KR20140022996A - 헬릭스 링커로 연결된 아타신 및 콜레옵테리신 재조합 항균 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

헬릭스 링커로 연결된 아타신 및 콜레옵테리신 재조합 항균 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 5'에서 3' 방향으로, 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래의 아타신(attacin) 유전자, 헬릭스를 형성하는 링커 단백질 코딩 유전자 및 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 유전자를 재조합시킨 재조합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질을 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질, 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항균용 미생물 제제 및 상기 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.

Description

헬릭스 링커로 연결된 아타신 및 콜레옵테리신 재조합 항균 단백질 및 이의 용도{Antibacterial attacin-coleoptericin hybrid protein linked by helical linker and uses thereof}
본 발명은 헬릭스 링커로 연결된 아타신 및 콜레옵테리신 재조합 항균 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 5'에서 3' 방향으로, 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래의 아타신(attacin) 유전자, 헬릭스를 형성하는 링커 단백질 코딩 유전자 및 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 유전자를 재조합시킨 재조합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질을 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질, 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항균용 미생물 제제 및 상기 미생물 제제의 제조 방법에 관한 것이다.
곤충에서 세포성 및 체액성 반응과 연관된 선천성 면역 체계는 다양한 병원균의 침투에 의해 유도된다. 세포 내 면역은 혈구 부착, 식균작용, 질소고정(nodulation) 및 캡슐화와 연관되어 있고, 멜라닌을 생성하는 프로페놀옥시다제 캐스케이드(prophenoloxidase cascade)와도 연관되어 있다. 세포성 반응과는 대조적으로, 항균 펩타이드는 체액성 면역의 주요한 인자이다. 항균 펩타이드는 침입한 미생물에 대한 반응으로 주로 지방 조직에서 합성되고, 혈체강(hemocoel)에서 분비된다. 병원균이 곤충의 혈체강에 침입하면, 항균 펩타이드는 두 가지 주요한 신호 전달 경로인 NF-kB 경로 Toll 및 침입 병원균 제거의 결과로 나타나는 면역 결핍(immune deficiency, Imd)에 의해 생성된다. 파리류(Diptera), 반시류(Hemiptera), 초시류(Coleopteran) 및 인시류(Lepidoptera)의 세크로핀(cecropin), 드로소신(drosocin), 메치니코윈(metchnikowins), 파이로코리신(pyrrhocoricin), 딥테리신(diptericins), 아타신(attacins), 타나틴(thanatin), 디펜신(defensins), 드로소마이신(drosomycin), 콜레옵테리신(coleoptericin), 글로베린(gloverin), 모리신(moricin) 또는 레보신(lebocin)과 같은 항균 활성을 나타내는 항균 펩타이드들이 곤충에서 지난 30여 년간 분리되었다.
아타신(attacin)은 세크로피아 나방(Hyalophora cecropia), 노랑초파리(Drosophila melanogaster), 집파리(Musca domestica ), 무늬밤나방(Trichoplusia ni ), 에리잠(Samia cynthia ricini ), 누에나방(B. mori ) 및 산누에나방(Antheraea pernyi )과 같은 몇몇 곤충에서 분리되었고, 넓은 항균 범위를 갖는다. 주로 α-헬릭스(helix), β-헤어핀(hairpin) 및 코일(coil)의 세 가지 다른 구조가 아타신의 단백질 구조에서 발견되었고, 상기 세 가지 구조의 위치는 α-헬릭스를 포함하는 N-말단 영역을 제외하고 곤충의 종마다 상이했다. 곤충에서 증가된 α-헬릭스의 수치로 인해 그람-양성 및 그람-음성 박테리아에 대한 항균 활성이 두 배 이상 증가된 것으로 나타났다. 항균 펩타이드의 β-가닥 구조 또한 항균 활성에서 매우 중요한 것으로 나타났다. 특히, 파밤나방(Spodoptera exigua)의 아타신은 다른 곤충의 아타신에 비해 더 많은 α-헬릭스 구조를 가지고 있었고, 이로 인해 다른 아타신 보다 더욱 강한 항균 활성을 나타내는 것으로 보인다.
콜레옵테리신-유사 단백질(coleoptericin-like protein)에는 콜레옵테리신(coleoptericin), 아칼로렙틴(acaloleptin), 홀로트리신(holotricin), 리노세로신(rhinocerosin) 등이 있다. 또한 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia), 빅밀웜( Zophobas atratus), 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma), 큰우단하늘소(Acalolepta luxuriosa) 및 쌀바구미(Sitophilus oryzae)와 같은 곤충에서 분리되었다. 콜레옵테리신-유사 단백질은 약 70개 잔기 단백질이며, 그람-양성 및 그람-음성 박테리아에 대응하여 살균작용을 하는 글리신(glycine) 및 프롤린(proline)이 풍부한 항균 펩타이드이다. 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis)에서 유래한 콜레옵테리신-유사 단백질은 몇몇 미생물에 대응하는 항균 활성을 나타냈다.
기존 항생제의 계속적인 사용은 박테리아 균주의 내성을 가져오기 때문에, 새로운 항균 펩타이드의 분리는 항생제의 대체 물질 개발을 가능하게 한다. 최근 항균 펩타이드는 비교적 작은 크기로 합성이 용이하고, 다양한 병원균에 대해 빠르고 효과적인 활성을 지니며, 넓은 범위의 항균 활성을 제공하고, 척추동물 세포에 낮은 독성을 지니고 있기 때문에 기존의 항생제를 대신하여 의학 및 농업에 적용 가능한 자연 항생제로 인식되고 있다. 특정 기능을 지닌 단백질을 생성하기 위해, 단백질 서열은 다른 단백질의 서열과 조합, 연결 또는 혼합될 수 있고 상기 결과로 형성된 단백질은 재조합(hybrid), 융합(fusion) 또는 키메라(chimeric) 단백질이라 불린다. 현재까지, 항균 펩타이드의 재조합 단백질에 대해 소수의 연구가 진행되었으며, 그 결과로 초기 단백질에 비교하여 미생물에 대해 개선된 독성 효과를 나타내었다(Kovalskaya et al., 2011 The Open Plant Science Journal 5, 29-42).
한편, 한국공개특허 제2010-0100246호에는 '호랑나비 유충에서 분리한 항균 펩타이드 유전자 및 항균 펩타이드'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0964136호에는 '울도하늘소 유충으로부터 분리한 항균 및 항진균 펩타이드 유전자 및 항균 및 항진균 활성을 가지는 합성 펩타이드'가 개시되어 있으나, 본 발명의 헬릭스 링커로 연결된 아타신 및 콜레옵테리신 재조합 항균 단백질 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래 아타신(attacin) 유전자, 헬릭스를 형성하는 링커 및 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 유전자를 재조합시켜, 아타신 및 콜레옵테리신 재조합 항균 단백질 발현용 벡터를 제조하였고, 이를 대장균에서 발현시킨 결과, 재조합 아타신-콜레옵테리신 단백질이 강한 항균 활성을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래의 아타신(attacin) 유전자, 헬릭스를 형성하는 링커 단백질 코딩 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 유전자를 재조합시킨 재조합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항균용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 5'에서 3' 방향으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래의 아타신(attacin) 유전자, 헬릭스를 형성하는 링커 단백질 코딩 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 유전자를 재조합시킨 재조합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 배양액을 얻는 단계를 포함하는 항균용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래 아타신(attacin) 유전자 및 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 유전자를 헬릭스를 형성하는 링커 서열을 이용하여 재조합시킨 후 이를 포함하는 벡터로 형질전환시켜 대장균에서 발현시킨 결과, 항균 활성이 증가된 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 아타신-콜레옵테리신 재조합 유전자로부터 유도된 단백질을 이용하여 효과적인 항균제 및 항생제를 개발할 수 있게 하므로 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 오버랩 확장(overlap extension) PCR 방법을 이용한 재조합 단백질 구축 모식도를 나타낸다. 아타신(attacin) 및 콜레옵테리신(coleoptericin) cDNA의 코딩 부위는 AF, AR1, AR2, CF1, CF2 및 CR 프라이머로 증폭하였다. EcoRI 및 XhoI 제한효소 자리는 AF 및 CR 프라이머 서열에 첨가하였다. 유동성 링커(flexible linker) 서열은 AR1 및 CF1 프라이머 서열에 첨가하였고, 헬릭스 링커(helical linker) 서열은 AR2 및 CF2 프라이머 서열에 첨가하였다. PCR 산물 겔 정제 후에, 두개의 cDNA를 혼합하기 위해 각 PCR 산물은 오버랩 확장 PCR의 주형으로 사용하였고, AF 및 CR 프라이머를 사용하였다. PCR 산물인 절편은 EcoRI 및 XhoI 제한효소 자리를 이용하여 pET-28a(+) 발현 벡터로 클로닝하였다.
도 2는 AHC(attacin-helical linker-coleoptericin) 재조합 단백질의 뉴클레오티드 및 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 서열은 헬릭스 링커로서 A(EAAAK)3A 모티프(박스)를 포함한다. AHC 재조합 단백질은 파밤나방 유래의 아타신의 N-말단 서열(ATT) 및 흰점박이꽃무지 유래의 콜레옵테리신(COL)의 C-말단 서열로 구성되었다. AHC 재조합 cDNA는 1,104 길이의 뉴클레오티드 유전자 및 367 아미노산 길이의 단백질을 코딩한다(아타신, 헬릭스 링커, 콜레옵테리신 및 제한효소 자리 포함). AFC(attacin-flexible linker-coleoptericin) 재조합 단백질의 뉴클레오티드 및 추정된 아미노산 서열은 AHC의 A(EAAAK)3A 모티프를 제외하고 거의 같다. AFC의 유동성 링커 서열(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)은 A(EAAAK)3A 모티프 대신에 추가되었다(데이터 미제시).
도 3은 AFC 및 AHC 재조합 단백질의 유도를 나타낸다. (A) 42.87 kDa의 유도된 AFC 재조합 단백질을 나타낸다. 레인 M은 단백질 표준 마커, 레인 1은 유도되지지 않은 대장균 로제타 세포의 총 단백질, 레인 2는 1 mM IPTG로 37℃에서 10시간 반응 후 유도된 대장균 로제타 세포의 총 단백질, 레인 3은 0.8 mM IPTG로 37℃에서 10시간 반응 후 유도된 대장균 로제타 세포의 총 단백질, 레인 4는 0.4 mM IPTG로 37℃에서 10시간 반응 후 유도된 대장균 로제타 세포의 총 단백질 및 레인 5는 0.2 mM IPTG로 37℃에서 10시간 반응 후 유도된 대장균 로제타 세포의 총 단백질을 나타낸다. (B) 43.67 kDa의 AHC 재조합 단백질의 유도를 나타낸다. 레인 M은 단백질 표준 마커, 레인 1은 유도되지 않은 대장균 로제타 세포의 총 단백질, 레인 2는 0.4 mM IPTG로 30℃에서 10시간 반응 후 유도된 대장균 로제타 세포의 총 단백질 및 레인 3은 0.2 mM IPTG로 30℃에서 10시간 반응 후 유도된 대장균 로제타 세포의 총 단백질을 나타낸다. (A)의 레인 5 및 (B)의 레인 3의 화살표로 표시된 AFC 재조합 단백질의 ~43 kDa 및 AHC 재조합 단백질의 ~44 kDa은 대장균에서 과발현된 재조합 단백질을 나타낸다.
도 4는 대장균에 대한 ATT(attacin), COL(coleoptericin), AFC(attacin-flexible linker-coleoptericin) 및 AHC(attacin-helical linker-coleoptericin)의 항균 활성을 시험한 결과를 나타낸다. 방사 확산 분석(radical diffusion assay, RDA)을 이용한 (A)대장균(Escherichia coli), (B)바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 (C)슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata)에 대한 ATT, COL, AFC 및 AHC의 항균 활성을 나타낸다. (+)는 대조군 항생제 암피실린(0.1 ㎍), (-)는 유도되지 않은 대장균 로제타 세포의 총 단백질을 나타낸다. (1, 2, 3 및 4)는 유도된 대장균 로제타 세포의 총 단백질(0.5 ㎍)을 나타내며, (1)은 ATT, (2)는 COL, (3)은 AFC 및 (4)는 AHC를 나타낸다. (D)는 최소 저해 농도 분석(minimal inhibitory concentration assay, MIC)을 통해 대장균에 대응하는 ATT, COL, AFC 및 AHC의 항균 활성을 나타낸다. AFC 재조합 단백질의 MIC 값은 23.1 μM이었고, 이것은 초기 단백질과 비교했을 때 대장균에 대해 낮은 감수성을 나타낸다. AHC 재조합 단백질은 초기 항균 단백질(ATT 및 COL)에 비해 높은 항균 활성을 나타냈다. AHC 재조합 단백질은 슈도모나스 코루가타에 대해 강한 항균 활성을 나타냈다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래의 아타신(attacin) 유전자, 헬릭스를 형성하는 링커 단백질 코딩 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 유전자를 재조합시킨 재조합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 따른 아타신 유전자의 범위는 파밤나방 유충으로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자 및 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 또한, 콜레옵테리신 유전자의 범위는 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자 및 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에서, 상기 헬릭스를 형성하는 링커 단백질은 A(EAAAK)nA(n= 2~5)인 아미노산 서열일 수 있고, 바람직하게는 A(EAAAK)3A인 서열번호 3의 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 두 개의 단백질을 연결하는데 사용한 비 헬릭스 링커(non-helical linker) 서열은 보통 글리신, 세린 또는 프롤린으로 구성되며 유동성 잔기를 갖는 구조이다. 따라서 두 가지 기능을 갖는 단백질의 연결을 가능하게 하며, 근접한 단백질들은 이동이 자유롭다. 그러나 단백질 서로 간의 생물학적 활성을 방해할 가능성도 있다. 상기 단백질 간의 간섭을 피하기 위하여, 본 발명에서는 비 헬릭스 링커 외에, 글리신 및 세린으로 구성된 확장된 헬릭스 링커(helical linker) 서열을 단백질 간의 링커로 사용하였다. 헬릭스 링커는 분리된 단백질 사이의 공간을 단단하게 연결하는 역할을 하며, 유동성이 없는 잔기로 구성되어 있다. 두 가지 기능을 하는 재조합 단백질의 기능을 효과적으로 나타낼 수 있도록 사용한 Glu-Ala-Ala-Ala-Lys (EAAAK) 헬릭스 링커는 재조합 단백질의 도메인을 효과적으로 분리할 수 있고, 재조합 단백질의 두 가지 기능을 효과적으로 나타낼 수 있게 한다. 본 발명의 A(EAAAK)3A 모티프는 재조합 단백질 사이에서 α-헬릭스 구조를 형성하며, 더욱 강력한 항균 활성을 나타낸다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에서, 상기 아타신 및 콜레옵테리신 유전자는 각각 아타신 및 콜레옵테리신 유전자의 신호 펩타이드(signal peptide)를 제외한 유전자로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
대부분의 곤충 유래 항균 펩타이드의 전장은 신호 펩타이드 때문에 전혀 항균 활성을 갖지 않는다. 따라서, 신호 펩타이드 서열(아타신의 51개 뉴클레오티드 및 콜레옵테리신의 48개 뉴클레오티드)이 없는 AFC 및 AHC 재조합 cDNA를 구축하고 클로닝하였다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 아타신 및 콜레옵테리신 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
아타신 및 콜레옵테리신 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 튜린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 곰팡이, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 숙주세포에서, 상기 숙주세포는 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아 유래이며, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 생산 방법에서, 상기 숙주세포는 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아이며, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 생산된 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항균용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미생물 제제에서, "항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제 또는 제거하는 능력을 의미하며, 바람직하게는 항세균(anti-bacterial)을 의미할 수 있으며, 상기 세균은 바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 항균용 미생물 제제는 예를 들어 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 항균용 미생물 제제는 분사, 분무, 살포, 흩뿌림 또는 붓기에 의해 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도한 목적에 의존하는데, 모든 경우에 본 발명에 따른 미생물 제제의 분포가 가능한 한 미세하고 균일하도록 해야 한다.
본 발명의 항균용 미생물 제제는 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로서 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한,
(a) 5'에서 3' 방향으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래의 아타신(attacin) 유전자, 헬릭스를 형성하는 링커 단백질 코딩 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 유전자를 재조합시킨 재조합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 배양액을 얻는 단계를 포함하는 항균용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
아타신 ( attacin ) 및 콜레옵테리신 ( coleoptericin ) cDNA 클로닝
mRNA 차별적 디스플레이 방법(differential display method)을 이용하여 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래의 아타신(attacin) 항균 펩타이드 유전자를 발견하고 분리하였다. 아타신 cDNA 전장(full-length)을 획득하기 위하여, 파밤나방 유충에 병원균을 주입하여 면역 관련 유전자를 활성화시키고, 총 RNA를 분리하였다. 그 후 분리된 RNA로부터 DEG GeneFishing kit(SeeGene Inc., 서울, 한국)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 아타신 cDNA의 전장을 확인하기 위해, RACE(Rapid amplification of cDNA ends) 방법을 이용하였다. 파밤나방 아타신 cDNA의 특성을 확인하고, 분석 및 항균 활성을 조사하였다. 동일한 과정을 이용하여 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 항균 펩타이드 유전자를 분리하고 cDNA를 합성하였다.
재조합 단백질 구축
파밤나방 유래의 아타신 및 흰점박이꽃무지 유래의 콜레옵테리신을 라이게이션(ligation) 및 클로닝하고, 대장균(Escherichia coli)에서 발현시켜 결합된 재조합 단백질을 획득하였다. 두 가지 cDNA를 결합시키기 위해, 오버랩 확장(overlap extension) PCR 방법을 이용하였고, 적용한 재조합 단백질 구축 전략을 도 1에 나타내었다. 아타신 및 콜레옵테리신 유사 유전자의 코딩 영역은 AF, AR1, AR2, CF1, CF2 및 CR 프라이머로 증폭시켰다(표 1). 도 1에 나타낸 바와 같이, EcoRI 및 XhoI 제한효소 자리는 프라이머 AF 및 CR의 서열에 첨가되었다. 유동성 링커(flexible linker) 서열을 AR1 및 CF1 프라이머 서열에 첨가하였고, 헬릭스 링커(helical linker) 서열을 AR2 및 CF2 프라이머 서열에 첨가하였다. 아타신에 대한 프라이머(AF, AR1 및 AR2)의 결합은 PCR에 의해 744 bp PCR 산물을 특이적으로 증폭시켰고, CF1, CF2 및 CR 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 통해서 399 bp의 콜레옵테리신 PCR 산물을 획득하였다.
PCR 산물의 겔 정제 후에, 두 개의 cDNA를 결합하기 위해 각 PCR 산물을 주형으로 하고, AF 및 CR 프라이머를 이용하여 오버랩 확장 PCR을 수행하였다. 유동성 링커 서열로 결합된 아타신-콜레옵테리신 재조합 유전자(attacin-flexible linker-coleoptericin, AFC)는 AF, AR1, CF1 및 CR 프라이머를 이용하여 생성되었고, 헬릭스 링커 서열로 결합된 아타신-콜레옵테리신 재조합 유전자(attacin-helical linker-coleoptericin, AHC)는 AF, AR2, CF2 및 CR 프라이머를 이용하여 생성되었다. 오버랩 확장 PCR은 95℃에서 20초, 60℃에서 20초 및 72℃에서 15초의 15회 반복으로 수행되었고, 그 후에 프라이머 없이 72℃에서 3분의 최종 증폭 단계로 구성하였다. 추가로 수행된 2차 PCR은 95℃에서 20초, 65℃에서 20초 및 72℃에서 15초의 20회 반복 후에 AF 및 CR 프라이머를 이용하여 72℃에서 3분간 최종 증폭시켰다. 1,222 bp의 PCR 산물을 pET-28a(+) 발현 벡터(Novagen, Madison, WI, 미국)에 EcoRI 및 XhoI 제한효소(Roche, 맨하임, 독일) 자리를 이용하여 클로닝하였다. 그 후에 서열 분석(Macrogen, 서울, 한국)을 통해 재조합 유전자의 서열을 확인하였다.
본 발명에 사용한 PCR 프라이머
Gene Primers Sequences
Attacin AF 5'-CCGTTCGAATTCAGACACGTGCCACAGGACCACC-3'(서열번호 4)
AR1 5'-GGCTGCAGCCTCCTTCGCAGCTGCTTCGGCGAATGATCTGCCTAGAGTA-3'
(서열번호 5)
AR2 5'-GGCTTTAGCAGCCGCCTCCTTGGCTGCAGCCTCCTTCGCAGCTGCTTCG-3'
(서열번호 6)
Coleoptericin CF1 5'-GCTGCAGCCAAGGAGGCGGCTGCTAAAGCCTACGTAGTGCCGGTTTACT-3'
(서열번호 7)
CF2 5'-GCCGAAGCAGCTGCGAAGGAGGCTGCAGCCAAGGAGGCGGCTGCTAAAG-3'
(서열번호 8)
CR 5'-CCGTTCCTCGAGTTACCACCTGTATGACCCT-3' (서열번호 9)
pET 발현 체계에서 재조합 단백질의 발현
AFC(attacin-flexible linker-coleoptericin) 및 AHC(attacin-helical linker-coleoptericin) 재조합 단백질을 생성하기 위해, 구축된 pET-28a(+) 발현 벡터를 대장균(E. coli) 로제타( Rosetta) 세포(Novagen Corp., 다름슈타트, 독일) 내로 형질전환시켰다. 그 후 세포가 중기 로그기(OD600=0.6)에 도달했을 때, 0.2 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Sigma-Aldrich Corp., 스텐하임, 독일)로 세포를 유도시켰다. 발현은 30℃에서 10시간 동안 추가로 유도시켰고, 세포를 4℃에서 6,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 원심분리된 세포에 용해 버퍼(5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 2 M DTT, 1 M Tris-HCl buffer, pH 7.5)를 첨가하여 재현탁 시키고, 생물학적 활성 측정을 위해 얼음에서 초음파 처리하여 세포를 용해시킨 후, -20℃에 보관하였다. 유도된 재조합 단백질은 전기영동 후에 9% SDS PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 확인하였다.
재조합 단백질의 항균 활성 규명
유도된 AFC 및 AHC 재조합 단백질의 항균 활성은 아가로스 확산 분석(agarose diffusion assay)을 이용하여 측정하였고, 그람-양성 박테리아인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KACC 14741), 그람-음성 박테리아인 대장균(Escherichia coli DH5α, KACC 10005) 및 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata, KACC 10141)에 대해 검증하였다. 박테리아의 단일 콜로니를 새로 제조한 LB 배지에 접종하였고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 배양액의 일부를 새로운 LB 배지로 옮겨 37℃에서 추가로 4-6시간 동안 반응시켰다(OD600=0.4). 페트리 디쉬는 LB 배지에 용해된 아가(agar) 6 ㎖을 넣어 제조하였으며, 100 ㎕의 박테리아 현탁액을 접종하였다(OD600=0.4). 그 후에 박테리아를 페트리 디쉬에 도말하고, 유도된 재조합 단백질을 지름 5 mm의 웰에 분주한 후 37℃에서 밤새 반응시켰다. 그 결과, 항균 활성을 나타내는 클리어링 존(clearing zone)이 관찰되었다.
최소 저해 농도 분석(minimal inhibitory concentration assay, MIC)을 위하여 미생물을 LB 배지에 37℃에서 15-16시간 동안 배양시켰다. 박테리아 배양액의 20 ㎕를 새로운 LB 아가 배지에 도말하였다. 박테리아의 단일 콜로니를 LB 액체 배지(OD600=0.13)에 접종한 후에, 2 ㎖ LB 배지의 10 ㎕를 샘플의 일련의 두 배 희석을 포함하는 15 ㎖ 코니칼 튜브에 접종하였다. MIC 값은 37℃에서 16시간 반응시킨 후에 측정하였다.
실시예 1. AFC 및 AHC 재조합 cDNA 구축
AFC(attacin-flexible linker-coleoptericin) 및 AHC(attacin-helical linker-coleoptericin) 재조합 cDNA를 오버랩 확장 PCR 방법을 통하여 구축하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, AFC 및 AHC 재조합 cDNA의 N 말단은 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래의 아타신 cDNA로 구성하였으며, C 말단은 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신 cDNA로 구성하였다. 아타신 및 콜레옵테리신 cDNA 사이에 링커(linker) 서열을 첨가하였다. AFC의 링커 서열은 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser으로 구성되었고, 이것은 서로 다른 두 개의 단백질을 연결하는데 이용되는 유동성(flexible) 단백질 서열이다. AHC를 구축하기 위한 다른 링커 서열은 비 유동성(non-flexible) 단백질 서열인 Glu-Ala-Ala-Ala-Lys(EAAAK) 헬릭스 링커(helical linker)를 이용하였다. 헬릭스 형태의 펩타이드 링커 A(EAAAK)nA (n=2~5)는 단량체의 친수성 α-헬릭스를 형성할 것으로 예상되었고, A(EAAAK)3A 모티프를 AHC 링커로 이용하였다. 오버랩 확장 PCR, 라이게이션 및 원핵생물 발현 벡터로 클로닝을 통해 획득된 AFC 및 AHC cDNA는 각각 서열 분석을 통해 확인하였다(도 2).
AFC는 유동성 링커 서열(15개 뉴클레오티드)을 포함하는 1,223개(6x His-Tag)의 뉴클레오티드이며, 추정된 폴리펩타이드의 길이는 395개 아미노산이고, 측정된 분자량은 42.87 kDa이었다. AHC는 α-헬릭스 링커 서열(51개 뉴클레오티드)을 포함하는 1,247개(6x His-Tag)의 뉴클레오티드이며, 추정된 폴리펩타이드의 길이는 401개 아미노산이고, 측정된 분자량은 43.67 kDa이었다. 대부분의 곤충 유래 항균 펩타이드의 전장은 신호 펩타이드(signal peptide) 때문에 전혀 항균 활성을 갖지 않는다. 따라서, 신호 펩타이드 서열(아타신의 51개 뉴클레오티드 및 콜레옵테리신의 48개 뉴클레오티드)이 없는 AFC 및 AHC 재조합 cDNA를 구축하고 클로닝하였다. AFC 및 AHC의 뉴클레오티드 서열 및 추정된 아미노산 서열은 도 2에 나타내었다. 제한효소 자리(EcoRI 및 XhoI)를 클로닝에 사용하였고, 링커 서열은 박스안에 나타내었다.
실시예 2. 재조합 단백질 발현
시험관 내(in vitro) AFC 및 AHC 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위해, pET 발현 체계를 사용하였다. 재조합 플라스미드는 발현을 위해 대장균(E. coli) 로제타 세포로 형질전환시켰다. IPTG 유도를 기반으로, AFC 및 AHC 재조합 단백질은 아타신의 N 말단 및 콜레옵테리신의 C 말단인 융합 단백질로서 발현되었다. 박테리아 세포 농도(OD600=0.1-1.0), IPTG 농도(0.5-1.5 mM), 반응 시간(6-12시간) 및 온도(16-37℃) 등을 포함한 몇 가지 단백질 발현의 최적 조건을 시험하였다. 재조합 단백질을 지닌 박테리아 세포를 얻어 9% SDS-PAGE로 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 발현 분석에서 재조합 단백질(AFC 또는 AHC)은 각각 42.87 kDa 및 43.67 kDa의 뚜렷한 밴드를 나타냈다. 재조합 단백질 발현의 몇몇 인자들의 시험 후에, 재조합 단백질(AFC 또는 AHC)에 0.2 mM IPTG 처리 후 30℃에서 10시간 동안 반응시킨 후에 OD600=0.6의 세포 농도로 획득된 것을 확인하였다. 적절한 단백질 발현 조건에 의해 생성된 재조합 단백질(AFC 또는 AHC)은 불용성 펠렛 보다 가용성 단편에서 더욱 풍부하게 존재했다. 가용성 재조합 단백질(AFC 및 AHC)은 단백질 정제 및 항균 활성 시험을 위해 선별되었다. 단백질 정제를 위해, 6x His-tag 재조합 단백질 및 Ni-NTA 콘주게이트(PRO·Hunt HisㆍBind Spin Column)를 함께 이용하였다. 정제된 단백질은 항균 활성을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 대장균 로제타 세포에서 추출한 과발현된 재조합 단백질(AFC 또는 AHC)의 항균 활성도 시험하였다. 음성 대조군으로는 유도시키지 않은 대장균 로제타 세포로부터 분리한 총 단백질을 사용하였다. 대장균 DH5α의 성장은 유도된 로제타 세포 총 단백질 추출물에 의해 명백히 억제되었으나, 유도되지 않은 대장균 로제타 세포 추출물에서는 상기 결과를 보이지 않았다. 따라서, 이후 시험에서는 유도시킨 총 단백질 추출물을 이용하였다.
실시예 3. 재조합 단백질의 항균 작용
재조합 단백질(AFC 및 AHC)의 항균 활성을 방사 확산 분석법(radical diffusion method, RDA) 및 최소 저해 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)를 통해 조사하였다. 방사 확산 분석법으로 두 개의 초기 펩타이드인 아타신(ATT) 및 콜레옵테리신(COL)과 비교한 결과, 재조합 단백질인 AFC 및 AHC는 그람-음성 박테리아인 대장균 DH5α 및 그람-양성 박테리아인 바실러스 서브틸리스에 대응하여 유사한 항균 활성을 나타냈다(도 4A 및 B). 유사한 활성을 보이는 AHC 및 ATT는 박테리아 대장균 DH5α에 대하여 AFC 및 COL 보다 강한 항균 활성을 나타냈다. 도 4D에 나타낸 바와 같이, MIC 값은 AHC에서 6.73이었고, ATT에서는 7.72로 AFC(MIC=23.1) 및 COL(MIC=22.37)에 비하여 낮았다. 비록 바실러스 서브틸리스에 대한 MIC 시험은 진행하지 못하였으나, AHC는 AFC, ATT 및 COL에 비해 상기 박테리아에 대해 높은 항균 효율을 보였다. 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata)는 그람-음성 박테리아이며 토마토의 일반적인 식물 병원균이다. 특히 AHC는 슈도모나스 코루가타에 대응하여 강력한 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 4C). 부가적으로, COL은 슈도모나스 코루가타에 대응하여 매우 약한 항균 활성을 나타내었다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Antibacterial attacin-coleoptericin hybrid protein linked by helical linker and uses thereof <130> PN12168 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 711 <212> DNA <213> Spodoptera exigua <400> 1 agacacgtgc cacaggacca cctggcatac gaacaagtac acctccttgg gtttgacgaa 60 gatgaacgac cagtattcga gtacgaagac ctgctaccag aactggaggt gtcctaccag 120 ccagagcacc tgacgagagc tcgcagacag gcgcagggca gcgttaccct caactctgac 180 ggaggcatgg gcttgggcgc taagatcccg cttgctcaca acgataagaa tgtgctgagc 240 gctatcggct ccatggactt caacaacaag atgcagcctg cttccaaggg ctttggtctg 300 gctctggaca atgtcaacgg gcacggactg accgtgatga aggaaagtgt tcccgggttc 360 ggggacaggc tgtcaggcgc tggcaagctg aacgtgttcc acaacgacaa ccacaacgtg 420 gccgtgaccg gctccctcac caggaacatg cctagcatcc caaacgtacc caacttcaac 480 actatcggcg ggggcgtcga ctacatgtac aacaacaagg tgggagcatc tctgggcatg 540 gccagtacgc cgttcttaga ccgcaaggac tactccgcga tgggcaacct gaacctgttc 600 cgtagcccga ccacttctgt ggacttcagc ggcggcttca agaagtttga gtcacccttc 660 atgagtagcg gctggaagcc caacttcgcc tttactctag gcagatcatt c 711 <210> 2 <211> 336 <212> DNA <213> Protaetia brevitarsis seulensis <400> 2 tacgtagtgc cggtttacta cgaaatatat cctgaagatg ccacttttga cgaagccgat 60 attgaaccac aattatcacc tgcagaatta caccatggaa gcatccgaga acgtagatcg 120 ctacaacctg gagcgccgtc ttttcctatg cctggaagtc aattacctac ttctgtaagc 180 ggtaatgtcg agaaacaggg acgtaacacc atcgctacaa ttgacgccca acacaaaact 240 gataggtacg atgttagagg tacctggacc aaggtagtcg acggtcctgg cagaagtaag 300 ccgaacttta gaattggagg gtcatacagg tggtaa 336 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 3 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ala <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccgttcgaat tcagacacgt gccacaggac cacc 34 <210> 5 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggctgcagcc tccttcgcag ctgcttcggc gaatgatctg cctagagta 49 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggctttagca gccgcctcct tggctgcagc ctccttcgca gctgcttcg 49 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gctgcagcca aggaggcggc tgctaaagcc tacgtagtgc cggtttact 49 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gccgaagcag ctgcgaagga ggctgcagcc aaggaggcgg ctgctaaag 49 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccgttcctcg agttaccacc tgtatgaccc t 31

Claims (15)

  1. 5'에서 3' 방향으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래의 아타신(attacin) 유전자, 헬릭스를 형성하는 링커 단백질 코딩 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 유전자를 재조합시킨 재조합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헬릭스를 형성하는 링커 단백질은 A(EAAAK)nA(n= 2~5)인 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 헬릭스를 형성하는 링커 단백질은 A(EAAAK)3A인 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아타신 및 콜레옵테리신 유전자는 각각 아타신 및 콜레옵테리신 유전자의 신호 펩타이드(signal peptide)를 제외한 유전자로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
  7. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질을 생산하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질.
  12. 제11항의 아타신-콜레옵테리신 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항균용 미생물 제제.
  13. 제12항에 있어서, 항세균(anti-bacterial)용인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세균은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata)인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  15. (a) 5'에서 3' 방향으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파밤나방(Spodoptera exigua) 유래의 아타신(attacin) 유전자, 헬릭스를 형성하는 링커 단백질 코딩 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유래의 콜레옵테리신(coleoptericin) 유전자를 재조합시킨 재조합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및
    (c) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 배양액을 얻는 단계를 포함하는 항균용 미생물 제제의 제조 방법.
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