KR20140022195A - Primer set for brucella canis strain-specific identification and method for detecting brucella canis strain using the same - Google Patents

Primer set for brucella canis strain-specific identification and method for detecting brucella canis strain using the same Download PDF

Info

Publication number
KR20140022195A
KR20140022195A KR1020120088442A KR20120088442A KR20140022195A KR 20140022195 A KR20140022195 A KR 20140022195A KR 1020120088442 A KR1020120088442 A KR 1020120088442A KR 20120088442 A KR20120088442 A KR 20120088442A KR 20140022195 A KR20140022195 A KR 20140022195A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
brucella
brucella canis
canis
primer set
strain
Prior art date
Application number
KR1020120088442A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR101437389B1 (en
Inventor
허문
김지연
이기찬
강성일
정석찬
Original Assignee
대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) filed Critical 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부)
Priority to KR1020120088442A priority Critical patent/KR101437389B1/en
Publication of KR20140022195A publication Critical patent/KR20140022195A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101437389B1 publication Critical patent/KR101437389B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The present invention relates to a primer set for Brucella canis strain-specific identification and a method for detecting Brucella canis strain using the same. A primer set according to the present invention specifically detects Brucella canis strains causing canine brucellosis, thereby promptly searching and diagnosing canine brucellosis and being used in a route of infection of a disease, mechanical research, diagnosis, treatments, etc.

Description

브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출 방법{Primer set for Brucella canis strain-specific identification and method for detecting Brucella canis strain using the same}[0001] The present invention relates to a primer set for Brucella canis-specific identification, and a method for detecting Brucella canis strain using the same.

본 발명은 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for identification of brucellosis, and a method for detecting brucellosis.

브루셀라병은 잠복기가 긴 만성 전염병으로, 전 세계적으로 발생하고 있다. 특히 소 브루셀라병은 암소의 임신, 유산 등의 번식 장애를 일으키고, 수소에서는 고환염, 전립선염 등의 생식기 질환을 일으켜, 국내에서는 2종 가축전염병으로 분류되어, 검진 및 살처분의 근절 대책이 확립되어 있다. 또한, 소 브루셀라병은 소 뿐만 아니라 사람에게도 감염되어 파상열, 관절통, 오한, 쇠약 등 감기와 유사한 증상을 일으키는 인수공통전염병으로, 치료하지 않을 경우 심내막염 및 척추염 등으로 진행되어 사망에 이를 수 있다. 또한, 제3군 법정 전염병으로 분류되어 공중위생상 매우 중요한 질병으로 취급되고 있으며, 미국, 유럽 등 세계적으로 근절을 위해 많은 노력을 기울이고 있다.Brucellosis is a long-lived chronic epidemic, occurring worldwide. In particular, small brucellosis causes reproductive disorders such as pregnancy and lactation in cows, and causes genital diseases such as testisitis and prostatitis in hydrogen. In Korea, it is classified as a livestock infectious disease, and measures for eradication of examination and killing are established have. In addition, bovine Brucellosis is a common infectious disease that infects not only cows but also humans and causes symptoms similar to colds such as fever, arthralgia, chills, and weakness. If not treated, it may progress to endocarditis and spondylitis and lead to death. In addition, it is classified as a third-class infectious disease and treated as a very important disease in public health, and efforts are being made to eradicate the disease globally in the United States and Europe.

브루셀라속 균주는 숙주 특이성, 배양 성상, 생화학적 및 혈청학적 특성에 따라 염소 및 면양의 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 소의 브루셀라 아보투스(B. abortus), 돼지의 브루셀라 수이스(B. suis), 양의 브루셀라 오비스(B. ovis), 개의 브루셀라 캐니스(B. canis), 사막 쥐의 브루셀라 네오토매(B. neotomae)와, 최근에 해양 포유류인 바다사자, 물범, 돌고래 등에서 분리된 브루셀라 세티(B. ceti, 고래류)와 브루셀라 핀니페디알리스(B. pinnipedialis, 바다표범류) 등으로 분류된다. 이 중에서 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 아보투스, 브루셀라 수이스 등 3종이 사람에게 병원성이 있는 것으로 알려져 있으며, 브루셀라 캐니스도 발생 사례가 보고되고 있다. The strain of Brucella sp., According to host specificity, culture characteristics, biochemical and serological characteristics, was found to contain chlorine and sheep brucella melitensis melitensis), bovine brucellosis Abo tooth (B. abortus), be brucellosis in pigs device (B. suis), Orbis amount of brucellosis (B. ovis), of Brucella canis (B. canis), brucellosis of the Desert Rats neo tomae are classified as (B. neotomae) and recent marine mammals of the sea lion, seals, dolphins, etc. separate brucellosis Shetty (B. ceti, cetaceans) and brucellosis pinni Pedy Alice (B. pinnipedialis, seals type) and the like. Of these, three are known to be pathogenic to humans, including Brucella melitensis, Brucella Avotus and Brucella Suis, and cases of Brucella canis have also been reported.

브루셀라병의 진단은 원인균의 분리와 항체 검사로 실시되고 있다. 그러나, 균주 분리에는 생물학적 안전성이 확보된 밀폐된 실험실에서 최소 10일에서 30일의 균 배양기간이 소요되며, 균을 동정하기 위해 25가지의 생화학적 성상 검사에 5일 정도의 추가 소요 기간이 필요하다. 뿐만 아니라, 균을 취급하는 실험실과 실험자에 대한 생물학적 안전성(biosafety)이 확보되어야 하며, 실험자의 숙련도에 따라 생화학적 성상 검사에 다소 차이가 나 정확한 동정이 곤란한 문제점이 있다. 이에 따라 일반적으로 항체검사에 의한 양성 반응우의 색출 방법이 전 세계적으로 많이 이용되고 있다. Diagnosis of brucellosis is based on the isolation of causative bacteria and antibody testing. However, in order to isolate the strain, it takes at least 10 to 30 days for incubation in an enclosed laboratory where biosecurity is ensured. In order to identify the bacteria, 25 additional biochemical tests are required for 5 days Do. In addition, biosafety for laboratories and laboratories handling bacteria must be ensured, and there is a problem that the biochemical test is somewhat different according to the skill of the experimenter, and it is difficult to identify correctly. Therefore, in general, the detection method of positive reaction by antibody test is widely used around the world.

브루셀라병을 근절하기 위한 질병진단체계 수립시에 고려되어야 할 사항 중 첫 번째는 감염 집단내 감염 개체를 색출할 수 있는 진단 체계와 특이도 보다는 민감도가 우수한 진단법을 사용하는 것이다. 신속 간단하고 저렴한 진단법이 가장 이상적이고 효율적이다. 두 번째는, 균주 분리 및 동정을 위한 진단 체계가 확립되어야 한다. 특히 브루셀라병에 대한 예방 접종을 실시할 경우에는 백신주와 야외주의 감별을 위한 진단 방법이 마련되어야 하며, 이러한 점을 고려할 때 PCR기법을 이용하여 분리주의 감별 및 동정을 위한 진단체계를 수립하는 것이 바람직하다. 세 번째로 고려할 사항은, 브루셀라병 발생의 역학적 상황을 조사하기 위해 감염원의 색출 및 유입경로를 추적할 수 있는 유전학적 분석에 기인한 프로파일링(profiling) 기법에 관한 것이다. The first of the issues to be considered when establishing a disease diagnosis system to eradicate brucellosis is to use a diagnostic system that is capable of detecting infectious organisms in the infected population and a method that is more sensitive than the specificity. Quick, simple and inexpensive diagnostics are ideal and efficient. Second, a diagnostic system for isolating and identifying strains should be established. In particular, when vaccination against brucellosis is performed, a diagnostic method for distinguishing between vaccine and outdoor should be provided. In view of this, it is desirable to establish a diagnostic system for discrimination and identification of the isolate using PCR technique Do. A third consideration is the profiling technique, which is based on a genetic analysis that can track the source and route of infectious agents to investigate the epidemiological situation of brucellosis.

현재 많이 사용되고 있는 혈청학적 진단 방법은 유사 항원 결정기를 가진 세균의 LPS의 교차반응에 의해 위양성 반응이 나타나지만, 이를 감별할 수 있는 정확한 검사 방법이 마련되어 있지 않은 상황이다. 브루셀라병 근절단계에 도달한 몇몇 국가에서도 위양성 반응에 따른 브루셀라병 발생으로 인한 정책의 혼선이 발생되기 때문에, 신속 정확한 원인체의 분리 및 동정을 위한 PCR 기법 등을 이용한 진단체계의 마련이 필요한 실정이다. Currently, the serologic diagnosis method that is widely used is a false positive reaction due to the cross reaction of LPS of bacteria having a similar antigenic determinant, but there is no accurate test method to distinguish it. In some countries that have reached the eradication stage of brucellosis, there is a policy confusion caused by the occurrence of brucellosis due to false positive reaction. Therefore, it is necessary to establish a diagnosis system using PCR technique for rapid identification and identification of causative agents.

최근 분자 유전학의 발전과 함께 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reactiono, PCR)을 이용한 여러 가지 브루셀라병 진단 기법이 개발되어 실시되고 있으며, 감염집단을 검색하기 위해 유즙 내의 특이 유전자 부위를 검출하는 방법, 양성 집단내 감염개체를 색출하기 위한 개체 검사 방법, 분리한 균의 동정을 위한 동정방법 및 동정된 균의 분자유전학적 분석을 실시하여 감염원의 유입경로 등을 밝혀내는 역학 조사에 PCR 방법이 많이 이용되고 있다.Recently, molecular genetics has been developed and various brucellosis diagnosis techniques have been developed by using polymerase chain reaction (PCR). In order to search for infectious groups, a method of detecting specific gene regions in milk, PCR method is widely used in epidemiological studies to identify infectious organisms in population, identification method for identification of isolated organisms, and molecular genetic analysis of identified organisms to identify infectious pathways have.

한편, 개 브루셀라병은 브루셀라 캐니스(B. canis)에 의해 주로 발생하며 브루셀라속 균 중 사람에게도 감염될 수 있는 인수공통병원체로 알려져 있다. 국내에서도 번식견을 중심으로 개 브루셀라병 발생이 보고되고 있으며 이에 대한 정확한 진단이 필요한 실정이다. 개 브루셀라병은 주로 혈청학적진단법인 B. canis M- strain을 이용한 rapid Rose-Bengal test 또는 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)을 첨가한 Rose-Bengal test로 검색하거나 최근 개발된 Dip-stick kit(immuno-chromatography kit)를 사용하고 있으나 진단의 민감도가 약 90% 내외로 알려져 있어 정확한 진단을 위하여 추가적인 다른 진단법과 함께 수행하여야한다. 보통 혈청학적 검사법과 함께 전혈에서 균 분리 동정을 수행하지만 이 방법은 시간과 비용이 많이 들고 실험자의 위험 등 여러 가지 문제점을 안고 있다. On the other hand, dog brucellosis is mainly caused by Brucella canis ( B. canis ) and is known to be a common causative agent that can be infected to people of the genus Brucella. In Korea, dog brucellosis has been reported mainly in dogs, and accurate diagnosis is needed. Dog brucellosis is mainly caused by B. canis A rapid-Rose-Bengal test using the M-strain or a Rose-Bengal test with 2-mercaptoethanol, or a recently developed dip-stick kit (immuno-chromatography kit) Sensitivity is known to be around 90% and should be performed with additional diagnostic methods for accurate diagnosis. In general, serologic tests are performed to isolate and isolate bacteria from whole blood, but this method has many problems such as time and expense and risk of the experimenter.

최근 이와 같은 단점을 극복하기 위해서 유전자를 이용한 분자생물학적인 기법으로 브루셀라 균을 좀 더 쉽게 감별하려는 시도가 계속되고 있다. 하지만 브루셀라 균은 DNA 유사도가 매우 높아 아직까지도 브루셀라 캐니스 만을 특이적으로 진단할 수 있는 일반 PCR법은 보고되지 않고 있다. 비록 감별 진단법으로 Bruce-ladder PCR법이나 멀티플렉스 PCR(advanced multiplex PCR)법이 있지만 균을 감별하기 위해서 민감도가 낮아 일반적으로 사용하기에는 부적합하며 많은 프라이머가 함유되어 있어 상대적으로 비용이 매우 고가이다. 또한 SNP를 이용한 실시간 PCR법이 있지만 고가의 전문적인 장비와 비용이 소요되는 등 동물병원이나 일선 방역기관에서 일반적으로 사용하기에는 문제점이 있다.In order to overcome these shortcomings, attempts have been made to more easily distinguish Brucella from molecular biologic techniques using genes. However, since the Brucella strain has a high degree of DNA similarity, a general PCR method capable of specifically diagnosing only Brucella canis has not been reported yet. Although the differential diagnosis method is Bruce-ladder PCR or advanced multiplex PCR method, it is inadequate for general use because of low sensitivity to discriminate bacteria, and it is relatively expensive because it contains many primers. In addition, although there is a real-time PCR method using SNP, there is a problem that it is generally used in veterinary hospitals and front line preventive institutions such as expensive professional equipment and costly.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 일반 PCR을 이용하여 브루셀라 캐니스 균을 특이적으로 동정할 수 있는 PCR 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 브루셀라 캐니스 균만을 동정함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.In order to solve the above problems, the present inventors prepared a PCR primer set capable of specifically identifying brucella canis using general PCR, and identified only brucella canis by using the PCR primer set. It was completed.

본 발명의 목적은 브루셀라 캐니스 균(개 브루셀라 균; Brucella canis) 특이적 동정용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a brucella canis strain (dog brucellosis; Brucella canis ) -specific identification primer set.

본 발명의 다른 목적은 상기 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스 균 동정용 PCR 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a PCR kit for identification of Brucella cannaceae comprising the aforementioned Brucella canis-specific primer set for identification.

본 발명의 또 다른 목적은 브루셀라 캐니스 특이적 동정용 프라이머 세트를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for detecting Brucella canis using a Brucella canis-specific primer set.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 브루셀라 캐니스(개 브루셀라 균; Brucella canis)균 특이적 동정용 프라이머 세트를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a brucellosis canis (dog brucellosis; Brucella canis ) -specific identification primer set.

본 발명은 상기 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스 균 동정용 PCR 키트를 제공한다. The present invention provides a PCR kit for identification of Brucella cannaceae comprising the aforementioned Brucella canis-specific primer set for identification.

본 발명은 브루셀라 캐니스 특이적 동정용 프라이머 세트를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출방법을 제공한다.The present invention provides a method for detecting Brucella canis using a Brucella canis-specific primer set.

본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 균 동정용 프라이머 세트는, 다양한 브루셀라 종(species) 중에서 개 브루셀라 병을 일으키는 브루셀라 캐니스 균만을 높은 민감도로 특이적으로 검출할 수 있어, 개 브루셀라 병을 신속하게 검색 및 진단할 수 있도록 하는 효과가 우수하다.The primer set for identifying Brucella cannacea according to the present invention is capable of specifically detecting Brucella canis causing various Brucella species from various brucella species with a high sensitivity and specifically detecting and detecting the Brucella canis, The effect of making diagnosis is excellent.

도 1은 본 발명의 프라이머 세트가 특이적으로 브루셀라 캐니스 균을 동정하는 것을 확인한 도이다(레인 M:100bp DNA 레이더; 레인 1: 브루셀라 아보투스 544(B. abortus 544); 레인 2: 브루셀라 캐니스 RM6/66(B. canis RM6/66); 레인 3: 브루셀라 수이스(B. suis 1330); 레인 4: 브루셀라 오비스(B. ovis); 레인 5: 브루셀라 네오토매(B. neotomae); 레인 6: 브루셀라 멜리텐시스(B. melitensis); 레인 7: 브루셀라 세티(B. ceti); 레인 8: 브루셀라 핀니페디알리스(B. pinnipedialis); 레인 9:브루셀라 마이크로티(B. microti); 레인 10: 브루셀라 이노피나타(B. inopinata); 레인 11: 에셔리키아 콜리 O157:H7(E. coli O157:H7); 레인 12: 파스텔라 멀토시다(P. multocida); 레인 13: 살모넬라 엔테리카(S. enterica); 레인 14: 예르시니아 엔테로콜리티카 O:9(Yersinia enterocolitica O:9); 레인 15: 오크로박트룸 안트로피(Ochrobactrum anthropi); 레인 16: 캄피오박터 제주니(C. jejuni); 레인 17: 스파필로코커스 아우레우스(S. aureus) 레인 18: 크로스트리디움 펄프리겐스(Clostridium perfrigens); 레인 19: 음성 대조군).
도 2는 본 발명의 프라이머 세트의 민감도를 확인한 도이다(M 레인: 100-bp DNA ladder; 레인 1: 60 ng/㎕; 레인 2: 6 ng/㎕; 레인 3: 0.6 ng/㎕; 레인 4: 60 pg/㎕; 레인 5: 6 pg/㎕; 레인 6: 0.6 pg/㎕; 레인 7: 60 fg/㎕; 레인 8: 증류수).BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing that the primer set of the present invention specifically identifies Brucella canis (Lane M: 100 bp DNA radar; Lane 1: B. abortus 544; B. canis RM6 / 66; Lane 3: B. suis 1330; Lane 4: B. ovis ; Lane 5: B. neotomae ; 6: B. melitensis ; lane 7: B. ceti ; lane 8: B. pinnipedialis ; lane 9: B. microti ; lane 10 : B. inopinata , lane 11: Escherichia coli O157: H7 ( E. coli O157: H7), lane 12: P. multocida , lane 13: Salmonella entericica ( S. enterica ) lane 14: Yersinia enterocolitica O: 9 ( Yersinia enterocolitica O: 9); Lane 15: Ochrobactrum anthropi ; Lane 16: Campiovator Jejuni ; Lane 17: S. aureus Lane 18: Clostridium perfrigens ; Lane 19: negative control).
Figure 2 shows the sensitivity of the primer set of the present invention (M lane: 100-bp DNA ladder; lane 1: 60 ng / l; lane 2: 6 ng / l; lane 3: 0.6 ng / Lane 6: 0.6 pg / l; lane 7: 60 fg / l; lane 8: distilled water).

본 발명은 브루셀라 캐니스 균(개 브루셀라 균; Brucella canis) 특이적 동정용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention relates to the use of Brucella canis ( Brucella sp. canis- specific primer sets.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트는 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.The brucella cannaceae specific identification primer set of the present invention is characterized by comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.

본 발명에서 사용하는 용어인프라이머란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.The term primer used in the present invention is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template and has a starting point for template strand copying ≪ / RTI > Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents (DNA polymerase or reverse transcriptase) for polymerisation and four different dNTPs (deoxynucleoside triphosphate) at appropriate buffer solutions and temperatures.

프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.Primers can incorporate additional features that do not alter the primer's basic properties that serve as a starting point for DNA synthesis.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. The primers of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, "capping ", substitution of one or more natural nucleotides for one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers, e.g., methylphosphonate, Phosphoamidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.). The nucleic acid can be in the form of one or more additional covalently linked residues such as a protein such as a nuclease, a toxin, an antibody, a signal peptide, a poly-L-lysine, an intercalator such as acridine, ), Chelating agents (e.g., metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.), and alkylating agents.

또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.In addition, the primer nucleic acid sequences of the present invention may, if necessary, comprise markers detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (eg horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioisotopes (eg 32 P), fluorescent molecules, chemical groups (eg biotin), and the like. There is this.

본 발명에서 사용하는 용어인 동정은 시료에서 다른 미생물뿐만 아니라 동종의 브루셀라 균중에서 브루셀라 캐니스 균을 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다.
Identification as the term used in the present invention means that Brucella cannacea can be distinguished from other microorganisms in the sample as well as from the same type of Brucella.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스 균 동정용 PCR 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a PCR kit for identification of a brucellosis cannister comprising the primer set.

상기 브루셀라 캐니스 균 동정용 PCR 키트는 상기의 프라이머 세트 이외에, 미생물 검출키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 미생물 검출키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2 +와 같은 조인자 등일 수 있다. In addition to the primer set described above, the PCR kit for identification of Brucellosis can include conventional components included in the microorganism detection kit. Typical components included in the microorganism detection kit may be a reaction buffer, a polymerase, a dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP), a joiner such as Mg 2 +, and the like.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다. A variety of DNA polymerases can be used in the amplification step of the present invention, including the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase, and bacteriophage T7 DNA polymerase. Preferably, the polymerase is a thermostable DNA polymerase obtainable from a variety of bacterial species, including Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, and Pyrococcus furiosus (Pfu) . Most of these enzymes can be isolated from the bacteria itself or commercially available. In addition, the polymerase used in the present invention can be obtained from cells expressing high levels of the cloning gene encoding the polymerase.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.When performing the polymerization reaction, it is preferable to provide the reaction vessel with an excessive amount of the components necessary for the reaction. The excess amount of the components required for the amplification reaction means an amount such that the amplification reaction is not substantially restricted to the concentration of the component.

증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.All enzymes used in the amplification reaction may be active under the same reaction conditions. In fact, buffers make all enzymes close to optimal reaction conditions. Thus, the amplification process of the present invention can be carried out in a single reaction without changing conditions such as the addition of reactants.

상기 브루셀라 캐니스 균 동정용 PCR 키트에는 브루셀라 캐니스 판별용 배지 또는 상기 배지를 포함하는 균주 배양용 장치를 추가로 포함할 수 있다. 상기 균주 배양용 장치는 상기 배지 특히, 바람직하게는 고체상의 상기 배지와 상기 배지가 적재되어 있는 용기로 구성될 수 있다.
The PCR kit for identification of the Brucella cannace isolate may further comprise a culture medium for the determination of brucella canis or a culture apparatus for culturing the strain containing the culture medium. The strain culture apparatus may be composed of the medium, in particular, the medium on which the medium and the container in which the medium is loaded.

또한, 본 발명은 상기 브루셀라 캐니스 특이적 동정용 프라이머 세트와 생물학적 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 브루셀라 캐니스 균의 검출방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting Brucella canis bacteria comprising the step of mixing PCR with a biological sample and a set of identifying primers for Brucella canis specific identification.

본 발명의 프라이머 세트는 브루셀라 캐니스에만 결손된 유전자 부위를 분석하여 제작하였고, 상기의 프라이머를 이용하여 10종, 22 생태형(biovar)의 브루셀라 표준 균주, 93개 브루셀라 캐니스 분리 균주와 함께 유전학적, 혈청학적으로 관련된 비 브루셀라 균 중에서 브루셀라 캐니스만 특이적으로 검출할 수 있으며, 6 pg/㎕ 농도의 DNA에서도 브루셀라 캐니스의 존재 여부를 검출할 수 있는 민감도가 높은 프라이머 세트로서 개 브루셀라 병을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다. The primer set of the present invention was prepared by analyzing gene regions deficient in Brucella canis alone. Using the primers described above, 10 types, 22 brucella standard strains, 93 brucella canis isolates, , Can detect Brucella canis only specifically among serologically related non-Brucella spp., And can detect dog Brucella disease as a highly sensitive primer set that can detect the presence of brucella canis even at a DNA concentration of 6 pg / Diagnosis can be made quickly and accurately.

상기 생물학적 시료는 동물의 혈액, 땀, 소변, 대변, 조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 동물은 사람, 개, 소, 돼지, 양, 고래 및 돌고래등을 포함한다.The biological sample may be blood, sweat, urine, feces or tissue of an animal, but is not limited thereto. The animal includes a person, a dog, a cattle, a pig, a sheep, a whale and a dolphin.

상기의 방법은 브루셀라 균 중에서 브루셀라 캐니스 균을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 한다.
The above method is characterized in that Brucella canis is specifically detected in the brucella.

이하, 본 발명을 실시 예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. It will be apparent to those skilled in the art that the embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention.

[[ 실시예Example 1]  One] 브루셀라 Brucella 캐니스를Canis 특이적으로 동정하는  Specially-identified PCRPCR 프라이머primer 세트의 제작 Production of sets

브루셀라 캐니스(B. canis)만을 특이적으로 증폭할 수 있는 새로운 프라이머를 제작하기 위하여 10종의 브루셀라 균의 전장 유전체 및 부분 유전체를 분석한 결과, 브루셀라 캐니스에만 결손된 12bp 크기의 유전자 부위를 확인하였다. 상기 결손된 12bp를 중심으로 브루셀라 캐니스의 염색체 Ⅱ의 BCAN_B0548-0549 유전자 부위에서 브루셀라 캐니스 균 동정용 프라이머를 제작하였으며, 제작된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다. 제작된 프라이머에 의해서 증폭되는 서열(서열번호 3)은 300bp의 염기서열을 갖는 것을 확인하였다.
In order to construct a new primer capable of specifically amplifying B. canis , a total of 10 brucella genomes and partial genomes were analyzed. As a result, a 12 bp gene fragment deficient in Brucella canis alone Respectively. Primers for identification of Brucella cannacea were prepared from the BCAN_B0548-0549 gene region of chromosome II of Brucella canis, centered on the 12-bp deletion, and the primer sequences thus prepared are shown in Table 1. It was confirmed that the sequence (SEQ ID NO: 3) amplified by the prepared primer had a base sequence of 300 bp.

염기서열        Base sequence 정방향 프라이머(forward primer) Forward primer 5`-CCAGATAGACCTCTCTGGA-3`5`-CCAGATAGACCTCTCTGGA-3` 서열번호1SEQ ID NO: 1 역방향 프라이머(reverse primer) Reverse primer 5`-TGGCCTTTTCTGATCTGTTC-3`5`-TGGCCTTTTCTGATCTGTTC-3` 서열번호2SEQ ID NO: 2

[[ 실시예Example 2] 2] 브루셀라 Brucella 캐니스Canis 특이적 동정 Specific identification

상기 실시예 1에서 제작된 프라이머가 브루셀라 캐니스를 특이적으로 동정 하는지 확인하기 위하여 10종, 22 생태형(biovar) 브루셀라 표준균주, 93개 브루셀라 캐니스 분리균주와 함께 유전학적, 혈청학적으로 관련된 비 브루셀라균 8종에 대하여 PCR을 수행하였다.To confirm whether the primer prepared in Example 1 specifically identified brucella cannis, 10 genotypes, 22 biovar brucella standard strains and 93 brucella canis isolates were genetically and serologically related to each other PCR was performed on 8 species of Brucella.

보다 구체적으로, amfiEco PCR premix kit(GenDEPOT)에 제작된 실시예 1의 프라이머 세트(서열번호 1 및 2) 2와 각각의 균주의 DNA 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 최종부피를 25㎕가 되도록 하여 PCR을 수행하였다. 사용된 PCR premix는 1U Taq DNA 중합효소, 1.75 mM MgCl2 및 0.2 mM dNTP가 포함되어 있다. PCR은 처음에 94℃에서 7분 동안 변성(denaturation) 후, 94℃에서 35초 동안 변성, 59℃에서 40초 동안 결합(anealing) 및 72℃에서 35초 동안 신장(extension)하여 35 사이클을 반응시킨 후, 72℃에서 10분간 최종 신장하는 조건으로 실시하였다. 증폭된 각각의 DNA를 이용하여 1.5~2.0 % 아가로오즈 젤에서 100V로, 약 60분간 전기영동을 수행하였다. 결과를 도 1 및 표 2에 나타내었다.More specifically, 2 primers (SEQ ID NOS: 1 and 2) of Example 1 prepared in the amfiEco PCR premix kit (GenDEPOT) and 2 μl of DNA of each strain were added and distilled water was added to make a final volume of 25 μl PCR was performed. The PCR premix used was 1 U Taq DNA polymerase, 1.75 mM MgCl 2 And 0.2 mM dNTP. PCR was initially performed at denaturation at 94 ° C for 7 min, followed by denaturation at 94 ° C for 35 sec, annealing at 59 ° C for 40 sec, and extension at 72 ° C for 35 sec. Followed by final extension at 72 ° C for 10 minutes. Using the amplified DNA, electrophoresis was performed at 1.5 V 2.0% agarose gel at 100 V for about 60 minutes. The results are shown in FIG. 1 and Table 2.

종Bell 균주명Strain name 16S rRNA PCR16S rRNA PCR 본 발명의 프라이머를 이용한 PCRPCR using the primer of the present invention 브루셀라 종(Brucella species ( Brucella Brucella species)species) 브루셀라 아보투스(B. abortus) bv. 1Brucella abortus ( B. abortus ) bv. One 544544 ++ -- 브루셀라 아보투스 bv. 2Brucella Avotus bv. 2 86/8/5986/8/59 ++ -- 브루셀라 아보투스 bv. 3Brucella Avotus bv. 3 TulyaTulya ++ -- 브루셀라 아보투스 bv. 4Brucella Avotus bv. 4 292292 ++ -- 브루셀라 아보투스 bv. 5Brucella Avotus bv. 5 B3196B3196 ++ -- 브루셀라 아보투스 bv. 6Brucella Avotus bv. 6 870870 ++ -- 브루셀라 아보투스 bv. 9Brucella Avotus bv. 9 C68C68 ++ -- 브루셀라 캐니스(B. canis ) Bruce Canis ( B. canis ) RM6/66RM6 / 66 ++ ++ 브루셀라 수이스(B. suis) bv. 1 B. suis bv. One 13301330 ++ -- 브루셀라 수이스 bv. 2Brucella Suisse bv. 2 ThomsenThomsen ++ -- 브루셀라 수이스 bv. 3Brucella Suisse bv. 3 686686 ++ -- 브루셀라 수이스 bv. 4Brucella Suisse bv. 4 4040 ++ -- 브루셀라 수이스 bv. 5Brucella Suisse bv. 5 513513 ++ -- 브루셀라 오비스(B. ovis ) Orbis Brucella (B. ovis) 63/29063/290 ++ -- 브루셀라 네오토매(B. neotomae)Brucella neo-tote ( B. neotomae ) 5K335K33 ++ -- 브루셀라 멜리텐시스(B. melitensis) bv. 1Brucella mellitic X cis (B. melitensis) bv. One 16M16M ++ -- 브루셀라 멜리텐시스 bv. 2Brucella melitensis bv. 2 63/963/9 ++ -- 브루셀라 멜리텐시스bv. 3Brucella melitensis bv. 3 EtherEther ++ -- 브루셀라 세티(B. ceti) Brucella Seti ( B. ceti ) B1/94B1 / 94 ++ -- 브루셀라 핀니페디알리스(B. pinnipedialis ) Brucella pinni Phedi Alice (B. pinnipedialis) B2/94B2 / 94 ++ -- 브루셀라 마이크로티(B. microti) Brucella microti ( B. microti ) CCM4915CCM4915 ++ -- 브루셀라 이노피나타(B. inopinata ) Eno brucellosis blood appear (B. inopinata) B01B01 ++ -- 브루셀라 캐니스Brucella Canis 94 isolates94 isolates ++ ++ NonNon -- BrucellaBrucella organismsorganisms 오크로박트룸 안트로피 (Ochrobactrum anthropi) Ochrobactrum anthropi ) ++ -- 에셔리키아 콜리(Esherichia coli) Esherichia coli ) O157:H7O157: H7 -- -- 파스텔라 멀토시다( Pasteurella multocida The pastel called Merle Tosh (Pasteurella multocida -- -- 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica subsp. enterica)Salmonella enterica enterica subsp. enterica) -- -- 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) Yersinia enterocolitica ) O:9O: 9 -- -- 캄피오박터 제주니( Campylobacter jejuni ) Kam Pio bakteo your Jeju (Campylobacter jejuni ) -- -- 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ) isolateisolate ++ -- 크로스트리디움 펄프리겐스(Clostridium perfrigens) Clostridium perfrigens < RTI ID = 0.0 > isolateisolate -- --

도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 브루셀라 종 전체를 동정하는데 사용되는 16S rRNA PCR은 다양한 종의 브루셀라 균주뿐만 아니라 오크로박트룸 안트로피 및 스타필로코커스 아우레우스에서도 비특이적인 반응을 나타내었으나, 본 발명의 브루셀라 캐니스 균 특이적 프라이머의 경우, 다른 종의 균주와 비특이적인 반응이 일어나지 않았으며, 브루셀라 균 중에서도 브루셀라 캐니스 균만을 특이적으로 동정함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 프라이머는 유전적으로 유사한 브루셀라 균 중에서 브루셀라 캐니스 균만을 신속하고 정확하게 동정할 수 있는 프라이머임을 확인하였다.
As shown in FIG. 1 and Table 2, the 16S rRNA PCR used for identification of the entire brucellosis species showed nonspecific reaction not only in various species of Brucella strains but also in Orcobacterium anthrophy and Staphylococcus aureus, In the case of the brucella cannaceae specific primer of the present invention, nonspecific reaction with the strain of the other species did not occur, and it was confirmed that only Brucella canis was specifically identified in the brucella. From these results, it was confirmed that the primer of the present invention is a primer capable of rapidly and accurately identifying only Brucella canis in genetically similar Brucella.

[[ 실시예Example 3]  3] 브루셀라 Brucella 캐니스Canis 특이적  Specific 프라이머primer 세트의 민감도 확인. Check the sensitivity of the set.

브루셀라 캐니스를 특이적으로 동정하는 PCR 프라이머 세트의 민감도를 확인하기 위하여, 브루셀라 캐니스 표준 균주의 DNA를 증류수로 10진 계단 희석하여 60 fg/㎕에서 60 ng/㎕까지의 DNA 시료를 준비한 후, 실시예 2와 같은 방법으로 PCR을 수행하였다. To confirm the sensitivity of a PCR primer set that specifically identifies Brucella canis, DNA samples of Brucella canis standard strains from 60 fg / μl to 60 ng / μl were prepared by 10 step dilution of the DNA of the standard strain with distilled water , And PCR was carried out in the same manner as in Example 2.

결과를 도 2에 나타내었다.The results are shown in Fig.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 브루셀라 캐니스 동정용 프라이머 세트는 브루셀라 캐니스 표준 균주의 DNA를 6 pg/㎕ 농도까지 검출할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 브루셀라 캐니스 동정용 프라이머 세트는 브루셀라 캐니스 균주를 특이적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 낮은 농도의 브루셀라 캐니스 균주를 민감하게 검출할 수 있는 효과적인 프라이머임을 알 수 있다.As shown in FIG. 2, it was confirmed that the primer set for identification of brucella canis of the present invention can detect DNA of Brucella canis standard strain up to a concentration of 6 pg / μl. Therefore, it can be seen that the primer set for identification of brucella canis according to the present invention is an effective primer capable of sensitively detecting brucella canis strain at low concentration as well as capable of specifically detecting brucella cannis strain.

<110> Animal, plant and Fisheries quarnantine and inspection agency <120> Primer set for Brucella canis strain-specific identification and method for detecting Brucella canis strain using the same <130> P-131 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is forward primer for identifying Brucella canis <400> 1 ccagatagac ctctctgga 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is reverse primer for identifying Brucella canis <400> 2 tggccttttc tgatctgttc 20 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is DNA sequence amplified by primer for identifying Brucella canis, called BCAN_B0549-0549 <400> 3 ccagatagac ctctctggat ttgcgagcct cgcctgcctg tgccggcgca gtgaaaagcg 60 gggaggcggc aaggccgatg gccgccaccg tgaacattac ggccctgcgg aaattcatcc 120 gatcaaaaat gttggcgata ttcatgacat gcctcctgtc ttcttgtatg gaagacgttt 180 agcattcgta atttaagcaa tttgccgaag aatcgtgaaa attttcagta aattctatcg 240 atttgggcgg ttcagctgac ataaagaaga aggctggaaa gaacagatca gaaaaggcca 300 300 <110> Animal, plant and fisheries quarnantine and inspection agency <120> Primer set for Brucella canis strain-specific identification and          method for detecting Brucella canis strain using the same <130> P-131 <160> 3 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is forward primer for identifying Brucella canis <400> 1 ccagatagac ctctctgga 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is reverse primer for identifying Brucella canis <400> 2 tggccttttc tgatctgttc 20 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is the DNA sequence amplified by primer for identifying Brucella          canis, called BCAN_B0549-0549 <400> 3 ccagatagac ctctctggat ttgcgagcct cgcctgcctg tgccggcgca gtgaaaagcg 60 gggaggcggc aaggccgatg gccgccaccg tgaacattac ggccctgcgg aaattcatcc 120 gatcaaaaat gttggcgata ttcatgacat gcctcctgtc ttcttgtatg gaagacgttt 180 agcattcgta atttaagcaa tttgccgaag aatcgtgaaa attttcagta aattctatcg 240 atttgggcgg ttcagctgac ataaagaaga aggctggaaa gaacagatca gaaaaggcca 300                                                                          300

Claims (6)

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 브루셀라 캐니스(Brucella canis) 특이적 동정용 프라이머 세트. Brucella canis specific identification primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스(Brucella canis)균 동정용 PCR 키트.A PCR kit for identifying a Brucella canis fungus comprising the primer set of claim 1. 제 1항의 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트와 생물학적 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 브루셀라 캐니스 균의 검출방법.A method for detecting Brucella canis bacteria comprising mixing a biological sample with a set of Brucella canis-specific identifying primers of claim 1 to perform PCR. 제 3항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 동물의 혈액, 땀, 소변, 대변 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 브루셀라 캐니스 균의 검출방법.4. The method according to claim 3, wherein the biological sample is at least one species selected from the group consisting of blood, sweat, urine, feces and tissues of an animal. 제 4항에 있어서, 상기 동물은 사람, 개, 소, 돼지, 양, 고래 및 돌고래로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 브루셀라 캐니스 균의 검출방법.5. The method according to claim 4, wherein the animal is at least one selected from the group consisting of a human, a dog, a cow, a pig, a sheep, a whale and a dolphin. 제 3항에 있어서, 상기 검출은 브루셀라 균 중에서 브루셀라 캐니스를 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는, 브루셀라 캐니스 균의 검출방법.
4. The method according to claim 3, wherein the detection specifically detects brucella canis in the brucella.
KR1020120088442A 2012-08-13 2012-08-13 Primer set for Brucella canis strain-specific identification and method for detecting Brucella canis strain using the same KR101437389B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120088442A KR101437389B1 (en) 2012-08-13 2012-08-13 Primer set for Brucella canis strain-specific identification and method for detecting Brucella canis strain using the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120088442A KR101437389B1 (en) 2012-08-13 2012-08-13 Primer set for Brucella canis strain-specific identification and method for detecting Brucella canis strain using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140022195A true KR20140022195A (en) 2014-02-24
KR101437389B1 KR101437389B1 (en) 2014-09-04

Family

ID=50268241

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120088442A KR101437389B1 (en) 2012-08-13 2012-08-13 Primer set for Brucella canis strain-specific identification and method for detecting Brucella canis strain using the same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101437389B1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500754A (en) * 2020-05-29 2020-08-07 山东省健牧生物药业有限公司 Primer and kit for identifying four Brucella in dog and application of primer and kit
CN112029830A (en) * 2020-09-16 2020-12-04 上海上药第一生化药业有限公司 Method for improving sensitivity of PCR (polymerase chain reaction) for identifying pig, cattle and sheep derived components in protein biochemical raw material crude product

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090100950A (en) * 2008-03-21 2009-09-24 경상북도(가축위생시험소) Method for detection brucellosis using real time pcr

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500754A (en) * 2020-05-29 2020-08-07 山东省健牧生物药业有限公司 Primer and kit for identifying four Brucella in dog and application of primer and kit
CN112029830A (en) * 2020-09-16 2020-12-04 上海上药第一生化药业有限公司 Method for improving sensitivity of PCR (polymerase chain reaction) for identifying pig, cattle and sheep derived components in protein biochemical raw material crude product

Also Published As

Publication number Publication date
KR101437389B1 (en) 2014-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Miller et al. Extended multilocus sequence typing system for Campylobacter coli, C. lari, C. upsaliensis, and C. helveticus
Bickley et al. Evaluation of the polymerase chain reaction for detecting the urease C gene of Helicobacter pylori in gastric biopsy samples and dental plaque
Whittington et al. Evaluation of modified BACTEC 12B radiometric medium and solid media for culture of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from sheep
Vandamme et al. Misidentifying helicobacters: the Helicobacter cinaedi example
Gilardoni et al. Bovine paratuberculosis: a review of the advantages and disadvantages of different diagnostic tests
Al Amri et al. Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools
De Groote et al. Detection of non‐pylori Helicobacter species in “Helicobacter heilmannii”‐infected humans
Higgins et al. Genotyping of Escherichia coli from environmental and animal samples
Iraola et al. Application of a multiplex PCR assay for Campylobacter fetus detection and subspecies differentiation in uncultured samples of aborted bovine fetuses
Suchodolski et al. Application of molecular fingerprinting for qualitative assessment of small-intestinal bacterial diversity in dogs
Baele et al. Multiplex PCR assay for differentiation of Helicobacter felis, H. bizzozeronii, and H. salomonis
Singh et al. Diagnostic application of IS900 PCR using blood as a source sample for the detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in early and subclinical cases of caprine paratuberculosis
Cantet et al. Helicobacter species colonizing pig stomach: molecular characterization and determination of prevalence
Vargas et al. Phenotypic and molecular characterization of bovine Campylobacter fetus strains isolated in Brazil
Motiwala et al. Rapid detection and typing of strains of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from broth cultures
Mikulić et al. Prevalence of thermotolerant Campylobacter spp. in chicken meat in Croatia and multilocus sequence typing of a small subset of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolates
Thomson et al. A multiplex PCR test to identify four common cattle-adapted Cryptosporidium species
Osek et al. Listeria monocytogenes in foods—From culture identification to whole‐genome characteristics
JP5613971B2 (en) Method for detecting pathogenic Listeria monocytogenes
Alvarez et al. Genetic diversity of Mycobacterium avium isolates recovered from clinical samples and from the environment: molecular characterization for diagnostic purposes
Glanemann et al. Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis‐specific DNA by PCR in intestinal biopsies of dogs
KR101437389B1 (en) Primer set for Brucella canis strain-specific identification and method for detecting Brucella canis strain using the same
Delpiazzo et al. Accurate and fast identification of Campylobacter fetus in bulls by real-time PCR targeting a 16S rRNA gene sequence
KR20090100950A (en) Method for detection brucellosis using real time pcr
AU2008292946B2 (en) Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant