleotídeos 277-2022 da sequência de polinucleotídeo contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEO ID NO: 3); nucleotídeos 1837-2415 da sequência de polinucleotídeo contida no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 1); nucleotídeos 2038-2604 da sequência de polinucleotídeo contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 3); nucleotídeos 2479-2694 da sequência de polinucleotídeo contida : no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 1); nucleotídeos 2722-2949 da sequência de polinucleotídeo contida no GenBank com número de acesso 4JF343239 (SEQ ID NO: 3); nucleotídeos 3115 - 4121 da sequência de polinucleotídeo contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 3); nucleotídeos 3597-3721 da sequência de polinucleotídeo contida no GenBank com número de acesso
42 / 155 JF343239 (SEQ ID NO: 3), ou um fragmento ou uma variante de qualquer uma das sequências. No contexto dos métodos da presente invenção (incluindo os referidos nos parágrafos acima), a sequência de polipeptídeo pode ser uma sequência de proteína de saxitoxina A (STXA). A sequência de polipeptídeo pode compreender qualquer um ou mais domínio(s) catalítico(s) de proteína STXA (isto é, o(s) domínio(s) STXAl, STXA2, STXA3 ou STXA4), ou fragmento(s) O deste. Preferencialmente, a sequência de polipeptídeo de STXA compreende um domínio STXAl ou STXA4, ou fragmento(s) deste. Mais preferencialmente, a sequência de polipeptídeo compreende um domínio STXA4, ou fragmento(s) deste.
Em algumas modalidades, a sequência de polipeptídeo corresponde a uma sequência contida no GenBank com número de acesso JF343238 ou JF343239 (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4), ou um fragmento ou uma variante de qualquer uma das sequências.
Em outras modalidades, a sequência de polipeptídeo pode compreender resíduos de aminoácidos 1-554 da sequência de : polipeptídeo contida no GenBank com número de acesso JF343238 : (SEQ ID NO: 2); resíduos de aminoácidos 1-582 da sequência de polipeptídeo contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 4), os resíduos de aminoácidos 560-752 da sequência de polipeptídeo contida no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 2), resíduos de aminoácidos 588- 776 da sequência de polipeptídeo contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 4), resíduos de aminoácidos
43 / 155 774-845 da sequência de polipeptídeo contida no GenBank com número de acesso JF343238 (SEQ ID NO: 2), resíduos de “aminoácidos 816-891 da sequência de polipeptídeo contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 4), os resíduos de aminoácidos 947-1281 da sequência de polipeptídeo contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 4), ou um fragmento ou uma variante de qualquer uma das sequências .
o Os dinoflagelados detectados em uma amostra ou que foram detectados ausentes em uma amostra utilizando os métodos da invenção podem ser dinoflagelados produtores de saxitoxina. sem impor qualquer limitação particular, os dinoflagelados, podem ser da ordem Gonyaulacales ou Gymnodiniales. Os dinoflagelados podem ser do gênero Alexandrium (anteriormente Gonyaulax), Pyrodinium ou Gymnodinium. Exemplos adequados de espécies Alexandrium incluem A. catenella (por exemplo, cepas ACCCO1l ACSHO2, ACTRAO2 e CCMP1493), A. fundyense (por exemplo, cepas CCMP1I719 e CCMP1979), A lusitaníicum, A. minutum (por exemplo, cepas CCMP1888, CCMP113, ALSPO1, ALSPO2 e AMDI6/AMADI6), A. ostenfeldii e A, tamarense (por exemplo, cepas CCMPl1771 ATBBOl, ATEBO1, ATCJ33 e ATNWBO1). Exemplos adequados de espécies Gymnodinium incluem G. catenatum (por exemplo cepas GCTRAOl e CS- 395), Os exemplos adequados de espécies Pyrodinium incluem P. bahamense var compressunm.
Uma amostra para utilização nos métodos da invenção pode ser "obtida" por qualquer meio. Por exemplo, a amostra pode ser obtida através da remoção à partir de um estado de
44 / 155 ocorrência natural (por exemplo, uma amostra de um lago, mar ou rio), ou removendo-a a partir de um estado de "não natural" (por exemplo, uma cultura em uma montagem de laboratório, represa, reservatório, tanque, etc.).
Uma amostra para utilização nos métodos da invenção pode ser suspeita de que compreende um ou mais dinoflagelados, ou um ou mais dinoflagelados produtores de saxitoxina. A amostra pode ser uma amostra comparativa ou de controle, por exemplo, O uma amostra compreendendo uma concentração conhecida Ou densidade de dinoflagelados ou dinoflagelados produtores de saxitoxina ou uma amostra compreendendo uma ou mais espécies ou cepas conhecidas de dinoflagelados ou dinoflagelados produtores de saxitoxina. A amostra pode ser derívada de qualquer fonte. Por exemplo, uma amostra pode ser uma amostra ambiental. A amostra ambiental pode ser derivada, por exemplo, de água salgada, água fresca, um rio, um lago, um oceano, ou águas costeiras. A amostra ambiental pode ser derivada de um afloramento de dinoflagelados. Alternativamente, a amostra 2£/O pode ser derivada de uma fonte de laboratório, tal como uma cultura, ou uma fonte comercial. Alternativamente, a amostra pode ser derivada de uma fonte biológica, tal como, por exemplo, tecido ou fluido biológico. A amostra pode ser modificada a partir do seu estado original, por exemplo, por purificação, diluição ou adição de qualquer outro componente ou componentes. Em certas modalidades, uma amostra testada utilizando os métodos da invenção pode fornecer informações sobre a presença
45 / 155 ou ausência de saxitoxina em animais que povoam a fonte da amostra.
Por exemplo, a amostra pode ser testada para determinar a presença ou ausência de saxitoxina em animais marinhos, tais como, por exemplo, peixes (por exemplo, baiacu) e em particular mariscos (por exemplo, mexilhões, amêijoas,
ostras, vieiras e outros semelhantes). Os polinucleotídeos e polipeptídeos para utilização nos métodos da invenção podem ser isolados (isto é, extraído), -O quer a partir de microrganismos em cultura mista ou como espécies individuais ou gêneros isolados.
Por conseguinte, os microrganismos de uma amostra podem ser cultivados antes da extração ou a extracção pode ser feita diretamente sobre uma dada amostra.
Os métodos adequados para o isolamento (ou seja, extração) e a purificação de polinmucleotídeos e polipeptídeos para análise utilizando métodos da invenção são geralmente conhecidas na arte e são descritos, por exemplo, em textos de referência tais como Ausubel (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; Coligan et al. (Eds) Current Protocols in Protein Science (2007), John Wiley and Sons, Inc; Walker, (Ed) (1988) New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, N.J; e Scopes, R.
K. (1987) Protein Purification: Principles and Practice, 3rd.
Ed., Springer-Verlag, New York, N.Y.. Métodos adicionais estão descritos em Neilan (1995) Appl.
Environ.
Microbiol. 61:2286-2291. Técnicas adequadas de purificação de polipeptídeo adequados para utilização nos métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a, cromatografia de fase reversa, cromatografia de interação
46 / 155 hidrofóbica, centrifugação, filtração por gel, precipitação com sulfato de amônio, e de troca iônica.
Em modalidades alternativas, os métodos da invenção podem ser realizados sem isolar os ácidos nucleicos e/ou polipeptideos a partir da amostra.
A detecção da presença (ou à determinação da ausência) de polinucleotídeos da invenção e / ou polipeptídeos da invenção O numa dada amostra pode ser realizada utilizando qualquer técnica adequada.
As técnicas adequadas podem tipicamente envolver a utilização de um primer, sonda ou anticorpo específicos, por qualquer um ou mais polinucleotídeos da invenção, ou qualquer um ou mais polipeptídeos do invento.
As técnicas adequadas incluem, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) e variações relacionadas desta técnica (por exemplo, PCR quantitativo), ensaios baseados em anticorpos, tais como ELISA, Manchas Ocidentais, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, e semelhantes.
Estas e outras técnicas apropriadas são geralmente conhecidas na arte e são | descritas, por exemplo, em textos de referência, tais como Coligan et al. (Eds) Current Protocols in Protein Science (2007), John Wiley and Sons, Inc; Walker, (Ed) (1988) New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, N.J; e Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practice, 3rd.
Ed., Springer-Verlag, New York, N.Y..
47 / 155 Em modalidades preferenciais, à detecção da presença (ou a determinação da ausência) de polinucleotídeos da invenção em uma dada amostra é alcançada por amplificação de ácidos nucleicos extraídos de uma amostra de interesse por reação em cadeia da polimerase utilizando primers que hibridizam especificamente à sequência de polinucleotídeos, e por detecção de sequência amplificada.
Sob a abordagem da PCR, os primers de oligonucleotídeos podem ser concebidos para utilização em reações de PCR para amplificar os O polinucleotídeos da invenção, tal como, por exemplo, de RNA (por exemplo, mRNA), polinucleotídeos de DNA e/ou de cDNA . Os métodos adequados de PCR incluem, mas não estão limitados a, aqueles que utilizam primer emparelhados, primer encaixados, primer individuais específicos, primer degenerados, primer específicos do gene, os primers específicos de vector, primers parcialmente incompatíveis e semelhantes.
Os métodos para a concepção de primers por PCR e RTI-PCR são geralmente conhecidos na arte e são revelados, por exemplo, em textos de referência tais como Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; Maniatis et al.
Molecular Cloning (1982), 280-281; Innis et al. (Eds) | (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications . (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, (Eds) (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, (Eds) (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York); e Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York.
48 / 155
O leitor especializado irá apreciar prontamente que vários parâmetros dos procedimentos de PCR e de RT-PCR podem ser alterados sem afetar a capacidade de se obter o produto desejado.
Por exemplo, a concentração de sal pode ser variada ou o tempo e/ou a temperatura de um ou mais etapas de desnaturação, recozimento e extensão podem ser variadas.
Da mesma forma, a quantidade de moldes de DNA, cDNA ou RNA também pode ser variada, dependendo da quantidade de ácido nucleico disponível ou da quantidade ótima do molde requerida para uma O amplificação eficiente.
Os primers para utilização nos métodos e nos kits da presente invenção são tipicamente oligonucleotídeos sendo de tipicamente pelo menos cerca de 5 nucleotídeos até cerca de 80 nucleotídeos em comprimento, mais tipicamente cerca de 10 nucleotídeos de comprimento até cerca de 50 nucleotídeos em comprimento, e ainda mais tipicamente cerca de 15 nucleotídeos de comprimento até cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
O leitor especializado irá reconhecer que os primers da -O presente invenção podem ser úteis a um número de aplicações diferentes, incluindo, mas não limitado a, PCR, RT-PCR, e como sondas para a detecção de polinucleotídeos da invenção.
Tais primers podem ser preparados por qualquer método adequado, incluindo, por exemplo, síntese química direta ou a clonagem e a restrição de sequências apropriadas.
Nem todas as bases no primer precisam refletir a sequência da molécula de molde a que o primer irá hibridizar.
O primer deve conter apenas bases complementares suficientes para permitir que o primer hibridize o molde.
Um primer pode também incluir bases
49 / 155 incompatíveis em uma ou mais posições, sendo que as bases não são complementares de bases no molde, mas sim são concebidas para incorporarem as alterações no DNA durante a amplificação ou extensão da base.
Um primer pode incluir bases adicionais, por exemplo, sob a forma de uma sequência de reconhecimento da enzima de restrição na extremidade 5' para facilitar a clonagem do DNA amplificado.
Os métodos da invenção envolvem a detecção da presença (ou 0 a determinação da ausência) dos polinucleotídeos da invenção e /ou polipeptídeos da invenção numa dada amostra.
Como notado acima, as sequências podem compreender sequências de saxitoxina A incluindo qualquer um ou mais sequências do domínio. catalítico de saxitoxina Al, A2, A3 ou AM (ou fragmento(s) dessa(s)). Preferencialmente, a sequência compreende o domínio de saxitoxina Al e/ou de saxitoxina A4 (ou fragmento(s) deste). Mais preferencialmente, a sequência compreende o domínio de saxitoxina A4 (ou fragmento(s) dos mesmos). o O leitor especializado irá reconhecer que qualquer brimer(s) capaz (es) de amplificar um polinucleotídeo da invenção, qualquer sonda capaz de detectar um polinucleotídeo da invenção ou qualquer anticorpo capaz de detectar um polipeptídeo da invenção, pode ser utilizado na realização do métodos da invenção.
Em modalidades preferenciais, os primers, sondas e anticorpos se ligam especificamente a qualquer uma ou mais das sequências de saxitoxina A referenciadas no parágrafo anterior (ou seja, no parágrafo diretamente acima).
50 / 155 Por "ligar especificamente" deve ser entendido que o primer, a sonda ou o anticorpo é capaz de se ligar à sequência alvo com uma afinidade maior do que se liga a uma sequência não relacionada.
Assim, quando exposto a uma pluralidade de sequências diferentes, mas igualmente acessíveis como potenciais parceiros de ligação, o primer, sonda ou anticorpo específico para uma sequência alvo vai se ligar seletivamente à sequência alvo e outros parceiros de ligação potencial O alternativos permanecerão substancialmente não ligados pelo primer, sonda ou anticorpo.
Em geral, um primer, sonda ou anticorpo específicos para uma sequência alvo ligam-se preferencialmente com a sequência alvo, pelo menos, 10 vezes, de preferência de 50 vezes, mais preferivelmente 100 vezes, e mais preferivelmente maior do que 100 vezes mais frequentemente que a outras sequências potenciais que não são sequências alvo.
Um primer, sonda ou um anticorpo específico para uma sequência alvo podem ser capazes de se ligar a sequências não alvo em um nível fraco, mas detectável.
Isto é -O comumente conhecido como ligação de fundo e é facilmente discernível da ligação específica, por exemplo, através da utilização de um controle apropriado.
Em modalidades preferenciais, os primers, sondas ou os anticorpos se ligam especificamente a uma sequência polinucleotídica de domínio catalítico de saxitoxina Al ou A4 ou sequência polipeptídica,y ou um fragmento deste.
Mais preferencialmente, os primers, sondas ou anticorpos se ligam especificamente a uma sequência polinucleotídica de domínio
51 / 155 catalítico de saxitoxina A4 ou sequência de polipeptídeo, ou um fragmento deste.
Primers e sondas adequados podem se ligar especificamente a qualquer fragmento de uma sequência de polinucletídeos do domínio catalítico de saxitoxina Al.
Os anticorpos apropriados podem se ligar especificamente a um fragmento de uma sequência polipeptídica do domínio catalítico de saxitoxina Al codificado por essas sequências polinucleotídicas. o Primers e sondas adequados podem se ligar especificamente a qualquer fragmento de uma sequência de polinucletídeos do domínio catalítico de saxitoxina A4. A título de exemplo não limitativo apenas, os primers e sondas adequados podem ligar-se especificamente a um fragmento de uma sequência de polinucletídeos do domínio catalítico de saxitoxina Al definido pelos nucleótidos 3115-4121 da sequência polinucleotídica contida no GenBank com número de acesso JF343239 (SEQ ID NO: 3). Os anticorpos apropriados podem se -O ligar especificamente a fragmento de uma sequência polipeptídica do domínio catalítico de saxitoxina A4 codificados por essas sequências polinucleotídicas.
Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem envolver a detecção da presença (ou a determinação da ausência) de polinucleotídeos da invenção numa amostra, utilizando amplificação por PCR.
Pares de brimers oligonucleotídicos apropriados para a amplificação por PCR de sequências polinucleotídicas de saxitoxina A podem ser capazes
52 / 155 | de amplificar qualquer um ou mais domínio(s) catalítico(s) do gene sxt, ou fragmentos(s) deste. Preferencialmente, os brimers amplificam uma sequência que compreende um fragmento de uma sequência de polinucletídeos do domínio catalítico de saxitoxina A4, ou fragmento deste. A título de exemplo não limitante apenas, um par de primer adequado para este fim pode compreender um primeiro primer que compreende a sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 198, ou um fragmento ou variante deste e/ou um segundo primer que compreende a O sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 199, ou um seu fragmento ou variante deste. Outros exemplos não limitantes de pares de primers adequados incluem aqueles contidos no SEQ ID NOS: 200-211, 220-223, 228-229 e 243-244 (incluindo fragmentos e variantes destas sequências de pares de primers).
O leitor especializado irá reconhecer que os primers exemplificados não se destinam a limitar a região do gene amplificado de saxitoxina A ou os métodos da invenção em geral. O leitor especializado irá também reconhecer que a “O invenção não está limitada à utilização dos primer específicos exemplificados, e sequências alternativas de primers também podem ser usados, desde que os primer sejam concebidos de forma apropriada de modo a permitir a amplificação de sequências polinucleotídicas de saxitoxina, preferencialmente sequências polinucleotídicas de saxitoxina A, e mais preferencialmente sequências de polinucletídeos de domínio Al e/ou A4 de saxitoxina.
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Em outras modalidades, os métodos da invenção podem envolver a detecção da presença (ou a determinação da ausência) de polinucleotídeos da invenção numa amostra pelo uso de sondas adequadas, As sondas da invenção estão baseadas em sequências polinucleotídicas sxt da invenção.
As sondas são sequências de nucleotídeos de comprimento variável, por exemplo, entre cerca de 10 nucleotídeos, e vários milhares de nucleotídeos, para utilização em detecção de sequências homólogas, tipicamente por hibridização.
As sondas de 0 hibridação da presente invenção podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos.
As sondas da invenção podem ser marcadas por incorporação de um marcador para facilitar a sua detecção.
Exemplos de marcadores adequados incluem moléculas fluorescentes (por exemplo, acetilaminofluoreno, S-bromodeoxiuridina, digoxigenina, fluoresceína) e isótopos radioativos (por exemplo, 32P, 35S, 3H, 33P). A detecção do marcador pode ser alcançada, por exemplo, por técnicas químicas, fotoquímicas, imunoquímicas, bioquímicas ou O espectroscópicas.
Os métodos para a criação e/ou produção de sondas nucleotídicas são geralmente conhecidas na arte, e são descritos, por exemplo, em textos de referência, tais como Robinson et al. (Eds) Current Protocols in Cytometry (2007), John Wiley and Sons, Inc; Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York; e Maniatis et al. (1982) Molecular
Cloning, 280-281.
54 / 155 Em outras modalidades, os métodos da invenção podem envolver a detecção da presença (ou a determinação da ausência) de polipeptídeos da invenção em uma amostra utilizando anticorpos. Os anticorpos podem ser utilizados para qualitativa ou quantitativamente detectar e analisar um ou mais polipeptídeos de STX da invenção numa amostra. Os anticorpos podem ser conjugados a um fluorocromo permitindo a detecção, por exemplo, por citometria de fluxo, imuno- “O histoquímica ou outros meios conhecidos na arte, Alternativamente, o anticorpo pode estar ligado a um substrato permitindo a detecção colorimétrica ou quimioluminescente. A invenção também contempla a utilização de anticorpos secundários capazes de se ligaren à um ou mais anticorpos capazes de se ligar especificamente a um polipeptídeo da invenção Kits para detecção de dinoflagelados A invenção também fornece kits para a detecção e/ou -o isolamento de polinucleotídeos da invenção e /ou polipeptídeos da invenção ("kits da invenção"). Em certas modalidades os kits são usados para detectar um dinoflagelado numa amostra.
Em outras modalidades os kits são usados para detectar um dinoflagelado produtor de saxitoxina em uma amostra.
55 / 155 Em outras modalidades os kits são utilizados para determinar à ausência de dinoflagelados produtores de saxitoxina em uma amostra.
Em geral, os kits do invento compreendem, pelo menos, um agente para detecção da presença de um ou mais polinucleotídeos da invenção, e/ou um ou mais polipeptídeos da invenção, e/ou suas variantes ou seus fragmentos (ver descrição na seção acima intitulada "polinucleotídeos e O polipeptídeos"). Qualquer agente adequado para este propósito poderá ser incluído nos kits. Exemplos não limitantes de agentes apropriados incluem primers, sondas e anticorpos, tais como aqueles descritos acima nas secções intituladas "sondas, primers e anticorpos" e "Métodos para detecção de dinoflagelados".
Em modalidades preferenciais, os kits são para utilização nos métodos da invenção (ver descrição na seção acima intitulada "Métodos para detecção de dinoflagelados").
o Em algumas modalidades, a invenção proporciona um kit para a detecção de um dinoflagelado numa amostra, contendo no kit, pelo menos, um agente para detectar na amostra a presença de um ou mais polinucleotídeos da invenção, e/ou um ou mais polipeptídeos da invenção, e/ou uma variante ou fragmento de um ou outro. Preferencialmente, o dinoflagelado é um dinoflagelado produtor de saxitoxina.
56 / 155 Em outras modalidades, a invenção proporciona um kit para a determinação da ausência de um dinoflagelado numa amostra, contendo no kit, pelo menos, um agente para a determinação da ausência de um ou mais polinucleotídeos da invenção na amostra, e/ou um ou mais polipeptídeos da invenção, e/ou uma variante ou fragmento de qualquer um destes. Preferencialmente, o dinoflagelado é um dinoflagelado produtor de saxitoxina.
AO Em geral, os kits do invento podem compreender qualquer número de componentes adicionais. A título de exemplo não limitante, os componentes adicionais podem incluir componentes para a coleta e/ou armazenagem de amostras, reagentes para a cultura de células, amostras de referência, tampões, etiquetas e/ou instruções escritas para realização do método(s) da invenção.
Os dinoflagelados detectados numa determinada amostra ou determinados estando ausentes de uma amostra utilizando os kits da invenção podem ser dinoflagelados produtores de saxitoxina. sem impor qualquer limitação particular, os dinoflagelados, podem ser da ordem —Gonyaulacales ou Gymnodiniales. os dinoflagelados podem ser do gênero Alexandrium (anteriormente Gonyaulax), Pyrodinium ou Gymnodinium. Os exemplos adequados de espécies de Alexandrium incluem A. catenella (por exemplo, cepas ACCCOl ACSHO2, ACTRAO2 e CCMPl493), A. fundyense (por exemplo, cepas CCMP1719 e CCMP1979), A. lusitanicum, A. minutum (por exemplo, cepas CCMPI888 CCMPl113, ALSPOl, ALSPO2 e AMDIG6 / AMADI6), A.
57 / 155 ostenfeldii e A. tamarense (por exemplo, cepas CCMP1771 ATBBO1, ATEBOl, ATCJ33 e ATNWBOl). Os exemplos adequados de espécies Gymnodinium incluem G. catenatum (por exemplo, cepas GCTRAOl e CS- 395), Os exemplos adequados de espécies Pyrodinium incluem P. bahamense var compressum.
Será apreciado por pessoas versadas na arte que podem ser feitas numerosas variações e/ou modificações à invenção tal como descrito nas modalidades específicas sem se afastar do espírito ou escopo da invenção como amplamente descrito. As presentes modalidades devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas.
Exemplos A invenção vai ser agora descrita com referência a exemplos específicos, os quais não devem ser construídos de forma limitante.
Exemplo 1: Identificação de genes nuclear codificados por Neurotoxina Saxitoxina em Dinoflagelados Materiais e Métodos Cultivo e medição de toxinas Produção de saxitoxina e não produção de cultura de dinoflagelados foram obtidas a partir de várias coleções de culturas (Tabela 1).
58 / 155 Tabela 1. Lista de cepas de dinoflagelados utilizados neste estudo, a sua produção de STX e se os fragmentos de sxtAl e sxtA4 foram amplificados a partir de seu DNA genômico.
PCR PCR Ordem Gênero Espécie Cepa sTX sxtAal SxXxtA4 Gonyaulacales Alexandrium affine CCMP112 n. d. n. d. n. d. affine AABBO1/01 n.d n.d. n. d. affine AABBO1/02 n.d mn. .ad. n. d. andersonii CCMPL1597 n. d. n. d. n. d. andersonii CCMP2222 n. d. n. d. n. d. catenella ACCCOl sim sim sim catenella ACSHO2 sim sim sim catenella ACTRAO2 sim sim sim catenella CCMP1493 sim sim sim fundyense CCMP1719 sim sim sim fundyense CCMP1979 sim sim sim minutum CCMP1888 sim sim sim minutum CCMP113 sim sim sim minutum ALSPO1 sim sim sim minutum ALSPO2 sim sim sim
59 / 155 minutum AMD16 sim sim sim tamarense CCMP1771 n. d. sim sim tamarense ATBBOl n. d. sim sim tamarense ATEBOl n. d. sim sim tamarense ATCJ33 n. d. sim sim tamarense ATNWBO1l sim sim sim Gambierdiscus australes CAWDl48 * n. d. n. d.
Ostreopsis ovata CAWD174 * n. d. n. d. siamensis CAWD96 * n. d. n. d.
Gymnodiniales Amphidinium massarti cs-259 * n. d. n. d.
Gymnodinium catenatum GCTRAOL sim sim sim catenatum CS-395 sim sim sim Prorocentrales Prorocentrum lima CS-869 * n. d. n. d. n.d não detectada, * espécie nunca relatada na sintetização de sTX.
60 / 155 As culturas foram mantidas em meio GSe (Doblin et al. (1999), Growth and biomass stimulation of the toxic dinoflagellate Gymnodinium catenatum (Grahamy by dissolved organic substances. J Exp Mar Biol Ecol 236: 33-47) ou meio Ll (ver método em in Guillard and Hargraves (1993) Stichochrysis immobilis is a diatom, not a chrysophyte. Phycologia 32, 234- 236) em 16-20 ºC, sob um ciclo de luz de 12/12, e uma irradiância de fótons de aproximadamente 100 micromoles de fótons m? s "*. A toxicidade das cepas foi determinada utilizando HPLC ou LCMS. O limite de detecção do método de HPLC foi de cerca de 0,07 ug STXeg/ 100 g para C1 e C3 até 4,1. O limite de detecção do método LCMS variou de cerca de 0,1 pg / célula para NEO e STX até 0,5 pg /célula para C1 e c2.
Extração de RNA e DNA Para isolar o RNA total da biblioteca de construção - 454 (veja abaixo), as culturas de Alexandrium fundyense Balech CCMP1719 e Alexandrium minutum Halim CCMP113 foram colhidas na fase exponencial através de centrifugação (1 min, 1000 x g, 12 º C) . As células foram lavadas com PBS, expostas a agitação em tubos com esferas em gelo seco com o equipamento Fast Prep bead-beater da Medinor (20 s, velocidade 4) usando esferas de 1,4 milímetros (Medinor) e RNA total foi extraído como ChargeSwitchoe Total RNA Cell kit (Invitrogen) de acordo com o protocolo dos fabricantes. Para as análises RACE (Remote Analysis Computation for gene Expression), mRNA enriquecido com polyA foi isolado usando o
61 / 155 Dynabeads DIRECT kit (Invitrogen). As células foram colhidas por centrifugação (2 min, 4 ºC, 16000 x g), foram lavadas duas vezes com PBS, o tampão de quebra/ligação foi adicionado e esta foi homogeneizada usando o agitador de esferas (bead- beater) (20 s, etapa 4). Depois da centrifugação (1 min, 4 ºC, 16000 x g), o clarificado homogeneizado foi transferido para o Dynabeads mixe o mRNA isolado de acordo com o protocolo. Por fim, o mRNA foi tratado com TURBO"" DNase (Ambion) de acordo com o protocolo fornecido.
O DNA genômico foi isolado a partir de todas as cepas de dinoflagelados listadas na Tabela 1 quer utilizando o Kit ChargeSwitcho (Invitrogen) para planta de DNA genômico de acordo com o protocolo do fabricante, ou pelo método de CTAB.
A qualidade e a quantidade de RNA e de DNA foram determinadas utilizando um espectrofotômetro Nanodrop (ThermoScientific), por amplificação de genes de controle de dinoflagelados (citocromo b, actina) e/ou visualizando-os em -O um gel de agarose corado com brometo de etídio. Construção da biblioteca de cDNA, sequenciamento 454, montagem e análises Bibliotecas de cDNA normalizados e enriquecidos com PolyA com 454 adaptadores conectados em cada extremidade foram construídos “comercialmente pela Vertis Biotechnologie AG (http://www. vertis-biotech.com/). Metades de uma lâmina da biblioteca de A.fundyense CCMP 1719 e de uma lâmina da biblioteca A. Minutum CCMP113 foram sequenciadas utilizando
62 / 155 tecnologia TITAN de sequênciamento Roche 454 (Roche 454 sequencing TITAN technology) no Centro de Alto Processamento de Sequenciamento Norueguês (Norwegian High-Throughput Sequencing Centre: http://www.sequencing.uio.no/). Apenas 454 leituras que possuíam pelo menos um adaptador de cDNA foram consideradas. Adaptadores e, onde presentes, sequências de líder inserido (spliced-leader, SL) de dinoflagelados foram removidas antes da montagem usando um roteiro in-house PERL que está agora integrado na ferramenta de bioinformática CLOTU. As leituras foram montadas usando o software Mira v3.0.5 com as principais chaves (switches) 'denovo', “est', accurate" and 454”, Para identificar sequências putativas de genes sxt nas duas bibliotecas 454, pesquisas BLAST personalizadas foram realizadas para os dados on-line disponíveis gratuitamente no portal 'Bioportal' (www.bioportal.no). Foram utilizadas duas estratégias: os genes sxt de cianobactérias foram confrontados com os conjuntos de dados montados de Alexandrium ou 454 0 conjuntos de dados de leitura desmontados. Todos os resultados com um valor e < 0,1 foram extraídos e a sequência com o menor valor e para cada gene foi comparado pelo método blast contra a base de dados de proteínas não redundante de NCBI.
Para a SxtA, todas as sequências obtidas foram reconstruídas no software do programa CLC Bio principal Workbench, utilizando uma sobreposição mínima de 10 pb e baixo ou alto rigor de alinhamento. As sequências contigs (contig) resultantes foram comparadas com os bancos de dados não redundantes e EST de NCBI usando algoritmos blastn, blastx e tblastx. A estrutura das transcrições de sxtA foi determinada
63 / 155 através do alinhamento com a sequência traduzida de sxtA de cianobactérias, assim como através de pesquisas de domínios conservados (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi).
Resíduos de ligação catalítica e de substrato de sxtA de cianobactérias foram previamente determinados. As transcrições foram pesquisadas pela presença de sinal de possíveis peptídeos e sítios de clivagem correspondentes utilizando as redes neurais e modelos ocultos de Markov implementados em SignalP 3.0 (http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) e a abordagem de 3 camadas de Sinal 3L (http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Signal-3L/). As hélices de transmembrana foram exploradas usando TMHMM server 2.0 (http: //www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) e perfis de hidrofobicidade com plotagens de Kyte - Doolittle. Análises RACE Os primers foram concebidos de regiões conservativas das sequências dos contigs com elevada similaridade com sxtA utilizando o software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/; Tabela 2).
64 / 155 Tabela 2. Primers usados em PCR e no sequenciamento.
TGCAGCGMTGCTACTCCTACTAC liga-se em sxtAl, sxt00l Direta concebida com 454 (SEQ ID NO: 200) leituras GGTCGTGGTCYAGGAAGGAG liga-se em sxtAl, sxt002 Reversa concebida com 454 (SEQ ID NO: 201) leituras ATGCTCAACATGGGAGTCATCC liga-se em sxtA4, sxto07 Direta concebida com 454 (SEQ ID NO: 202) leituras GGGTCCAGTAGATGTTGACGATG liga-se em sxtA, sxtoo8 Reversa concebida com 454 (SEQ ID NO: 203) leituras Primers adicionais usados para análise e sequenciamento RACE GTAGTAGGAGTAGCKACGCTGCA complemento sxt013 Reversa (SEQ ID NO: 204) reverso de sxt001l CTCCTTCCTRGACCACGACC reverse complement Direta sxt014|(SEQ ID NO: 205) of sxt002 GGATGACTCCCATGTTGAGCAT complemento Reversa sxt015|(SEQ ID NO: 206) reverso de sxt007 CATCGTCAACATCTACTGGACCC complemento Direta sxt016|(SEQ ID NO: 207) reverso de sxt008 GGCAAGTATCTCCGCAGGCTTAC liga-se em sxtAl, Reversa montante de sxt019|(SEQ ID NO: 208) sxt002 CGTGGAGGAGCATGTTGACAGAATC liga-se em sxtAl, sxt020 Direta (SEQ ID NO: 209) jusante de sxt001
65 / 155 ACTCGACAGGCCGGCAGTACAGAT liga-se com sxtA4, Reversa montante de sxt026|(SEQ ID NO: 210) sxt008 TGAGCAGGCACGCAGTCC liga-se em SXtAl Direta na transcrição sxt040|(SEQ ID NO: 211) longa Primers para ampliar clones diretamente GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG liga-se no vetor TopoF Direta pCRO2.1-TOPOS (SEQ ID NO: 212) - vector AGTCACGACGTTGTAAAACGACGG liga-se no vetor j TopoR Reversa (SEQ ID NO: 213) pCRO2.1-TOPOO
66 / 155 A primeira fita de cDNA foi sintetizada com - 95 ng de mRNA de enriquecida com polyA utilizando o primer adaptador AP de acordo com as instruções do fabricante para transcritos com elevado teor de GC (Sistema 3'RACE, Invitrogen). Seguindo o tratamento RNase H, o produto RACE foi diluído de 1:10 e utilizado como molde para PCR. Para amplificar a extremidade 5' do transcrito, foram utilizados três protocolos diferentes. Em primeiro lugar, o método de Zhang (Zhang et al. (2007) Spliced leader RNA trans-splicing in dinoflagellates. Proc Natl Acad Sci USA 104: 4618-4623) foi utilizado com ligeiras modificações: a biblioteca 3' RACE acima descrita foi amplificada com os primers AUAP (primer adaptador fornecido com o kit) e dinoSL para enriquecer para transcritos completos (programa de PCR: 94 ºC - 60 segundos; 30 x (94 º C - 30 segundos, 68 ºC - 5 min), 68 º C - 10 min; 8 ºC espera; química de PCR veja abaixo). O produto de PCR foi diluído 1:10 e utilizado como molde em PCR aninhados, os quais foram amplificados utilizando o primer dinoSL como direto e vários primers reversos internos (Tabela 2). Além disso, estes experimentos utilizaram os dois kits do Sistema 5'RACE (Invitrogen) e oO kit GeneRacer (Invitrogen), utilizando os primers 5'Adaptadores (5" adapter) fornecidos e vários diferentes primers reversos internos (Tabela 2). Todos os produtos foram clonados e sequenciados como descrito abaixo.
PCR e sequenciamento Todas as reações de PCR foram realizadas em volumes de 25 pl contendo molde, uma unidade de tampão 10X BD Advantage 2 PCR (BD Biosciences), 0,2 mM de dNTPs, 0,5 uM de cada primer
: 67 / 155 direto e reverso (Tabela 2), DMSO (10% de concentração final) e 0,25 unidades de 50X BD Advantage 2 Mix Polymerase (BD - Biosciences). Se não for mencionado o contrário, os PCRs foram amplificados como se segue: 94 º C - 2.5 min; 5 x (94 º* C - 30 s; 68 9º C - variável); 5 x (94 º C- 30 s; 66 º C- 30 s; 68 º C - variável), 25x (94 º C - 30 s; 64 º C - 30 s; 68 º* C - variável); 68 º C - 10 min, 8 º C - espera.
Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose corado com 1 % de brometo de etídio, cortado e limpo com o gel Wizard SV e sistemas de limpeza de PCR (Promega) e clonados com o kit de clonagem TOPO TAG de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen; vetor pCR O 2.1 -TOPO G; One Shot6 Machl "” Tl com células E. coli resistentes aos fagos quimicamente competentes). As colônias individuais foram diretamente adicionadas a 25 pl de reações de PCR contendo uma unidade de tampão padrão de PCR 10 X (Qiagen), 0,4 puM de primer Topof Topor (Tabela 2), 0.2 mM de dNTPs e 1 unidade HotStarTaq (Qiagen). As condições de amplificação foram de 95 º*º Cc - 15 min, 30 x (94 º* C - 30 s, 60 º* C - 30 s; 72 ºC - 90 s), 2º 72 ºC - 5 min, 8 º C - espera.
Os produtos da PCR foram diluídos e sequenciados diretamente pelo método de Sanger a partir de ambos os lados utilizando os primers MI13R e M13F fornecidos com o kit de clonagem.
Amplificação genômica de SxtAl e sxtA4 Todas as cepas de dinoflagelados (Tabela 1) foram testadas quanto à presença de genes sxtAl e sxtA4 putativos.
PCRs foram realizadas usando gDNA de acordo com o protocolo descrito acima.
O fragmento sxtAl foi amplificado com primers sxt001 &
68 / 155 sxt002 (- 550 pb) e o fragmento sxtA4 com osprimers sxt007 & sxt008 (- 750 pb) (Tabela 2). Análises filogenéticas Sequências nucleotídica de dinoflagelados foram alinhadas manualmente utilizando MacClado v4.07 (ver Maddison and Maddison (1992) MacClado. 3 ed: Sinauer Associates), considerando a sequência de codificação no enquadramento de leitura correto antes de ser traduzida para a sequência de aminoácidos correspondente.
As sequências de aminoácidos de dinoflagelados foram subsequentemente alinhadas usando modelo MAFFTV6 L-INS-I para as sequências de sxt ortólogas de cianobactérias, em adição a uma seleção de pontuação estreitamente relacionadas de NCBI nr BLASTP, que constitui o grupo externo.
Os alinhamentos resultantes foram verificados manualmente e posições mal alinhados excluídos usando MacClado v4.07 ( ver Maddison e Maddison (1992) supra). O ProtTest v2.4 (ver Abascal et al. (2005) ProtTest: !O selection of best-fit models of protein evolution.
Bioinformatics 21: 2104-2105) determinou WAG como o modelo evolutivo ótimo para todos os alinhamentos inferídos.
Análises de máxima verossimilhança (ML) foram realizados com RAxXML-VI- HPCv7.2.6, modelo PROTCATWAG com 25 categorias de taxa (ver Stamatakis (2006) RAXML.-VI-HPC: Maximum likelihood-based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models.
Bioinformatics 22: 2688-2690). A topologia mais provável foi estabelecida a partir de 100 pesquisas separadas e as análises bootstrap " foram realizadas com 100 pseudorreplicações.
: 69 / 155 Inferências Bayesiana foram realizadas utilizando Phylobayes v3.2e (veja Lartillot and Philippe (2004) A Bayesian mixture model for across-site heterogeneities in the amino-acid replacement process.
Mol Biol Evol 21: 1095-1109; e Lartillot and Philippe (2006) Computing Bayes factors using thermodynamic integration.
Syst Biol 55: 195-207) sob o mesmo modelo de substituição com um número livre de categorias de mistura e uma discreta variação em local sob quatro categorias.
As árvores foram inferidas quando a maior diferença máxima entre as bipartições (cadeias) foi < O.l.
Todo o modelo de estimativa e análises filogenéticas foram feitos no *Bioportal' livremente disponível | (http: //www.bioportal.uio.no/). Determinação do número de cópias Triplicatas de bateladas de 200 ml de culturas de cepa ACSHO2 de Alexandrium caátenella foram cultivadas como descrito anteriormente, e a abundância foi contada de três em três dias, utilizando uma câmara de Sedgewick-Rafter e microscópio de luz invertida (Leica Microsystems). Amostras de dez ml para extração de gDNA foram tomadas em fase inicial exponencial, fase exponencial posterior e fase estacionária.
Os primers adequados para qPCR foram concebidos com base em regiões conservativas em um alinhamento das leituras 454 de A. fundyense e A. minutum abrangendo a região sxtA4 usando oO software Primer 3 amplificando um produto de 161 pb (using Primer 3 software amplifying a 161 bp product). qPCR ciclos foram realizados no Rotor Gene 3000 (Corbett Life Science)
: 70 / 155 - utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Invitrogen). Os ensaios ] de qPCR foram realizadas num volume final de 25 pl sendo o volume consistindo em 12.5 pl de SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul de molde DNA, 1 ul de cada par de primers, 1 npl de BSA e
8.5 pl de água mili-Q. Os ensaios de qPCR foram realizadas em triplicata com o protocolo seguinte: 95 º C durante 10 s, e 35 ciclos de 95 º C durante 15 s e 60 º C durante 30 s. A análise da curva de fusão foi realizada no final de cada programa para confirmar a especificidade de amplificação, e alguns produtos O. de PCR foram sequenciados. A curva padrão foi construída a : partir de uma série de diluição de 10 vezes de uma : concentração conhecida do produto de PCR fresco, variando entre 2 - 2 x 10º? ng. As moléculas de produto de PCR foram determinadas: (A x 6.022 x 10º?) x (660 x B) * com A: concentração do produto de PCR, 6.022 x 10º: o número de Avogadro, 660: peso molecular médio por par e B: comprimento do produto de PCR. O número de moléculas nas amostras desconhecidas foi determinado e dividido pelo número de células conhecido no molde gPCR para obter o número de cópia e. por célula. O limite de detecção foi de cerca de 5000 cópias da sequência do gene (ou seja, de -20-30 células por ensaio, cada um com aproximadamente 200 cópias da sequência). No entanto, as análises foram realizadas com 10 - 100 vezes esse número de células e, assim, não realizadas em ou perto de um limite de detecção. Resultados Identificação de sequências de sxt no transcriptoma de A. minutum and A. fundyense
: 71 / 155 O sequenciamento 454 resultou em 589410 leituras brutas para A. minutum e 701870 leituras brutas para A. fundyense (SRAO28427.1: amostras SRS151150,.1 e SRS151148.1, respectivamente). Após o controle de qualidade, as leituras foram montadas em 44.697 contigs e 539 singletons para A. minutum e 51861 contigs e 163 singletons para A. fundyense.
Os comprimentos contigs e o conteúdo de GC foram semelhantes para as duas bibliotecas: os comprimentos médios da sequência (+ SD) de 669 bp ( + 360) e 678 bp ( + 361) e um conteúdo de GC de 59 % e 58% foram calculados para A. minutum e A. " fundyense, respectivamente,
Pesquisando na biblioteca desagregada 454 de CcDNA, as leituras com o gene sxtA de cianobactérias resultaram em 94 pontuações para A. fundyense e 88 pontuações para A. minutum, respectivamente.
A mesma pesquisa sobre os conjuntos de dados agregados retornou 10 contigs da biblioteca de A. fundyense e 9 da biblioteca de A. minutum.
Após o agrupamento de todas as sequências e remontageny dois contigs apresentaram alta 210 similaridade com sxtA de cianobactérias: uma para o domínio SxtAl (comprimento do contíg = 1450 bp, GC = 60,1%, bit score = 213, valor-e = 50€*) e outro para sxtA4 (comprimento do contíg = 1059 bp, GC = 65 %, bit score =195, valor-e = 16”). Ambos os contigs continham sequências de ambas as bibliotecas Alexandriíum, mas nenhum continha um ORF completo, uma sequência de líder inserido (splice leader) de dinoflagelados ou uma cauda de polyA.
Os dois contigs foram usadas para criar primers de sxtAl e sxtA4 para amplificação genômica, análises
RACE e sequenciamento.
72 /155 Os resultados da pesquisa in silico para os centros remanescentes de genes sxt estão resumidos na Tabela 3.
' mom 8H 1 4 = o r On sc. 0 O O Pp x 7 o sv Oo 4 0 O Ss é dh hã dh SS 6 P o o WO Ss No o MM > o SE à O 4 NOS S&S Oo À õ n A oO O nn q mo RNA $ E, à 8 OQ > mom ao + E qdo 8 O à 8 O o E o HA Q o pp 4 Ss 4 ã O O > 200 Qa qq o 43 + Ex e. go> 0 &&R o q
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. 78 / 155
Além de sxtA, contigs com uma boa pontuação de alinhamento
(score bit > 55) e um valor-e altamente significativo (< e?) foram recuperados para gene sxtG de amidinotransferase em ambas as bibliotecas.
Comparando novamente os contigs pelo método Blast com os menores valores-e com a base de dados nr proteínas do NCBI apresenta-se que o gene mais semelhante foi uma aminotransferase glicina actinobacterial, enquanto à similaridade de sxtG com cianobactérias foi menor, mas ainda altamente significativa (Tabela 3). Para OS genes da biossíntese de núcleo (core biosynthesis genes) sxtB, sxtF/M, sxtH/T, sxtI, SsxtR e sxtU, contigs com com um valor- e < 0,1 foram recuperados a partir de duas bibliotecas Alexandrium, enquanto sxtS só tinha uma pontuação na biblioteca A. minutum (Tabela 3). Nenhuma equivalência foi recuperada para sxtC,
sxtD e sxtE em qualquer uma das bibliotecas.
SxtC e sxtE são proteínas desconhecidas e sxtD é um proteína semelhante a sterol desaturase.
É possível que as proteínas dos dinoflagelados sem similaridade com os genes de cianobactérias realizem sua função.
Alternativamente, estes genes não estavam presentes na base de dados gerada.
Embora o conjunto de dados seja abrangente, este não é completo.
Por exemplo, algumas regiões das transcrições de sxtA também não foram recuperadas no conjunto de dados 454, mas só obtido por meio de análises RACE (veja acima). Comparando novamente as pontuações recuperadas pelo método Blast com a base de dados nr proteínas do NCBI para SxXtB (apenas A. fundyense), sxtF/M, sxtH/T, sxtI e sxtUu que são semelhantes aos codificados nos genes Ssxt correspondentes de cianobactérias.
A similaridade de sequência real foi menos conservada e não foram observadas pontuações
BR 79 / 155 significativas entre os contigs de Alexandrium e os genes sxt de cianobactérias, Estrutura transcrita de sxtA em A. fundyense Os experimentos RACE resultaram em duas famílias diferentes de transcritos similares de sxtA. Ambos tinham sequências de líderes inseridos de dinoflagelados na extremidade 5' e caudas de polyA na extremidade 3', mas diferian na sequência, comprimento, e no número de domínios de sxt que eles codificam. Os transcritos curtos codifiícam os domínios sxtAl, Ú SxtA2 e sxtA3, enquanto que os transcritos mais longos codifica todos os quatro domínios sxtA, que também são codificados pelo gene sxtA de cianobactérias (Fig. 1).
A sequência de consenso dos transcritos curtos foi 3136 bp, excluindo a cauda de polyA. Oito clones com líder-SL foram sequenciados, e três 5S'UTRs diferentes foram descobertos. As sequências foram quase idênticas, no entanto, um clone tinha inserção de 15 bp e outro tinha uma inserção de 19 pb seguindo exatamente a sequência-SL. As duas inserções de sequências foram, exceto pelo comprimento, idênticos. As nove 3'UTR que foram sequenciados foram praticamente idênticas e a cauda de polyA começou na mesma posição em cada clone. A estrutura de domínio deste transcrito curto de sxtA era como se segue: resíduos de aminoácidos 1-27 codificam um peptídeo de sinal. Os resíduos 28-531l correspondem a sxtAl, que contém três sequências-tema conservadas ((T: VDTGCGDGSL (SEQ ID NO: 214), IT: VDASRTLHVR (SEQ ID NO: 215), III: LEVSFGLCVL (SEQ ID NO: 216)). Resíduos 535-729 correspondem aos sxtA2 com os domínios
. 80 / 155 catalíticos 557- W, T - 648, 663- H, 711- R, enquanto sxtA3, o domínio final da transcrito curto, corresponde aos resíduos 750-822 com o sítio de ligação de fosfopanteteinil 783 -DSL -
785.
A sequência de consenso do transcrito mais longo de sxtA foi 4613 bp (regra majoritária, mais longo 3'UTR, sem cauda polyA, fig. 1). Cinco clones com seguências-SL foram caracterizados. Um deles tinha uma sequência-SL ligeiramente divergente com um A na posição 15 em vez do habitual G. Todos : os S'UTRs foram de 97 pb de comprimento (excluindo a : sequência-SL) e quase idênticas na sequência. Cada um dos quatro 3'clones sequenciados tinha um comprimento diferente (342, 407, 446 e 492 pb). A estrutura do domínio do transcrito mais longo de SsxtA foi como se segue: resíduos de aminoácidos 1-25 codificam um peptídeo de sinal. Os resíduos 26-530 correspondem ao domínio SxtAl com as sequências-tema conservadas IT: VVDTGCGDG (SEQ ID NO: 217), II: VDPSRSLHV (SEQ ID NO: 218) and III: LOGSFGLCML (SEQ ID NO: 219); resíduos 535-724 correspondem ao domínio sxtA2, com os resíduos catalíticos 556- W, T - 661, 693- H, 708- R; sxtA3 corresponde aos resíduos 763-539, onde 799- DSL- 801 é o sítio de ligação de fosfopanteteinil e, finalmente, o domínio sxtA4d corresponde aos resíduos 894-1272.
O conteúdo de GC dos dois transcritos de sxtA Alexandrium era consistentemente maior que os dos genes sxtA de cianobactérias (Fig. 2). Os conteúdos de GC foram de 69 %
. 81 / 155 (transcrito longo), 62% (transcrito curto) e 43% (todos os genes sxtA de cianobactérias).
Todos os algoritmos previram à presença de peptídeos de sinal (signal peptides, SP), e sítios de clivagem correspondentes para ambos os transcritos. No entanto, as de hélices transmembranas que podem indicar peptídeos de trânsito classe I em dinoflagelados não foram previstos. Nenhum dos transcritos se encaixou nos critérios para peptídeos de trânsito classe II e classe III.
. OS números de acesso do Genbank são JF343238 para o transcrito curto e JF343239 para os longos transcritos de sxtA (sequências de consenso da regra majoritária) e JF343357 - JF343432 para as sequências RACE restantes clonadas de A. fundyense CCMP 1719, Filogenia de sequências de sxtAl e sxtA4 de dinoflagelado Os primers de SsxtAl e sxtA4 desenvolvidos neste estudo (Tabela 2) amplificaram bandas únicas de - 550 bp (sxtAl) e - 750 bp (sxtM) de comprimento em 18 cepas de Alexandrium compreendendo cinco espécies e duas cepas de Gymnodinium catenatum, que teve uma série de efeitos tóxicos (Tabela 1). Nenhum dos produtos da PCR de sxtAl ou sxtM foram amplificados por cinco cepas não produtores de STX de Alexandrium affine e Alexandrium andersonii, nem por cepas de dinoflagelados não produtores de STX de gênero Gambierdicus, Ostreopsis, Prorocentrum, Amphidinium (Tabela 1). Estes resultados baseados na PCR estão geralmente de acordo com as
82 / 155 medições da toxina. No entanto, fragmentos de sxtAl e sxtA4d foram amplificados a partir do DNA genômico de quatro cepas de A. tamarense (ATCJ33, ATEBO1, CCMP1771, ATBBO1) em que não foi detectado nenhuma STX (Tabela 1).
As análises filogenéticas de sxtAl (Fig. 3; Fig. 5), mostram que todas as sequências de sxtal formaram um agrupamento (cluster) totalmente suportado, dividido em dois sub-agrupamentos. Alguns clones da mesma cepa eram idênticos, no entanto, clones um pouco diferentes foram observados para a maioria das cepas. Estes clones diferentes foram distribuídos por toda a filogenia, geralmente sem espécies ou moldes de cepa relacionados. Apenas sequências de G. catenatum formaram um ramo estreito dentro de um dos subgrupos. Os parentes mais próximos do agrupamento dos dinoflagelados forma as sintases policetídica de genes sxtA cianobacterial e proteobacterial (Fig. 3; Fig. 5). Todas as sequências de sxtA4 formaram um agrupamento bem suportado com os clones da mesma cepa distribuídos por toda extensão (Fig. 4;. Fig. 6). Os genes de sxtA cianobacterial e aminotransferases actinobacterial formaram os mais próximos clado irmão. Os números de acesso do Genbank para os fragmentos genômicos de sxtAl e sxtA4 são JF343240 - JF343356 . Número de cópias e polimorfismos de sxtA4
: 83 / 155 Entre 100-240 cópias genômicas de sxtA4 em A. catenella foram encontrados em culturas provenientes de triplicatas de bateladas de ACSHO2 coletadas em três pontos de tempo, com diferentes taxas de crescimento, com base no ensaio de qPCR (figura 4B). A análise de um contig de 987 bp, que cobriu o domínio SXtA4 e foi baseado na leitura 454 de A. fundyense revelou pelo menos 20 polimorfismos de nucleotídeo único (PNU's), 15 dos quais foram silenciosas.
PNU's foram definidos como uma i mudança de base do par que ocorrem em pelo menos duas das : leituras.
Trechos de homopolímero e índeis foram ignorados.
Discussão Genes Sxt são codificados em genomas de dinoflagelados O genoma de dinoflagelado é extraordinariamente grande [1,5-200 pg de células de DNA -1; 52] e altamente divergentes.
Estimativas recentes preveem que genomas de dinoflagelados contêm entre 38.000 e cerca de 90.000 genes codificadores de proteínas, as quais correspondem a 1,5-4,5 do número de genes codificados no genoma humano.
Os resultados do sequenciamento > 1,2 milhões de ESTs neste estudo demonstram que os homólogos próximos dos genes envolvidos na biossíntese de STX em cianobactérias estão também presentes em dinoflagelados produtores de STX (Tabela 3). Para confirmar ainda mais a sua origen nos dinoflagelados, SxXtA foi investigada sendo o único gene de partida da rota de biossíntese.
O transcriptona de A. fundyense CCMP 1719
. 84 / 155 continha duas famílias de transcritos diferentes que tinham a mesma arquitetura de domínio como sxtA em cianobactérias. As duas famílias de transcritos variaram em comprimento, sequência, e no número de domínios catalíticos que eles codifican. Os transcritos longos não continham os quatro domínios presentes nos genes SXtA conhecidos de cianobactérias, no entanto, nos transcritos curtos não havia o terminal de domínio aminotransferase (Fig. 1). Em contraste com os transcritos bacterianos, ambas as famílias de transcritos possuíam cauda eucariótica de polyA na extremidade 3' e sequências de líder inserido de dinoflagelados na extremidade 5'. Assim, estes resultados mostram claramente que, pelo menos sxtA e, possivelmente, outros genes sxt são codificadas no genoma nuclear de dinoflagelados e que a síntese de STX em dinoflagelados não se origina a partir de bactérias de co-cultura. Estas bactérias podem, ainda assim, no entanto, ter um papel importante na modulação da biossíntese de STX em dinoflagelados.
Os peptídeos de sinal identificados em ambas os transcritos indica uma mira específica de ambos os produtos de Sxt. Muitos genes nos genomas nucleares de dinoflagelados são derivados de plastídeos (plastos) e os seus produtos orientados para oO plastídeo. Estas proteínas são traduzidas no citosol e, em seguida, transportadas para o plastídeo através das membranas plastídicas. Em dinoflagelados contendo peridinina como Alexandrium, este processo requer à presença de sequências de peptídeos de sinal e de transferência. Ambos os transcritos de SsxtA são previstos para conter peptídeos de sinal, mas
. 85 / 155 peptídeos de transferência não foram identificados. Portanto, parece que ambas as proteínas de sxtA são orientadas para fora do citosol, mas a região de destino precisa ser investigada experimentalmente.
Os transcritos de sxtA de dinoflagelados transcritos não só diferiram dos correspondentes de cianobactérias pela presença de peptídeos de sinal, sequências-SL e cauda polyA, mas também no seu conteúdo de GC. Os ESTs de A. fundyense tinham um teor de GC consideravelmente mais elevados (Fig. 2). Genes Ú transcritos a partir de espécies Alexandrium foram relatados tendo um teor médio de GC > 56 %, enquanto cianobactérias filamentosas, tais como os gêneros produtores de SXT gênero Cylindrospermopsis, Anabaena, Aphanizomenon e Lyngbya, têm um conteúdo de GC genômico de cerca de 40 %. Isto indica que o teor de GC de sxtA divergiu significativamente do ancestral do progenitor possuidor de sxtA, em linha com o resto do genoma nestes microorganismos.
O envolvimento dos dois transcritos de sxtA diferentes e seu papel na síntese de STX é atualmente pouco claro, mas as diferenças de conteúdo GC (Fig. 2) indicam que eles estão sob diferentes pressões de seleção.
As cópias não idênticas de sxtA: a variação no nível do genoma e transcriptoma Uma característica típica de genomas dinoflagelados é que os genes que podem ocorrer em várias cópias, que podem ou não ser idênticas. Isto é possivelmente relacionado com mecanismos
86 / 155 genéticos altamente não convencionais, tais como a reciclagem de cDNAS processados. Parece que sxtA também ocorre em múltiplas cópias no genoma de dinoflagelados. Foi estimado que 100 —- 240 cópias do domínio sxtA4 estavam presentes no DNA genômico de A catenella ACSHO2 (ribotipos asiáticos temperado). As diferenças no número de cópias detectadas ao longo do ciclo celular estão provavelmente relacionadas com a taxa de crescimento da cultura da batelada e a proporção de células em diferentes fases do ciclo celular. Todas as sequências genômicas de sxtA4 a partir de 15 diferentes cepas de Alexandriun e uma cepa de G. catenatum formaram um : aglomerado filogenético bem suportado, com várias sequências de clone ligeiramente diferentes da mesma cepa distribuídos ao longo da árvore. Foi descoberto que SxtAl também ocorreu em múltiplas cópias não idênticas em todas as cepas analisadas (Fig. 5). Além disso, a separação do aglomerado de sxtAl de dinoflagelados em dois sub-clados indica que sxtAl pode ser codificada por duas classes distintas de genes, pelo menos em algumas cepas.
A variação genômica de sxtA também está presente nas transcriptomas de Alexandrium. Adicionando os dados do transcriptoma à árvore de sxtal mostrou-se que o clado superior corresponde aos transcritos de sxtA mais longos, enquanto que o clado inferior corresponde aos transcritos menores (Fig. 3, Fig. 5). As análises em nível nucleotídico da região sxtA4 no transcriptoma de A. fundyense revelou muitos dos sites SNP, dois terços dos quais foram silenciosos.
- 87 / 155 Correlação entre sxtAl, sxtA4 e produção de saxitoxina As sequências genômicas de sxtAl e sxtA4 identificadas durante este estudo estavam presentes em todas as cepas de dinoflagelados produtores de STX analisados, incluindo duas cepas de G. catenatum e 14 cepas de Alexandrium das espécies A, catenella, A. minutum, A. fundyense e A. tamarense. Nenhum dos dois fragmentos de sxt foi amplificado a partir de duas cepas de A. andersoni e três cepas de A. affine. Homólogos também não foram detectados em Gambierdiscus australes, Amphidinium massartii, Prorocentrum lima, Ostreopsis siamensis e Ostreopsis ovata, nenhum dos quais são conhecidos por . produzir STX (Tabela 1).
Apesar da muito boa correlação entre a presença de sxtAl e SsxtA4 e conteúdo de STX para a maioria das cepas analisadas, ambos os fragmentos foram também amplificado a partir de cepas de A. tamarense para os quais não se detectou produção de STX (Tabela 1). Análises RACE de cepa CCMP1771 de A. tamarense revelou que sxtAl e sxtA4 foram transcritas neste cepa (dados 40 não mostrados). Postula-se que a quantidade de STX produzido por A. tamarense é inferior ao limite de detecção dos métodos de determinação de toxina de HPLC/MS utilizado. Desde que um ensaio de saxifilina muito sensível utilizado para investigar a cepa ATBBO1A determinou que esta era tóxica. A abundância de Transcritos têmtem sido sugeridossugerida para ser positivamente relacionada com o número de cópias de genes presentes no genoma de um dinoflagelado. Por isso, é possível que as cepas com os baixos níveis de STX têm menos cópias dos genes sxt em comparação com aqueles com maior produção de STX.
88 / 155
Se isto é verdade, então a presença de sxtAl e sxtAM indicaria toxicidade e métodos moleculares poderiam ser utilizados para detectar células produtoras de STX no ambiente . Evolução da síntese de STX em eucariotos e seu papel na diversificação de Alexandrium
Os genes sxt de cianobactérias são altamente conservados entre as espécies de cianobactérias e acredita-se o agrupador do gene surgira há pelo menos 2100 milhões anos atrás.
Os resultados aqui mostram que os transcritos de sxtA de dinoflagelados que são filogeneticamente relacionados a um clado das sequências sxtA de cianobactérias e outros genes relacionados com a toxina bacteriológica putativa (Fig. 3 e Fig. 4). Propõe-se que esta semelhança notável é muito provavelmente devido a uma transferência genética horizontal (HGT) evento entre as bactérias ancestrais produtoras de STX e dinoflagelados.
Dentro dos dinoflagelados, STX são produzidas por espécies do gênero Alexandrium e Pyrodinium, que pertencem à família Gonyaulacaceae dentro da ordem Gonyaulacales, bem como por uma espécie do género Gymnodinium, que pertence à família dos Gymnodiniaceaena ordem Gymnodiniales.
Deste modo, estas toxinas são produzidas por dois gêneros dentro de uma família e por uma única espécie única a partir de uma ordem distante de dinoflagelados.
Esta distribuição da síntese de STX dentro dos dinoflagelados, bem como a relação de proximidade entre as sequências de sxtA de Alexandrium e Gymnodinium catenatum (Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, e Fig. 6), Sugere que a HGT da bactéria-para-dinoflagelados provavelmente teve lugar antes da origem do gênero Alexandrium e Pyrodinium
' 89 / 155 e foi seguida por uma transferência de dinoflagelados-para- dinoflagelado em G. catenatum.
A extensão da transferência Horizontal de Genes (HGT) de eucarióticas-para-eucarióticas é muitas vezes subestimada devido a dificuldades na detecção de tais eventos, no entanto, trabalhos recentes destacam a importância e prevalência de tais transferências de genes.
A relação entre as sequências sxtA de dinoflagelados neste estudo não foi resolvida neste estudo, como a maioria dos nós internos não foram estatisticamente abrangido (Fig. 5 e Fig. i 6). Por isso, não foi possível determinar com certeza se a . evolução dos genes sxtA espelha aquela do gênero Alexandrium, ou para determinar as origens de um HGT putativo de Alexandrium em G. catenatum.
No entanto, as cópias do gene sSxtAl e sxtA4 de múltiplas cepas de G. catenatum, A. mínutum e A. catenella tendem a ser agrupadas por espécies, indicando que sua história reflete a evolução das espécies.
A não amplificação de sxtAl e sxtAM4 das espécies não produtoras de STX de A, affine e A. andersoni pode indicar que os genes sxtA +20 foram perdidos a partir destas linhagens ou ter mutado tanto, que os primers aqui desenvolvidos não foram capazes de amplificá-los.
Os dois conjuntos de dados EST de Alexandrium continha transcritos, que codificaram homólogos para a maioria dos genes sxt identificados como sendo de cianobactérias (Tabela 3). Apesar da semelhança dos genes sxt de cianobactérias ser frequentemente significativa, era muito menos do que o observado para sxtA.
As pontuações foram mais próximas de
. 290 / 155 outros genes bacterianos ou eucarióticos presentes na base de dados. Isto indica que os diferentes genes da rota sxt podem ter origens distintas nos dinoflagelados. É necessário mais trabalho para elucidar as complexas origens deste grupo de genes e isso levará a avanços em relação aos genomas e biologia molecular desses microrganismos antigos e importantes.
Exemplo 2: método quantitativo para a detecção e quantificação da produção STX em dinoflagelados - Materiais e Métodos Manutenção de Cultura As culturas de dinoflagelados (Tabela 4) foram mantidas em GSe (Doblin et al., 1999, supra) ou meio Ll (Guillard & Hargraves, 1993 supra) a 16-20 ºC. Luz foi fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas (Crompton Light), com fluxo de fótons de 60-100 umol photon mº? sec”* em um ciclo de escuro/luz de 12/12 horas. As cepas utilizadas foram fornecidas pela 40 University of Tasmania (isolado por M. de Salas) da Coleção de Cultura Nacional Australiana de microalgas marinhas, Coleção de Culturas de Provasoli-Guillard (CCMP) e da Coleção de Culturas Cawthron Institute.
Tabela 4. Cepas de dinoflagelados testadas, o conteúdo STXs e se o par de primers de qPCR de sxtA4 resultou em um produto. Todas as amostras foram testadas com um controlo positivo para assegurar que inibidores da PCR não estavam presentes.
: 91 / 155 Tt Número da sTXs produto Dinoflagelado cepa detectado* "* qPCR de SXtAA Alexandrium affine CCMP112 = - affine Ccs-312/02 = - andersonii CCMP1597 - - andersonii CCMP2222 - 7 catenella ACCCO1l + + catenella ACSHO2 + + catenella ACTRAO2 + + fundyense CCMP1719 + + minutum CCMP113 + + minutum CS-324 + + tamarense ATCJ33 = + tamarense ATNWBOl + + Gambierdiscus australes CAWD1I48 - = Ostreopsis ovata CAWD174 - = siamensis CAWD -— - Amphidinium massarti cs-259 - - Gymnodinium catenatum GCTRAO1l + + Amostra de água ambiental contendo: n/a - Protoceratium reticulatum
- 92 / 155 Prorocentrum micans, Karenia sp Karlodinium veneficum Polarella glacialis Symbiodinium sp Extração de ADN e PCR A densidade da cultura foi determinada regularmente usando uma célula Sedgewick Rafter (Proscitech) e um microscópio de luz invertido (Leica Microsystems). Números conhecidos de células de cultura foram colhidos em fase de crescimento exponencial. O DNA foi extraído a partir dos pellets celulares - usando o método de CTAB (ver Doyle and Doyle, 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19:1-5), com uma precipitação adicional de DNA durante a noite a -20 ºC. A qualidade e a quantidade de DNA foi determinada utilizando um Nanodrop (Thermoscientific), e por amplificação de um gene de controle de dinoflagelado (cytb ou SSU rRNA), de acordo com os protocolos de Lin et al. (2009), utilizando o par iniciador 6f e 4r, que amplificam um fragmento de 440 pb, ou de 18S r primers de DNA 18SFO8 (5'- TTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTG-3' (SEQ ID NO: 220)) e ROITS (5'- CCTTGTTACGACTTCTCCTTCCTC-3' (SEQ ID NO: 221)) que amplifica -1780 bp.
Desenvolvimento de ensaio qQPCR de Sxt e determinação do número de cópias Um alinhamento de sxtA4 genômico e sequências de 9 cepas da espécie Alexandrium catenella , A. tamarense , A. minutum , A. fundyense e Gymnodinium catenatum (números de acesso do
93 / 155 GenBank JF343238 - JF343239, JF343259 - JF343265) foi construído. O grau de conservação das sequências genéticas foi verificado para a fração do domínio sxtÃ4 de 440 bp e como sendo de 94-98 % entre as espécies Alexandrium, e 89% entre espécies Gymnodinium catenatum e espécies Alexandrium. Primers específicos para sxtA4 foram projetados usando o software Primer3 e uma sequência consenso. A especificidade das sequências dos primers foi então confirmada utilizando BLAST (Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento de Local Básico) no NCBI (Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia). As sequências dos primers eram SsxtA4F 5' CTGAGCAAGGCGTTCAATTC 3º : (SEQ ID NO: 198) e sxtA4R 5' TACAGATMGGCCCTGTGARC 3' (SEQ ID NO: 199), resultando em um produto de 125 pb.
Para determinar a sua especificidade para a produção de STX ou potencialmente produtoras de STX, o par de primers de sxtA4 foi amplificado a partir de seis espécies de Alexandrium, Gymnodinium catenatum, três outras espécies produtoras de toxinas Gonyaulacales: Ostreopsis ovata, Gambierdiscus 40 australes, Ostreopsis siamensis, um dinoflagelado adicional, Amphidinium massartii, e uma amostra ambiental contendo uma comunidade fitoplanctônica mista, incluindo seis espécies de dinoflagelados identificados (Tabela 4). A amplificação por PCR foi realizada em reações de 20 ul contendo molde, 0,5 uM de cada primer, 3 mM de MgCla, 1 pl de BSA (NEB) e 10 ul Immomix (Bioline), contendo dNTPs, Immolase Taq polimerase e tampão de reação ou 20 nl de reação contendo molde, 0,2 pM de cada primer, 3 mM de MgCl2, 1 pl de BSA, 2 pl de tampão de reação MyTagq (Bioline) contendo dNTPs,
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0,2 pl MyTaq (Bioline) polimerase início quente e HO.
PCR com início a quente foram realizadas com uma etapa inicial de desnaturação de 95 º C durante 5-10 min, e 35 ciclos de 30s a 95ºC, 30s à 55 ou 60 ºC (para os primers cytb e sxtA4, respectivamente), 30s a 72 “ºC seguido por uma etapa de extensão final de 7 min a 72 º* C.
O fragmento de 188 foi amplificado em reações de 25 pL contendo molde, uma unidade 10X BD Advantage 2 PCR buffer (BD Biosciences) (BD Biosciences) , 5 mM de dNTPs , 0,2 pM de cada primer, DMSO (10% de concentração final) e 0,25 unidades de 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix (BD Biosciences). Os PCRs foram amplificados como se segue: 94 º C - 1 min, 30 x (94 º CC - 30 s, 57 º C- 30 s, com 68 ºC - 120s); com 68 ºC - 10 min, 8 º* C - fixo.
Os produtos foram analisados por electroforese em gel de agarose corado a 3% com brometo de etídio e visualizadas. qPCR também foi realizada utilizando um par de primers específico para a ribotipo asiático temperado de Alexandrium catenella, encontradas em águas temperadas australianas, com !0 base numa região de subunidade grande (LSU) do RNA ribossêômico local (Hosoi Tanabe and Sako, 2005), amplificando um fragmento 160, catF (5'- CCTCAGTGAGATTGTAGTGC -3' (SEQ ID NO : 222) ) e de catR (5'"-CCTCAGTGAGATTGTAGTGC-3" (SEQ ID NO: 222)) e catR (5' -=GTGCAAAGGTAATCAAATGTCC-3" (SEQ ID NO: 223)). Os ensaios foram realizados em amostraáãs ambientais e novas curvas padrão deste LSU de rRNA do par de primers foram construídos com base em cepas isoladas de águas australianas por M. de Salas (UTAS): ACCCO1l, isoladas de Cowan Creek, NSW, a aproximadamente 20 km do sítio de água de
95 / 155 Brisbane e 50 km do site Georges River, ACSHO02, isolado de Porto de Sydney, a aproximadamente 35 km ao norte do sítio do Rio Georges, e ACTRAO2, isolada da Tasmânia, na Austrália. O ciclo qPCR foi realizada em um Rotor Gene 3000 (Corbett Life Science), utilizando SSOFast Evagreen supermix (Biorad). Os ensaios de qPCR foram realizadas num volume final de 20 ul consistindo de 10 pl de mistura Evagreen master (contendo corante de intercalação de DNA, tampão e Taq polimerase), 1 pl de molde de DNA, 0,5 1uM de cada primer, e 1pl de BSA. Os ensaios de qPCR foram realizadas em triplicata com os . seguintes ciclos: 95 ºC durante 10 s, e 35 repetições de 95 ºC durante 15 s e 60 ºC durante 30 s. A análise da curva de fusão foi realizada no final de cada ciclo de para confirmar a especificidade de amplificação, e os produtos de PCR selecionados foram sequenciados.
AS curvas padrão para ambos sxtAM e LSU rRNA foram calculados de duas formas: (1) utilizando uma série de -O diluições de uma concentração conhecida do produto de PCR fresco, 5.7-5.7 x 10% ng (n=6). As curvas padrão utilizando o produto de PCR foram utilizados para determinar a eficácia do ensaio (ver método em Pfaffl, (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR Nucleic Acids Res. 2001 May 1;29(9):e45), bem como para determinar o número de cópias. As moléculas de produto da PCR foram determinadas: (A x 6.022 x 1023) x (660 x B)* com A: concentração do produto de PCR, 6,022 x 10º: o número de Avogadro, 660: peso molecular médio por par de base e B: comprimento do produto de PCR. O
96 / 155 número de moléculas em amostras desconhecidas foi determinado e dividido pelo número de células conhecido no molde qgPCR de DNA, para se obter o número de cópias por célula. (2) extração do ADN à partir de amostras em duplicata de números conhecidos de células de cepas de Alexandrium catenella (ACCCO1, ACSHO2, ACTRAO2) tomada durante a fase de crescimento exponencial, e diluindo o DNA em 50% ao longo de 3 ordens de grandeza (n = 6).
ao Para estimar a abundância ambiental de A. catenellia nas amostras com base no ensaio de LSU rRNA, as equações de (2) foram extrapolados e aplicados com os valores CT medidos para estas amostras, Devido a variabilidade foi encontrada em números de cópias dos genes de rRNA entre as cepas de algumas espécies Alexandrium, bem como uma variabilidade de até um fator de 2 esperada devido à variabilidade em condições de crescimento e do ciclo celular de células, o número de cópias da região do gene LSU rRNA em amostras em duplicata de cada uma das três cepas foi determinada. As abundâncias finais de £O A. catenella nas amostras ambientais foram determinadas como a média e o desvio-padrão de seis estimativas independentes.
Coleta de amostras de fitoplâncton e ostra A comunidade fitoplanctônica foi coletada diariamente em níveis médios de maré de 15 e 20 de novembro de 2010, em locais de monitoramento padrão perto das fazendas de ostra de rocha de Sydney (Saccostrea glomerata) em MWagonga Inlet, Narooma, NSW, -36" 13” E 150" 6“S e do Rio Georges, NSW -34"' 1" E 151' 8'' S (Fig. 7). As amostras também foram
97 / 155 retiradas da Brisbane Water, NSW -33" 28'"" E 151' 18'' S$ em 22 de julho de 2010 (Fig. 7). Triplicatas de amostras em garrafa de 41, foram retiradas a cada dia para análise molecular. Uma outra garrafa de 500 ml de amostra foi retirada e imediatamente fixada com iodeto de Lugol para a identificação microscópica e contagem. As amostras foram filtradas através de filtros Millipore de 3 pm e congeladas a -20 º C até a extração do ADN. Dez amostras iO individuais de S. glomerata foram retiradas de fazendas nas i imediações do local de amostragem do fitoplâncton em 17/11/10 e 19/11/10. Amostras de S. glomerata foram reunidas para testes de toxina.
Para determinar a especificidade do par de primers em amostras ambientais mistas, uma comunidade de fitoplâncton em que nenhuma das espécies produtoras de STX conhecidos estava presente foi amostrada. 1L da comunidade de superfície em Jervis Bay foi coletada no dia 19 de janeiro de 2011 e conservados, concentrados, identificadas e espécies presentes em 500 ml foram contadas como acima. Os Dinoflagelados presentes foram identificados como Protoceratium reticulatum, Karlodinium cf veneficum, Karenia sp., Prorocentrum micans, Polarella glacialis, Pfiesteria shumwayae, e Symbiodinium sp.
500 ml da amostra restante foram filtrados e à extração do DNA e a PCR foram realizadas como descrito acima.
Contagem de células Alexandrium usando microscopia
98 / 155 Células de fitoplâncton em - 300 ml de amostras conservadas em Lugol foram concentrados por filtração gravitacional assistida em membrana em filtros de éster de celulose de 5 um (Advantec) antes da lavagem em 4 ml e contagem. Espécies Alexandrium foram identificadas e contadas usando uma célula Sedgewick Rafter e um microscópio Zeiss Axiolab equipado com óptica de contraste de fase. O número de células contadas variou entre as amostras, dependendo da abundância Alexandrium, e taxas de erros padrão foram calculados usando a equação: Error = 2 / WVn, onde n é o número de células observadas na amostra. Determinação de toxina em ostras e culturas Amostras Moluscos e pellets de células de dinoflagelados foram testados por HPLC, de acordo com o AOAC Official Method
2005.06 para toxinas do envenenamento paralítico por moluscos em moluscos no Instituto Cawthron, Nova Zelândia. Um modificador de matriz, como descrito no protocolo original não foi usado, foram usadas em vez disso, a recuperação média de pico para cada composto separado. A análise por HPLC foi realizada num sistema Waters Acquity UPLC (Waters), acoplado a um detector Waters Acquity FLR. A separação foi conseguida com uma coluna Waters Acquity C18 BEH 1,7 um 2,1 x 50 mm a 30 “ºC, eluída em 0,2 mL minº*. As fases móveis foram formiato de amônio 0,1 M (A) e formiato de amônio 0,1 M em 5 % de acetonitrila (B), ambos ajustados a pH 6. O gradiente consistiu em 100 % de A durante 0,5 min, um gradiente linear para 80% B ao longo de 3,5 min, em seguida, voltando às condições iniciais durante 0,1 minutos e mantida durante
99 / 155 1,9 min. O detector de fluorescência teve excitação ajustada para 340 nm e emissão para 395 nm, Padrões analíticos para análogos de STX foram obtidos junto ao Conselho Nacional de Pesquisa, Canadá, O limite de detecção do HPLC das culturas celulares foi considerado 0.1 pg cell para NEO e STX, 0.2 pg cell* para GTX1/4, GTX6 (B2) e GTX5 (Bl), 0,5 pg cell* para Ccl1,2 e <0,3 pg cell 'para a análogos C3,4. Resultados io Especificidade, sensibilidade e eficiência do par de primers.
Foi-se descoberto que os primers concebidos neste estudo foram responsáveis por amplificar um fragmento do tamanho correto em todos os dinoflagelados produtores de STX testados das espécies: Alexandrium minutum, A. catenella, A fundyense, A. tamarense and Gymnodinium catenatum (Tabela 4). Além disso, amplificaram um fragmento de tamanho correto das espécies A. tamarense, cepa ATCJ33, ribotipo da Tasmânia, que não observou-se produzir STXs a um nível acima do limite de detecção do método de HPLC utilizado. O Sequenciamento dos produtos confirmou que este é um homólogo de sxtAd.
O par de primers sxtA4 não amplificou o DNA das espécies Gonyaulacalean relatadas não produtoras de STX Alexandrium andersonii, Alexandrium affine, Gambierdiscus australes, Ostreopsis ovata ou Ostreopsis siamensis nem das espécies mais distantes relatadas de dinoflagelados Amphidinium massartii. Além disso, o par de primers sxtA4 não amplificou o ADN das amostras de fitoplâncton, que continham uma comunidade
100 / 155 planctônicas mista incluindo bactérias, diatomáceas, picoplâncton e dinoflagelados Protoceratium reticulatum, Karlodinium cf veneficum, Karenia sp., Prorocentrum micans, Polarella glacialis, Pfiesteria shumwayae, e Symbiodinium sp. (Tabela 4). Em contraste, o DNA de todas as amostras foi amplificado utilizando o par de primes de controle positivo para assegurar o molde de reação estava intacto e isento de inibidores.
o A eficiência do ensaio sxtA4 baseado neste par de iniciadores foi de 97 % como calculado usando uma série de - diluições do produto de PCR fresco ao longo de 6 ordens de magnitude. O ensaio foi de 93-107 % de eficiência calculado utilizando uma série duplicata de diluição de 50% de gDNA das três cepas de A. catenella (Fig. 8). Para às curvas de padrão baseadas em ambos o produto de PCR e baseado em gDNA, valores rº das equações de regressão foram de 0,95 ou superior (fig. 8). O ensaio foi sensível a quantidades de DNA representando - 30 a > 2000 células das três cepas de A.catenella. Portanto, se a coleta das amostras foi realizada seguindo um protocolo semelhante à que foi utilizada, e 4 L de água do mar foi coletada, extraída e eluída em 15 ul, dos quais 1 uL foi testado, em seguida, o ensaio poderia detectar concentrações ambientais de A.catenella com um limite inferior de cerca de 110 células Lº?.
Número de cópias de genes sxtA4 O número de cópia de sxtA4 nas três cepas cultivadas de Alexandrium catenella tiveram uma média de 178-280 células **
101 / 155 (Tabela 5). A toxicidade destas cepas foi de 3,1-6,6 pg de célula” À equivalente de STX (Tabela 5). Nas amostras ambientais, o número de cópia de sxtA4 foi estimada em 226 e 376 célula” * nas amostras do rio Georges e Wagonga Inlet, respectivamente, e mais variável entre as estimativas baseadas nas amostras de Wagonga Inlet. Tabela 5. STXS presentes em cepas de Alexandrium catenella, em Pg célula*' e em Saccrostrea glomerata dos locais de amostragem, em pg de STX equivalentes kg” * de molusco, e o número médio de cópias de genes sxtA4 na cepa ou em todas as - amostras de fitoplâncton de que local de amostragem. Uma leitura de 0 indica que os níveis estavam abaixo do limite de detecção do ensaio. As amostras de S. glomerata foram tiradas em 17/11/10, 19/11/10 e 22/7/10 para o Rio Georges, Wagonga Inlet e Brisbane Water, respectivamente.
CE celula” de sTXS GTX-5 SXtA4d +/- sd em GTX-1,4 GTX-6 Cl,2 NEO/STX C-3,4 B2 - total (Bl) cepa ou amostra de plâncton culturas ACSHO2 5,25 1,75 0,60 2,40 05 <o,1 <o,3 o 178 +/- 49 (n=9) ACCCO1 6,60 1,15 o 2,55 o o 1,00 1,9 240 +/- 97 (n=3) ACTRAO2 3,13 1,13 o 2,00 o o o o 280 +/- 85 (n=3) S.glomerata 226 +/- 97 Rio Georges — 200 160 traços 30 10 o traços o (n=15) Wagonga 18 32 o 16 o o o o 376 +/- 257
102 / 155 Inlet (n=12) Brisbane 145 EX) 92 o o o o 275 (n=1) Water Amostras ambientais O sxtA4 foi detectado na amostra única de água Brisbane Water, bem como nos conjuntos de amostras no rio Georges e NWagonga Inlet (Fig. 9). Sequenciamento e análise de curva de fusão confirmaram que este é sxtA4, com uma média de identidade de 99% ou superior para o gene correspondente da cepa Alexandrium catenella. Uma relação positiva entre o ' número de células, tal como estimado a partir de microscopia, o número de células, como calculado a partir de LSU rDNA, e o número de cópias de sxtA4 foi observada em ambos os conjuntos de amostras ambientais, A correlação entre o número de células como estimado de LSU rRNA gene qgPCR e a número de cópias do gene SxtA4 estimado era muito alto para as amostras do rio Georges (rº=0.97, slope=0.0059, p<0.001) e menor para a amostra de Wagonga Inlet (r?=0.70, slope= 0.001, p<0.07) (Fig. 9). STXS agrupadas em amostras de S&S. glomerata foram detectados em cada um desses três sítios, com as maiores concentrações relatadas para o site do rio Georges (200 ug de STX equivalente kg de moluscos) com níveis mais baixos registrados tanto para Wagonga Inlet e Brisbane Water (48 e 145 pg de STX equivalente kg* de moluscos, respectivamente, Quadro 5).
Discussão
103 / 155 É fornecido aqui um novo método para detectar e quantificar o potencial de produção de STX em amostras de ambientes marinhos. O ensaio é baseado na detecção do gene SxtA que codifica uma única enzima putativamente envolvida na via sxt. O método descrito detectou o gene sxtA em todas as culturas produtoras de STX, e não detectou nas culturas não produtoras de STX ou na amostra ambiental que não contêm espécies produtoras de STX conhecidos. No entanto, os genes sxtA também foram detectados na cepa não produtora de Alexandrium tamarense, ribotipo da Tasmânia, ATCJ33. Apenas i uma cepa muito estreitamente relacionada da ribotipos da Tasmânia desta espécie é capaz de produzir STXS (dados não publicados), é possível que a cepa ATCJ33 tenha o potencial para produzir STXs sob certas circunstâncias. A amplificação de sxtAM4 das espécies e cepas de Alexandrium e Gymnodinium catenatum este estudo estão em linha com os achados do Exemplo um acima, em que fragmentos de sxtAl e sxt4 de cerca 550 bp e 750 bp foram amplificados a partir das mesmas cepas testadas, e nenhuma amplificação destes fragmentos das espécies Alexandrium affine and A. andersonii foi detectada.
Número de cópias de conteúdo sxtA4 e STXS Foi determinado que a abundância de sxtA4 é relativamente semelhante entre as cepas e amostras ambientais testadas, com uma gama de 178-376 células” de cópias (Tabela 5). Isso apoia os resultados do Exemplo um acima em que 100-240 células” de cópias foram encontrados ao longo do crescimento da cepa ACSHO02 de Alexandrium catenella utilizando QgPCR. A toxicidade total equivalente de STX das três cepas de Alexandrium
104 / 155 catenella foi de 3,1-6,6 pg de células”' equivalente de STX (Tabela 5). Isso está dentro das espécies produtoras de STX, como cepas de A. minutum, A. catenella e A. tamarense (0.66-
9.8 pg de células? equivalente de STX), dependendo “do suprimento de nutrientes e crescimento da cultura, mas menor que cepas mais tóxicas, tais como Gymnodinium catenatum (26-28 pg de células* equivalente de STX) e Alexandrium ostenfeldii (até 217 pg de células* equivalente de STX).
SxtA4 , A. catenella e STXS no sudeste da Austrália Alexandrium catenella foi amostrado em três ocasiões nos - estuários do sudeste australiano ao longo deste período de estudo e, em cada caso, sxtAM4 foi detectada ( Tabela 4). Para o conjunto de amostras do rio Georges, a correlação entre cópias de sxtA4 L'* e da abundância de células 1º, como determinado por LSU rDNA, foi altamente significativa (Fig. 9). No ponto de coleta do rio Georges, abundâncias médias de 3150-26450 células L* foram registrados durante todo o período de amostragem de 5 dias com base na estimativa do ensaio LSU rDNA, e 7900-38000, com base na contagem de células no microscópio de dias selecionados. No último dia de amostragem, a variabilidade da contagem de células foi encontrada entre as amostras em triplicatas feitas no sítio, o que reflete falta de informação na distribuição de A. catenella. Apesar disso, a correlação entre cópias de sxtM4 L* e o número de células de Alexandrium catenella baseados em rRNA qPCR foi muito forte (rº=0.97, slope=0.0059, p<0.001), e o total de cargas STX em amostras de ostras tiradas durante esta semana foram 200 ug de STX equivalente kg de moluscos, abaixo do nível regulatório
105 / 155 para monitoramento de saúde pública (800 pg de STX equivalente kg" * de molusco), mas a maior das três amostras colhidas durante este estudo.
Em Wagonga Inlet, abundâncias médias de 30-288 células L* foram encontrados com base na estimativa do ensaio LSU rDNA qaPCR e 80-540 células L* com base na contagem de células em microscópio ao longo do período de amostragem (Figura 9). A correlação entre cópias de sxtA4 L'* e o número de células, tal .»O como calculado a partir do ensaio de LSU rDNA qPCR, foi menor i do que aquele das amostras do rio Georges (rº=0.70, inclinação= - 0.001, p=0.07). Isto pode refletir o fato de que duas destas amostras continham menos do que 110 células Lº*, e foram, portanto, no limite inferior de detecção confiável deste ensaio. Alternativamente, o coeficiente de correlação inferior deste conjunto de amostragem pode ser atribuída à presença de diferentes cepas de Alexandrium catenella que diferiam no número de cópias de sxtA.
Os métodos de detecção para STXS e espécies Alexandrium Geralmente, a enumeração de fitoplânctons formadores de HAB e suas toxinas para a indústria e para a pesquisa oceanográfica biológica depende da contagem de espécies em microscópio e métodos de detecção direta de toxinas. A quantificação de STXs é geralmente conduzida por bioensaio em ratos, HPLC instrumental, LC-EM ou imunoensaios baseados em anticorpos, tais como ensaios ELISA. HPLC é um processo demorado e caro, exigindo um laboratório de análises bem equipado e padrões puros de STX e seus inúmeros análogos.
106 / 155 Enquanto os métodos ELISA recentemente desenvolvidos têm de ultrapassar algumas destas desvantagens, eles não estão disponíveis para vários derivados comuns de STX, e tem problemas de reatividade cruzada, já que perfis de toxinas são frequentemente bastante complexas.
Métodos genéticos moleculares e baseados em anticorpos para identificação de espécies do fitoplâncton marinho e enumeração têm muitas vantagens quando comparado com a .«O contagem feita em microscópio e métodos de detecção direta de toxinas: a sua simplicidade, com uma exigência muíto menor para treinamento e experiência em relação a identificação taxonômica baseada em microscópio, eficiência de custo (reagentes qPCR geralmente custam menos que - 1 US$ por amostra), velocidade e potencial para automação (até 30 amostras podem ser executados em triplicata em menos de duas horas em uma máquina gPCR padrão utilizando placas de 96) . Máquinas de qPCR em tempo real têm diminuído substancialmente seu custo, nos últimos anos, e é possível utilizá-las com um treinamento básico em técnicas de biologia molecular.
Um limite de detecção fiável de -+-110 células Lº* de Alexandrium catenella é alcançável pelo método de qPCR aqui relatado. Os ensaios baseados em aqPCR para a detecção de Alexandriun podem ser mais sensíveis do que os métodos baseados em microscopia com baixa abundância de células e onde a espécie de interesse pode ser um componente minoritário do fitoplâncton. O método de câmara contagem de Sedgewick-Rafter, como é aplicado nos programas maioritários de controle de
107 / 155 fitoplâncton, é considerado como tendo um limite de detecção fiável de 1000 células Lº*. No entanto, isto depende do volume da amostra observado. No presente estudo, os níveis de detecção baixo de < 20 células 1º foram obtidos usando o método de câmara contagem de Sedgewick-Rafter, por filtração da amostra de tal modo que fosse observado um maior volume de amostra. O erro padrão de contagem baseada em microscopia é dependente do número de células observado, e aumenta com à diminuição do número de células. Para os métodos baseados em 40 genética molecular, o desvio-padrão associado com a contagem de células é independente da abundância de células para - abundância de células maiores do que o limite de detecção do ensaio. Métodos de identificação e enumeração de genética molecular têm relatado limiares de detecção da ordem de 10-100 células 1 de espécies Alexandrium utilizando sondas qPCR e FISH, dependendo do volume de água (tipicamente 1-8 1L) amostrados usando estes métodos. Como concentrações tão baixas quanto 200 células L?* de espécies Alexandrium têm sido associados com a absorção de STX em moluscos, a detecção 2O fiável das espécies a baixa abundância de células é uma importante vantagem dos métodos de enumeração qPCR em relação à enumeração do microscópio, tal como atualmente praticado na maior parte dos programas de monitoramento do fitoplâncton.
Enquanto muitas vantagens têm sido observadas em métodos de monitoramento baseados em genética molecular, os métodos atuais têm várias desvantagens. O qPCR para enumeração de espécies usando genes marcadores requer o uso de múltiplas sondas em habitats onde várias espécies de Alexandrium,
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Pyrodinium bahamense e Gymnodinium catenatum OCcorrer e produzem STXs.
Espécies não documentadas previamente em um habitat particular são ocasionalmente identificadas e elas podem não ser notadas se uma sonda adequada não estiver disponível para à sua identificação.
Além disso, a enumeração de certas espécies alvo requer investigação para cultura e determinação da toxicidade das espécies produtoras de STX locais, uma vez que isso pode variar entre as regiões.
Altas abundâncias de Alexandrium catenella em regiões nas quais esta espécie geralmente produz STXS nem sempre foram | correlacionados com STXS em moluscos, o que sugere que podem
- ocorrer diferenças a nível da população na produção de STXs.
Uma desvantagem final da maioria dos métodos de contagem baseado em qPCR é que os genes de RNA ribossômico, os quais são comummente utilizados para a detecção, já que as suas taxas de divergência relativamente rápida permitem a concepção de marcadores específicos da espécie, podem variar significativamente em número de cópias entre as cepas de algumas espécies de Alexandrium e, em alguns casos, durante o crescimento das espécies.
Isto pode ser devido à presença de pseudogenes instáveis de rDNA em algumas espécies Alexandrium e, possivelmente, à presença de moléculas de rDNA extra- cromossômicas.
O efeito desta variação é causar disparidades entre o número de genes e o número de células e, consequentemente, inconsistências entre a abundância estimatida baseada na microscopia e aquela baseada em qPCR.
Por esta razão, no presente estudo, 0 número de cópias de genes de LSU rDNA foi determinada em réplicas de três cepas de
109 / 155 A.catenella isoladas das águas locais, a fim de obter uma estimativa fiável do número de células com base no número de cópias de LSU rDNA.
O novo método aqui apresentado baseia-se na detecção direta de um gene (SXtA) envolvida na síntese de STXs. Por conseguinte, pode ser mais estritamente correlacionado com a produção de STX que com a abundância de quaisquer espécies particulares. Além disso, é consideravelmente mais rápido e .140 barato para detectar sxtA do que os instrumentos analíticos atuais utilizados. Utilizando o par de primers descritos, sxtA4 não foi amplificado a partir de duas espécies Alexandrium não produtoras de STX testadas, mas foi amplificado a partir de espécie Gymnodinium catenatum não tão comumente relatadas como produtoras de STX. Isto permite a utilização de um único ensaio para detectar simultaneamente vários gêneros produtores de STX diferentes, incluindo as potenciais espécies produtoras STX não previamente conhecidas a partir de um determinado sítio. No entanto, o ensaio também amplificou um produto a partir de uma cepa de Alexandrium tamarense ATCJ33 onde a produção de SIX não era esperada, espelhando descobertas no Exemplo um acima que esta cepa possuía sxtAl e sxtA4, e mostrando que este ensaio não pode, em uma pequena percentagem dos casos, ser indicativo da presença de STXS.
O nível de regulação da transcrição pode desempenhar um papel relativamente minoritário na expressão de vários genes de dinoflagelados, em comparação com a regulação em outros
110 / 155 organismos, já que os genes que são de regulação positiva esses têm sido relacionados com o aumento da abundância da transcrição por não mais do que aprox. 5 vezes, em comparação com os níveis durante o crescimento normal.
Isto levou à teoria de que a duplicação de cópias genômicas de genes altamente expressos em dinoflagelados pode funcionar como um meio de aumentar a sua transcrição.
Se isto fosse verdade, pode haver uma relação entre o número de cópias de sxtA célula? e a quantidade de STXS produzidas por uma cepa O particular.
Neste estudo, as espécies testadas tinham cotas celulares de STXs relativamente “semelhantes e nenhuma diferença significativa na sxtA célula.
Exemplo 3: Investigação da sequência de sxtA em espécies de finoflagelados produtores e não produtores de saxitoxina.
Objetivo Amplificar os genes e sequências envolvidas na síntese de saxitoxina (STX) em dinoflagelados que são conhecidos por -O produzir saxitoxina e aqueles que não são conhecidos por produzir STX.
Materiais e Métodos Cepas dinoflagelados foram cultivadas em meio GSe e mantidas numa câmara de cultura aàa 18 graus, e um ciclo de luz 12/12. O DNA foi extraído a partir de 20 mL de cultura em crescimento exponencial com a colheita por centrifugação com 3000 g durante 5 minutos, em seguida, usando o método do CTAB.
111 / 155 O molde de DNA foi amplificado usando PCR usando Advantage GC rich PCR polymerase (Clontech), que contém 10 % de BSA, num Thermo Cycler com as seguintes condições de PCR: um período inicial de 5 minutos de desnaturação 95ºC antes de 35 ciclos de (1) 30 segundos de desnaturação 94ºC, (2) 30s de recozimento (temperatura variável), e (3) extensão de 1-2 minutos a 72 ºC, com uma extensão final de 10 minutos à mesma temperatura.
Produtos de PCR foram excisadas em gel usando Promega Wizard SV Gel e PCR System Clean-Up (Promega), antes .O de sequenciamento direto com um ABI3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) usando primers como abaixo. aa «= errar a— Sxt00l F TGCAGCGMTGCTACTCCTACTAC (SEQ ID NO: 200) 57.1 Sxt002 R GGTCGTGGTCYAGGAAGGAG (SEQ ID NO: 201) 55.9 Espécies novamente investigadas para este estudo foram as espécies que produzem STX: Alexandrium tamarense, cepa CAWD121, e a espécie não produtora Alexandrium sp, cepa AAKTO1, Alexandrium sp, cepa AAKTO1, Amphidinium massartii CS- 259, Amphidinium mootonorum CAWDI61, Coolia monotis CAWD98, Gambierdiscus australes CAWD148, Prorocentrum lima CAWD, Protoceratium reticulatum CAWD, Gonyaulax spinifera CAWD.
Resultados Um gene de domínio sxtAl do tamanho correto foi identificado a partir de espécies produtores de saxitoxina Alexandrium tamarense cepa CAWDl21 (SEQ ID NO: 224), e uma presumida espécie produtora de saxitoxina Alexandrium
112 / 155 catenella, cepa ACNC50 (SEQ ID NOs: 225-226 mostra a sequência de domínio sxtAl de dois clones da cepa ACNC50). Foi determinada similaridade de 99% com o gene correspondente de Alexandrium catenella cepa ACSHO2.
Um gene para sxtAl (SEQ ID NO: 227), também foi amplificado a partir da Alexandrium cepa AAKTOl, que não foi previamente relatado para produzir saxitoxina. o Nenhum gene pode ser amplificado a partir de qualquer uma das espécies de dinoflagelados não produtores restantes. Ea Conclusão A presença de genes putativamente envolvidos na síntese de saxitoxina em dinoflagelados foi confirmada em todas as espécies que produzem saxitoxina. Neste estudo, foram encontradas em mais de uma cepa produtora que causou proliferação de algas nocivas (HAB) contendo saxitoxina na Nova Zelândia, isolado como CAWD1I21. Além disso, em uma O espécie de Alexandrium, cepa AAKTOl, intimamente relacionada com espécies que produzem saxitoxina, verificou-se possuir o gene sxtAl. Esta espécie não foi relatada anteriormente como produtora de saxitoxina, mas agora é sugerido o potencial para produzi-la em determinadas circunstâncias. Análises de toxina utilizando técnicas de detecção mais sensíveis podem ser necessárias a fim de verificar esta hipótese. Por exemplo, Negri et al (2003) relataram que a cepa ATBBOl de A. tamarense mostrou actividade STX quando testada com o ensaio saxiphilin, mas não tinha toxinas detectáveis quando testada com métodos
113 / 155 de HPLC (ver Negri, et ai (2003). "“Paralytic shellfish toxins are restricted to few species among Australia's taxonomic diversity of cultured microalgae”, 3. Phycol. 39(4), 663-667.
Nenhuma das espécies de outras ordens de dinoflagelados investigados neste estudo, não conhecidas para produzir saxitoxina e não intimamente relacionado à espécies produtoras de saxitoxina, apresentaram o gene sxtAl.
Exemplo 4: Alexandrium catenella de Opua Bay, Nova Zelândia, como monitorado por um ensaio qPCR baseado em sxtaA.
Objetivo Determinar se o número de cópias do gene sxtA envolvido na síntese de saxitoxina em dinoflagelados marinhos está correlacionado com uma contagem manual do número de células de Alexandrium catenella em amostras ambientais marinhos.
Métodos As amostras foram coletadas em Opua Bay, na região suldeste da Onapua Bay em Queen Charlotte Sound, Tlha do Sul, Nova Zelândia. Uma vez por semana durante 4 semanas (22/2/12 - 13/3/12), amostras em triplicatas de 500 ml de uma amostra integrada de 0-15m de profundidade da coluna de água foram retiradas e armazenadas a -80 ºC. Após o descongelamento, 200 ml de cada amostra foram filtrados através de um filtro Millipore de 0,45um.
O filtro foi lavado em -50 ul de água do mar para um tubo eppendorf, vórtex e centrifugada. O sedimento foi extraído
114 / 155 utilizando o kit Mobio DNA soil, de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi eluído duas vezes em 100 ul (o mesmo eluidor foi passado através do filtro duas vezes). O DNA foi concentrado em 20 ul de amostra com uma elevada precipitação de sal /etanol.
As sequências de bprimers eram SXtA4F 5" =CTGAGCAAGGCGTTCAATTC-3" (SEQ ID NO: 198) e SXtA4R 5 *=TACAGATMGGCCCTGTGARC-3'/ (SEQ ID NO: 199), resultando em um
2. O produto de 125 bp.
As Curvas padrão para sxtA4 foram construídas usando uma série de diluições de uma concentração conhecida do produto de PCR fresco, variando 5.7-5.7 x 10 É ng (n=6). As curvas padrão utilizando o produto de PCR foram utilizados para determinar a eficiência do ensaio, bem como para determinar o número de cópias. As moléculas de produto da PCR foram determinadas: (A x 6,022 x 10º) x (660 x B)* com A: concentração do produto de PCR, 6,022 x 10º: o número de Avogadro, 660: peso molecular -O médio por par de base e B: comprimento do produto de PCR.
O qPCR cíclico foi realizado em um Rotor Gene 3000 (Corbett Life Science), utilizando SSO Fast Evagreen supermix (Biorad). Os ensaios de qPCR foram realizadas num volume final de 20 pl que consiste em 10 pl de mistura Evagreen master (contendo corante de intercalação de DNA, tampão e Taq polimerase), 1 pl de molde de ADN, 0,5 nuM de cada primer, e 1 ul de BSA. Os ensaios de qPCR foram realizadas em triplicata com os seguintes ciclos: 95 ºC durante 10 s, e 35 repetições
115 / 155 de 95 ºC durante 15s e 60 ºC durante 30 s. A análise da curva de fusão foi realizada no final de cada ciclo de para confirmar a especificidade de amplificação, e os produtos de PCR seleccionados foram sequenciados.
Resultados O número de cópias de sxta4 L”* detectado foi encontrado para atingir um pico na terceira semana de amostragem e, em seguida, uma queda (Figura 10), semelhante à variação na -O abundância de células Alexandrium catenella. O número de cópias de sxta4 L'* nas amostras de triplicata de água foi encontrado ser significativamente correlacionada com a abundância de células L* de Alexandrium catenella (Figura 11, Rº = 0.86).
Conclusão O ensaio de qPCR quantitativo baseada no gene sxtA foi encontrado ser um método fiável para determinar o potencial para a presença saxitoxina em amostras de ambientes marinhos -O contendo Alexandrium catenella. A abundância de cópias do gene SXtA foi considerada ser significativamente correlacionada com a abundância de espécies de Alexandrium catenella. Exemplo 5: Amplificação das sequências sxtAl e sxtM e investigação da produção de saxitoxina e sxtA no clado 'não tóxico' do Grupo V para Alexandrium tamarense Sumário
116 / 155 As três espécies Alexandrium A. tamarense. A. fundyense e A. catenella incluem cepas que podem ser potentes produtores da neurotoxina saxitoxina (STX) e seus análogos, os agentes causadores da paralisia devido ao envenenamento por molusco (PSP). Estas três espécies são morfologicamente muito semelhantes, diferindo umas das outras apenas quanto à presença de um poro ventral, ou na capacidade de formar cadeias. A adequação desses caracteres morfológicos para delimitação de espécies tem sido amplamenta debatida. O clado O distintivo deste complexo de espécies, Grupo V, clado da Tasmânia, é encontrada no sul da Austrália, e, ocasionalmente, - ocorre em proporções exponenciais. Este clado tem sido considerado não tóxico, e nenhuma toxina PSP foi encontrada em moluscos seguindo o afloramento desta espécie. No presente estudo, uma cepa da Tasmânia de Alexandrium tamarense, Grupo V foi identificada que produz STX e possui o gene sxtA, que está putativamente envolvidas na produção STX. O perfil da toxina foi determinado e é não usual, incluindo uma elevada proporção de GTX5 e uma pequena quantidade de STX, e difere dquela deco- —0 ocorrência de A.catenella (Grupo IV). Um afloramento putativo de A. tamarense que ocorreu em outubro de 2010, e a descoberta posterior de STX em ostras de rocha de Sydney (Saccostrea glomerata), pode sugerir que algumas cepas naturais desta espécie poderiam produzir STX.
Introdução Três espécies comuns e propagadas do gênero dinoflagelado Alexandrium, A. catenella, A. tamarense e A. fundyense, possuem características morfológicas, por vezes sobrepostas,
117 / 155 muito semelhantes (Balech, 1995; Fukuyo, 1985; Steidinger, 1990). Este clado é considerado compor um "complexo de espécie", uma vez que é composto por cinco grupos geneticamente distintos (John et al., 2003; Orr et al., 2011; Scholin et al., 1994; Lilly et al., 2007). As características que são utilizadas para a identificação destas espécies incluem a forma da célula, forma do complexo do poro apical (APC), presença (A. tamarense) ou ausência (A. catenella / A. fundyense) de um poro ventral na primeira placa apical, e se as células mostram uma tendência para a formação da cadeia (A. catenella) ou não (A. tamarense / A. fundyense) (Balech, 1995). Também foram observadas algumas formas com morfologias intermediárias entre estas três espécies (Cembella et al., 1988; Gayoso and Fulco, 2006; Orlova et al., 2007; Sako et al., 1990; Orr et al., 2011).
Em contraste com a informação baseada na morfologia, os muitos estudos filogenéticos das espécies Alexandrium, com base em regiões do operon de rRNA, incluíndo o SSU, ITS/5,8s, O e os genes LSU, têm clados claramente distinguidos (Grupos I- V) a partir de um outro John et al., 2003; Scholin et al., 1994); (Kim and Sako, 2005; Leaw et al., 2005; Lilly et al., 2007; Montresor et al., 2004; Rogers et al., 2006; Orr et al., 2011). Com base em um levantamento da diversidade de dinoflagelado e sua relação com sequências de rDNA, Litaker et al., (2007) sugeriu que um marcador conservativo de "nível de espécie" em dinoflagelados pode ser considerada uma diferença de 4% (= distância genética não corrigida de 0,04) em regiões alinhadas de ITS1/5.8S/ITS2 rDNA. Estes clados de Alexandrium
118 / 155 tamarense/catenella/fundyense diferem um do outro por 13-18 % em sequências alinhadas de ITS1/5.8S/ITS2 (Orr et al., 2011) e, portanto, a um nível 3-4 vezes maior que em alguma outra espécie de dinoflagelados.
A identificação de cepas de Alexandrium Alexandrium tamarense/catenella/fundyense para um clado genético particular (Grupos I-V) tem sido considerado mais preditiva da sua propensão para a produção de STX que identificações de espécies com base na morfologia (Scholin et al., 1994; John et al., 2003; Kim and Sako, 2005; Leaw et al., 2005; Montresor et al., 2004; Lilly et al., 2007; Rogers et al., 2006). Todas às cepas. dos Grupos I e IV analisadas até à data produzem quantidades variadas de STX, com perfis diferentes de toxina (Tabela 7, Anderson et ai., 1994), enquanto nenhuma cepa do Grupo II têm sido relatados para produzir STX (John et al., 2003). A toxicidade das cepas dos grupos III e V não é clara. Elas têm sido geralmente consideradas não tóxicas (Lilly et al., 2007; Scholin et al., 1994; Genovesi et al., 2011; Bolch “O and de Salas, 2007; Hallegraeff et al., 1991). Uma única cepa com uma sequência genética de localizada no Grupo 111, CCMP1l16, tem sido relatado como sendo tóxica (Penna e Magnani, 1999). Embora as cepas do Grupo V, em geral, tenham sido consideradas como não tóxicas (Hallegraeff et al., 1991; Bolch and de Salas, 2007), tem sido sugerido que níveis muito baixos de STXS podem ser produzidos pela cepa ATBBO01/CS298 de Bell Bay, Tasmânia (Scholin et al., 1994; Negri et al., 2003). O perfil de toxina não foi determinado.
119 / 155
Em águas marinhas australianas, as espécies Alexandrium A, catenella e A. minutum produzem STX, e têm ocorrido em proporções exponenciais, resultando na absorção de STX em moluscos (Hallegraeff et al., 1988; Hallegraeff et al., 1991; Bolch and de Salas, 2007). Do complexo de espécies A. tamarense, dois grupos têm sido consistentemente encontrados na região: A. tamarense do Grupo V e A. catenella do Grupo IV (Bolch and de Salas, 2007). Nenhum outro grupo deste complexo de espécies tem sido encontrado, durante investigações nos io últimos 20 anos (Hallegraeff et al., 1988; Hallegraeff et al., 1991; Bolch e de Salas, 2007). Várias teorias têm sido propostas quanto às origens destas cepas do 'complexo de espécies' de A. tamarense em águas marinhas da Austrália, incluindo a sua introdução por água de lastro (Grupo IV), ou à 15 sua presença a longo prazo na região (Grupo V) (Bolch and de
Salas, 2007). Afloramentos das espécies A.catenella (Grupo IV), A. minutum Gymnodinium catenatum têm sido associados com a absorção de STX em vetores de moluscos em múltiplas ocasiões, em locais do New South Wales, sul da Austrália, Victoria e Tasmânia, Austrália (revisto em Bolch e de Salas, 2007). Vetores potenciais de moluscos que foram investigadas para a presença de STX, seja experimentalmente ou no curso do monitoramento, em águas australianas são Ostras de Rochas de Sydney (Saccostrea glomerata), Ostras do Pacífico (Crassostrea gigas) e Pearl Oysters Pinctada imbricata (Murray et al,, 2009). Afloramentos de A. tamarense do Grupo V ocorreram de forma intermitente por toda a região, mas não foram relatados
120 / 155 como causadoras da absorção de STX em marisco (Hallegraeff et al., 1991). No curso da investigação das bases genéticas da produção &STX, os genes sxtAl e sxtA4 para os domínios putativos de sxtA foram descobertos em três cepas de A. tamarense Grupo V (Stuken et al., 2011). As cepas foram novamente investigadas para determinar as suas afinidades genéticas e seu potencial para a produção de STX. o Este estudo descreve o perfil de toxina, morfologia e filogenia molecular de uma cepa de A. tamarense que foi determinada como produtora de STX.
Além disso, uma constatação da presença de STX em amostras de S. glomerata de New South Wales, em 2010, seguindo um afloramento putativo desta espécie, é relatada.
Materiais e Métodos Manutenção da cultura o As culturas de dinoflagelados foram mantidas em meio GSe a 18 ºC.
Luz foi fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas (Crompton Light), com fluxo de fótons de 60-100 upmol fóton m-2 s-l, ciclo de 12/12 horas escuro/ luz.
As cepas utilizadas foram ATCJ33, isolado de Cape Jaffa, sul da Austrália, Austrália (-36.94,139.70); ATNWBOl, isolada de North West Bay, Tasmânia, Austrália (-43.08,147.31) e ATEBOl, isolada da Emu Bay, Burnie, Tasmânia, Austrália (-41.05,145.91), por M de Salas.
Culturas em massa para determinação da toxina foram inoculados no mesmo dia em frascos Erlenmeyer de 2 L e foram
121 / 155 colhidas em conjunto, durante fase posterior logarítmica ou fase inicial estacionária, para a extração de toxinas. A abundância de células foi determinada pela contagem de 1 ml subamostras utilizando uma câmara de contagem Sedgewick Rafter sob um microscópio Leica DMIL de luz invertida. As culturas foram centrifugadas e imediatamente congeladas a -20 º* C antes da análise por HPLC ou da extracção de DNA. As pérolasOs pellets de células para análise de HPLC continham 1,25-2,25 x 106 células.
O LM e MEV Forma e tamanho celular foram determinados utilizando um microscópio Leica DMIL de luz invertida claro com 40 ou 100 x de ampliação. Para a Microscopia Electrônica de Varredura, foram utilizados dois métodos, de modo a manter ou a membrana celular intacta Ou para expô-la. As culturas foram fixadas em tetróxido de ósmio a 2% durante 10 minutos, ou em glutaraldeído a 4 % durante 1-2 horas. Elas foram colocados em uma lamela revestido com polilisina ou em filtros Millipore 5
2.0 um, enxaguadas em água destilada, e desidratadas numa série de concentrações crescentes de etanol (30, 50, 70, 90, 100%), seguido por secagem de ponto crítico (Baltec). Quando completamente seco, eles foram encaixados em suportes e revestidos por bombardeamento com ouro. Eles foram observados usando um Microscópio Eletrônico de Varredura Zeiss Plus Ultra Field Emission (FESEM) da Universidade de Sydney (Centro Australiano de Microscopia e Microanálise): 5-15 kv. Extração de ADN e PCR
122 / 155 O DNA foi extraído a partir dos pellets celulares usando o método de CTAB, com uma precipitação adicional de DNA de um dia para outro a -20 º C. A qualidade e a quantidade de DNA foi determinada utilizando um Nanodrop (Thermoscientific), e por amplificação de um gene de controle de dinoflagelado (eytb), de acordo com os protocolos dos (Lin et al., 2009), utilizando o par iniciador 4f e 6r que amplificam um fragmento de 440 pb.
Sequências parciais dos genes LSU e SSU de rRNA e os genes completos 5.8s/ITS foram amplificadas utilizando os primers publicados anteriormente: 8SS3, SS5 (Medlin et al, 1988.), DIR, D3b (Scholin et al, 1994.) E Alex5.8s (Orr et al., 2011). Condições cíclicas típicas para PCRs consistiram de uma etapa de desnaturação inicial a 94 * C durante 2 min, seguido por 35 ciclos de 94 * C durante 20 s, 56 ºC durante 30 s e 72º C€ durante 1 min, seguido de uma etapa final de extensão de 7 min. Os produtos da PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose e corados com brometo de etídio e visualizados 20º por transiluminação UV. Os fragmentos à serem sequenciados foram excisados a partir do gel, o DNA foi purificado utilizando um kit de purificação em gel Bioline (Bioline, EUA), eluído em 2 x 10 pl de tampão de eluição, e a concentração verificada pelo uso de um Nanodrop.
Aproximadamente 40 ng de produto de PCR foram então utilizados para a sequenciação direta com os mesmos primers utilizados para a amplificação inicial do produto.
Determinação de toxina
123 / 155 Peletes de células de dinoflagelados foram testadas utilizando HPLC, de acordo com o método oficial AOAC 2005.06 para toxinas responsáveis pela paralisia por envenenamento por moluscos em moluscos no Instituto Cawthron, Nova Zelândia.
Um modificador de matriz, como descrito no protocolo original não foi utilizado, em vez disso recuperações médias de pico foram usadas para cada composto separado.
A análise por HPLC foi realizada num sistema Waters Acquity UPLC (Waters), acoplado a um detector Waters Acquity FLR.
A separação foi conseguida com uma coluna Waters Acquity BEH C18 mM 1,7 um 2,1 x 50 mm a 30 ºC, eluída a 0,2 mL min -1. As fases móveis foram formiato de amônio 0,1 M (A) e formiato de amônio 0,1 M em 5 % de acetonitrila (B), ambos a pH 6. O gradiente consistiu em 100 % de A durante 0,5 min, um gradiente linear até 80% de B ào longo de 3,5 min, em seguida, voltando às condições iniciais durante 0,1 minutos e mantido durante 1,9 min.
O detector de fluorescência tinha excitação ajustada para 340 nm e emissão a 395 nm.
Padrões analíticos para os análogos de STX foram obtidos junto ao Conselho Nacional de Pesquisa, no Canadá.
O limite de detecção do HPLC das culturas celulares foi considerado 0,1 pg células -1 para NEO e STX, 0,2 pg células - 1 para GTX1/4, GTX6 (B2) e GTX5 (Bl), O,5 pg células -1 para C1,2 e <0,3 pg célula -1 para a análogos C3,4. As análises filogenéticas Sequências do novo Grupo V Alexandrium tamarense que foram gerados por este estudo; (1) 188 (Pequeno Sub Unidade) rDNA, (2) Região Interna Transcrita (RIT) 1 e 2 mais 5.88 rDNA, e (3) 28S (Grande Sub Unidade) rDNA, foram concatenados pãra a
124 / 155 construção de uma região com 2821 caracteres de operon de rDNA para cepas ATNWBOl (números de acesso no GenBank JQ991015, JR991016, JQ991017). Além disso, novas sequências LSU de rDNA foram geradas a partir de cepas ATCJ33 (874bp) e ATEBO1l (678 bp comprimento, números de acesso no GenBank <JQ991018 e JÇ991019). Este foi alinhado em conjunto com todos os ortólogos a partir dos dados de sequências do Grupo V na base de dados de nucleotídeos NCBInr http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/ (a partir de 10.2010 /), e um grupo externo A. affine.
O modelo MAFFTV6 Q- INS -I modelo (Hofacker et al., 2002; Katoh and Ton, 2008; Kiryu et al., 2007), considerando a estrutura secundária de RNA, foi usado para alinhar o conjunto de dados (parâmetros padrões utilizado) e o alinhamento resultante verificado manualmente usando MacClado v4.07 (Madison and Madison, 1992). O alinhamento foi, então, inferido com Gblocks vO0.91b (Castresana, 2000), sob os parâmetros menos rigorosos, para excluir posições mal alinhadas e regiões divergentes da inferência filogenética.
MODELTEST (Posada and Crandall, 1998) estabeleceu o modelo ótimo de evolução de nucleotídeos, para todos os alinhamentos, GTR foi preferido para ambos os Criterions de informação Bayesiana e Akaike (AIC e BIC). Análises de máxima verossimilhança (MV) foram realizados com RAXML -VI- HPC v7.2.6, modelo GTRCAT com 25 categorias de taxas (Stamatakis, 2006). A topologia mais provável foi determinada a partir de 100 pesquisas separadas e análises bootstrap foram realizadas com o programa de inicialização 100 pseudorréplicas.
Inferência Bayesiana foram realizadas utilizando Phylobayes v3.2e (Lartillot et al, 2007; Lartillot e Philippe, 2004) sob o modelo de substituição de GTRCAT com
125 / 155 um número livre de categorias de mistura e uma variação discreta de cruzamento de sítio em quatro categorias.
As árvores foram inferidas quando a maior diferença máxima entre as bipartições (cadeias) era < 0,1. Todo o modelo de estimação e de análises filogenéticas foram realizadas no Bioportal livremente disponível (Kumar et al., 2009), na Universidade de Oslo (http://www.bioportal.uiío.no/). Coleta, contagem e identificação de fitoplânctons e moluscos O Fitoplâncton foi coletado como parte do Programa NSW de monitoramento quinzenal de Moluscos no Rio Hastings, New South Wales, Austrália (-31.42 E, 152.87 S) ao longo de duas semanas consecutivas, em Outubro e Novembro de 2010, 25/10/10 e 9/11/10. Na segunda semana, Ostras de Rocha de Sydney (Saccostrea glomerata) foram coletadas a partir de fazendas e testadas usando um teste Jellett PSP (Jellett Teste Rápido Ltd, Canadá), de acordo com as instruções do fabricante.
Para a contagem das amostras do frasco, as células de .20 —fitoplâncton em 500 ml de amostras conservadas em Lugol foram concentrados por filtração gravitacional assistida em membrana em filtros de éster de celulose de 5 um (Advantec) antes da lavagem em 4 ml e a contagem.
As espécies Alexandrium foram identificadas e contadas usando uma célula de Sedgewick Rafter e microscópio Zeiss Axiolab equipado com óptica de contraste de fase.
As espécies foram identificadas pelo Dr.
S.
Brett, que identificou fitoplâncton nocivo, como parte do Programa de NSW de Moluscos desde 2003. As espécies Alexandrium ocorrem geralmente em águas de NSW, sendo as espécies mais comunmente
126 / 155 identificadas A. catenella e A. pseudogonyaulax.
O número de células contadas variou entre as amostras, dependendo da abundância de Alexandrium, e taxas de erros padrão foram calculados usando a equação: Erro = 2/V n, onde n é o número de células observadas na amostra.
Resultados Microscopia Eletrônica de Varredura e de Luz.
Células de ATNWBOl foram arredondados, 25 - 45 nm de comprimento (7 = 34,2, = 20), 27 - 40 um de largura (p = 33,6, n = 20) (fig. 12, AB). As células apresentaram-se quase sempre únicas.
Foram observados cadeias de duas espécies de células.
A primeira placa é tipo apical estendido pára o complexo do poro apical e continha um poro pequeno, o poro ventral (Fig. 12 C). A placa de poro apical (Po) tinha uma forma característica de vírgula, rodeada por pequenos poros marginais (Fig. 12E). Ocasionalmente, foram observadas células com um poro na placa sulcamento posterior (Fig. 12 F). Na maioria das células faltava um poro na placa de sulcamento posterior.
As células das culturas ATCJ33 (Fig. 13 A-D), ATEBO1 (Fig. 13, E, F, H) e ATBBOl (Figura 13 G) eram do tipo arredondadas.
As células eram em sua maioria simples, ocasionalmente, com cadeias de 2 células (Fig. 13 A). Células de ATCJ33 possuíam 23-38 pm de comprimento (py = 30.6, n = 20), 23 - 38 um de largura (py = 29.5, n = 20), células de ATEBOl 25-40 m de comprimento (pn = 33.5, n = 20), 23 - 35 pm de largura (py = 31,6, n = 20). A primeira placa apical era alargada para
127 / 155 o poro apical e continha uma poro ventral (Fig. 13 B, D, H). A chapa mostrou uma poro apical em forma de vírgula. (Fig. 13 C, G, H). A análise filogenética As análises filogenéticas, incluindo às novas sequências de rDNA (Fig. 14, Fig. 16.) , o SSU de rDNA, as sequências parciais ITS/5.8s LSU rDNA da produção de toxina cepa ATNWBOl e as sequências LSU das duas cepas não - tóxicas, ATCJI33 e ATEBOl , mostram que todos estes formam um clado bem suportado ( 1.00/100 , para suporte PP / B8 ), juntamente com outras cepas do Grupo V. A.tamarense. Com base no comprimento total do rDNA, nenhuma diferença pode ser observada neste clado, observando variadas regiões ITS.
Comparação de sxtAl e sxtA4 domínios de genes sxtA em cepas O teor de sequências de nucleótidos para os dois domínios da sxtA em cepas de A. tamarense Grupo 5 foi comparada, esta última foi anteriormente sequenciada (Stuken et al., 2011). A
2.0 sequência de 440 pb do domínio sxtA4 mostrou que a cepa ATNWBO1l diferia das outras duas cepas do Grupo 5 A. tamarense analisados, ATEBO1l e ATCJ33 e, em apenas 2 nucleótidos (99.5 % de identidade de sequência) . Em contraste, estas três cepas apresentaram 89-98 % de identidade de sequência com estes genes de outras espécies de Alexandrium e Gymnodinium e catenatum. Numa comparação de uma região de 450 pb do domínio SxtAl, cepa ATNWBOl difere das outras duas cepas do Grupo 5 por 2-2.5 % (97.5-98 % de identidade de sequência), em comparação com uma identidade de sequência de 70-93 % para
128 / 155 outras sequências de Alexandrium e Gymnodinium catenatum de domínio sxtAl. Toxinas Das três cepas de A. tamarense, Grupo V, cerca de 1,5 - 2,2 x 10º células foram testadas quanto à toxicidade utilizando HPLC. Duas cepas, ATCJ33 e ATEBOl, tinham perfis negativos, sem toxinas detectáveis. Uma cepa, ATNWBO1, mostrou resultados positivos com um perfil que consiste principalmente de GTX5, com alguma STX, Cl, 2 e deSTX (Fig. 15, Tabela 7), e uma quota de células de 15,3 fmol celula. Amostras ambientais Células Alexandrium foram detectadas em níveis de 350 células. 1º em amostras de controle de rotina recolhidos a partir do rio Hastings em 25/10/10 (Tabela 6). Testes Jellet realizados posteriormente em amostras de ostras coletadas, no mesmo lugar em 9/11/10 foram positivos para toxinas PSP. As células Alexandrium, das amostras, eram células individuais e tinham forma geralmente arredondada. As células possuiam 35 um de comprimento e 32-35 mM de largura. Análises do Alexandrium theca revelou um poro ventral 1 'prato, uma placa de 1' de forma e tamanho de A. tamarense, e a ausência de uma poro de ligando na APC.
Das espécies de Alexandrium observadas em águas australianas, a forma e tamanho das células, a forma da 1 'da placa, a presença da poro ventral na 1' placa, e a forma da APC, aparecem como os mais consistentes com Alexandrium
129 / 155 tamarense.
Algumas culturas foram estabelecidas a partir deste evento de afloramento; no entanto, as sequências de perfis moleculares e de toxina não puderam ser confirmadas.
Tabela 6: Resultados para o monitoramento de toxicidade do fitoplancton e das ostras, Rio Hastings. is or rr Resultado do teste Jellet em Sítio Espécie Cel/L Data amostras de ostras Rio Alexandrium Hastings tomarense 350 25/10/2010 Negativo Alexandrium tomarense 350 09/11/2010 Positivo (PSP)
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134 / 155 Discussão Em geral, entre as cepas das espécies tóxicas do gênero Alexandrium, o perfil de toxina parece permanecer largamente constante ao longo do tempo (Cembella e Destombe, 1996), para além da situação de esgotamento extrema de nutrientes (Boczar et al., 1988). Em contraste, a quantidade de toxina produzida (quota de células) foi encontrada variando ao longo do tempo. Enquanto perfis de toxina parecem ser estáveis em uma cepa, a relação entre um perfil de toxina particular e a identificação de uma cepa de um grupo genético particular (IV) deste complexo de espécies não é clara. Uma variação considerável em perfis de toxina tem sido encontrada entre cepas de cada grupo estudado (Tabela 7).
Este estudo é o primeiro relato do perfil de toxina de uma cepa de Alexandrium tamarense, Grupo V. O estudo mostra que, com base nas características morfológicas, tais como a presença do poro ventral, e longas sequências de genes rDNA, incluindo a variável ITS1 / 5.8s/ITS2 regiões, a cepa ATNWBO1l -2O era um membro do grupo V. Anteriormente, as cepas deste grupo foram testados quanto à toxicidade por meio de HPLC e verificou- não tóxico (Hallegraeff et ai, 1991, Salas et al, 2001 , Bolch e De Salas, 2007) . Negri et al (2003) relataram que à cepa A. tamarense , ATBBOl STX mostrou atividade quando testado com o ensaio saxiphilin , mas não tinha toxinas detectáveis quando testada por métodos de HPLC. No mesmo estudo, uma cultura que havia sido identificada como A.tamarense de águas australianas (cepa ATTRAO3) foi encontrada para produzir STX (Negri et al. , 2003). A cepa
135 / 155 ATTRAO3 posteriormente morreu sem verificação de sua identidade, e por isso é claro que sem a identificação da espécie ou grupo por esta cepa representados. Ele pode ter sido derivado de um cisto introduzido, uma vez que foi isolado como um cisto de um porto de transporte utilizado para a exportação (Bolch e de Salas, 2007). Três cepas do Japão, incluindo At304, isoladas em Mikawa Bay, Japão, foram determinados como membros do Grupo V na .-O análise filogenética (Fig. 14). Este é o primeiro relatório de uma cepa Grupo V presente na região noroeste do Pacífico, como foi previamente pensado para ser confinada ao sul da Austrália (Bolch e Salas de 2007). A toxicidade das cepas do Japão não foi determinada, e precisa ser examinada.
A cepa ATNWBO1 tinha uma cota célular de STX dentro da gama detectável pelo método padrão HPLC (15,3 fmol célula -1 Tabela 7). Isto é semelhante ao contingente de toxína relatada para muitas cepas produtoras de cepas STX de espécies complexas (Tabela 7, 3,5-328 fmol célula*, 0,66 - 9,8 pg STX equivalente célula**). O perfil de toxina desta cepa era relativamente raro, como comumente GTX5 não tem sido relatado para ser uma parte importante do perfil da toxina de cepas de Alexandrium tamarense complexo de espécies (Tabela 7. Anderson et al, 1994), Em geral, as cepas de Alexandrium catenella (Grupo IV ), a fonte mais comum de PSTs em mariscos em Nova Gales do Sul, continham altas proporções de Cl / 2 e GTX1 / 4 como componentes principais ( Murray et al , 2011; Negri et al 2003; Hallegraeff et al , 1991). GTX5 foi encontrado para ser
136 / 155 um componente importante de uma cepa de Alexandrium tamarense Grupo I do Chile, (33,7%, Aguilera - Belmonte, et al , 2011.) , e duas cepas de Alexandrium catenella (Grupo IV) da França (44 = 46% , Lilly et al. , 2002).
Não foram feitas culturas da cepa de A. tamarense identificada a partir da amostra do Rio Hastings, e sequências moleculares não foram determinadas, desta forma não é possível identificar definitivamente como A. tamarense grupo V. Foi O reaizado um monitoramento quinzenal do fitoplâncton em 69 lugares, 32 estuários em Nova Gales do Sul nos últimos 7 anos. Alexandrium catenella foi identificado em oito ocasiões de amostragem em 2010 e 2011. Em 7 delas, as toxinas PSP foram encontradas em ostras de amostras de áreas de colheita de Ostras vizinhas , utilizando o teste PSP Jellet (NSW Food Authority, dados não publicados). Alexandrium tamarense foi identificado a partir de 4 amostras em 2010 e 2011. A amostra do rio Hastings é o primeiro relatório que associa a toxicidade PSP em ostras australianos. Os análogos produzidos por Alexandrium tamarense Grupo V, em particular, a elevada proporção de GTX5 tem uma baixa toxicidade equivalente, quando comparados com os análogos mais tóxicos, tais como STX, e estima-se ser de cerca de 10% tão tóxico como a STX (oshima, 1995). Esta baixa toxicidade equivalente de STX pode explicar por que este é o primeiro relatório de um incidente de toxicidade de crustáceos nesta região que está supostamente ligado a um afloramento desta espécie. Além disso, são necessárias amostragem da população de Alexandrium tamarense Grupo V, nas águas costeiras de Nova Gales do Sul, a fim de
137 / 155 verificar se as populações locais podem realmente produzir toxinas.
As três cepas de A. tamarense têm sido encontradas por possuir o gene SsxtA (Stuken et al., 2011). Verificou-se que os genes sxtA estavam estreitamente relacionados uns aos outros em todas as cepas do Grupo V (0.5 - 2.5% de diferenças em sequências alinhadas para domínios sxtAl e sxtÃ4). A presença ou ausência destes genes nestas amostras, por conseguinte, .40O parece não estar relacionado com a produção de toxina.
Diferenças no crescimento e produção de toxinas na espécie Alexandrium catenella, Alexandrium tamarense e Alexandrium minutum foram relacionadas com as condições ambientais da cultura, tais como salinidade, luz e nutrientes, e fase de crescimento da cultura (Hamasakií et al. de 2001, Hu et al, 2006;. Lippemeier et al, 2003;Anderson et al, 1990;. Grzebyk et al, 2003). No presente estudo, cada uma das três cepas de A. tamarense foi cultivada sob condições idênticas de luz, nos mesmos meios de comunicação e de água do mar, e em seguida foram inoculadas e colhidas nos mesmos dias.
Assim, parece improvável que a falta de toxicidade encontrados nas outras duas cepas tamarense Alexandrium Grupo V é o resultado de diferenças nas condições ambientais que promovem a expressão diferencial de produção de STX.
Algumas cepas cultivadas de Alexandrium podem perder toxicidade ao longo do tempo na cultura, por exemplo, em Alexandrium minutum (reportado como A. lusitanicum em Martins
138 / 155 et al., 2004). Isto foi inicialmente pensado para ser relacionado com a exposição a antibióticos, como as bactérias cocultivadas e simbióticas demonstraram desempenhar um papel na mediação da produção de toxinas de espécies Alexandrium (Ho et al., 2006). No presente estudo, as culturas do Grupo V contêm comunidades bacterianas misturadas em linha com as bactérias da água do mar no local de isolamento, e nenhuma delas tinha sido exposta a antibióticos.
Experiências de acoplamento descobriram que os subclones de uma cepa clonal tóxica de Alexandrium tamarense, (Grupo IV), podem ser não- tóxicos (Cho et al., 2008). As características não tóxicas de uma cepa de A. tamarense, um subclone não tóxico axênico de uma cepa tóxica, foram confirmados no attomole por nível celular. Três de nove subclones tóxicos desta mesma cepa se tornou não tóxico durante um período relativamente curto de tempo (4-6 anos), enquanto que os outros subclones tóxicos mantiveram a sua toxicidade e os subclones não tóxicos permaneceu não tóxico (Cho et ai . , 2008).
Altos níveis de diferenças genéticas de população foram encontrados dentro da espécie Alexandrium catenella Grupo IV (Masseret et al., 2009), Alexandrium tamarense Grupo [ (Nagai et al., 2007), (Alpermann et al., 2009), A. fundyense grupo IT (Erdner et al., 2011) e A minutum (McCauley et al., 2009), utilizando marcadores microssatélites. Isto, em combinação com os resultados de diferentes cepas, com a produção de toxina após experiências de acasalamento intra-
139 / 155 específicas (Cho et al., 2008), sugere que as diferenças a nível da população significativas na produção de toxina pode também existir em A. tamarense (Grupo V). Estudos adicionais utilizando marcadores microssatélites em várias culturas clonais desta cepa podem ajudar a determinar se a produção da toxina é restrita a uma determinada população da espécie, que pode permitir a concepção de ferramentas genéticas preditivos para a identificação desta população. Referências Aguilera-Belmonte, A., Inostroza, I., Franco, J.M., RiobÃ, P., Gomez, P.I., 2011. The growth, toxicity and genetic characterization of seven cepas of Alexandrium catenella (Whedon and Kofoid) Balech 1985 (Dinophyceae) isolated during the 2009 summer outbreak in southern Chile. Harmful Algae. In Press. Alpermann, T.J., Beszteri, B., John, U., Tillmann, U., Cembella, A.D., 2009. Implications of life history transitions
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Exemplo 6: As reações de qPCR para a detecção de sxtM e discernir entre cepas tóxicas e não tóxicas de Alexandrium minutum.
Materiais e métodos Soluções de 10 pl ou 20 pl de qPCR foram reagidas em um sistema Roche LightCyclerêe 480 com placa em branco de 96 poços. Cada reação continha 5 ou 10 ul do LightCycler& 480 SYBR Green I Mestre, 125 nM de cada iniciador (sxt072 e sxt073) e do molde (Alexandrium CDNA ou gDNA). As reações —420 foram realizadas em duplicata. As curvas padrão e controles não molde foram incluídos em cada placa. As curvas padrão foram geradas com diluições sequenciadas de 10x de uma amostra de gel purificado PCR purificado amplicon gerado a partir da cepa CCMP113 com iniciadores sxt007 & sxt008 (PCR para obter como produto de amplificação, tal como descrito em Stuken et ai. De 2011, PlosOne). Os parâmetros do ciclo do qPCR foram; Início quente: 1x (95 º C, 1l0min); ampliação: 45x (94 * C; 10s, 64 º C, 208, 72 º* C, 108, Única aquisição; curva de fusão: 1x (95 º C, 58; 65 º C, Imin, até 97 º C medições
151 / 155 contínuas); Resfriamento:. 1x (40 * C, 10s), As análises de ponto de passagem e de curva de fusão foram realizadas usando o software fornecido pela Roche.
Os primers utilizados qPCR para a detecção de sSxtA nestas experiências foram os seguintes: sxt072 CTTGCCCGCCATATGTGCTT (SEQ ID NO: 228) sxt073 GCCCGGCGTAGATGATGTTG (SEQ ID NO: 229) o Resultados Espécies Cepas SXT-síntese? Resultados Alexandrium 1022 Rance Sob investigação pico duplo minutum Alexandrium Sob 771 Penzé pico duplo minutum investigação Alexandrium pico sim tamarense ATNWBO1 simples Alexandrium pico ATCJI33 não tamareênse simples Alexandrium pico ATEBO1l não tamarense simples Alexandrium pico ACTRA sim catenella simples Alexandrium pico ACCCO1 sim catenella simples Alexandrium CCMP2222 não *indefinido andersonii
152 / 155 Alexandrium CCMP2082 não *indefinido insuetum Alexandrium CCMP112 não *indefinido affine Alexandrium nenhuma PA8V não affine amplificação Alexandrium pico CCMP113 sim minutum simples Alexandrium pico AL24V sim . minutum simples Alexandrium pico Min3 sim minutum simples Alexandrium VGO650 não pico duplo minutum Alexandrium VGO651 não pico duplo minutum Alexandrium pico AL10C sim minutum simples Alexandrium pico CCMP1493 sim catenella simples Alexandrium pico CCMP1719 sim fundyense simples Alexandrium pico MDQ1096 sim fundyense simples Sequências de cepas produtoras de saxitoxina foram geradas como se segue:
153 / 155 Alexandrium minutum CCMP113 sxtA4 gDNA consenso (SEQ ID NO: 230) Alexandrium minutum CCMP113 sxtA4 CDNA consenso (SEQ ID NO: 231)
Alexandrium minutum AL24V sxtA4 gDNA consenso (SEQ ID NO: 232) Alexandrium minutum AL24V sxtA4 cDNA consenso (SEQ ID NO: 233) Alexandrium minutum Min3 sxtA4 gDNA consenso (SEQ ID NO: 234) Alexandrium minutum Min3 sxtA4 cDNA consenso (SEQ ID NO: 235) Alexandrium minutum VGO650 sxtA4 gDNA consenso (SEQ ID NO:
-o 236)
Alexandrium minutum VGO651 sxtA4 gDNA consenso (SEQ ID NO: 237) Alexandrium minutum VGO651 sxtA4 CcDNA consenso (SEQ ID NO: 238)
Alexandrium minutum ALI1O0C sxtA4 CcDNA consenso (SEQ ID NO: 239) Alexandrium catenella CCMP1493 sxtAÃ4 cDNA consenso (SEQ ID NO: 240)
Alexandrium fundyense CCMP1719 sxtA4 cDNA consenso (SEQ ID NO: 241)
Alexandrium fundyense MDQ1096 sxtA4 cDNA consenso (SEQ ID NO: 242)
O primer utilizado, sxtA, detectado em espécies produtoras STX, também pode discriminar entre cepas tóxicas e não tóxicas de Alexandrium minutum.
A A. minutum não tóxica, tem duas cópias diferentes sxtA no seu genoma, o que resulta numa curva bimodal de fusão, quando um ensaio de SYBR Green é utilizado (ver Fig. 17:. Tóxico A. minutum AL1IV, duas curvas, sem STX A, minutum VGO651, uma curva). Outras espécies também têm curvas
154 / 155 de fusão características, mas a discriminação entre as espécies tóxicas e não tóxicas com base na curva de fusão só funciona para A. minutum.
Os primers sxt072 e sxt073 também foram demonstrados para funcionar bem com a Biblioteca de Inquérito Universal de Roche, ft 142 (dados não mostrados). Este ensaio é muito específica e útil para a detecção de sxtA em amostras ambientais.
o) Exemplo 7: sxtAl e sxtAM4 estão ausentes em cepas dinoflagelados que não produzem saxitoxinas Materiais e Métodos PCRs de sxtAl e sxtA4 foram realizados como descrito no Exemplo 1 acima.
Resultados O sxtaA (1/4) não foi detectada em nenhuma das cepas de dinoflagelados listadas abaixo: sxta Espécies/Taxon (1/4) Adenoides eludens CCMP1891 n.d. Alexandrium insuetum CCMP2082 n.d. Amphidinium carteri UTOO081 n.d. Amphidinium mootonorum CAWD161 n.d. Azadinium spinosum RCC2538 n.d. Ceratium longipes CCMP1770 n.d.
155 / 155 Coolia monotis n.d.
Gambierdiscus australes CAWD148 n.d.
Gymnodinium aureolum SCCAP K-1561 n.d.
Heterocapsa triquetra RCC2540 n.d.
Karlodinium veneficum RCC2539 n.d.
Lepidodinium chlorophorum RCC2537 n.d.
Lingulodinium polyedrum CCMP1931 n.d.
Pentapharsodinium dalei SCCAP K-1100 n.d.
Polarella glacialis CCMP2088 n.d.
Prorocentrum micans UIO0292 n.d.
Prorocentrum minimum UIO085 n.d.
Protoceratium reticulatum n.d.
Pyrocystis noctiluca CCMP732 n.d.
Scrippsiella trochoideae BS-46 n.d.
Thecadinium kofoidii SCCAP K-1504 n.d. n.d. não detectado

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para a detecção de dinoflagelados produtores de saxitoxina em uma amostra, caracterizado por compreender: a obtenção de uma amostra para utilização no método; e análise da amostra para a presença de um ou mais de um polinucleotídeos de domínio catalítico de saxitoxina A de dinoflagelados, ou um polipeptídeo codificado pelo referido polinucleotídeo; o sendo que: o domínio catalítico de saxitocina é selecionado a partir de: domínio catalítico de saxitocina Al, domínio catalítico de saxitocina A4, ou um fragmento de um domínio catalítico de saxitocina Al ou A4; e a presença do referido polinucleotídeo ou polipeptídeo indica a presença de dinoflagelados produtores de saxitoxina na amostra.
2. Método para determinar a ausência de um dinoflagelado —) produtor de saxitoxina em uma amostra, caracterizado por compreender: obtenção de uma amostra para utilização no método; e análise da amostra para a presença de um ou mais polinucleotídeos de domínio catalítico de saxitoxina A de dinoflagelados, ou um polipeptídeo codificado pelo referido polinucleotídeo; em que: o domínio catalítico de saxitocina é selecionado a partir de: domínio catalítico de saxitocina Al, domínio catalítico de saxitocina A4, ou um fragmento de um domínio catalítico de saxitocina Al ou A4; e a ausência do referido polinucleotídeo ou polipeptídeo indica a ausência de dinoflagelados produtores de saxitoxina na amostra.
3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o polinucleotídeo compreender uma sequência de nucleotídeos de saxitoxina A selecionada a partir daqueles -O de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 224-227, 230-242 e 247, ou um fragmento ou variante de qualquer uma dessas sequências.
4. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a sequência do domínio catalítico de saxitoxina A4 ou seu fragmento compreender os nucleotídeos 3115-4121 da sequência polinucleotidica estabelecida na SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 3597-3721 da sequência polinucleotidica estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou um fragmento ou variante de !.O qualquer das sequências.
5. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a sequência do domínio catalítico de saxitoxina Al compreender os nucleotídeos 160-1821 da sequência polinucleotidica estabelecida na SEQ ID NO: 1, os nucleotídeos 277-2022 da sequência polinucleotidica estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou um fragmento ou variante de qualquer sequência.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a referida análise compreender a amplificação de polinucleotídeos da amostra através da reação em cadeia da polimerase.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida reação em cadeia da polimerase utilizar um ou mais primers que compreendem uma sequência de acordo com qualquer uma das ID SEQ NOs : 198-199, 200-211, 228-229 e 243- O 244, ou um fragmento ou variante de qualquer uma destas sequências.
8. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o polipeptídeo compreender: (1) uma sequência de aminoácidos de domínio catalítico de saxitoxina Al como apresentada nos resíduos 1-554 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos 1-582 da SEQ ID NO: 4, ou um fragmento ou variante de qualquer das sequências; ou (ii) uma sequência de aminoácidos de domínio catalítico de —O saxitoxina A4 como apresentada nos resíduos 847-1281 da SEQ ID NO: 4, ou um fragmento ou variante da mesma.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações l a 8, caracterizado por os dinoflagelados produtores de saxitoxina pertenceren à classe Alexandrium, do gênero Gymnodinium Pyrodinium.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o dinoflagelado produtor de saxitoxina ser selecionado do grupo constituído por: A. catenella, A. fundyense, A. lusitanicum, A. minutum, A. ostenfeldii, A. tamarense, e P. G. catenatum bahamense var compressum.
11. Kit para a detecção de dinoflagelados produtores de saxitoxina em uma amostra, caracterizado por o kit compreender pelo menos, um agente para detecção da presença de um polinucleotídeo de domínio catalítico de saxitoxina A de dinoflagelados, ou um polipeptídeo codificado pelo referido -O polinucleotídeo, sendo que o domínio catalítico de saxitocina é selecionado a partir de: domínio catalítico de saxitocina Al, domínio catalítico de saxitocina A4, ou um fragmento de um domínio catalítico de saxitocina Al ou A4.
12. Kit para a determinação da ausência de um dinoflagelado produtor de saxitoxina em uma amostra, caracterizado por compreender, pelo menos, um agente para detecção da presença de um polinucleotídeo de domínio catalítico de saxitoxina A de dinoflagelados ou um polipeptídeo codificado pelo referido -O polinucleotídeo, sendo que o domínio catalítico de saxitocina é selecionado à partir de: domínio catalítico de saxitocina Al, domínio catalítico de saxitocina A4, ou um fragmento de um domínio catalítico de saxitocina Al ou A4.
13. Kit de acordo com as reivindicações 11 ou 12, caracterizado por o agente se ligar especificamente a um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos de saxitoxina A selecionado a partir daqueles de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 224-227, 230-242 e 247 ou um fragmento ou variante de qualquer uma destas sequências.
14. Kit de acordo com as reivindicações 11 ou 12, caracterizado por a sequência do domínio catalítico de saxitoxina A4 ou seu fragmento compreender os nucleotídeos 3115-4121 da sequência polinucleotidica estabelecida na SEQ ID NO: 3, os nucleotídeos 3597-3721 da sequência polinucleotidica estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou um fragmento ou variante de 0 qualquer das sequências.
15. Kit de acordo com as reivindicações 11 ou 12, caracterizado por a sequência do domínio catalítico de saxitoxina Al compreender os nucleotídeos 160-1821 da sequência polinucleotidica estabelecida na SEQ ID NO: 1, os nucleotídeos 277-2022 da sequência polinucleotidica estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou um fragmento ou variante de qualquer sequência.
0 16. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado por o agente ser um primer, da sonda ou do anticorpo.
17. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado por o agente ser um primer que compreende uma sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 198- 199, 200-211, 228-229, e 243-244, ou um fragmento ou variante de qualquer uma destas sequências.
18. Kit de acordo com às reivindicações 11 ou 12, caracterizado por o agente se ligar especificamente a: (i) uma sequência de aminoácidos de domínio catalítico de saxitoxina Al como apresentada nos resíduos 1-554 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos 1-582 da SEQ ID NO: 4, ou um fragmento ou variante de qualquer das sequências; ou (ii) uma sequência de aminoácidos de domínio catalítico de saxitoxina A4 como apresentada nos resíduos 847-1281 da SEQ ID NO: 4, ou um fragmento ou variante da mesma. o
19. Par de primers para à detecção de dinoflagelados produtores de saxitocina em uma amostra, caracterizado por o referido par de primers ser constituído por: um primeiro primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 198 e um segundo primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 199, ou um primeiro primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 200 e um segundo primer que —0O compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 201, ou um primeiro primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 202 e um segundo primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 203, ou um primeiro primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 204 e um segundo primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 205, ou um primeiro primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 206 e um segundo primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 207, ou um primeiro primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 208 e um segundo primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 209, ou um primer primer que compreende ou consiste na sequência de O polinucleotídeos da SEQ ID NO: 210 e um segundo primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 211, ou um primeiro primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 228 e um segundo primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 229, ou um primeiro primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 243 e um segundo primer que compreende ou consiste na sequência de polinucleotídeos da SEQ O TD NO: 244.
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3/14 ; FIGURA 4h EEE SS ARTE E CEARA FRISO TAINAINO AAA. fa FE cm SE SATA ns SCE RA o AEREAS iai dos fo o E IE LIRA USEI SETOR TA Eca CAS SE sã 5, PEGUE ETA BEE ão er SABES ARES: EANES S) FRETE NE E Te Bars E RR Bea ER AS sas Pis 22 Dinondgeiado. Lo Es : iss E algo: SE bica SAIS A da AO Fé ROO Tio asp E fo CoiEA AGR STESAE: 2 PEIES Ra RE CABLE cu Ti es ao Enc Sa âNOS Bio AS e Aa da RSS Bota ag ETNIAS ra Go So df SAS Seção Anseri ANE E EE qeseE FTITETEERN. adeGA o EE, age TiToE: & ER Ra: iDinohagelado É NTE ALSO, Guias CNS, RO “V: CASES IR Mc SER Si no AAA RS São os EO DO CD RES ais ETA LOA E Raio Cyanôbaciêda; ns: asi Lx Ps Pegando: gas neaoe CARA ONE E Femas asa E toaton (| So Hd o os e tias E sr TAN SAAE o Ts se TRA e Rabo e co ANSA ARE Sa uso à SIA aa EN AO. ei NA A io. A To Aclinobacierias RARAS L) ENE ts AS os aminotransferase. e e E TU TR NA eco ão A, so ee LO CARSCAENO E RECO ERROS POETA i LED o. RS A: Jess SERIO ATA A sad Fish CR ato LT pi RESO ato 1 EE ADS cal fia Fo, REU 0h “sete aaa io EXTÉ ap ANS 1 eb RÉ CONSERTO ET Jeso » TERNO. Goo ELO [ES AOS su seara O o RNA, Es EPA a TOnÇOOS SS CCRERMAMENTO A SER OTS UC a E ue o Ma Sea Cao O Es EO AEDES FS Sp IEA Ed NE | E E EEN AA: DR FA Seo OS TESE e ias FORA, EA FE tas 4B FIGURA Le moer AAA FAROL NAEESICE 6 ES RES E o GURI Ss, Cao Fes EEE Asa OG So o a BO sd oo EPE LEO Ps ao E EESCREX. seo o o icon io cs E ESB So É PRATARE SO eso ENE EE RA EE os ste ESA ro: elos TSE: ENO ASIA Es SS ES EO Ens cs toçto lo ad RAS ESA PoE CEE iAdaS Ee ido SEEEETERAS A ANNA ao 280 PE e ABEL Es E E e. : SS: a cpa TS Ras [ROS SS NARA do “af CEEE), EE Es aee is cabe, A ER o. ES EE ALA, ão SO O DIE NA EE RE Gia E So Es Sigo sos REGIAO cho 100 é fase e Ps res] PTS Ei ss E EA ES RE o O TATO E SEL Teo ATA ee Class: ERA OO ds aros o PS ass ET ae o [ERES EE SO Ts feto: Eira ção PE iss Ea a: To Tres, AE od snDo É estacionar (U=0), : CITIES Ao oo TOTO)! estacionário (USO) UT ó (USC0/48): SEptamdio (um 0:10) “es 12 o — exp /antecioado (Ut RENDA STA CRS,
IR NNIARR ER ERES
Mm) 4/14 FIGURA 5 | | A. Minutam COMP113 eo 1/18 A minutum AMAD16 cio2/02 A minutum COMP1988 cos A. Minutum COMPIBBS dO6D4 | A. mimutum COMP 1888 ctónos. - À. minutum COMPY13 017 A, minutum AMADI6 02. A minutum COMPIIÔ CORO [4 minutum AMAD'6 SId03 : . | x. mintum AMADTE cogth [A minstum COMP119 cover [4 mingom CONP1 13 CV | A eninutum AMADÇ6 ci0a A. minutum COMPI588 dOS/02. [A minsum COMP113 ovos. À minimam COMPYÍI CIOUOS [A tómarente ATCIIS | A tamaronse COMP115 601 [A tomarem COMPYIS AO. | A. fundyense long RACE transcript A. fsneyensa CCMP19T8 03 A Anyone GEMP 1979 cOM [A formdyensa COMPI718 ca A Amebenes COMPITIS ci2iOS. A Aneyense COMPITIS cOTIOS É | A fiundrense COMPITID 02/04 . S A fundyense COMP1I719 cI02/07 (6. cstanetum GCTRAO1 cos G. cotenatum GCTRADI cio3
6. estenetm GOTRAMA CO! | G. cafenatuas C305 .
16. cstanatum OCTRAO1 c02. Dinoflagelado E estenstom GCTRAOT . | A. cstenena ACCCO1 dez R SxtAT | A. catenels CCMP1493 07 (4. cstenass COMP 1493 ci05 | 4. estenana COMP 1483 COS : | 4. catenofs CCMP1493 COS: A. catenesa ACTRAÇR: ' A catemeita ACTRAG2 033 VA. entensãe CCO! cita A estende ACCCO! . | A tomarense ATNWBO) Doo A, minutum AMADAS. . | A. tamerensa ATEBOT cioG. . | A. dermarenao ATEBO1 ci03 [ 4. tamarónes ATEBOS x imargoto ATEÊD co | A, tamenense ATEBO1 cibáia 1 tomarmnse ATEGO! cio! A tamerenae ATBBDA cio4/01 ' A, fundivensa COMPITISCIOZOR . ' À, fimdvense COMP17(9 0) | A, fndyensa COMP1719 cias oe A fundyense CCMPITIS CO2/08 . | A. fundyense short RACE transoript ” 100. | 4. fundyense 4S4contig repetTo7 A Aindrensa COMPITIS dO! : * JA ftndyensa COMPITIS cómo! ' Í A. femerense ATEBO1 coz : ' A temarenás COMP11S ci4 | . À corsneds ACTRAG2 08 | SN1.00) À a, catoneta COMPI493 GO | | A cateneta ACOCO1 dzS 100/7.00] A. minutum 4S4contig repe16Sa7 | Aohenizonmenon to. NHS (ACGSISO1) . “Ansbeene cheats AWOCTI1G (ABIS123) Cyanobacteria ermsL inçora wolw(acassaee) Cytticiospemmopais recfoonakd T3 (ABITSIS4) SxtA1 | Rephidioasis brmokt! DO (2P. 06305237) À “Candigatus Endobuguis setuia (ABMEIS2S) Yeruinta krisfenseni ATCCI3838 (2P CAGA2168) . Mysneoceu ráoihica DK1622 (VP H32410) Proteobacteria Burkholcena ubonanais By (ZP. 02380458) 'Burkholdaria ambitaia AMMD (YP. TT7E04) Horia akpicida OT1 (ZP 02167699) Loo Dutdonte donçhaensia MED'IA (25 91050532) | GRUPO EXTERNO MNostoc punciforme POCT3102 (YP 001B56SSO) | Tv
" o ÔÔ.l.0ÓAA)S).RAAS in nn A EO“““OR 5/14 FIGURA 6 A. minutum AMADI16 ci03/04 A. minutum AMAD16 cio3/02 . A, minutum AMADI6 cIO3/04 7 A, minutum COMP113 c103/02 A, minutum CCMP1868 c/07/01
4. minutum ALSPOS c104 A. minutum COMP113 cios/06 A. minutum 4S4contig repc1T30 | 4 minuvtum COMP1986 cia 1 . A. minutum AMAD16 cloa/03 . A, minutum COMPt13 ci03voS . A, minutum CCMP1888 c:07/03 . A, minutum COMP113 cio3/10 . A. minutum AMADOS | A. minutum CCMP113 cio3/01 : A. minutum CCMP1888 clo7/02 | A. .minutuvm COMP113 coa - A. minutum CCNIP113 ci0a/07 | A, mínutum GCMP1888 cio 1 . A. minuturm AMAD16 cio3/05 G. catnanum GCTRAOI ' . . A, temarense ATEBO1 cips/o2 A. tamaronso ATBBD1 cioS/os - A. tornarenaa ATEBO1 “A. temrense ATNWBO] A. tamarense ATEBO1 clo2 ' A. tamarensb ATBBO1 ciOS/04 ' A. tamarense ATBBO1 cioS/01 A. tameronse ATCJS33 A. fundyense AS4contig ropcS1370 i A. fundyense 454contig repc11370 Dinoflagelado A, fundyense COMP1719 cto7 - SxtA4 A. fundyense CCMP1979 cl39 A. catensflo ACTRAO2 ' A fundyense COMP1T19 ci04/04 A, funtiyanse COMP1I719 cioa/01 | A, fundyensa COMP1I719 025 ' | A. fundyenae COMP1979 ei36 A. cotonolia AGSHO2Z A. catenelia CCOMP1493 ct01 | A. catonaiia ACCCO?t A. fundyense COMP1719 ci9a/05 . - . A. fundyense CCMP1719 cl26 " A. fundyense GCMP1979 ci3e : 7 A, fundyensa COMP1718 cio4/08 A. fundyensa COMP1719 ci24 1 A. fundyense COMP1719 ciaT À, minutum ALSPO2 10 " A. minutum ALSPO2 cl 2 A. minutum ALSPO2 ci01 A. minutum ALSPO2 11 + - A, minutum ALSPO2 cio9 A. minutum ALSPO? c13 A. fundyense CCMP1979 clo2 A. tamaranse COMP116 ct02 .
4. tomerense CCMP116 cl20 A. fundyonse COMP1719 cio4/02 e 100100] A. fundyense ASácontig rope3425 Fr + A. fundyensae long RACE transcript . : | 4. fundyense 454contig ropc21538 A. fundyense CCMP1979 cia5 4, fundyense 454contig repc51400
120. * pAnabasna circinelia AWQC131C (ACFO4637) e . “Aphenizomenon sp. NHS (ACGE3801) > * 100/1.00] | Raphidiopsis brookii DS (ZP 06305237) yanobacteria “Gylindrospermaps!a raciborskil T3 (ACFE4636) SxtÃ4 '
526.6 Lyngbya worel str Carmichao| Alabama (ACFG4632) A ano Frankia sp, EANTpec (YP 001505355) . 00 Frankia sp. EUNIN (EFÇBL918) " 7 . Frankie aini ACN1I4a (VP. 718114) | Actinobacteria . Frenkie sp. Ccl3 (VP. 462022) . Plasmodium vivax Sal1 (XP OD1616796) Plasmodium bergire! ANKA (XP. 676780) Plosmodium knowlesi H (XP, 002260835) À Plasmodium faiciparum 307 (XP 001546328) GRUPO EXTERNO Cryptosporídivm muris RN68 (XP. 002140281) Toxoplasma gond!! ME4S (XP. 002368482) im - Synechacoocus sp. PCCT002 (YP 001735222) H Blastopireituta marina DSM3645 (ZP. 01092227) . . Acaryochforis marine MBIC11017 (YP 001515086) o
NE o EMO NE | 6/14 FIGURA 7 | | | ' o 1 a pro oo PSA de SD | os gg ; E y MEX: fo . à goes ' Ne, O o) ! as * Ipdese É ' CS ao Í * ! t io OS NOS: | oe + ' . a “ah aà 1 eds 1 = É ; o + £b fr o « e.” nã RA *f. cao : > : : | -..” - : os a à e GS “e ETC - natetaena-tentamnaentro —- - UE, e i “ “2: Sl FF Ass TER Doado: net Sedes A Pr dd T+ 1) OL am dá :: As GomeaRiva à Lá] S ELA "Ee s ão E 1 " 7 ares Ad & ” Ge.
Fo Ao : E 21 datar o quado a Bat Eos Pad AR + 2 TS A NANA ' Es AAA Top = faças to o Tm Po AEREAS o qe ue. ; cd ÃO o Foueahdioos o ' A Cont so Aa o o ' cao “ia o P: a
FIGURA 8
35.00 « v=-3.1528x+ 33,79 | | i - RS09666 |
30.00 Í , : ss vy=-3.04316x+ 31,779 | ” i às Rt= 0.9809 Í Õ j a | H a 25.00 3 a. i 8 j Sã — vys-35119x+34,959 | = 1 R$=0.9459 i 2 2000 + +ACTRAOL i i 3s | ! | GACCCO1 i
15.00 + i oo | cACSHO2 Í i i e ' 10.00 errar qu serasa a L
0.50 150 2.50 3.50 Í | Log do número de células FIGURA 9 a - 8 44 = 8) em x tao 3 Ti. 1 35 3 eLSU 30 E as —s&- contagem ' S 25 ê a de células 20 o $ 31. 15 É CS 7 * V to 1 poco o 5 . [MD +o a
15.Nov 16.Nov 17.Nov IM&-Nov 19.Nov ZO-Nov v : 12º B "e : 1 10 HDs E 3 Â + LSU 8 2 0) D > smem 16 FE à a É z : 2à 2 dra Z o 9? : 15-Nov 16.Nov 17.Nov 18-Nov tó.Nov ZO-Nov Data
Po o o NS o o 8/14 FIGURA 10
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" a po IS 2a 2222)»5Si 9257/22] """ ) l"É co .l=“. 0" õ""P"oSe nn 11/14 FIGURA 14 EN mA ENGATE EEE "
TSE RA SE FESCRAAAA ERAS AA EA solo pos EL SARA ie e Rea SEIA As ve | = Et BE A Edo Au Eis fo ELE o A Ei Ts | A e So o so “et LEE OS iss Fo io ! EITA TESES Ma SÓTÃO Ea Esso SO Ena e PRA DE: Ma, fo é vãs ESTETICA O NE EE et mio o ÃO: ESSE o TESESES Ts MESA A ERA AE = = e. O E - Tesiaioo GDE EE e ENE caga, “a RATE AS: TER Eh [08:E eo RESTOS LEO [ES O EO ES DE | Ss Ae o ES ELA A EmetrA AÇES al 2 Tod A A ES o AE E: ESTE AN [aee oo ia, alii oo o1eo a CO MA o ES o É o O É dis ARA A SE RES CALA a TALO E. SRI BESSA LE Ena Edo ENE | AAA fais o da al toe nO E A o E” 1 e O Ps REA EO TESNA EXITO TIA SS EEE ie | EE BE ES A LDO ERA Tra TA, TaDDEA OS SE A CSto | Ri SAS TRATO, ELA RA E EO Er A rea EAR TA Esto | E ARDE E AREAS: EA REA OR E Um dao RR EE SENTI Apre to A REAL, EE | dO E Ro k o. ã E ES E AA ado É EE dE A RARE RS a 1 o sã = = E AA ia o agi | MNE SO a Simao ES FER ENEIDA ES E Fa VEIO o. e & BE ESA Ee fes ee FS Y SAO esse sos ERAS CCTTEECTAE, SOS as Meco: Eos ao AOS ao EAN SOS e Esc. EE SO A o o = E ' ã So o at: EUA = Ma No d o S E ano a íRia 0 adia ro ENE RS Ar Aco TÉSNDOS si SIIAE SS NE * » AD Tama CR A eos ESSE NES) A ao a DO SIRENE TA OS its E ARA SL io ui Leça Bono A ae PRETO REA SS ESTO
E o eme me rs 5 oínq)Ie⺠EONSCN 99 G69 ”/ Ô“º»0ú "O" .-. - CO -A“"“es o 12/14 FIGURA 15 ardido da Raio A ENS dA E diaria gam bn dO : E EE TIS AD TARA dra OE E DR AC RNA ad SO O As ' RESTA NERO ORA IDT CAES a CSA CoNE o CARRO ú eo FA ara ne a io A AERTAAASOO a, DES SRO as CESAR EPE Tra cego ooo EE Go ES ANOS FAS SOUTO: BASTA SE PREADS FIMRROIAS ANS EERCEÇAA o SEN Edi cio A, CRECRTROS SEER asi e cds Se ST IE a ad dbacdiçã. UÉ a ESSA RACE ART RA Bai o TA a GER SUE ae hos LAB nad os loca (ON ola 6, SEE Nan REA a SAM aa ER SAS Do ELAS ADE "o. OE
CA AR OC OO AE CS TIRAS EE dat PERTO CARLA CAOS E | TESE dae o iso ATA DO: FARC IEA RE RS ONE A E A a CARON IVAROI) à E RT cr RESTOS del NANDO Dai CAN ATER E A ORE E AA AO ERES: pç RGE SEE AA fat ARE CINE Aco SE iog (EAR Ã ca ha Se) s & o ES ANO ta FE BEN ANETNIRS : ES Rage ANDAS LE AO AARAETO Se PEC EE o A TERA E FEB ' TES EE AoA LENDA ASAE ROME TE GUAN ed AA o peço Não RA da O TA e Nç ag tato DEBE ANNA DRS Ca ANE CS RA CEC ARIC IA oo AMEI Conérado
A RA AA ENA ATER EAN E aa DA, AA AA ro E EA SAN TARA Susana adErA, ES ELIM ditar ART! ! Goo EC NR ca AAA a ARA CR o a LR, dificção. Xea o ES afor DES EEE fi o Aa Rs RSA Sadia Santa Es ADO SOCO, EO CEA A A CAN ARENS CNS CANO ACAS ara Panis CEE IA Sodado FABI ABAS A Sh A dO aa “1 aii E RT CELTAS AL QUIT ddãco NRO BR o SESI Si rela, NAO SARRO: on ge ESB CATÁÇAS SOS O aaa CEDO DE Eae EA ANA Re o A TAS CERA PRO BEE a ASA CARS ARO a cedo O RA: EA ARRAIOLOS EE, visto AS E SULA IIS O oc deesdão uti ATI Ugo MRE Doni E a DE 50 A E E a DERA, ink E ASR o asd aial o SEDAN EAD OS 2Ao Sara ur CABE a CESAR E A Ao: FAS co a AA A TE RO Qu Foro ETA Ao SR Aro, to Aa E SE of Co ANS AESAT CL OSS aa a a a NAAS ; CE A DO RR A o cce e - SERPRO Si at NS PÃO SEE 0 cc toenda No qa e add Sp RA EA aro Sal Pim LEE) TES STATES CERA DA RAE idosa A Nr tido of Do AOS 1 : Bi o a O aan ata dao EPE AS O ai SESAU SEIOS SAR ESTO A EAD) REGAR CRIS SRS ACASO, RAS TES EMENDAS SEIOS ONA SE EAR o HER dão, ELA EIA CE ABCR | ESA SEA RENATO ED ir E FOR SEC ARNEALAM TIRAR DR 2 ASLAUARDO: na Dune cfc PIA E
SE SA A CEA DRE po TRADE CAES Frio code load end. ELAS Di SOR SEDES Te can: E cas Ao Au eflNa ECA: Ta ADa ta Ras Tt nã ANEARE LAN O AGIDO EEN A AR ARD ano SORANECAS SODT ANNERSMETHARTS HA ER e AA CIVISCE Rg Ro Bo a Eras Braga DAE ENO STISCE EE ES ESNE TES A ANS DEE RAN IAED ua : IRIS DORSO SESCEEA OR RS ESA RADAR, oo ABI CCR leo RE SRS CR Ia RAS EE NIVA IRES O oo . DUTTOINBICSOORO ES E Su A EIEAUADANS NEGRAS VACA Roma : Poe EE DNAICARRARES o das cio Ens : bl LAIe ARO SML ao ação
13/14 ! ] FIGURA 16 De6-[ A.
Anoyense COMPT9SO (JFSZIGTO) A Ringyense COMPABAE (1FS2IS2S) A fanóyensa DMR, S, 162008 (HFE21520 ' A fndyense CCHP1878 (JFS21626) Grupol A! A fundyençe CCMPITIO (SFEIT624) R * ass A fararense FYGTADIM (DOTESESA| GGI 4 camarense AX-O3 (DOTESBRD) . : 120toof À famaense SINI9 (ASSISSE6) l Geno A tamartose SZNOt (AJSSS3S, AM2IOBS3, ASSISTE) . A catenela AxApX003 (DOTASARE) Ú 2 A EAtEMEIA AXSp-KD1 (DO7ESEES) 2 A CRENESIALCLKO1 JAY IATIOS) Grupo v x À : , A catenefa (AY34TIDA) g ! À. catenena Axep-K0S (DOTASEST) g A tamarense CCMP1493 (IFSTIGA1) z R 2 marense (U44959) . . ê Io A Bimarense AESDSA (NE196451) ' | É A tamarense ATIOS (ABÍSG490) | o. . | A. tamarense ATCISS roxNinofo A tamarense MUCCIS (AFORZ 191) Grupo V A tamatense ATEBO! (EFITStUT] . o A tamarense ATCIZA (EFITOTA9) : ' A. tamarense ATHBOS LFS2TEIS). : . L) Aftamarense ATRINBOS LOAD! À famaréaie COMPHS (SFSTISIO) | Grupo UI A. tomatense CCAP1119/9 (DOTESEI!) - ANNE COMPHRUIFRRISIO) | GRUPO EXTERNO ra A, aro ARBODUDT [IFS21616) 1 |
FIGURA 17 FESLAE O TREO OS 9] ARAANIRAS DNS an nesaeh An 17 sua SOBRE 10 AS aQ0E das rr d nam o PESE os COTAS mess deRio? lp os e SADIO: « EOXSS = , : ão TEN. Atamarense a. = CEAR - fATNWBON) , je À Faso — À A miúutum STXe pio w ESA FASENEU fé ' ES E A anderson Ae So ' = 5.024 ' (cemMP2222) = fa ' * A.cateneila os SE As é 1 a fundyense ACTRAD1) sm NES ff Nécaemoa | jd À CS Ss f 1 AR o PEER Í À A. minutum STX- É “ ST : 17 W (VGO6S1) + RESTO i N 1 geo : / À s À ss ; TENIS L À e 4 SS / NA | & í Vagas Í NI $i Eos ; TAS, / ; 2 A W ; “1604 as leme — & assa, is SA Í E saDÃo: aaa oo o os FE A APTBE E: IE o MORRE OA ATTEAToS AN HOTVUDI EN ANINODAo Qu oauArA o .
ue AO E A AA ae a EAD CEO OS
BR112013029635-6A 2011-05-16 2012-05-16 "método para a detecção de uma produção de dinoflagelados saxitoxina em uma amostra, kit para a detecção de dinoflagelados, kit para a determinação sa ausencia de um dinoflagelados, polinucleotídeo" BR112013029635A2 (pt)

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