KR20140041632A

KR20140041632A - Composition for improving obesity and fatty liver using an extract of leaves of sasa quelpaertensis or p-coumaric acid

Info

Publication number: KR20140041632A
Application number: KR1020140018112A
Authority: KR
Inventors: 김세재; 강성일; 고희철
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2014-04-04

Abstract

The present invention discloses a composition for alleviating obesity and fatty liver using an extract of leaves of Sasa quelpaertensis Nakai or p-coumaric acid separated therefrom. The extract of Sasa quelpaertensis Nakai restrains the weight increase and the accumulation of fat, increases the manifestation content of adiponectin, and activates AMP-activated protein kinase (AMPK) in animal testing. In addition, the extract of Sasa quelpaertensis Nakai decreases the contents of glutamic pyruvic transaminase (GPT), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) and lactate dehydrogenase (LDH).

Description

Technical Field [0001] The present invention relates to a composition for improving obesity and fatty liver using an extract of Jeju Syrup or a para-coumaric acid isolated therefrom, and a composition for improving obesity and fatty liver using an extract of Sasa quelpaertensis or p- coumaric acid

본 발명은 제주조릿대(Sasa quelpaertensis) 잎 추출물 또는 그로부터 분리된 파라-쿠마르산(p-coumaric acid)을 이용한 비만 및 지방간 개선제 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing Sasa quelpaertensis leaf extract or para-coumaric acid isolated therefrom.

최근 경제 발전에 따른 생활 수준의 향상, 바쁜 생활 환경에 따른 운동 부족, 영양의 과잉 섭취 등으로 비만 인구가 급속히 늘고 있다. 우리나라의 비만(BMI> 25) 인구 비율은 1995년 11.7%이던 것이 2008년 30.7%, 고도 비만(BMI> 30) 인구 비율은 1998년 2.3%에서 2008년 4.1%로 빠른 증가세를 보이고 있다(보건복지부, 2009). In recent years, the population of obesity has been rapidly increasing due to improvements in living standards due to economic development, lack of exercise due to busy living environment, and excessive intake of nutrition. The proportion of obesity (BMI> 25) in Korea was 11.7% in 1995, 30.7% in 2008, and the proportion of obesity (BMI> 30) increased rapidly from 2.3% in 1998 to 4.1% , 2009).

비만은 에너지의 섭취와 소모의 불균형으로 인하여 체내에 에너지가 과잉으로 축적되어 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태를 말한다(Clinical Endocrinology 28:675-689, 1998; Clinical Obesity (eds. Kopelman PG, Stock MJ) 248-89 (Blackwell Science, Oxford 1998). Obesity is a condition in which energy is excessively accumulated in the body due to unbalanced energy intake and consumption, resulting in abnormally increased adipose tissue (Clinical Obstetrics 28: 675-689, 1998; Clinical Obesity (eds. ) 248-89 (Blackwell Science, Oxford 1998).

세계보건기구(WHO)는 동양인 기준 BMI(Body Mass Index: 체질량지수)가 23∼25를 과체중, 25∼30을 비만, 30 이상을 고도비만으로 보고 있다.The World Health Organization (WHO) estimates that the BMI (body mass index) of the Asian standard is 23 to 25 overweight, 25 to 30 for obesity, and 30 for high obesity.

비만의 원인으로는 고지방·고열량의 식생활, 바쁜 사회적 환경에 따른 운동 부족, 내분비 이상 등 환경적 요인과 유전적 요인을 들 수 있는데, 이 중 비만의 50 내지 70% 정도가 환경적 요인에 의한 것으로 알려져 있고, 나머지가 유전적 요인에 의한 것으로 알려져 있다. The causes of obesity include environmental dietary factors such as high fat and high calorie diet, lack of exercise due to busy social environment, and endocrine abnormalities, among which 50 to 70% of obesity is caused by environmental factors And the rest is known to be caused by genetic factors.

지방간이란 정상적인 지방대사가 이루어지지 못함으로써 간에 지질, 특히 중성지방(트리클리세라이드)이 과도하게 축적되어 간세포 절반 이상에서 지방 공포(空胞)가 관찰되는 상태의 질환을 말한다. Fatty liver refers to a condition in which lipid fears, especially triglycerides, are excessively accumulated in the liver and fat fear is observed in more than half of hepatocytes because normal fat metabolism is not achieved.

임상적으로는 간세포의 5% 이상에서 지방이 관찰되거나 간 100mg 당 지방이 5mg 이상일 때를 지방간으로 분류한다. 최근 들어서는 생활 수준의 향상에 따른 고지방, 고열량의 식생활, 문명의 발달로 인한 운동부족 등으로 인하여 지방간 환자가 급증하고 있으며, 연령층도 10대부터 50, 60대 이후까지 전반적으로 발병되고 있다. 지방간은 방치될 경우 간염, 간경변증, 간암 등으로 진행될 수 있다.Clinically, fat is observed in more than 5% of hepatocytes, or when fat is greater than 5 mg per 100 mg of liver. In recent years, fatty liver patients are rapidly increasing due to high fat, high calorie diet, lack of exercise due to the development of civilization, and the age group is also generally developing from the 10's to 50's and 60's. Fatty liver, if left untreated, can lead to hepatitis, cirrhosis and liver cancer.

지방간의 원인으로서는 알코올, 당뇨, 비만, 영양불량증(장기간의 저단백식, 고지방식, 기아, 비타민 부족, 과잉의 당질 섭취), 약물의 남용(김성훈 외, "복부초음파로 진단된 지방간의 원인" 가정의학회지 175(1995.12) pp.785-794) 등이 보고 되어 있다.The causes of fatty liver include alcohol, diabetes, obesity, malnutrition (long-term low-fat diet, high fat diet, starvation, starvation, vitamin deficiency, excess carbohydrate intake), drug abuse Journal of Medicine 175 (1995.12) pp.785-794).

현재 대표적인 비만 치료제로는 오리스타트(Orlistat)가 주원료로 하는 제니칼™(로슈), 시브트라민을 원료로 하는 리덕틸™(애보트) 등이 시판되고 있으나 오심, 설사, 복통, 불면증, 혈압상승, 지방변 등의 부작용을 보이고 있으며, 지방간의 치료제로서는 클로피브레이트(clofibrate)로 대표되는 피브레이트계 약제 등이 임상에서 사용되고 있으나, 간기능 장애 등의 부작용이 보고되고 있다(Atherosclerosis. 92:31-40 (1992)).At present, representative examples of the obesity treatment include Orlistat (Roche), which is the main raw material, and Reductil (Abbott), which is made from sibutramine. However, there is a possibility that nausea, diarrhea, abdominal pain, insomnia, And fibrates such as clofibrate have been used for clinical use in liver diseases, but side effects such as hepatic dysfunction have been reported (Atherosclerosis. 92: 31-40 1992).

이처럼 합성 의약품의 부작용과 서양 의학이 한계를 보임에 따라 천연물 의약품에 대한 가치가 새롭게 부각되고 있다.As these side effects of synthetic drugs and western medicine show limitations, the value of natural drug products is newly emerging.

본 발명은 제주조릿대 추출물의 비만 개선 활성과 지방간 개선 활성을 개시한다.
The present invention discloses an obesity improving activity and a fatty liver improving activity of Jeju Sori extract.

본 발명의 목적은 비만 개선제 조성물과 지방간 개선제 조성물을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide an obesity improving agent composition and a fatty acid improver composition.

본 발명은 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
Other objects and specific objects of the present invention will be described below.

본 발명은 일 측면에 있어서 비만 개선제 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an obesity improving agent composition in one aspect.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 제주조릿대 잎 열수 추출물을 실험동물에 고지방식이와 함께 투여하였을 때 고지방식이만을 투여한 경우에 비하여, 체중 증가가 유의성 있게 감소하고 복부지방 및 신장지방의 증가 정도를 감소시킴을 확인할 수 있었다.As shown in the following examples and experimental examples, the inventors of the present invention found that when the hot water extract of Jeju Syrup Lentil was administered to an experimental animal together with the high fat diet, weight gain was significantly decreased Abdominal fat, and kidney fat.

또한 본 발명자들은 제주조릿대 추출물의 투여군에서는 아디포넥틴(adiponectin)의 발현량이 증가하고 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시키고(p-AMPK 증가) ACC(acetyl-CoA carboxylase)의 활성을 억제시킴(p-ACC 증가)을 확인하였으며, 세포실험에서도 제주조릿대 추출물이 AMPK를 활성화시키고 CPT-1α(carnitine palmitoyl transferase-1α)를 활성화시킴(CPT-1α 증가)을 확인할 수 있었다.In addition, the present inventors have found that administration of the extract of Jeju Sori extract increases adiponectin expression, activates AMP-activated protein kinase (p-AMPK) and inhibits the activity of ACC (acetyl-CoA carboxylase) -ACC increase), and in the cell test, it was confirmed that the extract of Jeju Sasa extract activates AMPK and activates CPT-1α (carnitine palmitoyl transferase-1α) (increase of CPT-1α).

그리고 본 발명자들은 제주조릿대 추출물에서 분리된 생물활성 물질인 p-쿠마르산(p-coumaric acid)도 세포실험에서 중성지방의 축적을 억제하고 AMPK의 인산화 및 ACC의 인산화를 증가시킴과 함께 AMPK를 활성화시키는 LKB1의 인산화를 증가시키고 CPT-1의 전사인자인 PPARα 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었다. The present inventors have also found that p -coumaric acid, a biologically active substance isolated from Jeju Sori extract, inhibits the accumulation of triglycerides in cell experiments and increases AMPK phosphorylation and ACC phosphorylation and activates AMPK Increased the phosphorylation of LKB1 and increased the expression of PPARα, a transcription factor of CPT-1.

아디포넥틴의 발현량 증가는 비만 개선과 깊은 연관성이 있다고 알려져 있으며(Commb, T. P., et al, J. Clin. Invest., 108(12):1875-1881, 2001), AMPK는 세포 내의 에너지 항상성 유지에 센서 역할을 담당하는 효소로서 포도당 결핍, ROS 등의 산화적 스트레스에 의해 AMP:ATP 비율이 증가하게 되면 활성화된다고 알려져 있다(J. Biol. Chem. 277:32571-32577, 2002; J. Appl. Physiol. 92:2475-2482, 2002). AMPK가 활성화되면 ACC가 인산화되어 불성화되는데, ACC는 지방산 합성의 초기 단계에 관여하는 효소로서 아세틸코에이(acetyl-CoA)를 말로닐코에이(malonyl-CoA)로 합성하는 효소이다(Trends Biochem. Sci. 24:22-25, 1999; Biochem. Soc. Trans. 31:162-168, 2003). ACC가 불활성화되면 말로닐코에이(malonyl-CoA)의 세포 내 농도가 낮아져 UCP2, CPT-1α 등이 활성화되어 지방 산화가 촉진되는 것으로 알려져 있다(J. Biol. Chem. 277:32571-32577, 2002, J. Appl. Physiol. 92:2475-2482, 2002). AMPK has been shown to be involved in the maintenance of energy homeostasis in the intracellular space [1], [2], [3] and [4] It is known that an enzyme that acts as a sensor is activated when the AMP: ATP ratio is increased by oxidative stress such as glucose deficiency and ROS (J. Biol. Chem. 277: 32571-32577, 2002; J. Appl. Physiol 92: 2475-2482, 2002). When AMPK is activated, ACC is phosphorylated and becomes inactivated. ACC is an enzyme involved in the early stage of fatty acid synthesis and is an enzyme that synthesizes acetyl-CoA with malonyl-CoA (Trends Biochem. Sci. 24: 22-25, 1999, Biochem. Soc. Trans. 31: 162-168, 2003). When ACC is inactivated, it is known that the intracellular concentration of malonyl-CoA is lowered and UCP2, CPT-1α etc. are activated to promote lipid oxidation (J. Biol. Chem. 277: 32571-32577, 2002 , J. Appl. Physiol. 92: 2475-2482, 2002).

따라서 아디포넥틴의 발현량이 증가하고 AMPK가 활성화되면 체내 지방의 축적을 억제할 수 있으며, 결과적으로 체중의 증가를 억제할 수 있고, 또한 혈중 중성 지방과 콜레스테롤 농도를 저하시키는 결과를 얻을 수 있다.Therefore, when the expression level of adiponectin is increased and the AMPK is activated, accumulation of the body fat can be inhibited, consequently, the increase of body weight can be suppressed, and the blood triglyceride and cholesterol concentration can be lowered.

본 발명의 비만 개선제 조성물은 전술한 바의 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, 본 발명의 비만 개선제 조성물은 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다. The composition for improving obesity of the present invention is provided on the basis of the results of the experiment described above, and the composition for obesity improvement of the present invention is characterized in that it contains an extract of Jeju Soseki or p -coumaric acid as an active ingredient.

본 명세서에서, "제주조릿대 잎 추출물"은 추출 대상으로 제주조릿대 잎을 사용하고, 추출 용매로 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다. 추출 방법은 유효성분의 추출 정도, 보존 정도 등을 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사 등 임의의 방식을 적용될 수 있다. 또한 유효물질(활성을 나타내는 미지의 단일물질)을 변화 또는 유효물질의 다양화를 유도하기 위하여 추출시에 다당류 분해 효소를 사용할 수 있는데, 단당류가 3 분자 이상, 바람직하게는 10 분자 이상 결합하여 이루어진 당류를 분해할 수 있는 효소이면 어떠한 효소라도 무방하다. 그러한 효소로서는 예컨대, 셀룰나제(cellulase), 키실라나제(xylanase), 헤미셀룰나제(hemicellulase) 및 베타-클루카나제(β-glucanase), 셀로비하이드롤나제(cellobihtydrolase), 1,4-베타-디-클루코시다제(1,4-β-D-glucosidase) 및 1,4-베타-디-글루카나제(1,4-β-D-glucanase), 아밀로클루코시다제(amyloglucosidase), 알파-아밀라제(α-amylase), 펙틴나제(pectinase), 펙토산나제(pentosanase), 만나제(mannase), 펙틴트란스리미나제(pectintranseliminase), 폴리칼락토나제(polygalactonase), 펙틴에스터라제(pectinesterase) 및/또는 이들 효소를 함유한 동식물 추출물 등을 들 수 있다. 실제적으로는 Pectinex™(Novo Nordisk, Denmark), Ultraflo L™(Novo Nordisk, Denmark), Viscozyme L™(Novo Nordisk, Denmark), Ceremix™(Novo Nordisk, Denmark), Celluclast™(Novo Nordisk, Denmark), Filterase BR™(Gist-Brocades, Netherlands), Termamyl (Novozymes, Denmark) 등 상업적으로 판매되고 있는 효소가 사용될 것이다. 상기 추출물은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된, 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물일 수 있다. 특히 "제주조릿대 추출물"은 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 추출 용매로 사용하여 얻어진 것을 의미한다. In the present specification, "Jeju bamboo sake berry leaf extract" means a bamboo sake berry leaf used as an extraction target, and water, methanol, ethanol, butanol, Means an extract obtained by using ethyl acetate, butyl acetate, dichloromethane, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), 1,3-butylene glycol, propylene glycol or a mixed solvent thereof do. The extraction method may be applied by any method such as cold rolling, refluxing, heating, ultrasonic irradiation, etc. in consideration of the degree of extraction of the active ingredient and the degree of preservation. In addition, a polysaccharide degrading enzyme can be used at the time of extraction to change the active substance (an unknown single substance exhibiting activity) or to induce diversification of the active substance. The polysaccharide degrading enzyme may be prepared by combining three or more molecules, Any enzyme capable of decomposing a saccharide may be used. Such enzymes include, for example, cellulase, xylanase, hemicellulase and beta-glucanase, cellobihtydrolase, 1,4-beta- 1,4-β-D-glucosidase and 1,4-β-D-glucanase, amyloglucosidase, A-amylase, pectinase, pentosanase, mannase, pectintransliminase, polygalactonase, pectinesterase, pectinase, ) And / or plant and animal extracts containing these enzymes. Actually, a mixture of PectinexTM (Novo Nordisk, Denmark), Ultraflo LTM (Novo Nordisk, Denmark), Viscozyme LTM (Novo Nordisk, Denmark), CeremixTM (Novo Nordisk, Denmark), CelluclastTM (Novo Nordisk, Commercially available enzymes such as Filterase BR ™ (Gist-Brocades, Netherlands) and Termamyl (Novozymes, Denmark) will be used. The extract may be a concentrated liquid extract or a solid extract, from which the extraction solvent has been removed by lyophilization, vacuum drying, hot air drying, spray drying and the like. In particular, "Jeju Sori extract" means preferably obtained by using water, ethanol or a mixed solvent thereof as an extraction solvent.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.In the present specification, the term " active ingredient "alone means an ingredient which exhibits the desired activity or which can exhibit activity together with a carrier which is not itself active.

또 본 명세서에서, "비만"이란, 그것이 유전적 요인에 의한 비만이든 또는 환경적 요인에 의한 비만이든 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태를 의미하며, 체질량지수의 구분에 따른 비만(BMI이 25 이상인 경우)과 과체중(BMI이 23~25인 경우)을 포함하는 의미이다.In the present specification, "obesity" means an abnormally increased state of fat tissue, whether it is caused by genetic factors or environmental factors, and the obesity (BMI of 25 or more ) And overweight (when BMI is between 23 and 25).

또 본 명세서에서, 상기 "비만 개선"이란 비만의 예방, 비만의 치료를 포함하여, 체지방의 감소 및/또는 체중의 감소를 포함하는 의미이다.In the present specification, the term "improvement of obesity" is meant to include reduction of body fat and / or reduction of body weight, including prevention of obesity and treatment of obesity.

본 발명의 비만 개선제 조성물은 그 유효성분을 비만 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.990 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 비만 개선 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다. The composition for improving obesity of the present invention may contain the active ingredient in any amount (effective amount) as long as it exhibits the activity of improving obesity, the formulation, the purpose of compounding, etc. A typical effective amount is based on the total weight of the composition And will be determined within the range of 0.001 wt% to 99.990 wt%. Here, "effective amount" refers to the amount of effective ingredient capable of inducing an obesity-improving effect. Such effective amounts can be determined experimentally within the ordinary skill of those skilled in the art.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.The subject to which the composition of the present invention can be applied (prescription) is preferably a mammal and a person, particularly a human.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 다이어트용 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a composition for diet comprising as an active ingredient pomegranate extract or p -cumaric acid.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 개선제 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a composition for improving hyperlipemia comprising an extract of Jeju Soso or p -cumaric acid as an active ingredient.

본 명세서에서 "다이어트"란 체중 상태가 비만이나 과체중은 아니지만 미용이나 건강 목적으로 체중/체지방의 감소가 바람직하거나 필요한 상태로서 정의된다. 통상 본 발명의 다이어트용 조성물은 정상인의 미용이나 건강 목적으로 제조·사용될 것이다. As used herein, a "diet " is defined as a condition in which the weight is not obese or overweight, but is desirable or necessary for weight or body fat reduction for cosmetic or health purposes. In general, the composition for diet of the present invention will be manufactured and used for the beauty and health of a normal person.

또 본 명세서에서, "고지혈증"이란 중성 지방과 콜레스테롤 등의 지방대사가 제대로 이루어지지 않아 혈액 중에 지방량이 많아 유발되는 질환을 말한다. In the present specification, the term "hyperlipidemia" refers to a disease caused by a high amount of fat in the blood because fat metabolism such as triglycerides and cholesterol is not properly performed.

본 발명의 다이어트용 조성물과 고지혈증 개선제 조성물에 있어서, 제주조릿대 추출물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 상기 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.With respect to the meaning of the Jeju Somen Sauce Extract, the effective amount thereof, and the like in the composition for diet and the composition for improving hyperlipemia of the present invention, the above-mentioned items relating to the obesity-improving composition of the present invention are effective as they are.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만이 원인이 되어 발생하는 질환 예방용 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a composition for preventing diseases caused by obesity comprising an extract of Jeju Sauce as an active ingredient.

비만이 지속되면 비만이 원인이 되어 고혈압, 혈중 콜레스테롤 상승, 신장 질환, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간, 관절염, 암, 수면무호흡증, 당뇨병 등이 발병할 수 있다. When obesity persists, obesity can cause hypertension, elevated blood cholesterol, kidney disease, stroke, atherosclerosis, fatty liver, arthritis, cancer, sleep apnea, and diabetes.

그러므로 상기 "비만이 원인이 되어 발생하는 질환"이란 고혈압, 혈중 콜레스테롤 상승, 신장 질환, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간, 관절염, 암, 수면무호흡증 및 당뇨병 중 하나로서 이해할 수 있다.Therefore, the term " a disease caused by obesity "can be understood as one of hypertension, elevated blood cholesterol, kidney disease, stroke, arteriosclerosis, fatty liver, arthritis, cancer, sleep apnea and diabetes.

본 발명의 비만이 원인이 되어 발생하는 질환 예방용 조성물에 있어서도, 그것의 유효성분인 제주조릿대 추출물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.With respect to the composition for preventing diseases caused by obesity of the present invention, the above-described effects with respect to the meaning of the extract of Jeju Sauce Extract, which is an effective ingredient thereof, and the effective amount thereof and the like, with respect to the composition for obesity-relieving agent of the present invention are still valid.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 지방간 개선제 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a composition for improving liver fat remediation comprising as an active ingredient a bovine Sasa extract or p -coumaric acid.

아래의 실험예는 제주조릿대 추출물이 글루타민산피루브산트랜스아미나아제(이하 "GPT"), 글루타민산옥살로아세트산트랜스아미나아제(이하 "GOT") 및 락테이트디하이드로게나제(이하 "LDH")의 함량을 낮추는 것을 보여주며, 또한 적출된 실험동물의 간 조직의 조직 절편 관찰에 있어서도 고지방식이와 함께 제주조릿대 추출물이 투여된 군의 경우는 간 조직 형태가 정상식이군과 유사한 반면 고지방식이만이 투여된 군은 지방간의 현저히 진행되었음을 보여준다. In the following Experimental Example, it was confirmed that the extract of Jeju Soso is the content of glutamic acid pyruvic acid transaminase (hereinafter "GPT"), glutamic acid oxaloacetate transaminase (hereinafter "GOT") and lactate dehydrogenase (hereinafter "LDH" In addition, in the observation of the tissue sections of the liver tissues of the extracted experimental animals, in the case of the group administered with the high-fat diet and the extract of the low fat diet group, the hepatic tissue morphology was similar to that of the normal diet, whereas only the high fat diet The army showed a marked progression of fatty liver.

상기에서 GPT, GOT 및 LDH는 간이 비만, 알콜 등이 원인이 되어 손상을 입을 경우 간으로부터 혈액 중으로 분비되기 때문에, 이들 효소의 활성은 간 기능 장애를 나타내는 일반적인 지표로서 사용되고 있는데, 이들 효소의 활성이 낮다는 것은 간 손상 정도가 낮다는 것을 의미한다.Since GPT, GOT and LDH are secreted from the liver into the blood when they are damaged due to liver obesity, alcohol and the like, the activity of these enzymes is used as a general indicator of liver dysfunction. Low means that liver damage is low.

제주조릿대 추출물에서 분리된 p-쿠마르산의 경우도 지방 축적이 유도된 HepG2 세포에서 SREBP-1c(sterol regulatory element binding protein -1c)의 활성화를 농도 의존적으로 억제하였다. 상기 SREBP-1c는 간에서의 지방산과 중성지방의 합성에 관여하는 것으로 알려져 있다(Cell, 89 (3): 331-340, 1997)In the case of p - cumaric acid isolated from Jeju Sori extract, SREBP - 1c (concentration - dependent inhibition of activation of SREBP - 1c) was induced in fat accumulation - induced HepG2 cells. The SREBP-1c is known to be involved in the synthesis of fatty acids and triglycerides in the liver (Cell, 89 (3): 331-340, 1997)

이러한 실험 결과는 제주조릿대 추출물 등이 지방간 개선 용도로도 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.These results suggest that the extract of Jeju Sori extract may be useful for the improvement of fatty liver.

본 명세서에서, "지방간"은 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 동맥경화 등의 원인이 되는 질병으로서, 간의 지방대사 장애로 인하여 지방이 간세포에 과도한 양으로 축적된 상태의 질환을 말한다.As used herein, the term "fatty liver" refers to a disease that causes angina, myocardial infarction, stroke, arteriosclerosis, etc., and refers to a disease in which fat is accumulated in hepatocytes excessively due to liver fat metabolism disorder.

본 발명의 지방간 개선제 조성물에 있어서도, 제주조릿대 추출물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 상기 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.Regarding the fatty liver improvement composition of the present invention, regarding the meaning of the Jeju Somen berry extract, the effective amount thereof, and the like, the above-mentioned effects with respect to the composition for obesity-relieving agent of the present invention are still valid as they are.

한편, 지방간은 방치될 경우 간염, 간경변증, 간암 등으로 진행될 수 있다. 따라서 본 발명의 지방간 개선제 조성물은 지방간이 원인이 되어 발생하는 간염, 간경병증 또는 간암의 예방 목적으로 사용될 수도 있다.On the other hand, when the liver is left untreated, it may progress to hepatitis, liver cirrhosis, liver cancer and the like. Therefore, the composition of the present invention can be used for prevention of hepatitis, hepatopathy or liver cancer caused by fatty liver.

따라서 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간이 원인이 되어 발생하는 질병인 간염, 간경병증 또는 간암의 예방용 조성물로서 파악될 수 있다.Therefore, in another aspect, the present invention can be grasped as a composition for preventing hepatitis, hepatopathy or liver cancer, which is a disease caused by fatty liver containing the extract of Jeju Soseki as an active ingredient.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 제주조릿대 추출물 또는 p-쿠마르산을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성 개선제 조성물에 관한 것이다.In yet another aspect, the present invention relates to an insulin resistance improving composition comprising as an active ingredient a bovine sage extract or p -coumaric acid.

비만은 인슐린 저항성의 여러 원인 중 하나에 해당한다. 고도 비만에서 인슐린 저항성이 발병하지 않는 경우도 있지만, 인슐린 저항성과 비만은 밀접한 상관관계가 있어, 일반적으로 비만이 심할수록 특히 내장 비만(visceral obesity)이 심할수록 인슐린 저항성도 심해진다고 알려져 있다.Obesity is one of several causes of insulin resistance. It is known that obesity is associated with insulin resistance, but obesity is closely correlated with insulin resistance. It is generally known that the more obesity is, the more visceral obesity is, the more insulin resistance becomes.

지방세포는 생리활성물질인 아디포사이토카인을 분비하는데, 이 아디포사이토카인은 대사의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하지만, 비만 즉 지방의 과도한 축적 상태가 되면 아디포사이토카인의 생성·분비가 과잉 또는 과소가 되어 균형이 파괴됨으로써 인슐린 저항성이 야기되는 것으로 이해되고 있다.Adipocytokines secrete physiologically active adipocytokines, which play an important role in maintaining metabolic homeostasis. Adipocytokines play an important role in the maintenance of obesity, that is, excessive accumulation of fat. It is understood that excessive or ineffective destruction of balance leads to insulin resistance.

아디포사이토카인 중에는 인슐린 감수성을 항진시키는 것과 인슐린 저항성을 야기시키는 것이 있으며, 전자의 대표적인 경우가 아디포넥틴과 AMPK(AMP-의존성 단백질 키나아제)이며, 후자의 대표적인 경우가 TNF-α, lL-6, 레지스틴(resistin) 등을 들 수 있다.Among the adipocytokines, there are those that promote insulin sensitivity and induce insulin resistance. Representative examples of the former are adiponectin and AMPK (AMP-dependent protein kinase), and the latter representative examples are TNF-a, lL-6, and resistin.

특히 AMPK 활성 저하는 인슐린 저항성과 고혈당을 수반하므로 AMPK를 활성화시킬 수 있는 물질은 인슐린 저항성을 개선할 수 있는 후보 물질일 수 있다는 연구 결과들이 발표된 바 있다(J. Biol. Chem., 277(28):25226-32, 2002; Diabetes. 51(7):2074-81, 2002; J. Clin. Invest. 108(8):1167-74, 2001).In particular, studies have shown that AMPK activation may be a candidate for improving insulin resistance, since the decrease in AMPK activity is accompanied by insulin resistance and hyperglycemia (J. Biol. Chem., 277 ): 25226-32, 2002; Diabetes. 51 (7): 2074-81,2002; J. Clin. Invest. 108 (8): 1167-74,2001).

아래의 실시예 및 실험예는 본 발명의 비만 개선제 조성물의 유효성분인 상기 제주조릿대 추출물 또는 그것으로부터 분리된 p-쿠마르산이 AMPK를 활성화시킴을 보여준다. 이러한 실험 결과는 제주조릿대 추출물 등이 비만 개선제로서 뿐만 아니라 인슐린 저항성 개선제로서도 유용하게 활용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.The following Examples and Experiments show that the above-described Jeju bacillus Sogarifide extract or p -cumaric acid isolated therefrom, which is an active ingredient of the composition for improving obesity of the present invention, activates AMPK. These results suggest that Jeju Sori extract can be used not only as an obesity - improving agent but also as an insulin resistance improving agent.

본 명세서에서, 상기 "인슐린 저항성"이란 세포, 장기, 인체 등이 정상적인 대사 활동을 위하여 통상적인 양 이상의 인슐린을 필요로 하는 상태, 즉 인슐린의 작용력이 저하된 인슐린의 작용 부전 상태를 의미하며, 인슐린 비의존형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병과 동일한 의미로 받아들여진다. 당뇨병은 췌장의 β-세포가 파괴된 결과 그 치료를 위하여 인슐린이 필수적으로 요구되는 인슐린 의존형 당뇨병(제1형 당뇨병)과 인슐린의 작용력이 저하되어 그 치료에 인슐린이 요구되지 않은 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)으로 구분되기 때문에, 당업계에서 인슐린 저항성, 인슐린 비의존형 당뇨병 그리고 제2형 당뇨병은 동일한 의미로 받아들여지고 있다. In the present specification, the term "insulin resistance" refers to a state in which cells, organs, the human body, etc. require a normal amount of insulin for normal metabolic activities, that is, insulin action- It is accepted in the same sense as non-dependent diabetes or type 2 diabetes. Diabetes mellitus is the result of the breakdown of β-cells in the pancreas. As a result, the insulin-dependent diabetes mellitus (type 1 diabetes) Type 2 diabetes), so insulin resistance, non-insulin dependent diabetes mellitus and type 2 diabetes are accepted in the same sense in the art.

본 발명의 인슐린 저항성 개선제 조성물에 있어서도, 제주조릿대 추출물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 상기 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.In the insulin resistance improving composition of the present invention, regarding the meaning of the extract of Jeju Soseki, the effective amount thereof and the like, the above-mentioned facts relating to the composition for obesity-improving agent of the present invention are still valid as they are.

본 발명의 비만 개선제 조성물, 다이어트용 조성물, 고지혈증 개선제 조성물, 비만 합병증 예방용 조성물, 지방간 개선제 조성물, 지방간이 원인이 되어 발병하는 질환의 예방제 조성물 및 인슐린 저항성 개선제 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.(Hereinafter, referred to as "the composition of the present invention"), a composition for preventing obesity, a composition for preventing obesity, a composition for preventing fatty liver, a preventive composition for diseases caused by fatty liver and a composition for improving insulin resistance Can be grasped as a food composition in a specific embodiment.

본 발명의 식품 조성물은 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.The food composition of the present invention can be produced as a health supplement food, a special nutrition supplement food, a functional beverage and the like.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.The food composition of the present invention may contain sweetening agents, flavoring agents, physiologically active ingredients, minerals and the like in addition to the active ingredients thereof.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다. Sweetening agents may be used in an amount that sweetens the food in a suitable manner, and may be natural or synthetic. Preferably, natural sweeteners are used. Examples of natural sweeteners include sugar sweeteners such as corn syrup solids, honey, sucrose, fructose, lactose and maltose.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다. Flavors may be used to enhance taste or flavor, both natural and synthetic. Preferably, a natural one is used. When using natural ones, the purpose of nutritional fortification can be performed in addition to the flavor. The natural flavor may be obtained from apples, lemons, citrus fruits, grapes, strawberries, peaches, and the like, or may be obtained from green tea leaves, round leaves, jujube leaves, cinnamon, chrysanthemum leaves, jasmine and the like. Also, those obtained from ginseng (red ginseng), bamboo shoots, aloe vera, banks and the like can be used. The natural flavoring agent may be a liquid concentrate or a solid form of extract. Synthetic flavors may be used depending on the case, and synthetic flavors such as esters, alcohols, aldehydes, terpenes and the like may be used.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.Examples of the physiologically active substance include catechins such as catechin, epicatechin, gallocatechin and epigallocatechin, and vitamins such as retinol, ascorbic acid, tocopherol, calciferol, thiamine and riboflavin.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.As the mineral, calcium, magnesium, chromium, cobalt, copper, fluoride, germanium, iodine, iron, lithium, magnesium, manganese, molybdenum, phosphorus, potassium, selenium, silicon, sodium, sulfur, vanadium and zinc can be used.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다. In addition, the food composition of the present invention may contain preservatives, emulsifiers, acidifiers, thickeners and the like as needed in addition to the above sweeteners.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.Such preservatives, emulsifiers and the like are preferably added in a very small amount as long as they can attain an application to which they are added. The term " trace amount " means, when expressed numerically, in the range of 0.0005% by weight to about 0.5% by weight based on the total weight of the food composition.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다. Examples of the preservative which can be used include calcium sodium sorbate, sodium sorbate, potassium sorbate, calcium benzoate, sodium benzoate, potassium benzoate and EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.Examples of the emulsifier which can be used include acacia gum, carboxymethyl cellulose, xanthan gum, pectin and the like.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.Examples of the acidulant that can be used include acid, malic acid, fumaric acid, adipic acid, phosphoric acid, gluconic acid, tartaric acid, ascorbic acid, acetic acid, and phosphoric acid. Such an acidulant may be added so that the food composition has a proper acidity for the purpose of inhibiting the growth of microorganisms other than the purpose of enhancing the taste.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다. Agents that may be used include suspending agents, sedimentation agents, gel formers, bulking agents and the like.

또한 본 발명의 식품 조성물은 향미나 기호성을 향상시키고 그 기능성을 상승 보강하거나 다른 기능성(예컨대 숙취 해소 활성 등)을 부가하기 위하여 이미 비만 개선 활성, 숙취 해소 활성 등이 있다고 알려진 임의의 천연물 유래의 분말 또는 추출물을 포함할 수 있는데, 선지 분말 또는 추출물, 콩나물 분말 또는 추출물, 조개 분말 또는 추출물, 굴 분말 또는 추출물, 산미나리 분말 또는 추출물, 무 즙 또는 추출물, 오이 즙 또는 추출물, 부추 즙 또는 추출물, 시금치 즙 또는 추출물, 연근 즙 또는 추출물, 칡 즙 또는 추출물, 솔잎 즙 또는 추출물, 인삼 즙 또는 추출물, 백화사설초 분말 또는 추출물, 감초 분말 또는 추출물, 갈화 분말 또는 추출물, 갈근 분말 또는 추출물, 사인 분말 또는 추출물, 박 분말 또는 추출물, 생강 분말 또는 추출물, 대추 분말 또는 추출물, 인진 분말 또는 추출물, 지구자 분말 또는 추출물, 수비계 분말 또는 추출물, 백출 분말 또는 추출물, 저령 분말 또는 추출물, 진피(진귤의 껍질) 분말 또는 추출물, 구기자 분말 또는 추출물, 녹차 분말 또는 추출물, 오미자 분말 또는 추출물, 헛개나무 분말 또는 추출물, 지치 분말 또는 추출물, 노근 분말 또는 추출물, 계피 분말 또는 추출물, 데커시놀 등이 예시될 수 있다. 상기에서 추출물의 의미는 제주조릿대 추출물과 관련하여 앞서 설명한 바와 같다. 이러한 추출물은 추출 대상을 혼합하여 얻어질 수도 있다.In addition, the food composition of the present invention may further contain a powder derived from any natural substance known to have an activity of improving obesity, hangover activity, etc., in order to enhance flavor or palatability, to enhance its functionality, or to add other functionalities Or extract of the present invention may be selected from the group consisting of a pregelatinized powder or extract, a bean sprouts powder or extract, a shell powder or extract, an oyster powder or extract, an oxalate powder or extract, a jujube or an extract, a cucumber juice or extract, Ginseng powder or extract, licorice powder or extract, garlic powder or extract, powder or extract powder, extract powder, extract powder, extract powder, extract powder, Peanut powder or extract, ginger powder or extract, jujube powder or The present invention relates to a powder or extract of a ginger powder, a powder or extract of green tea, a powder or extract of a green tea, a powder or extract of a ginger, a powder or extract of a ginger, a powder or extract of a ginger, Omega powder or extract, hinoki powder or extract, dirt powder or extract, candy powder or extract, cinnamon powder or extract, decaccinol and the like. The meaning of the extract in the above is as described above in connection with the jeju jeoldae extract. Such an extract may be obtained by mixing the object to be extracted.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.In another specific embodiment, the composition of the present invention can be identified as a pharmaceutical composition.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be in a form suitable for oral use (tablets, suspensions, granules, emulsions, capsules, syrups, etc.), parenteral formulations (sterile injectable aqueous or non- Ointments, ointments, solutions, creams, ointments, gels, lotions, patches, and the like).

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다는 의미이다.The term "pharmaceutically acceptable" as used herein means that the application (subject) does not have an adaptive or higher toxicity (sufficiently low toxicity) without inhibiting the activity of the active ingredient.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.Examples of pharmaceutically acceptable carriers include lactose, glucose, sucrose, starch (e.g., corn starch, potato starch and the like), cellulose, derivatives thereof (e.g. sodium carboxymethylcellulose, ethylcellulose, etc.), malt, gelatin, talc, (E.g., peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, olive oil, etc.), polyols (e.g., propylene glycol, glycerin, etc.), alginic acid, emulsifiers (e.g., TWEENS), wetting agents (For example, sodium lauryl sulfate), a coloring agent, a flavoring agent, a tableting agent, a stabilizer, an antioxidant, a preservative, water, a saline solution and a phosphate buffer solution. The carrier may be selected from one or more of suitable pharmaceutical formulations according to the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 사용할 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 사용할 수 있다.The excipient may be selected according to the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention. For example, when the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by an aqueous suspension, suitable excipients include sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydropropylmethylcellulose , Sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, and the like can be used. As a suitable excipient when prepared by injection, Ringer's solution, isotonic sodium chloride and the like can be used.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.
The daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is usually 0.001 to 150 mg / kg body weight, and may be administered once or several times. However, since the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is determined in view of various related factors such as route of administration, age, sex, weight, and patient's severity of the patient, the dose is limited in any aspect to the scope of the present invention Should not be understood to be.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 비만 개선제 조성물을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면 지방간 개선제 조성물을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면 고지혈증 개선제 조성물, 인슐린 저항성 개선제 조성물 등을 제공할 수 있다. 본 발명의 비만 개선제 조성물 등은 기능성 식품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.
As described above, according to the present invention, an obesity improving agent composition can be provided. Also, according to the present invention, a composition for improving liver fat remedy can be provided. Also, according to the present invention, a composition for improving hyperlipemia, a composition for improving insulin resistance, and the like can be provided. The composition for obesity-relieving agent of the present invention and the like can be commercialized as a functional food or medicine.

도 1은 제주조릿대 열수 추출물의 크로마토그램과 그 주성분의 분자 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 실험동물에 정상식이를 급여한 경우(ND), 고지방식이를 급여한 경우(HFD) 및 고지방식이와 제주조릿대 추출물을 경구 투여한 경우 실험동물(HFD+SQE)의 체중(body weight)을 5일마다 70일간 측정한 결과이다.
도 3은 실험동물에 정상식이를 급여한 경우(ND), 고지방식이를 급여한 경우(HFD) 및 고지방식이와 제주조릿대 추출물을 경구 투여한 경우(HFD+SQE) 70일 후의 실험동물의 복부지방(epididymal adipose tissue) 세포 크기를 확인한 결과이다.
도 4는 실험동물에 정상식이를 급여한 경우(ND), 고지방식이를 급여한 경우(HFD) 및 고지방식이와 제주조릿대 추출물을 경구 투여한 경우(HFD+SQE) 70일 후의 실험동물의 복부지방에서 아디포넥틴의 RNA 발현을 측정한 결과이다.
도 5는 실험동물에 정상식이를 급여한 경우(ND), 고지방식이를 급여한 경우(HFD) 및 고지방식이와 제주조릿대 추출물을 경구 투여한 경우(HFD+SQE) 70일 후의 실험동물의 복부지방에서 p-AMPK, p-ACC 의 단백질 발현량을 측정한 결과이다.
도 6은 실험동물에 정상식이를 급여한 경우(ND), 고지방식이를 급여한 경우(HFD) 및 고지방식이와 제주조릿대 추출물을 경구 투여한 경우(HFD+SQE) 70일 후의 실험동물의 간조직(liver) 절편을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 제주조릿대 추출물(SQE)의 분화된 3T3-L1 지방세포에서 p-AMPK, p-ACC의 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 8은 제주조릿대 추출물(SQE)의 분화된 L6 골격근 세포에서 p-AMPK, p-ACC의 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 9는 제주조릿대 추출물(SQE)의 지방화가 유도된 HepG2 간 세포에서 p-AMPK, p-ACC의 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 10은 제주조릿대 추출물(SQE)의 분화된 3T3-L1 지방세포에서 CPT-1a의 RNA 발현을 측정한 결과이다.
도 11은 p-쿠마르산이 분화된 3T3-L1 지방세포에서 중성지방의 축적을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 12는 p-쿠마르산이 분화된 3T3-L1 지방세포에서 농도 의존적으로 LKB1의 인산화, AMPK의 인산화 및 ACC의 인산화를 증가시킴을 보여주는 결과이다.
도 13은 p-쿠마르산이 분화된 L6 골격근 세포에서 농도 의존적으로 AMPK 및 ACC의 인산화를 증가시킴을 보여주는 결과이다.
도 14는 p-쿠마르산이 분화된 L6 골격근 세포에서 농도 의존적으로 PPARα 발현을 증가시킴을 보여주는 결과이다.
도 15는 p-쿠마르산이 지방 축적이 유도된 HepG2 세포에서 농도 의존적으로 AMPK 및 ACC의 인산화를 증가시킴을 보여주는 결과이다.
도 16은 p-쿠마르산이 지방 축적이 유도된 HepG2 세포에서 농도 의존적으로 SREBP-1c의 발현을 증가시킴을 보여주는 결과이다. FIG. 1 shows the chromatogram of the hydrothermal extract of Jeju Saury and its molecular structure.
FIG. 2 is a graph showing the body weight (body weight) of experimental animals (HFD + SQE) when fed a normal diet (ND), when fed a high fat diet (HFD) and when fed a high fat diet weight) was measured every 5 days for 70 days.
FIG. 3 is a graph showing the results of an experiment in which the animals were fed a normal diet (ND), a high fat diet (HFD), a high fat diet and an oral diet (HFD + SQE) It is the result of confirming the cell size of epididymal adipose tissue.
FIG. 4 is a graph showing the results of an experiment in which animals were fed a normal diet (ND), a high fat diet (HFD), a high fat diet, and an oral diet (HFD + SQE) This is the result of measuring RNA expression of adiponectin in abdominal fat.
FIG. 5 is a graph showing the results of the experiment (HFD) when the normal diets were fed to the experimental animals (ND), the animals fed the high fat diet (HFD) and the animals fed the oral diet (HFD + SQE) The expression level of p-AMPK and p-ACC protein in abdominal fat was measured.
FIG. 6 is a graph showing the results of the experiment (HFD) when the normal diet was fed to the experimental animals (ND), the experimental animals (HFD + SQE) The results of microscopic observation of liver sections.
FIG. 7 shows the results of measurement of protein expression of p-AMPK and p-ACC in differentiated 3T3-L1 adipocytes of the sake brewer's extract (SQE).
FIG. 8 shows the results of measurement of protein expression of p-AMPK and p-ACC in differentiated L6 skeletal muscle cells of Jeju Bacillus subtilis extract (SQE).
FIG. 9 shows the results of measurement of p-AMPK and p-ACC protein expression in HepG2 liver cells induced by localization of Jeju Bacillus subtilis extract (SQE).
FIG. 10 shows the results of measurement of RNA expression of CPT-1a in differentiated 3T3-L1 adipocytes of the spermatogonium extract (SQE).
Fig. 11 shows that p -cumaric acid inhibits the accumulation of triglycerides in 3T3-L1 adipocytes differentiated.
Figure 12 shows that p -cumaric acid increases phosphorylation of LKB1, phosphorylation of AMPK and phosphorylation of ACC in a concentration-dependent manner in 3T3-L1 adipocytes differentiated.
FIG. 13 shows that p -cumaric acid increases phosphorylation of AMPK and ACC in a concentration-dependent manner in L6 skeletal muscle cells differentiated.
Fig. 14 shows the results showing that PPAR [alpha] expression is increased in a concentration-dependent manner in the L6 skeletal muscle cells in which p -cumaric acid has been differentiated.
FIG. 15 shows that p -cumaric acid increases phosphorylation of AMPK and ACC in a concentration-dependent manner in HepG2 cells induced by fat accumulation.
FIG. 16 shows that p -cumaric acid increases the expression of SREBP-1c in a concentration-dependent manner in HepG2 cells induced by fat accumulation.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples and Experimental Examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples and experimental examples.

<< 실시예Example > > 제주조릿대 추출물의 제조 및 생리활성 물질의 분리Preparation of Jeju Sauce Extract and Isolation of Physiologically Active Substances

<실시예 1> 제주조릿대 추출물의 제조예 1 Example 1 Preparation of Jeju Sauce Extract Preparation Example 1

제주조릿대 6 kg을 수돗물로 수세하고, 동결건조 후 분쇄하였다. 분쇄한 제주조릿대를 물에 침지시켜 90℃에서 4시간 동안 열수추출하고 감압농축 후 추출용매를 제거하여 분말 형태의 제주조릿대 추출물을 얻었다.6 kg of the berry sake of the present invention was washed with tap water, lyophilized and then pulverized. The pulverized Jeju Sauce was immersed in water and subjected to hot water extraction at 90 ° C for 4 hours. After concentration under reduced pressure, the extract solvent was removed to obtain a powdery Jeju sake extract.

<실시예 2> 제주조릿대 추출물의 제조예 2 Example 2 Preparation of Jeju Sauce Extract Preparation Example 2

제주조릿대 6 kg을 수돗물로 수세하고, 동결건조 후 분쇄하였다. 분쇄한 제주조릿대를 그 중량의 3% 만큼의 viscozyme™(Novo Nordisk, Denmark), 3% celluclast™(Novo Nordisk, Denmark)와 구연산(pH 4.5)이 포함된 물에 첨가한 다음 50에서 5시간 동안 추출하고, 100℃에서 1시간 동안 효소를 불활성화시켰다. 그리고 감압농축 후 동결건조시켜 추출용매를 제거하고 분말 형태의 제주조릿대 추출물을 제조하였다. 6 kg of the berry sake of the present invention was washed with tap water, lyophilized and then pulverized. The ground Jeju bran was added to water containing 3% by weight of viscozyme ™ (Novo Nordisk, Denmark), 3% celluclast ™ (Novo Nordisk, Denmark) and citric acid (pH 4.5) And the enzyme was inactivated at 100 DEG C for 1 hour. After concentration under reduced pressure, the extract was freeze-dried to remove the solvent to prepare a powdery Jeju bacillus subtilis extract.

<실시예 3> 생리활성 물질의 분리 Example 3 : Isolation of physiologically active substance

(1) 제주조릿대 추출물의 분획(1) Fraction of Jeju Sori Sago Extract

제주조릿대 추출물 100g을 증류수 1L에 현탁시키고, 여기에 n-hexane, EtOAc, n-BuOH 1L씩을 가하여 각각 3회씩 순차적으로 반복하여 추출한 후 회전농축기를 사용하여 40℃에서 농축하였다.100 g of the bovine syrup extract was suspended in 1 L of distilled water, and 1 L each of n-hexane, EtOAc and n-BuOH was added thereto. The extract was sequentially extracted three times and concentrated at 40 ° C using a rotary evaporator.

(2) 표준용액의 조제(2) Preparation of standard solutions

제주조릿대 열수추출물의 성분 확인을 위한 표준용액은 chlorogenic acid, p-쿠마르산와 tricin 10mg을 1mL의 DMSO(dimethylsulfoxide)로 녹인 후 9mL의 메탄올로 정용한 후 이를 희석하여 표준용액으로 사용하였다.Standard solutions for the identification of components in Jeju Sulfur hydrothermal extract were prepared by dissolving chlorogenic acid, p - cumaric acid and tricin (10 mg) in 1 mL of DMSO (dimethylsulfoxide) and diluting with 9 mL of methanol.

(3) 시험용액의 조제(3) Preparation of Test Solution

상기 <실시예 1>의 제주조릿대 열수추출물 약 500mg을 취해 DMSO 2.5 mL를 넣고 메탄올 2.5mL를 가하여 10분 동안 sonication 한 후 이 추출액을 0.50 mm 테프론(PTFE, polytetrafluoroethylene)과 주사기 필터 (Advantec Toyo Roshi Kaisha Ltd., DISMIC^R-13_JP, Japan)로 여과하여 시험용액으로 사용하였다.2.5 mL of DMSO was added to 2.5 mL of methanol and sonication was performed for 10 minutes. The extract was washed with 0.50 mm polytetrafluoroethylene (PTFE) and a syringe filter (Advantec Toyo Roshi Kaisha Ltd., DISMIC ^R- 13 _JP , Japan).

(4) 화합물의 분석(4) Analysis of compounds

제주조릿대 열수추출물의 정성분석은 HPLC (Waters사, 2695 Alliance system, USA), Sunfire^TM C₁₈ 컬럼 (250 × 4.6 mm ID. 5㎛)를 사용하였고, 컬럼 온도는 40℃를 유지하였다. 제주조릿대 분획의 성분탐색은 PDA 검출기를 이용하여 200 ~ 600 nm 범위의 UV 흡광도에서 검출하였고, 이동상은 MeOH과 초순수를 사용하여 기울기 용리법으로 분리하였다(표 1). 유속은 1.0 mL/min을 유지하였다.Qualitative analysis of Jeju Sasa hot-water extract were used for HPLC (Waters Corporation, 2695 Alliance system, USA), ^TM Sunfire C ₁₈ column (250 × 4.6 mm ID. 5㎛ ), the column temperature was maintained at 40 ℃. The components of Jeju Syrup fractions were detected by UV absorption in the range of 200 ~ 600 nm using PDA detector and mobile phase was separated by gradient elution method using MeOH and ultrapure water (Table 1). The flow rate was maintained at 1.0 mL / min.

(5) 화합물의 분리 및 동정 방법(5) Method for Isolation and Identification of Compound

제주조릿대 열수추출물의 화합물 분리를 위한 장비는 HPLC (Waters사, 2695 Alliance system, USA), Symmetryprep^TM C₁₈ 컬럼(7.8 300 mm ID. 7 m)을 사용하였고, 컬럼 온도는 40℃를 유지하였다. 검출기는 PDA 검출기를 이용하여 200 ~ 600 nm 범위의 UV 흡광도에서 검출하였다. 이동상은 MeOH과 초순수를 사용하여 기울기 용리법으로 분리하였다. 유속은 1.8 mL/min을 유지하였고 머무름 시간이 동일한 peak를 반복 분취하였다. 구조분석에 이용된 NMR (Nuclear Magnetic Resonance) 분광기는 400 MHz FT-NMR (JEOL 사, JNM-LA, Japan)을 이용하였고, 측정 시 용매는 Merck사의 CD₃OD와 CDCl₃을 사용하였다.HPLC (Waters, 2695 Alliance system, USA), Symmetryprep ^TM C ₁₈ column (7.8 300 mm ID, 7 m) was used for the separation of compounds from the hydrothermal extract of Jeju Sulfur. Column temperature was kept at 40 ℃. Detectors were detected at UV absorbance ranging from 200 to 600 nm using a PDA detector. The mobile phase was separated by gradient elution using MeOH and ultrapure water. The flow rate was maintained at 1.8 mL / min and repeated peaks with the same retention time were collected. The nuclear magnetic resonance (NMR) spectrometer used in the structure analysis was 400 MHz FT-NMR (JEOL, JNM-LA, Japan). The solvent used for the measurement was CD ₃ OD and CDCl ₃ from Merck.

(6) 분리된 화합물의 동정(6) Identification of isolated compounds

제주조릿대 열수추출물에 함유되어 있는 3개의 화합물을 HPLC를 사용하여 분리하였고 문헌(J. Agric . Food Chem ., 2007, 55(25), 10086-10092; J. Appl . Biol . Chem., 2008, 51(4), 148-154; Arch . Pharm . Res ., 2007, 30(2), 161-166; Bull . Koeran Chem . Soc ., 2010, 31(4), 1088-1090)과 비교하여 chlorogenic acid, p-쿠마르산, tricin과 동일 화합물임을 확인하였다. 또한 이를 확인하기 위해 각각의 분리된 화합물의 표준물질을 사용하여 정성분석을 실시하였다. 열수추출물에서 분리된 구성 화합물을 확인하기 위해 320nm에서 3번 반복 주입하여 각 화합물 peak의 머무름을 확인하였고, 그 결과 chlorogenic acid peak는 7분 근처에 p-쿠마르산 peak는 10~11분 사이에 tricin peak는 18~19분 사이에 검출되었고 표준용액의 표준물질과 동일한 머무름 및 흡광도를 나타내었다. 제주조릿대 추출물에서 클로로젠산(chlorogenic acid), p-쿠마르산, 트리신(tricin)은 각각 0.132, 23.706, 0.286 mg이 함유되어 있는 것으로 확인되었다(도 1). 제주조릿대 열수 추출물의 주요 구성성분을 분석한 결과, 가장 많은 함량을 나타내는 것은 p-쿠마르산이었다. 따라서 아래의 실험에서는 열수 추출물의 주성분인 p-쿠마르산가 세포 지질대사에 미치는 영향을 조사하였다.
Three compounds contained in the hydrothermal extract of Jeju Saury were separated by HPLC and used in the method described in J. Agric . Food Chem . , 2007, 55 (25), 10086-10092; J. Appl . Biol . Chem., 2008, 51 (4), 148-154;. .. Arch Pharm Res, 2007, 30 (2), 161-166;... Bull Koeran Chem Soc, compared with 2010, 31 (4), 1088-1090 ) chlorogenic acid, p - coumaric acid, and tricin. In order to confirm this, qualitative analysis was carried out using standard substances of each separated compound. In order to identify the constituent compounds isolated from the hot - water extract, the retention of each compound peak was confirmed by repeating 3 times at 320 nm. As a result, the peak of p - Peaks were detected between 18 and 19 minutes and showed the same retention and absorbance as the standards of the standard. Chlorogenic acid, p - coumaric acid, and tricin were found to contain 0.132, 23.706, and 0.286 mg, respectively, in the extract from Jeju Sori (Fig. 1). The major components of the hydrothermal extract of Jeju Sage were p - cumaric acid. Therefore, the effects of p - coumaric acid, a major component of hot - water extract, on cellular lipid metabolism were investigated in the following experiments.

<< 실험예Experimental Example > > 제주조릿대 추출물과 이로부터 분리된 Jeju Sori extract and its isolated pp -쿠마르산의 대사성 질환 개선 활성 실험- Experiments to improve metabolic disease activity of cumaric acid

<< 실험예Experimental Example 1> 1> 제주조릿대 추출물의 대사성 질환 개선 활성 실험Experimental study on improvement of metabolic diseases of Jeju Sasa extract

<실험예 1-1> 동물실험에서 체중 및 체지방 측정 실험 <Experimental Example 1-1> Measurement of body weight and body fat in an animal experiment

(주)나라바이오텍에서 구입한 4주령 C57BL/6 수컷 생쥐를 고형사료와 물을 공급하면서 1주간 적응시킨 후, 체중이 비슷한 생쥐를 무작위로 10 마리씩 3개의 군으로 나누었다. 정상군(ND)은 정상식이, 비만대조군(HFD)은 고지방식이, 실험군(HFD+SQE)은 고지방식이와 상기 제주조릿대 추출물(150mg/kg of body weight/day)을 경구투여 하면서 두 마리씩 분리·사육하였다. 사육환경은 온도 23℃, 습도 50±5%, 밤과 낮을 12시간 주기로 유지시켰다.Four weeks old C57BL / 6 male mice purchased from Nara Biotech Co., Ltd. were adapted for 1 week while feeding solid feed and water, and mice having similar weight were randomly divided into three groups of 10 mice. (HFD + SQE) and the Jeju bokbunja extract (150 mg / kg of body weight / day) were administered orally while the control group (HFD + SQE) Respectively. The incubation environment was maintained at a temperature of 23 ° C, a humidity of 50 ± 5%, and night and day at a cycle of 12 hours.

상기에서 정상식이는 10% kcal 지방식이(Research Diets, USA) 사료를 사용하였고, 고지방식이는 60% kcal 지방식이(Research Diets, USA) 사료를 사용하였다. In this study, 10% kcal diets (Research Diets, USA) were used for normal diet and 60% kcal diets (USA) for high fat diet.

체중에 대한 제주조릿대 추출물의 효과는 5일마다 같은 시간대에 동물체중계를 사용하여 70일간 측정하여 실험 결과를 도 2에 그래프로 나타내었고, 식이 섭취량은 5일마다 같은 시간대에 70일간 측정하여 5일 단위 측정량의 평균(g/cage/5day)을 표 2에 나타내었다. 그리고 70일 동안의 체중 증가 총량(70일 후 최종 체중에서 처음 체중을 제함으로써 측정)을 표 3에 나타내었다. The effect of Jeju Sori extract on body weight was measured by using an animal scales at every 5 days for 70 days. The results of the experiment were shown in FIG. 2, and the dietary intake was measured every 5 days for 70 days at the same time, The average (g / cage / 5day) of the unit measurements is shown in Table 2. And the total weight gain for 70 days (measured by first weight loss in the final body weight after 70 days) is shown in Table 3.

식이 섭취량Dietary intake 구분 division NDND HFDHFD HFD+SQEHFD + SQE 식이 섭취량(g/cage/5day)Dietary intake (g / cage / 5day) 26.57±0.40^a 26.57 ± 0.40 ^a 21.19±0.28^b 21.19 ± 0.28 ^b 21.04±0.28^b 21.04 ± 0.28 ^b * a, b 및 c 사이는 통계적 유의성을 가짐(p<0.05) * There was statistical significance between a, b and c ( p <0.05)

체중 증가 총량Total weight gain 구분division NDND HFDHFD HFD+SQEHFD + SQE 체중 증가량(g)Weight gain (g) 5.65±0.60^a 5.65 ± 0.60 ^a 15.60±0.78^c 15.60 ± 0.78 ^c 10.76±0.59^b 10.76 ± 0.59 ^b *a, b 및 c 사이는 통계적 유의성을 가짐(p<0.05) * There was statistical significance between a, b and c ( p <0.05)

도 2 및 표 3은 제주조릿대 추출물이 투여된 HFD+SQE군의 경우 HFD군에 비해 체중 증가가 유의성 있게 감소하였음을 보여준다. 표 2에서는 HFD+SQE군이 HFD군과 비교하여 식이 섭취량이 적지 않았음을 확인할 수 있다.FIG. 2 and Table 3 show that the weight gain of HFD + SQE group administered with Jeju Sori extract was significantly lower than that of HFD group. Table 2 shows that the HFD + SQE group had lower dietary intake than the HFD group.

복부지방(백색지방)과 신장지방 무게에 대한 제주조릿대 추출물의 효과를 확인하기 위하여, 70일간의 실험이 끝난 다음 에테르로 마취한 후 적출하여 무게를 측정하였고, 그 실험 결과를 표 4에 나타내었는데, HFD+SQE이 HFD군에 비해 백색지방 무게가 덜 증가하였음을 알 수 있다.In order to confirm the effect of Jeju Sori extract on the abdominal fat (white fat) and kidney fat weight, after 70 days of experimentation, the animal was anesthetized with ether and then weighed and weighed. The results of the experiment are shown in Table 4 , And HFD + SQE were less than those of the HFD group.

복부지방과 신장지방의 증가 총량Increase in abdominal fat and kidney fat 구분division NDND HFDHFD HFD+SQEHFD + SQE 복부지방(g)Abdominal fat (g) 0.86±0.05^a 0.86 ± 0.05 ^a 2.02±0.12^c 2.02 ± 0.12 ^c 1.42±0.06^b 1.42 ± 0.06 ^b 신장지방(g)Kidney fat (g) 0.50±0.06^a 0.50 0.06 ^a 1.23±0.07^c 1.23 + 0.07 ^c 0.97±0.06^b 0.97 + 0.06 ^b * a, b 및 c 사이는 통계적 유의성을 가짐(p<0.05) * There was statistical significance between a, b and c ( p <0.05)

한편, 복부지방(epididymal adipose tissue)의 세포 크기에 대한 제주조릿대 추출물의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 에테르로 마취한 후 적출하여 조직 절편 후 세포의 크기를 현미경으로 관찰하였고, 그 실험 결과를 도 3에 군당 개체 2마리의 조직 절편 사진으로 나타내었다. 도 3은 HFD+SQE군의 지방조직 세포 크기는 ND군과 유사한 크기인데 반해 HFD군은 지방조직 크기가 현저하게 증가하였음을 알 수 있다.On the other hand, in order to confirm the effect of Jeju Sori extract on the cell size of epididymal adipose tissue, after 70 days of experiment in Experimental Example 1, anesthetized with ether and then extracted, And the results of the experiment are shown in Fig. 3 as the tissue section photographs of 2 mice per group. FIG. 3 shows that the fat tissue size of the HFD + SQE group was similar to that of the ND group, whereas the fat tissue size of the HFD group was significantly increased.

<실험예 1-2> RT - PCR 를 통한 아디포넥틴 발현량 측정 실험 <Experimental Example 1-2> Measurement of adiponectin expression level by RT - PCR

복부지방(epididymal adipose tissue)의 사이토카인의 발현에 대한 제주조릿대 추출물의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 에테르로 마취한 후 적출하여 전체 RNA 분리 후 Real time RT-PCR 기법으로 측정 하였고, 그 실험 결과를 도 4에 그래프로 나타내었다. In order to confirm the effect of Jeju Sori extract on the expression of cytokines of epididymal adipose tissue, after 70 days of experiment in Experimental Example 1, the cells were anesthetized with ether and then extracted. -PCR technique, and the experimental results are shown in the graph of FIG.

Real-time PCR을 위한 total RNA는 Trizol Reaent(Invitrogen, USA)를 500㎕ 첨가하여 상온에서 5-10 분간 세포를 균질화한 후, 튜브로 옮기고 chloroform 100㎕를 첨가하여 원심분리(12,000 × g, 15분) 하였다. 상층액을 회수하여 새로운 튜브로 옮기고 동량의 isopropanol을 첨가하여 원심분리(12,000 × g, 15분)하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA는 75% 에탄올로 3회 세척하고 건조시킨 후 DEPC 처리된 증류수에 용해시킨 후 nanodrop 2000 spectrometer(Nanodrop, USA)를 이용하여 260㎚의 흡광도를 측정하여 정량하였다. A260/A280 ㎚ 의 비율이 1.8-2.2 범위 내의 값을 갖는 RNA 시료를 DNase(Wako, Japan)를 처리하여 순수한 RNA만을 분리하여 실험에 사용하였다. For total RNA for real-time PCR, 500 μl of Trizol Reaent (Invitrogen, USA) was added, and the cells were homogenized at room temperature for 5-10 minutes. Then, 100 μl of chloroform was added to the tube, centrifuged (12,000 × g, 15 Min). The supernatant was recovered and transferred to a new tube. The same amount of isopropanol was added and the RNA was precipitated by centrifugation (12,000 × g, 15 minutes). The precipitated RNA was washed three times with 75% ethanol, dried, and dissolved in DEPC-treated distilled water. The absorbance at 260 nm was measured using a nanodrop 2000 spectrometer (Nanodrop, USA). RNA samples with a ratio of A260 / A280 nm within the range of 1.8-2.2 were treated with DNase (Wako, Japan) to isolate pure RNA and used in the experiments.

cDNA는 Maxime RT PreMix Kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 합성하였다. 1㎍ total RNA와 nuclease-free water를 총 20㎕가 되게 tube에 넣고 45℃에서 60분, 95℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성한 후 여기에 30㎕의 nuclease-free water를 첨가하여 희석한 후 PCR에 사용하였다. cDNA was synthesized using Maxime RT PreMix Kit (iNtRON Biotechnology, Korea). 1 μg total RNA and nuclease-free water were added to the tube in a total volume of 20 μl. The cDNA was synthesized by reacting at 45 ° C for 60 minutes and 95 ° C for 5 minutes, and then adding 30 μl of nuclease-free water to dilute Were used for PCR.

Real time polymerase chain reaction(PCR)은 5㎕의 cDNA, 각 primer는 0.4㎕(10pmol/L/㎕)씩, 2㎕ nuclease-free water와 6㎕ iQ™ SYBR®Green Supermix(Bio-rad, USA)를 혼합한 후 Peltier thermal cycler(Bio-rad, USA) real time PCR 기기를 이용하여 수행하였다. PCR 조건은 95℃/20초, 65℃/20초, 72℃/30초로하여 49회 증폭하였고 결과는 1회 증폭할 때마다 형광량을 측정하였으며 모든 cycle이 완료된 후 65℃에서 95℃까지 반응시켜 primer의 melting curve 분석을 실시하였다. 결과 분석은 Chromo4 Real-Time PCR Detection System v1.10(Bio-rad, USA)을 이용하여 β-actin 대비 상대적 값으로 정량하였다. Real-time PCR에서 사용된 primer의 염기서열은 adiponectin, 5'-GAC CTG GCC ACT TTC TCC TC-3'(서열번호 1) 및 5'-GTC ATC TTC GGC ATG ACT GG-3'(서열번호 2); β-actin, 5'-AGG CTG TGC TGT CCC TGT AT-3'(서열번호 3) 및 5'-ACC CAA GAA GGA AGG CTG GA-3'(서열번호 4)이다.Real time polymerase chain reaction (PCR) was performed using 5 μl of cDNA and 0.4 μl (10 pmol / L / μl) of each primer, 2 μl of nuclease-free water and 6 μl of iQ ™ SYBR® (Bio-rad, USA) using a Peltier thermal cycler (Bio-Rad, USA). The PCR conditions were amplified 49 times at 95 ° C for 20 seconds, 65 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. The fluorescence intensity was measured for each amplification. The melting curve analysis of the primers was performed. Results were analyzed using a Chromo4 Real-Time PCR Detection System v1.10 (Bio-Rad, USA) relative to β-actin. The nucleotide sequences of the primers used in the real-time PCR were: adiponectin, 5'-GAC CTG GCC ACT TTC TCC TC-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'- GTC ATC TTC GGC ATG ACT GG- ); 3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-ACC CAA GAA GGA AGG CTG GA-3' (SEQ ID NO: 4).

도 4는 HFD군의 아디포넥틴의 발현량이 ND군에 비해 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있고, 그에 반해서 HFD+SQE군의 아디포넥틴의 발현량은 비만대조군에 비해 현저하게 증가하였음을 알 수 있다.FIG. 4 shows that the expression level of adiponectin in the HFD group was significantly lower than that in the ND group, whereas the expression level of adiponectin in the HFD + SQE group was significantly increased compared with the obesity control group.

<실험예 1-3> Western blot 을 통한 p- AMPK 및 p- ACC 의 발현량 측정 실험 <Experimental Example 1-3> Western Expression of p- p- AMPK and ACC by measuring the amount blot experiments

복부지방(백색지방)의 AMPK 활성화에 대한 제주조릿대 추출물의 효과를 확인하기 위하여, 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 에테르로 마취한 후 적출하여 단백질 분리 후 Western blot 기법으로 측정 하였고, 그 실험 결과를 도 5에 사진으로 나타내었다. In order to confirm the effect of Jeju Sori extract on the abdominal fat (white fat) activation, after 70 days of experiment in Experimental Example 1, the extract was anesthetized with ether, and the protein was separated and measured by Western blotting. The results of the experiment are shown in Fig.

Western blot 분석을 위해 시료가 처리된 지방조직을 PBS로 2회 세척 후 1mM PMSF, 1mM Na₃VO₄, 1mM NaF, 1㎍/㎖ aprotinin, 1㎍/㎖ pepstatin, 1㎍/㎖ leupeptin 및 10% RIPA lysis buffer(Upstate Biotechnology, USA)를 함유하고 있는 단백질 분리 시약을 이용해 1시간 동안 vortexing 하여 분해시킨 후 원심분리(15000 rpm, 4℃, 20분)하여 상층액을 획득하였다. 단백질 농도는 Bio-rad protein assay kit(Bio-rad, USA)를 사용하여 micro reader로 595㎚에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. 35㎍의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동으로 분리한 후 poly vinylidene difluoride(PVDF) membrane(Milipore, USA)에 전이(100V, 120분)시켰다. 단백질이 전이된 PVDF membrane은 상온에서 1시간 동안 5% skim milk 또는 5% BSA를 함유한 0.1% Tween 20이 포함된 Tris buffered saline(TTBS) 용액으로 blocking 시킨 후, 1차 항체(p-AMPK, p-ACC, 및 β-actin)와 반응시켰다. p-AMPK antibody(1:2,000, Cell Signaling, USA), p-ACC antibody(1:1,000, Cell Signaling, USA), and β-actin antibody clone AC-74(1:10,000, Sigma, USA)를 이용하여 4℃에서 하루 밤 동안 수행하였다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 0.1% TTBS용액으로 세척한 후 peroxidase-conjugated된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:2,000, 1:5,000 혹은 1:10,000으로 희석하여 1시간동안 반응한 후 TBS-T로 세척하였다. 각 단백질의 발현은 WEST-ZOL western blot detection system(iNtRON Biotechology, Korea)로 반응시켜서 X-ray 필름(Ortho CP-G plus; Agfa Gevaert N.V., Belgium)으로 검출하였다.For Western blot analysis, the adipose tissues treated with the sample were washed twice with PBS and then incubated with 1 mM PMSF, 1 mM Na ₃ VO ₄ , 1 mM NaF, 1 μg / ml aprotinin, 1 μg / ml pepstatin, 1 μg / The supernatant was obtained by centrifugation (15000 rpm, 4 ° C, 20 minutes) by vortexing for 1 hour using a protein separation reagent containing RIPA lysis buffer (Upstate Biotechnology, USA). Protein concentrations were measured and quantified at 595 nm using a micro-reader using the Bio-rad protein assay kit (Bio-Rad, USA). Protein was separated by electrophoresis on 10% SDS-polyacrylamide gel and transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA) for 100 min (120 min). Protein-transferred PVDF membrane was blocked with Tris buffered saline (TTBS) solution containing 0.1% Tween 20 containing 5% skim milk or 5% BSA for 1 hour at room temperature. The primary antibody (p-AMPK, p-ACC, and? -actin). (1: 10,000, Sigma, USA), p-AMPK antibody (1: 2,000, Cell Signaling, USA) and p-ACC antibody RTI ID = 0.0 > 4 C < / RTI > overnight. After washing the membrane with 0.1% TTBS, the peroxidase-conjugated secondary antibody (Jackson ImmunoResearch, USA) was diluted to 1: 2,000, 1: 5,000 or 1: 10,000 and reacted for 1 hour TBS-T. Expression of each protein was detected by X-ray film (Ortho CP-G plus; Agfa Gevaert NV, Belgium) after reacting with WEST-ZOL western blot detection system (iNtRON Biotechology, Korea).

도 5는 HFD군의 AMPK 활성화(p-AMPK) 및 ACC 불활성화(p-ACC)가 ND군에 비해 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있고, 그에 반해서 HFD+SQE군의 AMPK 활성화 및 ACC 불활성화는 HFD군에 비해 현저하게 증가하였음을 알 수 있다.FIG. 5 shows that the AMPK activation (p-AMPK) and ACC inactivation (p-ACC) of the HFD group were significantly decreased compared with the ND group, whereas the AMPK activation and the ACC inactivation of the HFD + Compared with the control group.

<실험예 1-4> 혈중 총콜레스테롤 및 혈중 중성지방 측정 실험 <Experimental Example 1-4> Measurement of total cholesterol and triglyceride in blood

혈중 총콜레스테롤 및 혈중 중성지방 함량에 대한 제주조릿대 추출물의 효과는 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 혈청을 분리하여 분석용 키트(아산제약, 대한민국)를 이용하여 측정하였고, 그 실험 결과를 표 5에 나타내었는데, HFD+SQE군에서 HFD군에 비해 혈중 총콜레스테롤 및 혈중 중성지방 함량이 낮음을 알 수 있다.The effect of Jeju Sori extract on serum total cholesterol and blood triglyceride content was measured by using an assay kit (Asan Pharmaceutical Co., Ltd.) after separating the serum after completion of the experiment for 70 days in Experimental Example 1, As shown in Table 5, the serum total cholesterol and blood triglyceride contents were lower in the HFD + SQE group than in the HFD group.

혈중 총콜레스테롤(T-CHO) 및 혈중 중성지방(TG)의 총 증가량Total increase in serum total cholesterol (T-CHO) and blood triglyceride (TG) 구분division NDND HFDHFD HFD+SQEHFD + SQE T-CHO(mg/dL)T-CHO (mg / dL) 119.71±4.09^a 119.71 + 4.09 ^a 179.14±3.90^c 179.14 ± 3.90 ^c 158.57±2.38^b 158.57 ± 2.38 ^b TG(mg/dL)TG (mg / dL) 92.29±4.86^a 92.29 ± 4.86 ^a 138.43±9.15^b 138.43 + - 9.15 ^b 83.43±3.03^a 83.43 + 3.03 ^a * a, b 및 c 사이는 통계적 유의성을 가짐(p<0.05) * There was statistical significance between a, b and c ( p <0.05)

<실험예 1-5> 간 조직 관찰 실험 <Experimental Example 1-5> Experimental Observation of Liver Tissue

간조직 손상에 대한 제주조릿대 추출물의 효과는 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 에테르로 마취한 후 적출하여 조직 절편 후 현미경 관찰을 통하여 확인하였고, 실험 결과를 도 5에 군당 개체 2마리의 조직 절편 사진으로 나타내었다. 도 6은 HFD+SQE군의 경우 ND군과 유사함을 보여주고 있고 HFD군의 경우는 HFD+SQE군이나 ND군에 비해 다량의 지방구가 증가하였음을 보여주고 있다.The effect of Jeju Sori extract on hepatic tissue injury was confirmed by observing microscopic observation of the tissue section after anesthetizing with ether after 70 days of experiment in Experimental Example 1. The results are shown in Fig. Tissue sections. FIG. 6 shows that the HFD + SQE group is similar to the ND group, and the HFD group has a larger amount of fat globules than the HFD + SQE group or ND group.

<실험예 1-6> 간 손상 지표 효소 활성 측정 실험 <Experimental Example 1-6> Measurement of enzyme activity of liver damage index

간 조직 손상 정도의 지표 효소로 이용되고 있는 GPT, GOT 및 LDH의 수치는 실험예 1에서 70일간의 실험이 끝난 다음 혈청을 분리하여 분석용 키트(아산제약, 대한민국)를 이용하여 측정하였고, 실험 결과를 표 6에 나타내었다. 표 6을 참조하여 보면 HFD+SQE군이 HFD군에 비해 GPT, GOT 및 LDH 수치가 낮음은 물론이고 거의 ND군 수치와 비슷한 것을 알 수 있다.The levels of GPT, GOT, and LDH, which are used as indicator enzymes for liver damage, were measured by the use of an assay kit (Asan Pharmaceutical, Korea) after separating the serum after 70 days of experiment in Experimental Example 1, The results are shown in Table 6. Table 6 shows that the HFD + SQE group had lower GPT, GOT and LDH levels than the HFD group, and was similar to the ND group value.

GPT, GOT 및 LDH 활성GPT, GOT and LDH activity 구분division NDND HFDHFD HFDHFD ++ SQESQE GPT(IU/L)GPT (IU / L) 8.57±0.85^a 8.57 ± 0.85 ^a 17.29±3.03^b 17.29 ± 3.03 ^b 8.29±0.65^a 8.29 ± 0.65 ^a GOP(IU/L)GOP (IU / L) 42.29±1.62^a 42.29 ± 1.62 ^a 57.43±3.14^b 57.43 ± 3.14 ^b 44.00±1.21^a 44.00 ± 1.21 ^a LDH(IU/L)LDH (IU / L) 440.86±80.48^a 440.86 ± 80.48 ^a 981.86±117.44^b 981.86 ± 117.44 ^b 566.57±26.43^a 566.57 ± 26.43 ^a * a, b 및 c 사이는 통계적 유의성을 가짐(p<0.05) * There was statistical significance between a, b and c ( p <0.05)

<실험예 1-7> 세포실험에서의 Western blot 을 통한 p- AMPK 의 발현량 측정 실험 <Experimental Example 1-7> Experiment of cells in Western Measurement of p- AMPK expression level by blot

제주조릿대 추출물이 동물실험에서 AMPK를 활성화시키는 결과를 세포 수준으로 확인하기 위해, 3T3-L1 세포(지방세포), L6 세포(골격근세포), HepG2 세포(간세포)를 배양하여 확인하였고, 실험 결과를 각각 도 7, 도 8 및 도 9에 사진으로 나타내었다. In order to confirm the results of the activation of AMPK in animal experiments, 3T3-L1 cells (adipocytes), L6 cells (skeletal muscle cells) and HepG2 cells (hepatocytes) were cultured and the results were confirmed. 7, 8 and 9, respectively.

분화된 지방세포에 미치는 제주조릿대 추출물의 AMP-activated protein kinase (AMPK) 및 그 substrate인 Acetyl Co-A carboxylase (ACC)의 인산화와 그 하위 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여 지방세포의 분화를 다음과 같이 수행하였다. 3T3-L1 전구지방세포를 10% BCS와 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 6 well cell culture plate (1.6 또는 2.0 × 10⁵ cells/well)에 접종하고 48시간 동안 배양하여 pre-confluent 상태가 되도록 하였다. Pre-confluent 상태에서 배지를 한 번 더 교환하여 48시간을 더 배양하였다. Confluent 상태(분화유도 0일째)에서 배양액을 분화유도 배지[10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA), 1% P/S, 1μM dexamethasone (DEXA.; Sigma, USA), 0.5μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; Sigma, USA) 및 5㎍/㎖ 인슐린(Sigma, USA)이 함유된 DMEM 배지]로 교환하여 2일간(분화유도 2일째) 분화 유도하였다. 다시 2일 후(분화유도 4일째)부터는 실험에 사용할 때까지 2일 마다 10% FBS와 1% P/S가 포함된 DMEM 배지로 교환하였다. 분화유도 8-10일째에 배양용기에서 배지를 제거하고 DMEM로 2번 세척한 후 무혈청 배지(0.5% BSA + DMEM)로 16시간 배양한 후 농도별(20, 100, 250, 500 및 1,000 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하여 AMPK 및 ACC의 인산화를 확인하였다. (AMPK) and its substrate, Acetyl Co-A carboxylase (ACC), on the differentiated adipocytes were investigated. The differentiation of adipocytes Respectively. 3T3-L1 preadipocytes were inoculated into 6 well cell culture plates (1.6 or 2.0 × 10 ⁵ cells / well) using DMEM supplemented with 10% BCS and 1% P / confluent state. The culture medium was further exchanged in the pre-confluent state for 48 hours. In the confluent state (0 day after induction of differentiation), the culture was inoculated into differentiation-inducing medium [10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA), 1% P / S, 1 μM dexamethasone (DEXA .; Sigma, USA), 0.5 μM 3-isobutyl (DMEM medium containing 5 μg / ml-1-methylxanthine (IBMX; Sigma, USA) and 5 μg / ml insulin (Sigma, USA)] for 2 days. After 2 days, the cells were changed to DMEM medium containing 10% FBS and 1% P / S every 2 days until the experiment. At 8-10 days after induction of differentiation, the medium was removed from the culture vessel, washed twice with DMEM, and cultured for 16 hours in serum-free medium (0.5% BSA + DMEM) / Ml) for 24 hours to confirm the phosphorylation of AMPK and ACC.

L6 myotube에 미치는 제주조릿대 추출물의 AMP-activated protein kinase (AMPK) 및 그 substrate인 Acetyl Co-A carboxylase (ACC)의 인산화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 근육세포의 분화를 다음과 같이 수행하였다. L6 myoblast를 10% FBS와 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 12 well cell culture plate (1 × 10⁵ cells/well)에 접종하고 48시간 동안 배양하여 pre-confluent 상태가 되도록 하였다. Pre-confluent 상태에서 배지(10% FBS가 첨가된 DMEM)를 한 번 더 교환하여 48시간을 더 배양하였다. Confluent 상태(분화유도 0일째)에서 배양액을 분화유도 배지(2% FBS가 첨가된 DMEM 배지)로 교환하여 분화 유도하였다. 실험에 사용할 때까지 배지를 2일 마다 동일한 배지로 교환하였다. 분화유도 9-10일째에 배양용기에서 배지를 제거하고 DMEM 배지로 세척한 후 0.5% BSA가 첨가된 DMEM 배지로 4시간 배양하였다. 이후 농도별 (125, 250, 500 및 1,000 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하여 AMPK 및 ACC의 인산화를 확인하였다. To elucidate the effects of Aβ-activated protein kinase (AMPK) and its substrate Acetyl Co-A carboxylase (ACC) on L6 myotube, the differentiation of muscle cells was performed as follows. L6 myoblast was inoculated into a 12-well cell culture plate (1 × 10 ⁵ cells / well) using DMEM supplemented with 10% FBS and 1% P / S and incubated for 48 hours in a pre-confluent state. The culture medium (DMEM supplemented with 10% FBS) was preincubated once more in the pre-confluent state and cultured for another 48 hours. At the confluent state (day 0 differentiation induction), the culture broth was induced to differentiate by changing to differentiation induction medium (DMEM medium supplemented with 2% FBS). The medium was replaced every two days with the same medium until use in the experiment. At 9-10 days after induction of differentiation, the medium was removed from the culture vessel, washed with DMEM medium, and cultured in DMEM medium supplemented with 0.5% BSA for 4 hours. Then, phosphorylation of AMPK and ACC was confirmed by treatment with each concentration (125, 250, 500 and 1,000 / / ml) for 24 hours.

지방-유도된 간세포에 미치는 제주조릿대 추출물의 AMP-activated protein kinase (AMPK) 및 그 substrate인 Acetyl Co-A carboxylase (ACC)의 인산화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 간세포의 지방유도를 다음과 같이 수행하였다. HepG2 세포를 10% FBS와 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 12 well cell culture plate (1 × 10⁶cells/well)에 접종하고 48시간 동안 배양하여, DMEM 배지로 2번 세척한 후 무혈청 배지(0.5% BSA + DMEM)로 16시간 배양한 후 0.4mM palmitate가 함유된 무혈청 배지(0.5% BSA + DMEM)로 24시간 배양하여 HepG2 세포에 지방유도를 하였다. 지방유도 후 배지를 제거하고 무혈청 상태(0.5% BSA + DMEM)로 농도별 (62.5, 125, 250, 500 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하여 AMPK 및 ACC의 인산화를 확인하였다. In order to analyze the effect of the extract of Jeju Bacillus subtilis on lipid-induced hepatocytes on the phosphorylation of AMP-activated protein kinase (AMPK) and its substrate Acetyl Co-A carboxylase (ACC), lipid induction of hepatocytes was performed as follows . HepG2 cells were inoculated into 12 well cell culture plates (1 × 10 ⁶ cells / well) using DMEM supplemented with 10% FBS and 1% P / S, cultured for 48 hours, washed twice with DMEM medium The cells were cultured for 16 hours in serum-free medium (0.5% BSA + DMEM) and cultured in serum-free medium (0.5% BSA + DMEM) containing 0.4 mM palmitate for 24 hours to induce fat in HepG2 cells. After the induction of the fat, the medium was removed and the phosphorylation of AMPK and ACC was confirmed by treatment with serum free (0.5% BSA + DMEM) for 24 hours in concentration (62.5, 125, 250, 500 ㎍ / ㎖).

Western blot 분석을 위해 시료가 처리된 세포를 PBS로 2회 세척 후 1mM PMSF, 1mM Na₃VO₄, 1mM NaF, 1㎍/㎖ aprotinin, 1㎍/㎖ pepstatin 1㎍/㎖ leupeptin 및 10% RIPA lysis buffer(Upstate Biotechnology, USA)를 함유하고 있는 단백질 분리 시약을 이용해 1시간 동안 vortexing 하여 분해시킨 후 원심분리(15000 rpm, 4℃, 20분)하여 상층액을 획득하였다. 단백질 농도는 Bio-rad protein assay kit(Bio-rad, USA)을 사용하여 micro reader로 595㎚에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. 35㎍의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동으로 분리한 후 poly vinylidene difluoride(PVDF) membrane(Milipore, USA)에 전이(100V, 120분)시켰다. 단백질이 전이된 PVDF membrane은 상온에서 1시간 동안 5% skim milk 또는 5% BSA를 함유한 0.1% Tween 20이 포함된 Tris buffered saline(TTBS) 용액으로 blocking 시킨 후, 1차 항체(p-AMPK, AMPK, p-ACC, ACC 및 β-actin)와 반응시켰다. p-AMPK antibody(1:2,000, Cell Signaling, USA), AMPKα antibody(1:5,000, Cell Signaling, USA), p-ACC antibody(1:1,000, Cell Signaling, USA), ACC antibody(1:1,000, Cell Signaling, USA) and β-actin antibody clone AC-74(1:10,000, Sigma, USA)를 이용하여 4℃에서 하루 밤 동안 수행하였다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 0.1% TTBS용액으로 세척한 후 peroxidase-conjugated된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:2,000, 1:5,000 혹은 1:10,000으로 희석하여 1시간동안 반응한 후 TBS-T로 세척하였다. 각 단백질의 발현은 WEST-ZOL western blot detection system(iNtRON Biotechology, Korea)로 반응시켜서 X-ray 필름(Ortho CP-G plus; Agfa Gevaert N.V., Belgium)으로 검출하였다.For Western blot analysis, the cells treated with the sample were washed twice with PBS and incubated with 1 mM PMSF, 1 mM Na ₃ VO ₄ , 1 mM NaF, 1 μg / ml aprotinin, 1 μg / ml pepstatin 1 μg / ml leupeptin and 10% RIPA lysis (Upstate Biotechnology, USA) for 1 hour, followed by centrifugation (15000 rpm, 4 ° C, 20 minutes) to obtain supernatant. Protein concentrations were measured and quantified at 595 nm using a micro-reader using the Bio-rad protein assay kit (Bio-Rad, USA). Protein was separated by electrophoresis on 10% SDS-polyacrylamide gel and transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA) for 100 min (120 min). Protein-transferred PVDF membrane was blocked with Tris buffered saline (TTBS) solution containing 0.1% Tween 20 containing 5% skim milk or 5% BSA for 1 hour at room temperature. The primary antibody (p-AMPK, AMPK, p-ACC, ACC and beta-actin). ACC antibody (1: 1,000, Cell Signaling, USA), ACC antibody (1: 1,000, Cell Signaling, USA) and p-AMPK antibody Cell Signaling, USA) and β-actin antibody clone AC-74 (1: 10,000, Sigma, USA) overnight at 4 ° C. After washing the membrane with 0.1% TTBS, the peroxidase-conjugated secondary antibody (Jackson ImmunoResearch, USA) was diluted to 1: 2,000, 1: 5,000 or 1: 10,000 and reacted for 1 hour TBS-T. Expression of each protein was detected by X-ray film (Ortho CP-G plus; Agfa Gevaert NV, Belgium) after reacting with WEST-ZOL western blot detection system (iNtRON Biotechology, Korea).

도 7, 도 8 및 도 9를 참조하여 보면 제주조릿대 추출물이 세 종류의 세포 모두에서 AMPK 활성을 증가시키는 것을 알 수 있다.Referring to FIGS. 7, 8 and 9, it can be seen that the extract of Jeju Soser is increased in AMPK activity in all three kinds of cells.

<실험예 1-8> RT - PCR 를 통한 CPT -1a 발현량 측정 실험 <Experimental Example 1-8> Measurement of CPT- 1a expression level by RT - PCR

특히, 제주조릿대 추출물이 3T3-L1 세포에서 지방산의 β-산화 정도를 측정하는 지표인 AMPK 하위 조절자 CPT-1a의 RNA 발현을 확인하였고, 실험 결과를 도 9에 그래프로 나타내었다. 도 10을 참조하여 보면 제주조릿대 추출물이 CPT-1a 발현을 증가시키는 것을 알 수 있다.In particular, the expression of the RNA of the AMPK subadjustor CPT-1a, which is an index for measuring the degree of β-oxidation of fatty acids in 3T3-L1 cells, was confirmed by Jeju Sori extract and the results of the experiment are shown in FIG. Referring to FIG. 10, it can be seen that the extract of Jeju Sauce Extract increased the expression of CPT-1a.

cDNA는 Maxime RT PreMix Kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 합성하였다. 1㎍ total RNA와 nuclease-free water를 총 20㎕가 되게 tube에 넣고 45℃ 60분, 95℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성한 후 여기에 30㎕의 nuclease-free water를 첨가하여 희석한 후 PCR에 사용하였다. cDNA was synthesized using Maxime RT PreMix Kit (iNtRON Biotechnology, Korea). 1 μg total RNA and nuclease-free water were added to the tube in a total volume of 20 μl. The cDNA was synthesized by reacting at 45 ° C for 60 minutes and 95 ° C for 5 minutes, followed by addition of 30 μl of nuclease-free water PCR.

Real time polymerase chain reaction(PCR)은 5㎕의 cDNA, 각 primer는 0.4㎕(10pmol/L/㎕)씩, 2㎕ nuclease-free water와 6㎕ iQ™ SYBR®Green Supermix(Bio-rad, USA)를 혼합한 후 Peltier thermal cycler(Bio-rad, USA) real time PCR 기기를 이용하여 수행하였다. PCR 조건은 95℃/20초, 65℃/20초, 72℃/30초로하여 49회 증폭하였고 결과는 1회 증폭할 때 마다 형광량을 측정하였으며 모든 cycle이 완료된 후 65℃에서 95℃까지 반응시켜 primer의 melting curve 분석을 실시하였다. 결과 분석은 Chromo4 Real-Time PCR Detection System v1.10(Bio-rad, USA)을 이용하여 β-actin 대비 상대적 값으로 정량하였다. Real-time PCR에서 사용된 primer의 염기서열은 carnitine palmitoyltransferase-1a(CPT-1a), 5'-ACC CTG AGG CAT CTA TTG ACA-3'(서열번호 5) 및 5'-TGA CAT ACT CCC ACA GAT GGC-3'(서열번호 6); β-actin, 5'-AGG CTG TGC TGT CCC TGT AT-3'(서열번호 7) 및 5'-ACC CAA GAA GGA AGG CTG GA-3'(서열번호 8)이다.Real time polymerase chain reaction (PCR) was performed using 5 μl of cDNA and 0.4 μl (10 pmol / L / μl) of each primer, 2 μl of nuclease-free water and 6 μl of iQ ™ SYBR® (Bio-rad, USA) using a Peltier thermal cycler (Bio-Rad, USA). The PCR conditions were amplified 49 times at 95 ° C for 20 seconds, 65 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. The fluorescence intensity was measured for each amplification. The melting curve analysis of the primers was performed. Results were analyzed using a Chromo4 Real-Time PCR Detection System v1.10 (Bio-Rad, USA) relative to β-actin. The base sequences of the primers used in the real-time PCR were carnitine palmitoyltransferase-1a (CPT-1a), 5'-ACC CTG AGG CAT CTA TTG ACA-3 'and 5'- TGA CAT ACT CCC ACA GAT GGC-3 '(SEQ ID NO: 6); 3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-ACC CAA GAA GGA AGG CTG GA-3' (SEQ ID NO: 8).

<< 실험예Experimental Example 2> 2> pp -쿠마르산의 대사성 질환 개선 활성 실험- Experiments to improve metabolic disease activity of cumaric acid

<실험예 2-1> 전구지방세포의 지방세포로의 분화 억제 활성 실험 <Experimental Example 2-1> Inhibitory activity on differentiation of adipocytes in adipocytes

3T3-L1 전구지방세포는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다. 3T3-L1 전구지방세포는 1% penicillin/streptomysin (PS), 10% bovine calf serum (BCS)이 포함된 Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에서 37℃, 5% CO₂의 환경에서 배양하였다. 3T3-L1 precursor adipocytes were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). 3T3-L1 precursor adipocytes were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) medium containing 1% penicillin / streptomysin (PS) and 10% bovine calf serum (BCS) at 37 ° C and 5% CO ₂ .

세포가 가득 찬 상태에서 2일 정도 더 배양 후 세포들은 1% PS, 10% fetal bovine serum (FBS), MDI(0.5mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1M dexamethasone, 1㎍/mL insulin)이 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 분화를 유도하였다. 분화 유도 2일 후에는 1% PS, 10% FBS, 1㎍/mL insulin이 포함된 DMEM 배지로 교체해 주었으며, 다시 2일 후에는 1% PS, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지로 교체하였으며, 이 배지를 실험 전까지 2일 마다 교체해주었다.Cells were incubated in DMEM medium containing 1% PS, 10% fetal bovine serum (FBS), MDI (0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 M dexamethasone, 1 μg / To induce differentiation. After 2 days of induction of differentiation, the medium was replaced with DMEM medium containing 1% PS, 10% FBS and 1 μg / mL insulin. After 2 days, the medium was replaced with DMEM medium containing 1% PS and 10% FBS The medium was changed every 2 days until the experiment.

지방세포 분화 유도 동안 시료(p-쿠마르산)를 100uM의 농도로 각 배지에 처리하였고, 분화가 완성되는 시점인 8일째에 지방세포 분화 정도를 관찰하였다. 구체적으로 3T3-L1 전구지방세포는 분화유도 8일 후, PBS (Phosphate-buffered saline)로 두 번 세척하였고 3.7% formaldehyde 로 1시간 동안 고정하였다. 이후 1차 증류수로 두 번 세척 후 0.6% Oil Red O 시약을 처리하여 1시간 동안 염색을 실시하였다. 염색 후 Oil Red O를 제거하여 1차 증류수로 두 번 세척 후 세포를 건조하였고, 염색된 지방방울을 정량하기 위하여 4% Nonidet P-40을 첨가하였다. 이후 540nm의 흡광도에서 수치를 측정하였고, 결과는 순수 분화유도 시킨 세포의 흡광도와 시료를 처리한 세포의 흡광도를 비교하여 나타내었다.During induction of adipocyte differentiation ( p - coumaric acid) was treated in each medium at a concentration of 100 uM and the degree of adipocyte differentiation was observed on the 8th day when the differentiation was completed. Specifically, 3T3-L1 precursor adipocytes were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) 8 days after induction of differentiation and fixed with 3.7% formaldehyde for 1 hour. After washing twice with distilled water, 0.6% Oil Red O reagent was applied and stained for 1 hour. After dyeing, Oil Red O was removed, washed twice with primary distilled water, and cells were dried. 4% Nonidet P-40 was added to quantify stained fat droplets. Thereafter, the absorbance at 540 nm was measured, and the results were compared with the absorbance of the cells induced by pure differentiation and the absorbance of the cells treated with the sample.

결과를 도 11에 나타내었다. 도 11을 참조하여 보면, Day4 ~ Day8 동안 p-쿠마르산를 처리한 군에서 TG 함량이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있다. 이러한 효과는 p-쿠마르산가 지방세포 분화 이후 TG의 합성 및 lipolysis와 관련이 있다고 추측할 수 있다.The results are shown in Fig. 11, it can be seen that the TG content was significantly decreased in the group treated with p -cumaric acid during Day 4 to Day 8. This effect can be assumed to be related to the synthesis and lipolysis of TG after the adipocyte differentiation of p - coumaric acid.

<실험예 2-2> 분화된 3 T3 - L1 지방세포에서 Western blot 을 통한 p- LKB1 및 p-AMPK의 발현량 측정 실험 <Experimental Example 2-2> The differentiation 3 T3 - L1 adipocytes in the Western LKB1 p- and p-AMPK expression level measured in the experiment with the blot

분화된 3T3-L1 지방세포에서 p-쿠마르산가 지방 산화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Day 8일째 분화된 지방세포를 0.2% BSA, 1% PS가 포함된 DMEM 배지에서 12시간 동안 starvation 하여, 배지를 제거한 후 10%FBS, 1% PS가 포함된 DMEM 배지와 p-쿠마르산를 농도별로 처리하였다. To examine the effect of p -coumaric acid on lipid oxidation in differentiated 3T3-L1 adipocytes, the adipocytes differentiated on day 8 were starvated in DMEM medium containing 0.2% BSA and 1% PS for 12 hours, And DMEM medium containing 10% FBS and 1% PS and p - coumaric acid were treated by concentration.

배양된 세포들은 차가운 PBS로 세척하였고, lysis buffer [1×RIPA (Upstate Biotechnology, Temecula, CA, USA), 1mM phenylemthyl-sulfonyl fluoride, 1mM, 1mM NaF, 1㎍/mL aprotinin, 1㎍/mL pepstatin, 1㎍/mL leupeptin]를 사용하여 세포를 수확하였고, 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 원심분리를 통하여 세포찌꺼기를 제거하였고, 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 Bio-Rad protein Assay reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 통해서 정량하였다. 정량한 단백질은 SDS를 함유하고 있는 10% Polyacrylamide gel을 통해서 전기영동 하였고, polyvinylidene difluoride membranes에 transfer 하였다. Membranes은 5% BSA, 0.1% Tween 20을 포함하는 Tris-bufferd saline (TBS)에서 1시간 동안 Blocking 처리하였다. 이후 1차 Anti-body를 4℃ 에서 16 시간 이상 처리하였고, 2차 Anti-body는 상온에서 1 시간 동안 처리하였다. 타겟 단백질은 ECL western blotting detection reagent (Amersham Biosciences)을 통해서 확인되었다.The cultured cells were washed with cold PBS and lysed with 1 mM RIPA (Upstate Biotechnology, Temecula, CA, USA), 1 mM phenylemthyl-sulfonyl fluoride, 1 mM, 1 mM NaF, 1 μg / mL aprotinin, Cells were harvested using 1 μg / mL leupeptin and reacted on ice for 1 hour. Then, cell debris was removed by centrifugation, and proteins were separated. The separated proteins were quantified using Bio-Rad protein assay reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif., USA). The quantified protein was electrophoresed through 10% polyacrylamide gel containing SDS and transferred to polyvinylidene difluoride membranes. Membranes were blocked in Tris-buffered saline (TBS) containing 5% BSA and 0.1% Tween 20 for 1 hour. Then, the primary anti-body was treated at 4 ° C for at least 16 hours, and the secondary anti-body was treated at room temperature for 1 hour. Target proteins were identified by ECL western blotting detection reagent (Amersham Biosciences).

결과를 도 12에 나타내었다. 도 12를 참조하여 보면, p- 쿠마르산는 분화된 3T3-L1세포에서 AMPK를 활성화시킨다고 알려진 LKB1의 인산화를 증가시켰으며, AMPK와 ACC의 인산화 역시 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 p-쿠마르산가 지방세포에서 지질의 축적을 억제시키며, 성숙한 지방세포에서는 AMPK signal을 통해서 β-oxidation과 같은 지질대사를 활성화 시킴으로써 항비만 효과를 나타낸다는 것을 암시한다.The results are shown in Fig. Referring to FIG. 12, it was confirmed that p- cumaric acid increased phosphorylation of LKB1, which is known to activate AMPK in differentiated 3T3-L1 cells, and phosphorylation of AMPK and ACC were also increased. These results suggest that p - coumaric acid inhibits lipid accumulation in adipocytes and activates lipid metabolism such as β - oxidation through AMPK signal in mature adipocytes.

<실험예 2-3> 분화된 L6 세포에서 Western blot 을 통한 p- AMPK 및 p- ACC 의 발현량 측정 실험 <Experiment 2-3> In Western differentiated L6 cells Expression of p- p- AMPK and ACC by measuring the amount blot experiments

Rat 유래 L6 골격근 세포주는 ATCC에서 구입하였다. 세포는 10% FBS와 1% PS가 포함된 DMEM에서 배양하였고, 37℃의 5% CO₂ 조건을 유지하였다. 세포 분화를 위하여 실험에 사용하기 전까지 이틀마다 2% FBS가 함유된 DMEM 배지로 교체하였다. 분화된 L6 세포는 0.5% bovine serum albumin (BSA)이 포함된 serum-free DMEM으로 4시간 동안 절식 배양한 후, p-쿠마르산를 농도별로 48시간 처리하였다.Rat derived L6 skeletal muscle cell line was purchased from ATCC. Cells were cultured in DMEM containing 10% FBS and 1% PS and maintained at 37 ° C in 5% CO ₂ . For cell differentiation, the medium was replaced with DMEM medium containing 2% FBS every two days before use in the experiment. The differentiated L6 cells were cultured for 48 hours in serum-free DMEM containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) and treated with p-coumaric acid for 48 hours.

다음 상기 <실험예 2-2>와 동일한 방법으로 AMPK와 ACC의 인산화 정도를 Western blot을 통해 분석하였다.The degree of phosphorylation of AMPK and ACC was analyzed by Western blot in the same manner as in <Experimental Example 2-2>.

결과를 도 13에 나타내었다. 도 13을 참조하여 보면, 대조군에 비하여 p-쿠마르산를 처리한 군의 AMPK와 ACC의 인산화가 농도의존적으로 증가하였음을 알 수 있다. 특히, 최고 농도인 50uM에서 AMPK, ACC 모두 인산화 정도에 있어서 현저한 증가를 보였다. 이는 p-쿠마르산가 분화된 L6 세포에서 AMPK를 활성화시킴으로써 AMPK의 downstream인 ACC가 인산화되었다고 판단된다. 인산화된 ACC는 궁극적으로 미토콘드리아 내의 지방산 산화(fatty acid β-oxidation)에 관여한다고 보고되어 있다(FENS let., 223 (2): 217-222, 2003). 따라서 p-쿠마르산는 AMPK를 활성화시킴으로써 세포 내 β-oxidation에 관여할 것이라고 사료된다.The results are shown in Fig. 13, phosphorylation of AMPK and ACC in the group treated with p -coumaric acid was increased in a concentration-dependent manner as compared with the control group. In particular, at 50 uM, the highest concentration, AMPK and ACC showed a marked increase in the degree of phosphorylation. This suggests that ACC, which is the downstream of AMPK, is phosphorylated by activating AMPK in p6 - lysates of p - coumaric acid. Phosphorylated ACC is ultimately reported to be involved in fatty acid β-oxidation in mitochondria (FENS let., 223 (2): 217-222, 2003). Therefore, p - coumaric acid may be involved in intracellular β - oxidation by activating AMPK.

<실험예 2-4> 분화된 L6 세포에서 Western blot 을 통한 PPAR α 발현량 측정 실험 <Experimental Example 2-4> In the differentiated L6 cells, Western Measurement of PPARα expression level by blot

상기 <실험예 2-3>과 동일한 방법으로 p-쿠마르산를 농도별로 48시간 처리하고, 상기 <실험예 2-2>와 동일한 방법으로 PPARα의 발현량을 Western blot을 통해 분석하였다.The expression level of PPAR? Was analyzed by Western blotting in the same manner as in <Experimental Example 2-3>, and p -cumaric acid was treated for 48 hours according to the concentration in the same manner as in <Experimental Example 2-2>.

결과를 도 14에 나타내었다. 도 14을 참조하여 보면, 대조군의 PPARα 발현과 비교하여 p-쿠마르산를 처리한 군의 PPARα 발현이 증가하였음을 알 수 있다. Peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs)는 지질 대사와 에너지 항상성에 관련된 유전자 발현을 조절한다고 알려져 있다(Diabetes, 52: 2249-2259, 2003). 특히, PPAR는 지방산을 이용하여 에너지를 만들어내는 과정인 β-oxidation과 관련된 유전자의 전사 조절에 중요한 역할을 한다(Molecular and cellular biology, 20 (5): 1868-1876, 2000). 이처럼 β-oxidation과 관련된 유전자 발현을 조절하는 PPARα 발현 증가는 p-쿠마르산가 분화된 L6 세포에서 β-oxidation에 관여한다는 것을 시사하고 있다.The results are shown in FIG. Referring to FIG. 14, PPARa expression in the group treated with p -cumaric acid was increased compared with the expression of PPARa in the control group. Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are known to modulate gene expression associated with lipid metabolism and energy homeostasis (Diabetes, 52: 2249-2259, 2003). In particular, PPAR plays an important role in the transcriptional regulation of genes involved in β-oxidation, a process that uses fatty acids to produce energy (Molecular and cellular biology, 20 (5): 1868-1876, 2000). Thus, the increase in PPARα expression, which regulates gene expression associated with β-oxidation, suggests that p -coumaric acid is involved in β-oxidation in differentiated L6 cells.

<실험예 2-5> HepG2 세포에서 Western blot 을 통한 p- AMPK 및 p- ACC 의 발현량 측정 실험 <Experimental Example 2-5> HepG2 cells were treated with Western Expression of p- p- AMPK and ACC by measuring the amount blot experiments

HepG2 세포주는 ATCC에서 구입하였다. 세포배양은 10% FBS에 1% PS가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건하의 환경에서 배양하였다. 세포는 T-75 cell culture flask 바닥에 세포가 80% 정도 찼을 때 계대 배양하여 유지하였다. HepG2 세포의 지방 축적 유도는 Gomez-Lechon 등의 방법(Chem Biol Interact., 165 (2): 106-116, 2007)을 변형하여 수행하였다. HepG2 세포를 10% FBS와 1% PS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 6 well cell culture plate에 접종(1 × 10⁶ cells/well)하고 6 well cell culture plate 바닥에 80% 정도 찬 상태가 될 때까지 배양하였다. 세포가 80% 정도 찬 상태에서 0.5% BSA가 함유된 DMEM 배지에서 Starvation overnight을 하였다. 자유유리지방산인 oleic acid를 600uM 와 p-쿠마르산가 첨가한 배지로 교환한 뒤 24시간 동안 배양하여 HepG2 세포에 지방 축적을 유도하였다. 세포에 oleic acid 600M과 p-쿠마르산를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하고 상기 <실험예 2-2>와 동일한 방법으로 p-AMPK 및 p-ACC의 발현량을 Western blot을 통해 분석하였다.HepG2 cell line was purchased from ATCC. Cell culture was performed in DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% PS at 37 ° C and 5% CO ₂ . Cells were maintained in subculture at the bottom of the T-75 cell culture flask when cells were 80% full. The induction of lipid accumulation of HepG2 cells was performed by modifying the method of Gomez-Lechon et al. (Chem Biol Interact., 165 (2): 106-116, 2007). HepG2 cells were inoculated into a 6-well cell culture plate (1 × 10 ⁶ cells / well) using DMEM supplemented with 10% FBS and 1% PS . Starvation overnight was performed in DMEM medium containing 0.5% BSA in a state where the cells were about 80% cold. Oleic acid, a free fatty acid, was replaced with media supplemented with 600 uM and p - coumaric acid, and cultured for 24 hours to induce lipid accumulation in HepG2 cells. Cells were treated with oleic acid 600M and p -coumaric acid at various concentrations and cultured for 24 hours. The expression levels of p-AMPK and p-ACC were analyzed by Western blot in the same manner as in <Experimental Example 2-2>.

결과를 도 15에 나타내었다. 도 15를 참조하여 보면 지방산 산화에 관여하는 AMPK, ACC 인산화가 농도의존적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.The results are shown in Fig. Referring to FIG. 15, it can be seen that AMPK and ACC phosphorylation, which are involved in fatty acid oxidation, increase in a concentration-dependent manner.

<실험예 2-5> HepG2 세포에서 Western blot 을 통한 SREBP -1c의 발현량 측정 실험 <Experimental Example 2-5> HepG2 cells were treated with Western Measurement of expression level of SREBP- 1c by blot

상기 <실험예 2-4>와 동일한 방법으로 지방축적을 유도한 세포에 oleic acid 600M과 p-쿠마르산를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하고 상기 <실험예 2-2>와 동일한 방법으로 SREBP-1c의 발현량을 Western blot을 통해 분석하였다.In the same manner as in <Experimental Example 2-4>, oleic acid 600M and p -coumaric acid were treated at different concentrations for 24 hours, and SREBP- 1c were analyzed by Western blotting.

결과를 도 16에 나타내었다. 도 16을 참조하여 보면 지방산과 중성지방의 합성에 관여하는 SREBP-1c가 농도 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있다.
The results are shown in Fig. 16, SREBP-1c, which is involved in the synthesis of fatty acids and triglycerides, decreases in a concentration-dependent manner.

Claims

A composition for improving obesity comprising p - coumaric acid as an active ingredient.

The method of claim 1,
Wherein the composition is a food composition.

The method of claim 1,
Wherein the composition is a pharmaceutical composition.

A composition for improving hyperlipemia comprising p - coumaric acid as an active ingredient.

5. The method of claim 4,
Wherein the composition is a food composition.

5. The method of claim 4,
Wherein the composition is a pharmaceutical composition.

A composition for improving fatty liver comprising p - coumaric acid as an active ingredient.

8. The method of claim 7,
Wherein the composition is a food composition.

8. The method of claim 7,
Wherein the composition is a pharmaceutical composition.