KR20140018824A - Pharmaceutical composition having antioxidant comprising chlorophylls from isolated soybean - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 콩으로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition having antioxidant activity comprising chlorophylls isolated from soybean as an active ingredient.
인간의 질병 중 암은 현대의학의 발달에도 불구하고 아직까지 치료에 어려움이 있는 질병으로, 그 발생 요인의 80~90%는 환경적 요인에 기인하고 이 중 30~60%가 식이 및 영양과 연관되어 있으며, 기타 다른 요인으로는 흡연, UV, X-ray와 같은 방사선 조사, 직업적 요인, 음주, 내인성 호르몬 등에 의해 유발된다고 알려져 있다(Doll and Peto, 1981). Cancer among human diseases is a disease that is difficult to treat despite the development of modern medicine. 80 ~ 90% of the causes are caused by environmental factors, and 30 ~ 60% of them are related to diet and nutrition (Doll and Peto, 1981). Other factors are known to be caused by radiation, such as smoking, UV, X-ray, occupational factors, drinking and endogenous hormones.
이에 많은 연구자들이 암을 정복하기 위해 여러 방면으로 다양한 연구를 진행하고 있으며, 이러한 연구의 한 부분으로 식품이나 천연약제 중에서 암의 증식을 차단하거나 억제하는 성분을 생물체에서 찾으려는 노력이 이루어지고 있다. Many researchers are conducting various studies to conquer cancer. As a part of this research, efforts are being made to find an ingredient in an organism that blocks or inhibits the growth of cancer in foods or natural medicines.
식품 중에서 대표적인 발암 저해작용을 갖는 성분들로 페놀, 인돌, 방향성 이소티오시아네이티, 메틸화 플라본, 쿠마린, 식물 스테롤, 셀레늄염, 단백질분해저해제, 아스코르브산, 토코페롤, 케로틴 등의 피토케미칼(phytochemical)이 알려져 있다(Ames, 1983). 이러한 피토케미칼들은 대부분 높은 항산화 활성을 가지고 있으며, 발암형성 초기단계에 영향을 주거나 발암물질이 목표부위에 도달하는 것을 막는 차단제(blocking agent)로 작용하고 또는 최종 단계에 작용하여 암 발생을 방지한다(Wattenberg, 1985).Examples of the components having typical carcinogenic inhibitory action in foods include phytochemicals such as phenol, indole, aromatic isothiocyanate, methylated flavone, coumarin, plant sterol, selenium salt, proteolytic inhibitor, ascorbic acid, tocopherol, (Ames, 1983). Most of these phytochemicals have a high antioxidant activity and act as a blocking agent to prevent the carcinogen from reaching the target site or to act on the final stage to prevent cancer development Wattenberg, 1985).
식물의 잎이나 과일에 포함되어진 피토케미칼의 섭취는 그들의 항산화 활성에 기인하여 다양한 질병을 예방하는데 중요한 역할을 수행하는 것이 증명되었다. 과거 많은 연구에서 이러한 잠재적인 항산화 활성을 가지고 있는 소재 및 물질을 선발하는 내용을 주로 다루고 있다. 하지만 인간의 건강에 관하여 질병치료와 건강증진에 기여하는 것이 비타민 C나 E, 카로티노이드(carotenoid) 및 폴리페놀(polyphenol) 등에 의한 것인지, 또는 클로로필에 의한 것인지에 대해서는 서로 다른 의견이 있다. 그럼에도 불구하고 자연계에 풍부하게 존재하는 색소화합물인 클로로필은 대부분의 연구에서 그 대상에 포함되지 못하고 있다. 이러한 정보의 부족은 클로로필과 그 유도체를 정제된 형태로 얻기가 어렵고 구조적 불안정성에 기인한 분해양상에 의한 것으로 판단되어진다. The intake of phytochemicals contained in plant leaves and fruits has been shown to play an important role in preventing various diseases due to their antioxidant activity. Many studies in the past have focused on the selection of materials and substances that have these potential antioxidant activities. However, there is a different opinion as to whether human health contributes to disease treatment and health promotion by vitamin C or E, carotenoids, polyphenols, or chlorophyll. Nonetheless, chlorophyll, which is an abundant pigment in nature, is not included in most studies. The lack of this information is thought to be due to the difficulty in obtaining chlorophyll and its derivatives in purified form and the degradation pattern due to structural instability.
클로로필은 식물의 녹색색깔을 나타내는 본질적인 색소이며, 전자기적 스펙트럼(spectrum)에서 적색과 청색부분을 흡수하고, 광합성 과정을 통하여 태양에너지를 화학에너지로 변환시키는데 중요한 역할을 하고 있다. 광 존재 하에서 클로로필의 산화촉진활성(pro-oxidant)은 산소에 에너지를 전달하여 수퍼옥사이드 라디칼(O2 ·－)이나 단일항산소(1O2)와 같은 활성산소종을 형성하는 것으로 알려져 있으나(Enod et al., 1985a; Endo et al., 1985b), 암조건하에서 클로로필이나 페오피틴은 식용 유지의 자동산화를 막음으로써 유지가 산패되는 것을 막는 효과를 가지고 있고, 수소공여 메카니즘에 의해 라디칼 형성 연쇄반응을 파괴하는 항산화 기능을 가지고 있는 것이 보고되었다(Usuki et al., 1984). 뿐만 아니라 클로로필을 구성하는 본질적인 화학적 구조인 포르피린(porphyrin) 구조는 항산화 활성에 본질적인 기능을 수행하는 것으로 보고되어지고 있다(Ursula et al., 2005). Hoshina 등 (1998)은 클로로필이 핵 중앙에 메탈이 없는 클로로필 유도체보다 더 우수한 항산화 효과를 가지고 있는 것을 확인하였으며, 지질의 자동산화를 억제하는 포르피린 고리(porphyrin ring)의 중요성을 확인하였다. Chlorophyll is an intrinsic pigment that represents the green color of plants, and it plays an important role in absorbing the red and blue parts in the electromagnetic spectrum and converting solar energy into chemical energy through photosynthesis. In the presence of light, the pro-oxidant of chlorophyll is known to transfer energy to oxygen to form reactive oxygen species such as superoxide radicals (O 2 .sup.- ) or singlet oxygen ( 1 O 2 ) Chlorophyll and pheophytin have been found to inhibit auto-oxidation of edible fats to prevent slaughter of oils and fats, and the formation of radicals by the hydrogen donor mechanism (Enod et al., 1985a; Endo et al., 1985b) It has been reported that it has an antioxidant function that destroys the chain reaction (Usuki et al., 1984). In addition, the porphyrin structure, an intrinsic chemical structure that constitutes chlorophyll, has been reported to perform its essential function in antioxidant activity (Ursula et al., 2005). Hoshina et al. (1998) confirmed that chlorophyll has a better antioxidative effect than chlorophyll derivatives without metal at the center of the nucleus, and confirmed the importance of porphyrin ring, which inhibits autoxidation of lipid.
Ferruzzi 등(2002)은 in vitro 상의 자유라디칼 소거활성과 박테리아의 복귀돌연변이 활성 검정에서 금속이 킬레이트화된 클로로필 유도체 뿐만 아니라 수용성과 지용성의 특성을 가진 클로로필 유도체가 항산화 활성 및 항돌연변이활성을 가지고 있음을 보고하였고, 합성되어진 금속치환 클로로필 유도체, 특히 구리(Cu)가 킬레이트 된 클로로필이 자연상태의 클로로필이나 마그네슘이 없는 클로로필보다 더 높은 항산화 능력을 가지고 있다고 보고하였다. Ferruzzi et al. (2002) found that chlorophyll derivatives with water-soluble and lipophilic properties, as well as chlorophyll derivatives chelated with metals, have antioxidative and antimutagenic activities in vitro in terms of free radical scavenging activity and bacterial return mutagenic activity And reported that the synthesized metal-substituted chlorophyll derivatives, especially copper (Cu) chelated chlorophyll, have higher antioxidant capacity than natural chlorophyll or magnesium-free chlorophyll.
현재 천연의 클로로필이 다양한 과일 및 영양체에 높은 수준으로 포함되어진 점에 기인하여 인간의 건강에 영향을 미치는 효과에 대한 관심이 높아지고 있으나, 이러한 자연적인 클로로필의 농도의존적인 반응에 대한 항산화 활성이나 항발암활성(anticarcinogenecity)에 대한 활용할 만한 자료는 거의 없는 실정이다. At present, natural chlorophyll is included in various fruits and nutrients at a high level. However, interest in the effect of human chlorophyll on human health is increasing. However, There is little data available for anticarcinogenicity.
한편, 콩(Glycine max L.)은 우리나라의 주요 식량작물로서 단백질(약 40%)과 지질(약 20%)을 다량 함유하여 영양 면에서 우수한 식품이며, 중요한 식물성 기름의 원료이기도 하다. 콩은 된장, 청국장, 고추장, 간장 등의 발효제품, 콩나물 같은 발아제품 및 두유, 두부, 식용유 등 기타 제품의 형태로 가공되어 식품으로서의 이용도가 높고, 또한 의약품, 화장품, 비누 등 공업용 제품의 원료로서도 널리 이용되고 있다.On the other hand, soybean ( Glycine max L.) is a major food crop in Korea and contains a large amount of protein (about 40%) and lipid (about 20%). Soybean is processed in the form of fermented products such as doenjang, cheonggukjang, kochujang, soy sauce, germinated products such as soybean sprouts, and other products such as soybean milk, tofu and edible oil, Is also widely used.
콩은 주요 영양적 기능 외에도 인체에 유익한 다양한 생리활성 물질이 함유되어 있는 것으로 평가되므로 이들 영양성분과 생리활성 물질의 분석기법 확립 및 국내ㆍ외 유용자원에 대한 체계적 검토는 향후 국내 식량작물의 경쟁력 강화를 위한 주요 요소로 작용할 것이다.As soybeans are evaluated to contain various physiologically active substances beneficial to human body in addition to their major nutritional functions, establishment of analytical techniques for these nutrients and bioactive substances and systematic review of domestic and foreign useful resources will strengthen the competitiveness of domestic food crops It will serve as a key element for
종래 이러한 콩의 성분 중 단백질이나 이소플라본을 위주로 한 연구가 주류를 이루고 있으며, 이를 이용한 기술개발이 주로 이루어지는 상황으로서, 그 외 다양한 기능성 성분에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있다.Research on soybean protein or isoflavone as a main component of soybean has been conducted in the past, and development of the technology using soybean protein has been mainly performed, and research on various other functional ingredients has hardly been conducted.
따라서 본 발명에서는 콩으로부터 클로로필 및 그 유도체를 분리하고 분리된 클로로필 및 그 유도체가 가지는 농도의존적인 반응에 대한 항암 및 항산화 활성을 평가하여 이를 포함하는 약학적 조성물, 건강보조식품 및 화장료 조성물로 제공하고자 한다.
Accordingly, in the present invention, chlorophyll and its derivatives are separated from soybean, and the anticancer and antioxidative activities against the concentration-dependent reaction of the separated chlorophyll and derivatives thereof are evaluated to provide a pharmaceutical composition, a health supplement and a cosmetic composition containing the same do.
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 콩으로부터 분리된 클로로필류를 포함하는 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.In order to solve the problems of the prior art as described above, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition having an antioxidant activity including chlorophylls isolated from soybeans.
또한 본 발명은 콩으로부터 분리된 클로로필류를 포함하는 항산화 효과 증진용 건강보조식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a dietary supplement for enhancing antioxidant effects, including chlorophylls isolated from soybeans.
또한 본 발명은 콩으로부터 분리된 클로로필류를 포함하는 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a cosmetic composition having antioxidative activity containing chlorophylls separated from soybean.
또한 본 발명은 콩의 새로운 생리활성 기능을 밝히면서 항산화 활성을 가지는 조성물로서의 새로운 원천을 제시할 수 있으며, 콩으로부터 분리된 클로로필류의 항암 및 항산화 효과를 검정하여 새로운 기능을 제시할 수 있는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물, 건강보조식품 및 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
In addition, the present invention can propose a new source as a composition having antioxidant activity while revealing a new physiological activity of soybeans, and anticancer and antioxidants that can suggest new functions by assaying the anticancer and antioxidant effects of chlorophylls isolated from soybeans. It is an object to provide a pharmaceutical composition, dietary supplement and cosmetic composition having an activity.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콩으로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition having an antioxidant activity, characterized in that it comprises chlorophylls isolated from soybean as an active ingredient.
상기 클로로필류는 약학적 조성물에 0.1~80중량%로 포함되는 것이 바람직하다.The chlorophyll is preferably contained in the pharmaceutical composition in an amount of 0.1 to 80% by weight.
특히, 상기 클로로필류는 클로로필 a 또는 클로로필 b인 것이 바람직하다.Particularly, the chlorophyll is preferably chlorophyll-a or chlorophyll-b.
상기의 클로로필류는 콩, 발아콩 또는 콩나물로부터 분리할 수 있다.The above-mentioned chlorophyll can be separated from soybeans, sprouts or bean sprouts.
구체적으로, 상기 클로로필류는 콩의 종실을 발아시키는 단계, 상기 발아된 콩을 건조하고 분쇄하여 유기용제에 침지하고 여과시킨 여액을 감압 농축하여 발아 콩 추출물을 얻는 단계 및 상기 발아 콩 추출물로부터 클로로필을 분리 정제하는 단계로 분리하는 것이 좋다.Specifically, the chlorophyll is obtained by germinating soybean seeds, drying and pulverizing the germinated soybeans, immersing in an organic solvent, and concentrating the filtrate under reduced pressure to obtain a germinated soybean extract, and extracting chlorophyll from the germinated soybean extract And separation and purification steps.
상기와 같은 콩으로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 대장암에 대하여 우수한 항암 활성을 나타낸다.The pharmaceutical composition comprising chlorophyll, which is isolated from soybean as above, as an active ingredient shows excellent anticancer activity against colon cancer.
또한 본 발명은 콩으로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 및 항산화 효과 증진용 건강보조식품을 제공한다.The present invention also provides a health supplement for promoting anticancer and antioxidative effect, which comprises chlorophyll isolated from soybean as an active ingredient.
상기 클로로필류는 건강보조식품에 0.1~50중량%로 포함되는 것이 바람직하다.It is preferable that the chlorophyll is contained in the health supplement food in an amount of 0.1 to 50% by weight.
상기 클로로필류로는 클로로필 a 또는 클로로필 b인 것이 바람직하다.The chlorophyll is preferably chlorophyll-a or chlorophyll-b.
또한 본 발명은 콩으로부터 분리한 클로로필류를 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition having an antioxidative activity comprising chlorophyll separated from soybean as an active ingredient.
상기 클로로필류는 화장료 조성물에 0.1~40중량%로 포함되는 것이 바람직하다.
The chlorophylls are preferably contained in 0.1 to 40% by weight in the cosmetic composition.
본 발명에 따르면, 콩으로부터 분리된 클로로필류에 대한 항산화 활성 및 다양한 암세포주에 대한 증식 억제 효과를 검증하여 콩의 새로운 생리활성 기능을 밝힘으로써 항암 및 항산화 활성을 가지는 조성물로서의 새로운 원천을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
According to the present invention, the antioxidant activity against chlorophylls isolated from soybeans and the proliferation inhibitory effect against various cancer cell lines are verified, thereby revealing a new bioactive function of soybean, thereby suggesting a new source as a composition having anticancer and antioxidant activity. You can expect the effect.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 발아시킨 콩 추출물에서 분리한 클로로필 a(분리색소 2)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 발아시킨 콩 추출물에서 분리한 클로로필 b(분리색소 1)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 콩으로부터 분리된 클로로필류의 리놀레산 산화에 의해 발생하는 퍼옥시기 생성 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 물/리놀레산 에멀젼에서 β-카로틴 블리칭 분석법(β-carotene bleaching assay method)에 의하여 측정된 클로로필 a의 농도별 항산화활성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 MTT 분석에 의하여 측정된 클로로필류의 농도별 암세포 증식 억제율을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 발암성과 관계되는 헴(heme) 처리에 의해 유발되는 대장 상피세포 분화와 과도생장에 대한 클로로필류의 저해효과를 나타낸 것이다.1 is a 1 H-NMR spectrum of chlorophyll-a (separated dye 2) isolated from a soybean germinated in accordance with an embodiment of the present invention.
2 is a 1 H-NMR spectrum of chlorophyll b (isolated dye 1) isolated from a soybean germinated in accordance with an embodiment of the present invention.
FIG. 3 shows the effect of inhibiting the formation of peroxygen from the oxidation of linoleic acid in chlorophylls isolated from soybean according to an embodiment of the present invention.
4 shows the antioxidative activity of chlorophyll-a according to the concentration measured by the? -Carotene bleaching assay method in a water / linoleic acid emulsion according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing inhibition rate of cancer cell proliferation by concentration of chlorophyll, measured by MTT analysis according to an embodiment of the present invention.
Figure 6 shows the effect of chlorophyll inhibition on differentiation of colon epithelial cells and overgrowth induced by heme treatment associated with carcinogenicity according to one embodiment of the present invention.
이하 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명자들은 인간의 건강을 위한 클로로필류의 생리활성적 고찰과 이러한 색소계 화합물의 사용에 대한 특성을 파악하기 위하여 콩으로부터 클로로필 a, 클로로필 b를 정제된 형태로 획득하였고, 분리된 각 색소 화합물에 대한 항산화 활성 및 항암활성을 검정한 결과, 콩으로부터 분리된 클로로필류가 항산화 및 항암 활성을 가짐을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors obtained chlorophyll-a and chlorophyll-b in purified form from soybeans in order to examine the physiological activity of chlorophyll for human health and the characteristics of use of such a pigment-based compound, The antioxidant activity and the anticancer activity of the extracts of the present invention were tested to confirm that the chlorophylls separated from the soybean had antioxidant and anticancer activities. Based on this finding, the present invention was completed.
이하 본 발명에서 설명하는 콩은 콩과에 속하는 식물 종자를 모두 의미하는 것으로, 순수한 콩 이외에 통상의 방법으로 콩을 발아시켜 얻어지는 발아콩(배축부가 1㎝ 이하) 및 콩나물(배축부가 5~10㎝)을 모두 포함하는 것은 물론이다. 또한, 클로로필류는 콩으로부터 분리한 모든 클로로필류를 의미하는 것으로, 이하 본 발명에서는 콩으로부터 분리할 수 있는 클로로필류 중 클로로필 a, 클로로필 b를 구체적인 예로 들어 설명한다.The soybeans described in the present invention mean all of the plant seeds belonging to the soybean family, and in addition to pure soybeans, germinated soybeans obtained by germinating soybeans in a usual manner (less than 1 cm in pore size) and bean sprouts (5 to 10 cm in pore size Of course). In the present invention, chlorophyll a and chlorophyll b among the chlorophyls which can be separated from soybean will be described as specific examples.
본 발명의 약학적 조성물은 콩으로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.The pharmaceutical composition of the present invention is characterized by comprising chlorophyll separated from soybean as an active ingredient.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 클로로필류는 통상적인 방법에 의하여 콩으로부터 분리할 수 있다. 예를 들어, 추출 용매로 아세톤을 1~30배, 바람직하게는 5~15배 부피량을 10~50℃, 바람직하게는 실온에서 0.5~48시간, 바람직하게는 20~30시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법으로, 바람직하게는 냉침추출법으로 추출하거나, 또는 추출 용매로 메탄올 또는 에탄올을 포함한 알콜류를 1~30배, 바람직하게는 5~15배 부피량을 4~80℃, 바람직하게는 30~80℃의 추출 온도에서 0.5~10시간, 바람직하게는 1~5시간 침적, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법으로 추출한 후 추출액을 원심분리 및 여과, 농축하여 콩으로부터 클로로필류를 분리할 수도 있다.The chlorophyll contained in the pharmaceutical composition of the present invention can be isolated from soybeans by a conventional method. For example, acetone is extracted 1 to 30 times, preferably 5 to 15 times by volume as an extraction solvent at 10 to 50 ° C, preferably at room temperature for 0.5 to 48 hours, preferably 20 to 30 hours, Extraction by hot water extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction, or the like, preferably by a cold extraction method, or by extracting alcohols containing methanol or ethanol with an extraction solvent in a volume of 1 to 30 times, preferably 5 to 15 times Extraction with an extraction method such as immersion, cold extraction, hot water extraction, ultrasonic extraction or reflux cooling extraction at an extraction temperature of 4 to 80 ° C, preferably 30 to 80 ° C for 0.5 to 10 hours, preferably 1 to 5 hours, May be centrifuged, filtered, and concentrated to separate the chlorophylls from the soybean.
구체적으로, 본 발명에서 콩으로부터 클로로필류를 분리하기 위해 실시한 일예는 다음과 같다.Specifically, an example of separation of chlorophylls from soybeans in the present invention is as follows.
먼저, 콩의 종실을 발아시킨 후, 상기 발아된 콩을 건조하고 분쇄하여 유기용제에 침지하고 여과시킨 여액을 감압 농축하여 발아 콩 추출물을 얻는 다음, 상기 발아 콩 추출물로부터 클로로필을 분리 정제하는 단계로 이루어진다.First, the soybean seeds are germinated, and then the germinated soybean is dried and pulverized. The soybean is dipped in an organic solvent and filtered. The filtrate is concentrated under reduced pressure to obtain a germinated soybean extract, followed by separation and purification of chlorophyll from the germinated soybean extract .
콩의 발아는 콩의 종실을 물에 침지한 다음 상온다습이 유지되는 암(暗)상태에서 간헐 살수하여 이루어진다. 상기 침지는 18~25℃의 상온의 물에서 4~12시간 침지하는 것이 원활한 발아를 위하여 바람직하다. 충분한 침지가 이루어진 후 상온다습, 즉 상온에서 상대습도 50~100%로 유지되는 암상태에서 발아시킨다. 상기한 콩은 콩과에 속하는 식물의 종자이면 모두 적용 가능하다.The germination of soybeans is accomplished by immersing soybean seeds in water and intermittently spraying them in a dark state where normal temperature and humidity are maintained. It is preferable that the immersion is carried out in water at a temperature of 18 to 25 DEG C for 4 to 12 hours for smooth germination. After sufficient immersion, germination is carried out at normal temperature and humidity, that is, in a dark state maintained at a relative humidity of 50 to 100% at normal temperature. The above-mentioned soybean is applicable to any seed of a plant belonging to the soybean family.
상기 간헐 살수는 4~6시간 간격으로 1~10분간 살수하여 이루어질 수 있으며, 타이머가 장착된 장치를 사용할 경우 재배가 편리하다. 발아는 콩의 자엽과 하배축 분리 시점부터 20일간, 바람직하기로는 4~15일간 이루어지는 것이 좋다.The intermittent spraying can be done by spraying at intervals of 4 to 6 hours for 1 to 10 minutes, and cultivation is convenient when a device equipped with a timer is used. Germination is preferably carried out for 20 days, preferably 4 to 15 days from the time of separation of the cotyledon and hypocotyl of the soybean.
그 다음, 상기 발아된 콩을 건조하고 분쇄하여 유기용제에 침지하고 여과시킨 여액을 감압 농축하여 발아 콩 추출물을 얻는다.Then, the germinated soybeans are dried and ground, immersed in an organic solvent, filtered, and concentrated under reduced pressure to obtain a germinated soybean extract.
상기 발아된 콩은 자엽과 배축부를 포함하여 이루어진 것으로, 콩이 발아 후 자엽과 배축부가 분리된 시점부터의 발아된 콩을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 발아 후 2~20일 경과한 것을 사용하는 것이 클로로필 수득 측면에서 바람직하다.The germinated soybean comprises cotyledon and a spinal part. The soybean germinated from the time when the cotyledon is separated from the cotyledon after germination can be used. Preferably, 2 to 20 days after germination is used Which is preferable in terms of obtaining chlorophyll.
클로로필은 분자구조 내에 소수성 잔기인 피톨을 함유하고 있는 구조적 특성상 지용성을 나타낸다. 따라서, 물과 같은 완전극성 용제에는 전혀 용해되지 않으므로, 극성 혹은 비극성 유기용제를 추출용매로 사용하는 것이 좋다.Chlorophyll exhibits lipophilicity due to its structural nature, which contains a hydrophobic residue, phytol, in the molecular structure. Therefore, it is not soluble in a completely polar solvent such as water. Therefore, it is preferable to use a polar or nonpolar organic solvent as an extraction solvent.
상기한 극성 혹은 비극성 유기용제로는 탄소수 2~5의 저급 알코올, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸에테르, 크실렌, 헥산 등과 같은 유기용제를 사용할 수 있다.Examples of the polar or non-polar organic solvent include organic solvents such as lower alcohols having 2 to 5 carbon atoms, acetone, acetonitrile, ethyl acetate, chloroform, dichloromethane, ethyl ether, xylene and hexane.
상기 유기용제로서 알코올 또는 아세토니트릴과 같이 극성이 5~6 수준의 극성 유기용제에는 비교적 잘 용해되는 특성을 나타내지만, 이들 용제의 경우 당을 포함한 다양한 극성물질에 대한 용해도가 뛰어나므로 상기한 극성 유기용제를 사용하는 경우에는 클로로필 외에 당, 플라보노이드, 배당체 및 단백질을 포함한 다른 극성물질까지 포괄적으로 추출되는 경향이 다소 있다.The organic solvent is relatively soluble in polar organic solvents having a polarity of 5 to 6, such as alcohol or acetonitrile. However, since these solvents have excellent solubility in various polar materials including sugar, When solvents are used, there is a tendency to extract chlorophyll as well as other polar substances, including sugars, flavonoids, glycosides and proteins, in a comprehensive manner.
또한 상대적으로 중간극성 또는 비극성의 특성을 나타내는 에틸아세테이트, 클로로포름, 부탄올, 프로판올, 디클로로메탄, 에틸에테르, 크실렌, 헥산 등과 같은 유기용제를 사용할 경우 지용성의 특성을 나타내는 클로로필도 잘 추출할 수 있지만, 클로로필보다 더 낮은 극성을 나타내는 물질의 용해도가 극히 증가되어 비극성 물질의 혼입이 커지는 경향이 있다.When organic solvents such as ethyl acetate, chloroform, butanol, propanol, dichloromethane, ethyl ether, xylene, hexane and the like which exhibit relatively intermediate polarity or nonpolar characteristics are used, chlorophyll exhibiting oil-solubility characteristics can be extracted well. The solubility of the material exhibiting a lower polarity is extremely increased, and the incorporation of the non-polar material tends to be increased.
한편, 아세톤은 극성의 측면에서 알코올류와 유사한 5.1 수준을 나타내지만, 식물체 내에 다량으로 존재하는 당, 배당체 및 단백질 성분들은 아세톤에 대해 용해도가 극히 부족하여 아세톤을 용제로 사용할 경우 추출이 잘 이루어지지 않으며, 소량 추출된다 하더라도 냉침을 이용하면 용해도가 극히 낮아져 침전물 형태로 침전되므로 여과에 의해 제거할 수 있어 상대적으로 고순도의 클로로필을 추출할 수 있는 잇점이 있다.On the other hand, acetone exhibits a 5.1 level similar to that of alcohols in terms of polarity, but sugar, glycosides and protein components present in a large amount in plants are extremely insoluble in acetone, Even if a small amount of water is extracted, it is advantageous to extract chlorophyll with a relatively high purity since it can be removed by filtration because it is precipitated in the form of precipitate because of its extremely low solubility.
용제는 발아된 콩의 건조 분말 중량대비 5~20배의 중량으로 사용할 수 있으며, 상기 추출은 저온의 암조건 추출, 상온 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 응용할 수 있다.The solvent may be used at a weight of 5 to 20 times the dry powder weight of the germinated soybean. The extraction may be carried out by various methods such as low temperature dark condition extraction, room temperature extraction, and ultrasonic extraction.
상기 아세톤을 제거한 발아 콩 추출물을 농축시킨 후 컬럼크로마토그래피를 수행하여 클로로필의 분획을 얻고, 각 분획을 농축 건고하여 재용해한 다음 분취 HPLC를 사용하여 순수 분리 및 정제하여 콩으로부터 클로로필을 분리할 수 있다.The acetone-free germinated soybean extract was concentrated and then subjected to column chromatography to obtain a fraction of chlorophyll. The fractions were concentrated and dried, followed by redissolving, followed by pure separation and purification using preparative HPLC to separate the chlorophyll from the soybean have.
본 발명에서는 현시점에서 콩으로부터 이상적으로 클로로필류를 수득할 수 있는 방법을 상술하였으나, 상기 클로로필류를 분리하는 방법에 본 발명이 한정되는 것이 아님은 자명할 것이다. 본 발명의 항암 조성물이 포함하는 클로로필류는 과거 또는 향후 개선 및 개발될 식물체로부터 클로로필류를 분리하는 방법에 의하여 분리 수득될 수 있음은 물론이다. In the present invention, a method capable of obtaining chlorophylls ideally from soybeans at present is described, but it is obvious that the present invention is not limited to the method of separating chlorophyll. Of course, the chlorophyll contained in the anticancer composition of the present invention can be separately obtained by a method of separating chlorophylls from plants that have been improved or developed in the past or in the future.
본 발명에서는 콩으로부터 분리된 클로로필류인 클로로필 a 및 클로로필 b에 대하여 지질과산화 억제작용과 물/리놀레산 에멀젼(water/linoleic acid emulsion)에서의 β-카로틴 블리칭 분석(β-carotene bleaching assay)을 수행하여 이들의 항산화적 활성을 검정하였으며, MTT 분석을 통한 암세포증식 억제 활성과 흰쥐(rat)의 대장에서 헴(heme)에 의하여 유발되는 상피세포 과도증식(hyperproliferation)에 대한 클로로필 a, b의 저해효과를 검정하였다. In the present invention, chlorophyll a and chlorophyll b isolated from soybean were subjected to lipid peroxidation inhibition and β-carotene bleaching assay in a water / linoleic acid emulsion Their antioxidative activity was assayed and the inhibitory effect of chlorophyll a and b on the inhibition of cancer cell proliferation by MTT assay and the hyperproliferation induced by heme in the rat colon Respectively.
본 발명은 상기와 같이 콩으로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 포함하는 항암 및 항산화 활성을 갖는 약학적 조성물을 제공하는 바, 상기 클로로필류는 조성물에 0.1 내지 80중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50중량%로 포함되는 것이다. 그 함량이 0.1중량% 미만일 경우에는 약학적 조성물의 항암 및 항산화 효과가 미미할 수 있으며, 80중량%를 초과할 경우에는 사용량에 대비 항암 및 항산화 효과가 상대적으로 낮을 수 있다.The present invention provides a pharmaceutical composition having anticancer and antioxidative activity comprising chlorophyll separated from soybean as an active ingredient as described above. The chlorophyll is preferably contained in the composition in an amount of 0.1 to 80% by weight, More preferably from 0.1 to 50% by weight. If the content is less than 0.1% by weight, the anticancer and antioxidative effect of the pharmaceutical composition may be insignificant. If the content is more than 80% by weight, the anticancer and antioxidative effect may be relatively low compared to the usage.
본 발명의 콩으로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골순, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.The pharmaceutical composition comprising the chlorophylls separated from the soybean of the present invention as an active ingredient can be administered orally or parenterally. The route of administration of the pharmaceutical compositions of the present invention may be, but is not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, gingiva, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, , Sublingually or topically.
이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 경구투여, 비경구 투여용, 주사용 등의 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 제제화에 필요한 통상의 성분들과 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 엘릭시르(elixirs), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이때, 정제, 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유 등을 혼합할 수도 있다. 캡슐 제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 혼합할 수도 있다.For such clinical administration, the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a suitable formulation, such as oral administration, parenteral administration, or injection, using known techniques. For example, upon oral administration, it may be admixed with an inert diluent or edible carrier, sealed in a hard or soft gelatin capsule, or pressed into tablets. For oral administration, the active compound may be formulated as an ingestible tablet, buccal tablets, troches, lozenges, aqueous or oily suspensions, prepared powders or granules, emulsions, suspensions, Hard or soft capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like. In this case, binders such as lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin for formulation into tablets, capsules and the like; Excipients such as dicalcium phosphate; Disintegrants such as corn starch or sweet potato starch; Magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, or a lubricant such as polyethylene glycol wax may be mixed. In the case of a capsule formulation, a liquid carrier such as fatty oil may be mixed in addition to the above-mentioned substances.
또한, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식과 점막, 또는 국소에 적용되는데, 분산제, 좌제, 분제, 에어로졸(비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액제(수성, 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼), 용액제 등 비경구 투여에 적합한 액상 투여 형태 등에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화 할 수 있다.Parenteral administration is also applied to subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intra-thoracic injection injections, mucous membranes, or topical application, including dispersing agents, suppositories, powders, aerosols (nasal sprays or inhalants), gels, , Or a non-aqueous liquid suspension, an oil-in-water emulsion or a water-in-oil emulsion), a solution, and the like. For formulation into a parenteral dosage form, the composition may be formulated into a solution by mixing with a stabilizer or buffer in water to form a unit dosage form of ampoule or vial.
상기와 같은 본 발명의 약학적 조성물의 유효투입량은 환자의 연령, 신체적 조건, 몸무게 등의 상태를 고려하여 임상의 판단에 따라 필요한 범위로 조절될 수 있다. 일반적으로, 상기 약학적 조성물의 유효투입량은 성인 환자 체중 1kg 당 1 내지 20㎎/일이고, 바람직하기로는 5 내지 10㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 2회 내지 5회 분할 투여될 수 있다.The effective dose of the pharmaceutical composition of the present invention as described above can be adjusted to a necessary range according to the clinical judgment in consideration of the patient's age, physical condition, and weight. Generally, the effective dose of the pharmaceutical composition is 1 to 20 mg / day, preferably 5 to 10 mg / day, per 1 kg body weight of an adult patient, Preferably two to five times a day.
또한, 본 발명은 콩으로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 포함하는 항암 및 항산화 효과 증진용 건강보조식품을 제공하는 바, 본 발명의 건강보조식품은 널리 식용되는 콩으로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 포함하므로 인체에 안전하여 식품에 첨가하여 사용하기에 적합하다.In addition, the present invention provides a health supplement food for enhancing anticancer and antioxidative effect comprising chlorophyll separated from soybean as an active ingredient, wherein the health supplement food of the present invention contains chlorophyll isolated from soybean, It is safe for human body and is suitable for use in food.
상기 클로로필류는 항암 및 항산화 효과 증진용 건강보조식품에 0.1 내지 50중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 30중량%로 포함되는 것이다. 그 함량이 0.1중량% 미만일 경우에는 건강보조식품의 항암 및 항산화 증진 효과가 미미할 수 있으며, 50중량%를 초과할 경우에는 첨가 농도 대비 항암 및 항산화 증진 효과가 상대적으로 낮을 수 있다.The chlorophyll is preferably contained in 0.1 to 50% by weight, more preferably 0.1 to 30% by weight, of the health supplement food for enhancing anticancer and antioxidant effect. When the content is less than 0.1% by weight, the effect of promoting anticancer and antioxidation of the health supplement may be insignificant. If the content is more than 50% by weight, the effect of enhancing anticancer and antioxidation may be relatively low.
상기 건강보조식품으로는 그 종류가 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 등에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품으로 제조할 수 있고, 식용가능한 색소로서 적용할 수도 있다. 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화 될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류 등으로 제조될 수도 있다. 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적절하게 선택하여 배합할 수 있음은 물론이다.The kind of the health supplements is not limited. For example, the health supplements may be added to conventional palatable foods such as noodles such as ramen noodles, raw noodles, tofu, cereals, breads, chewing gum, candies, And can be used as a food coloring matter. In addition, it can be formulated into a common formulation such as tablets, granules, pills, hard capsules, soft capsules or liquid formulations, and can be prepared as a juice, a pouch, a drink, or the like. It goes without saying that components other than the above-mentioned components can be appropriately selected and blended by those skilled in the art according to the formulations.
또한, 본 발명의 건강보조식품에 포함되는 클로로필류는 항산화 활성이 우수하여 산화에 의해서 일어나는 식품의 냄새나 풍미의 변화, 유지의 산패, 그리고 식품의 변색을 효과적으로 방지할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 콩으로부터 분리한 클로로필류는 통상의 각종 식품류에 배합함으로써 이들 식품류를 보존하거나 식품의 신선도 및 품질을 장기간에 걸쳐 유지하기 위해 사용할 수도 있다.In addition, the chlorophyll contained in the health supplement food of the present invention has an excellent antioxidative activity and can effectively prevent the change of the smell and flavor of the food caused by the oxidation, the rancidity of the fat and the discoloration of the food. Therefore, the chlorophylls separated from the soybean of the present invention can be used to preserve these foods or to maintain the freshness and quality of foods for a long period of time by blending them into various kinds of ordinary foods.
상기 식품류로는 전형적인 식품뿐만 아니라, 음료(알콜성 음료도 포함함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용 식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소오스 등) 등을 포함함은 물론이다.Such foods include not only typical foods but also beverages (including alcoholic beverages), fruit and processed foods thereof (e.g., canned fruits, jars, jam, maare marlade, etc.), fish, meat and processed foods Ham, sausage, corn oil, etc.), breads and noodles (eg udon, buckwheat noodles, ramen noodles, spaghetti, macaroni, etc.), fruit juice, various drinks, cookies, Vegetable protein, retort food, frozen food, various seasonings (e.g., soybean paste, soy sauce, soy sauce, etc.), and the like.
또한, 본 발명은 콩으로부터 분리한 클로로필류를 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition having an antioxidative activity comprising chlorophyll separated from soybean as an active ingredient.
상기 클로로필류는 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물에 0.1 내지 40중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 20중량%로 포함되는 것이다. 그 함량이 0.1중량% 미만일 경우에는 항산화 활성이 미미할 수 있으며, 40중량%를 초과할 경우에는 투입 농도대비 항산화 효과가 상대적으로 낮을 수 있다.The chlorophyll is preferably contained in the cosmetic composition having an antioxidative activity in an amount of 0.1 to 40% by weight, more preferably 0.1 to 20% by weight. If the content is less than 0.1% by weight, the antioxidative activity may be insignificant. If the content is more than 40% by weight, the antioxidative effect may be relatively low compared to the input concentration.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 클로로필류를 그대로 사용하거나 또는 필요에 따라 희석하여 사용할 수 있다. 상기 클로로필류는 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로션제, 입욕제 등의 형태를 포함할 수 있다.The cosmetic composition of the present invention can be used by using the chlorophyll as it is or by diluting it if necessary. The chlorophyll may be prepared in liquid or solid form using bases, adjuvants and additives commonly used in the cosmetics field. The liquid or solid form of cosmetics may include, for example, but not limited to, lotions, creams, lotions, bath salts, and the like.
화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 물, 알콜, 프로필렌글리콜, 스테아르산, 글리세롤, 세틸 알코올, 유동 파라핀 등이 있다.The base, adjuvant and additives commonly used in the cosmetics field are not particularly limited, and examples thereof include water, alcohol, propylene glycol, stearic acid, glycerol, cetyl alcohol, liquid paraffin and the like.
상기와 같은 본 발명의 화장료 조성물은 피부의 산화에 의한 손상, 예를 들면, 반점(갈색반), 주근깨, 피부균열, 자외선 손상(햇볕에 탐) 등을 예방하는데 매우 유용하며, 화장품 자체의 산화를 방지함으로써 화장품의 품질을 유지하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있다.The cosmetic composition of the present invention as described above is very useful for preventing damage due to oxidation of the skin, for example, spots (brown half), freckles, skin cracks, and ultraviolet damage (sunburn) It is very useful to maintain the quality of cosmetics.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. These embodiments are for purposes of illustration only and are not intended to limit the scope of protection of the present invention.
실시예 1. 콩(발아콩, 콩나물) 추출물 제조Example 1: Preparation of soybean (germinated bean, bean sprouts) extract
풍산나물콩 500g의 콩을 6㎝(가로)ㅧ 6㎝(세로)ㅧ 14㎝(높이)인 플라스틱 재배용기에 넣어 20℃의 물에 4시간 침지한 후 자체 개발한 생육장치(Hanbaek Co., HB-301L, Seoul)를 이용하여 온도 20℃, 습도 80%의 암 상태에서 10일 동안 발아시켰다. 콩의 발아기간 동안 타이머가 달린 자동 살수 장치를 이용하여 물을 4시간 마다 3분씩 위에서 살수하였다. Poongsan Herbage 500g of soybean was put into a plastic cultivation vessel of 6cm (width), 6cm (length) and 14㎝ (height), soaked in water at 20 ° C for 4 hours, HB-301L, Seoul) for 10 days at a temperature of 20 ° C and a humidity of 80%. During the germination period of the soybean, water was sprinkled on top of every 3 minutes for 4 hours using a timer watering device.
상기 발아된 발아콩(콩나물)의 자엽부분을 채취하여 -80℃에서 냉동시켜 동결건조하고 60메쉬(mesh)로 분쇄하였다.The cotyledon of the germinated soybeans (sprouts) was collected, frozen at -80 DEG C, lyophilized, and pulverized into 60 mesh.
상기 발아콩 분쇄물 200g에 아세톤 2L를 첨가한 후 40℃ 조건의 초음파 추출기에서 30분간 추출하고, 상온조건에서 3,000rpm의 속도로 10분간 원심분리한 후 상등액을 회수하여 여과지로 여과한 후 콩나물 추출물을 얻었다. 이렇게 얻은 콩나물 추출물을 다시 0.45㎛의 실린지 필터로 여과한 후 HPLC로 분석하였다. 2 g of acetone was added to 200 g of the germinated bean pulp, and the mixture was extracted with an ultrasonic extractor at 40 ° C for 30 minutes at room temperature. After centrifugation at 3,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was recovered and filtered with a filter paper. ≪ / RTI > The bean sprouts extract thus obtained was again filtered through a 0.45 μm syringe filter and analyzed by HPLC.
실시예 2. 콩으로부터 클로로필류 분리 및 확인Example 2. Isolation and Identification of Chlorophylls from Soybean
상기 실시예 1의 콩나물 추출물을 분취(preparative) HPLC(Agillent 1200 series, USA)를 이용하여 클로로필류를 분리하였다. 이때, 분취 HPLC의 분리조건은, 컬럼은 HiQ sil C18-10(21.0ㅧ 250㎜, KYA TECH, Japan)을 이용하였고, 분석파장 430㎚, 분당 유속 10㎖, 분석 용매로 A용매는 75% 메탄올, B용매는 에틸아세테이트를 농도구배(0분: 70% 용매A, 25분: 15% 용매A, 26분: 70% 용매A, 35분: 70% 용매A)로 사용하였고, 시료 주입량은 2㎖로 조절하여 고순도 분리를 실시하여 클로로필 a와 클로로필 b를 분리하였으며, 상세한 분리 조건은 하기 표 1과 같다.The bean sprouts extract of Example 1 was separated by preparative HPLC (Agillent 1200 series, USA). Separation conditions of preparative HPLC were as follows: HiQ sil C18-10 (21.0 ㅧ 250 mm, KYA TECH, Japan) was used as the column, the analysis wavelength was 430 nm, the flow rate per minute was 10 ml, the solvent A was 75% , The solvent B was ethyl acetate as the concentration gradient (0 min: 70% solvent A, 25 min: 15% solvent A, 26 min: 70% solvent A, 35 min: 70% solvent A) Ml and chlorophyll-a and chlorophyll-b were separated by high purity separation. The detailed separation conditions are shown in Table 1 below.
분리 수행으로 얻어진 수종의 분리화합물 중 클로로필에 해당하는 물질에 대하여 NMR, UV-VIS 스펙트럼 분석 및 질량분석을 수행하였으며, 클로로필의 1H-NMR(300MHz, CDCl3) 결과의 화학적 이동치 분석 결과는 표 2에 나타내었고, 1H-NMR 스펙트럼은 도 1(클로로필 a)과 도 2(클로로필 b)에 나타내었다.NMR, UV-VIS spectral analysis and mass spectrometry were carried out for the corresponding chlorophyll among the several kinds of separated compounds obtained by separation, and the results of chemical shift analysis of 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ) The results are shown in Table 2, and the 1 H-NMR spectrum is shown in FIG. 1 (chlorophyll a) and FIG. 2 (chlorophyll b).
분리색소 1 및 2의 화학적 구조를 동정하기 위한 1H-NMR(300MHz, CDCl3) 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 도 1, 2 및 표 2를 살펴보면, 두 물질의 NMR 스펙트럼이 고도로 유사한 양상을 나타내었다. NMR 분석에 의한 양성자들의 화학적 이동치를 검토한 결과 1.5ppm 이하에서는 소수성인 긴 사슬의 피틸(phytyl)기 양성자들(H-P5~P16)의 공명에 의한 피크를 확인할 수 있었고, 1.5ppm 부근에서 H-82, H-181 및 H-P31에 해당하는 메틸(CH3)기의 전형적인 양성자 피크를 확인할 수 있었다. 3~4ppm 부근의 강한 양성자 피크(분리색소 1: 3.25ppm(H-21), 3.46ppm(H-121) 및 3.74ppm(H-134), 분리색소 2: 3.25ppm(H-21, H-71), 3.31ppm(H-121) 및 3.74ppm(H-134))는 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅴ 고리(ring)에 결합된 메틸(CH3)기에 의한 양성자 피크로 확인 되었는데, 이는 일반적으로 메틸기의 양성자 피크가 1.5ppm 영역에서 확인되나 F, I, N, S, 및 Br 등과 같은 할라이드(halide)가 이웃할 경우 +2ppm 미차폐된(deshielded) 영역에서 메틸기 피크가 확인되기 때문일 것이다. 또한 4.9ppm 부근에서는 H-P1에 해당하는 피틸기 내의 산소에 결합된 메틸렌(CH2)기의 양성자 피크를 확인할 수 있었고, 5.3~5.7ppm 부근에서는 옆 사슬의 소수성 피틸기에 결합된 불포화 탄소에 결합된 H-P2의 양성자 피크로 확인되었다. 6ppm 부근에서는 H-32의 양성자에 해당하는 비닐기(CH2=CH-)의 1차 양성자(Hcis 및 Htrans)와 H-32 위치의 양성자들에 의한 피크를 확인할 수 있었고, 8ppm 부근에서 나타나는 피크(7.84 및 7.98ppm, H-31)는 옆 사슬의 비닐기(H-32)의 2차 양성자에 의한 피크이며, 8∼10ppm 부근의 피크는 H-5, H-10, H-20에 해당하는 4개의 피롤(pyrrole)기를 고리형태로 결합하는 부분의 양성자들이 링 전류효과로 나타나는 피크로 확인되었다. 한편, 분리색소 1은 10.7ppm부근에서 한 개의 양성자 피크를 확인할 수 있었는데, 이는 알데하이드(aldehyde)에 결합된 양성자에 의한 피크로서 H-71에 해당하는 양성자 피크로 동정하였다.1, 2 and Table 2 showing the 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ) spectral measurement results for identifying the chemical structures of the separated
또한, 분리색소 1의 질량분석 및 UV-VIS. 스펙트럼 분석 결과 m/z=907.5로 조사되었고, UV-VIS. 스펙트럼은 λ(㎚)=432, 456, 596, 645로 조사되었다.Further, mass spectrometry of the
한편 분리색소 2의 질량분석 및 UV-VIS. 스펙트럼을 분석한 결과를 보면 m/z=893.5로 조사되었고, UV-VIS. 스펙트럼은 λ(㎚)=381, 411, 430, 577, 615, 662를 나타내었다.On the other hand, mass spectrometry and UV-Vis. Spectrum analysis showed m / z = 893.5 and UV-VIS. The spectra show? (Nm) = 381, 411, 430, 577, 615, and 662.
이상의 1H-NMR, MS 및 UV-VIS. 스펙트럼을 종합적으로 해석한 결과, 분리색소 1은 진녹색을 나타내며, 화학식이 C55H70MgN4O6= 907.5(R=CHO)인 클로로필 b(chlorophyll b)로 동정되었고, 분리색소 2는 청녹색을 나타내며, 화학식이 C55H72MgN4O5=893.5(R=CH3)인 클로로필 a(chlorophyll a)로 동정되었다.≪ 1 > H-NMR, MS and UV-VIS. As a result of the comprehensive analysis of the spectrum, the
실험예 1. 콩으로부터 분리한 클로로필류의 지질과산화 저해활성Experimental Example 1. Lipid peroxidation inhibitory activity of chlorophyll isolated from soybean
콩으로부터 분리한 클로로필류에 대한 항산화 활성 검정은 Nagai 등(2005)에 의한 방법을 변형하여 사용하였다. 0.2μM의 클로로필 a 및 b 시료 0.083㎖에 0.208㎖의 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.0)을 혼합하고, 다시 0.208㎖의 2.5%(w/v) 리놀레산(linoleic acid)을 첨가하였다. 산화 유도 시작은 0.021㎖의 0.1M 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride) 를 첨가하여 30℃, 암상태로 반응시키면서부터 시작하여 72시간까지 매 12시간마다 리놀레산이 산화되는 정도를 검정하였다. 산화반응 유도 시작 후 12시간마다 상기 기술한 반응액 0.1㎖에 75% 에탄올 4.7㎖, 30% 암모늄 티오시아네이트(ammonium thiocyanate) 0.1㎖ 및 3.5% HCl이 포함된 0.02M 염화제1철(ferrous chloride) 0.1㎖를 혼합한 후에 3분 동안 정치하여 두었다가 UV-1200 UV/VIS 분광분석기(spectrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 시간의 경과에 따른 과산화물 생성정도를 500㎚에서 흡광도를 측정하여 검정하였다. 음성대조구(con)로는 클로로필 시료를 첨가하지 않고 리놀레산만을 첨가한 것을 사용하였으며, α-토코페롤(tocopherol, VE)을 분리된 클로로필 a, b와 동일한 농도의 수준으로 제조하여 사용하였다. 실험결과는 도 3에 나타내었으며, 500㎚에서 흡광도가 증가할수록 형성되어지는 과산화물이 높은 수준임을 나타낸다. The antioxidative activity test for chlorophyll species isolated from soybean was modified by Nagai et al. (2005). 0.208 ml of sodium phosphate buffer (pH 7.0) was mixed with 0.083 ml of 0.2 μM chlorophyll a and b samples, and 0.208 ml of 2.5% (w / v) linoleic acid was added again. The start of the oxidation reaction was carried out by adding 0.021 ml of 0.1
지질과산화는 유리기(free radical)에 의해 불포화지방산의 메틸렌(-CH2-)기로부터 수소원자(H·)가 탈취됨에 따라 개시(initiation)된다. 이를 흔히 일으키는 라디칼로는 OH, RO·, ROO·, HO2· 등이 있고, O2 -와 H2O2는 그 자체로는 그런 능력이 없다. 수소탈취에 의해 생긴 알킬기(R·)는 분자재구성을 통해 디엔(diene) 형태로 바뀌고, 이것이 다시 산소와 결합하여 과산화기(peroxy radical)를 형성한다. 과산화기는 전술한 대로 다시 다른 불포화지방산으로부터 수소를 탈취함으로써 일종의 연쇄반응(chain reaction)이 진행되기 때문에 과산화물이 급속하게 증가하게 된다. 따라서, 항산화 활성을 평가하기 위해서는 지질과산화 개시단계에서의 평가가 매우 중요하며, 특히 클로로필 또는 이들의 유도체와 같이 높은 항산화 활성을 가지지만 안정성이 검정되어야 하는 활성소재를 검증하는 경우에서는 지질과산화 초기단계에서의 항산화 활성 평가가 매우 중요하다고 할 수 있다. Lipid peroxidation is initiated as hydrogen atoms (H ·) are taken from the methylene (-CH 2 -) group of unsaturated fatty acids by free radicals. Common radicals are OH, RO, ROO, HO 2 , etc. O 2 - and H 2 O 2 do not have such a capability in themselves. The alkyl group (R) formed by the deodorization of hydrogen is converted into a diene form through molecular reconfiguration, which again binds to oxygen to form a peroxy radical. As described above, the peroxidation of the peroxidic group leads to a rapid increase of the peroxide because a kind of chain reaction proceeds by deodorizing hydrogen from other unsaturated fatty acids. Therefore, in order to evaluate the antioxidant activity, evaluation at the initiation stage of lipid peroxidation is very important. In particular, in the case of verifying the active material having high antioxidative activity like chlorophyll or derivatives thereof, The antioxidant activity of the extracts is very important.
콩으로부터 분리한 클로로필류를 0.2μM 수준으로 처리한 후 리놀레산의 과산화 초기 단계에서의 항산화 활성을 검정한 결과, 대조군이 12시간부터 빠르게 흡광도가 증가하는 반면 클로로필류의 경우 대조군에 비하여 증가속도 비율이 크게 감소하는 결과를 나타내었다. 대조군인 비타민 E와 클로로필 a, b의 경우 12시간까지는 큰 차이를 나타내지 않다가 24시간 이후에는 각각의 지질과산화 저해활성이 다르게 유도되었다. 즉, 클로로필 a, b는 대조군에 비하여 24시간 이후부터 1/2~1/7 수준의 흡광도를 나타내어 지질과산화에 대한 높은 저해활성을 가지는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 클로로필류가 지질과산화에 있어 중간생성물인 과산화기의 형성에 있어 디엔 형태로 만들어진 알킬기를 안정화시키거나 산소의 결합을 막아 급속하게 형성되는 과산화물의 형성을 억제하는 작용기전을 나타내는 것으로 생각된다. As a result of the antioxidative activity of linolenic acid at the initial stage of peroxidation after treatment with chlorophylls separated from soybean at a level of 0.2 μM, the absorbance of the control group increased rapidly from 12 hours, whereas the rate of increase of chlorophyll was higher than that of the control group The results are shown in Fig. The vitamin E and chlorophyll a and b control groups did not show any significant difference until 12 hours, but their lipid peroxidation inhibitory activities were different after 24 hours. That is, chlorophyll a and b showed absorbance at a level of 1/2 to 1/7 from 24 hours after the administration of chlorophyll a and b, showing high inhibitory activity against lipid peroxidation. These results suggest that chlorophyll is a mechanism of stabilizing the alkyl group formed in the form of dienes or inhibiting the formation of peroxides which are rapidly formed by blocking the binding of oxygen in the formation of the peroxide group as an intermediate product in lipid peroxidation .
도 3에 의하면, 최종 72시간이 경과한 후 클로로필류 및 비타민 E의 첨가에 따른 지질과산화 저해효과를 나타내기 위하여 음성대조구(con, 비타민 E나 클로로필을 첨가하지 않은 구)의 흡광도에 대해 비타민과 클로로필을 첨가함에 따라 감소하는 흡광도의 비율을 저해율(%)로 나타내었다. 72시간이 경과한 후 대조구의 흡광도가 500㎚에서 2.906을 나타낸 반면 클로로필 a를 첨가하는 경우 흡광도가 0.692를 나타내어 약 75.88%의 지질과산화 저해율을 나타내었고, 클로로필 b를 첨가하는 경우 500㎚에서 1.085의 흡광도를 나타내어 대조구의 흡광도에 비해 62.94%의 지질과산화 저해율을 나타내었다, 반면, 양성대조구인 비타민 E의 경우에서는 500㎚에서 1.588을 나타내어 대조구의 흡광도에 비하여 45.29%의 저해율을 나타내어, 콩으로부터 분리한 클로로필 a 및 클로로필 b가 비타민 E보다 높은 항산화 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.FIG. 3 shows that the absorbance of the negative control (con, vitamin E and chlorophyll-free) was significantly lower than that of the vitamin C supplemented with vitamin E and chlorophyll in order to show lipid peroxidation inhibition effect after addition of chlorophyll and vitamin E The ratio of the absorbance decreasing with addition of chlorophyll was expressed as the inhibition rate (%). After 72 hours, the absorbance of the control was 500nm to 2.906, while the absorbance of chlorophyll-a was 0.692, indicating a lipid peroxidation inhibition of 75.88%. When chlorophyll-b was added, the absorbance of chlorophyll- The inhibition rate of lipid peroxidation was 62.94% compared to that of the control. In contrast, in the case of vitamin E, which was a positive control, the inhibition rate was 1.588 at 500 nm, which was 45.29% lower than the absorbance of the control. It was confirmed that chlorophyll-a and chlorophyll-b had higher antioxidative activities than vitamin E.
이러한 결과는 클로로필이 식물체가 나타내는 항산화 활성의 활성본체로 작용할 수 있다는 결과를 제시하는 것이다. These results suggest that chlorophyll can act as the main body of antioxidant activity of plants.
실험예 2. 콩으로부터 분리된 클로로필류의 β-카로틴 블리칭 분석(β-carotene bleaching assay)Experimental Example 2. Analysis of? -Carotene bleaching assay of chlorophylls separated from soybean
콩으로부터 분리된 클로로필 a 및 b의 항산화 활성 검정을 위하여 물/리놀레산 에멀젼에서 β-카로틴 블리칭에 대한 지연능력을 Miller(1971)에 의한 방법을 변형하여 검토하였다. β-카로틴은 다른 항산화제가 없을 경우 빠른 퇴색을 보이며, 유리 리놀레산기(free linoleic acid radical)가 β-카로틴을 공격하여 이중결합을 해리하면서 특정적인 색깔 특성을 잃게 된다. 클로로필 a, b의 농도는 0.1, 1, 50, 100, 200, 400, 500μM 수준으로 제조하였고, 대조군으로 동일 농도의 BHT를 사용하였다. For the antioxidative activity test of chlorophyll a and b isolated from soybean, the delayed ability to β-carotene bleaching in water / linoleic acid emulsion was examined by modifying the method by Miller (1971). β-carotene exhibits rapid fading in the absence of other antioxidants, and free linoleic acid radicals attack β-carotene, resulting in the loss of specific color characteristics by dissociating the double bonds. The concentrations of chlorophyll a and b were 0.1, 1, 50, 100, 200, 400, and 500 μM, and the same concentration of BHT was used as a control.
에멀젼의 제조를 위하여 β-카로틴 용액(1㎎/㎖ in chloroform) 1㎖, 40㎕의 리놀레산(20㎎)과 400㎕ Triton X-100(100㎎)을 플라스크에 넣은 후 질소 존재 하에서 클로로포름을 제거한 후, 사전에 산소로 30분간 산화시킨 이온수 100㎖의 증류수를 천천히 넣으면서 강하게 교반하여 안정한 에멀젼을 형성하였다. 에멀젼 용액 3㎖를 분광분석학적 큐벳(spectrophotometric cuvette, light path 10 mm)에 넣고 다시 농도별로 조제된 클로로필 a, b를 각각 0.2㎖로 첨가한 후 470㎚에서 흡광도를 측정하였다. 최초 흡광도를 측정한 후 반응용액을 50℃ 수욕상에서 암상태로 보관하면서 15분 간격으로 최대 120분까지 측정하였고, 항산화 활성 정도는 대조구의 광학 밀도(optical density, D.O.initial-D.O.final)가 감소된 양을 100% 산화한 것으로 산정하여 계산하였으며, BHT나 클로로필을 첨가하지 않은 대조구의 산화에 대한 저해비율을 도 4에 나타내었다.1 ml of β-carotene solution (1 mg / ml in chloroform), 40 μl of linoleic acid (20 mg) and 400 μl of Triton X-100 (100 mg) were placed in a flask and chloroform was removed in the presence of nitrogen , 100 ml of ionized water oxidized with oxygen for 30 minutes in advance was slowly added while stirring, and a stable emulsion was formed. 3 ml of the emulsion solution was added to a spectrophotometric cuvette (
콩으로부터 분리된 클로로필 a를 대상으로 0.1~500μM의 비교적 넓은 범위의 농도에서 β-카로틴 블리칭법을 이용해 항산화 활성을 검정하고 대조구인 BHT와 비교하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 또한, 클로로필 b는 β-카로틴 블리칭법을 적용하지 않았는데, 이는 클로로필 b가 아세톤 용액 내에서 462㎚에서 강하게 흡수되어 447, 474㎚에서 흡수되는 β-카로틴과 복합 간섭(background interference)을 유발하기 때문이다. The antioxidative activity of chlorophyll-a isolated from soybean was assayed by β-carotene blotting method at a relatively wide range of concentration of 0.1 to 500 μM, and compared with BHT as a control, the results are shown in FIG. In addition, chlorophyll b does not apply the? -Carotene blotting method because chlorophyll b is strongly absorbed at 462 nm in an acetone solution and causes background interference with? -Carotene absorbed at 447, 474 nm to be.
BHT의 산화저해율은 클로로필 a보다 높은 활성을 나타내었으며, 1~50μM까지 산화 저해 활성이 급격히 증가되다가 50~500μM까지는 산화 저해 활성율이 약 85% 이상 일정하게 유지됨을 확인할 수 있었다. 반면, 클로로필 a의 경우에는 1~50μM 수준에서 산화 저해 활성이 급격히 증가되었다가, 50μM 이상의 농도에서는 일정하게 유지되는 경향을 나타내었다. The oxidation inhibition rate of BHT showed higher activity than chlorophyll a, and the oxidation inhibition activity was rapidly increased to 1 ~ 50 μM, and the oxidation inhibition activity rate was maintained at about 85% or more at 50 ~ 500 μM. On the other hand, in the case of chlorophyll a, the oxidation inhibitory activity rapidly increased at a concentration of 1 to 50 μM, but remained constant at a concentration of 50 μM or more.
Usuki 등(1984a)의 보고에 의하면 일반적으로 다른 클로로필 유도체에 비하여 클로로필 a는 낮은 항산화 활성을 나타내는데, 이는 클로로필 a가 다른 클로로필 유도체보다 구조적인 화학적 불안전성이 더 높기 때문이라고 하였다. 그러나, 본 발명의 도 3에서 보는 바와 같이 낮은 농도에서 클로로필 a가 클로로필 b보다 높은 지질과산화 저해활성을 나타내었던 결과를 고려하여 볼 때 클로로필 a의 화학적 구조의 불안전성은 농도에 의해 좌우될 수 있다는 것을 판단할 수 있다. 일반적으로 항산화제의 농도가 어떤 수준에 도달할 때까지 증가하나 더 높은 농도에서는 산화촉진제(pro-oxidant)로 작용하여 항산화 활성이 감소한다는 보고(Enod et al., 1985a)를 고려하여 볼 때, 클로로필 a는 낮은 농도에서는 다른 화합물과의 반응성이 매우 높아 높은 항산화 활성을 나타내면서도 화학적 구조의 안전성이 낮은 것으로 예측되나, 50μM 이상의 고농도로 적용하는 경우에는 산화촉진제로 작용하여 낮은 항산화 활성을 나타내기는 하나 화학적 구조의 안전성이 확보되어 500μM까지 일정 수준의 항산화 활성이 유지됨을 예측할 수 있었다.According to Usuki et al. (1984a), chlorophyll-a generally shows lower antioxidative activity than other chlorophyll derivatives because chlorophyll-a is more structurally unstable than other chlorophyll derivatives. However, considering that the chlorophyll-a exhibits higher lipid peroxidation-inhibiting activity than chlorophyll-b at a low concentration as shown in Fig. 3 of the present invention, the instability of the chemical structure of chlorophyll-a can be influenced by the concentration It can be judged. (Enod et al., 1985a), which suggests that antioxidant activity generally increases as the level of antioxidant reaches a certain level but acts as a pro-oxidant at a higher concentration. Chlorophyll-a is highly reactive with other compounds at low concentrations and thus exhibits a high antioxidative activity. However, when the concentration of chlorophyll-a is higher than 50 μM, it acts as an oxidation promoter and exhibits a low antioxidative activity The safety of the chemical structure was secured and it was predicted that a certain level of antioxidative activity was maintained up to 500 μM.
한편, 지질과산화 저해활성과 β-카로틴 블리칭법에서 클로로필 a의 항산화 활성이 서로 다르게 나타나는 것은 항산화 활성 측정방법의 차이에 기인하는 것으로 사료된다. 클로로필 유도체의 지질과산화 저해활성 측정의 경우 리포피틱 시스템(lipophytic system)에서 퍼록사이드 전개(peroxide development)를 검정한 반면, β-카로틴 블리칭법은 수성 에멀젼(aqueous emulsion)을 이용하였기 때문에 서로 다른 결과가 유도된 것으로 사료되며, 불포화 지방산을 함유하는 반응액은 클로로필의 분해를 촉진하여 항산화력을 떨어드린다는 보고(Usuki et al., 1984b)를 고려할 경우 클로로필 유도체의 항산화 활성을 검정하는 경우 한 가지 이상의 방법을 적용하여 각각의 항산화 활성을 평가할 필요가 있다고 할 수 있다. On the other hand, the antioxidative activities of chlorophyll-a in the lipid peroxidation inhibitory activity and the β-carotene bleaching method are different from each other because of the difference in the antioxidant activity measurement method. In the measurement of the lipid peroxidation inhibitory activity of the chlorophyll derivatives, peroxide development was tested in lipophytic system, whereas β-carotene bleaching method used aqueous emulsion, (Usuki et al., 1984b) that the reaction solution containing unsaturated fatty acid accelerates the decomposition of chlorophyll, thereby decreasing the antioxidant capacity. When the antioxidant activity of the chlorophyll derivative is tested, It is necessary to evaluate each antioxidant activity by applying the method.
실험예 3. 콩으로부터 분리된 클로로필류의 암세포 증식 억제율 검정Experimental Example 3: Inhibition rate of cancer cell proliferation of chlorophyll isolated from soybean
콩으로부터 분리된 클로로필 a, b의 암 세포주(cancer cell line)에 대한 세포증식 억제율을 검정하기 위하여, 인간 폐암 세포주 A549, 위암 세포주 ACHN, 전립선암 세포주 LNCaP, 결장암 세포주 HCT-15, 유방암세포주 MCF-7을 대상으로 클로로필 a, b를 50, 100, 200㎍/㎖의 농도별로 각각 처리하고, MTT 분석을 통해 세포생존율(cell viability)을 검정하였다. 각 암세포주를 96 웰 플레이트에(1ㅧ 104/well) 배양한 후 시료를 농도별로 처리하고 36시간 동안 더 배양하였다. 세포 생존율은 시판 키트(Cell Titer 96 non-radioactive cell proliferation assay kit, Promega, Madison, WI)를 통하여 검정하였는데, tetrazolium compound MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H- tetrazolium, inner salt)와 일렉트론 커플링 시약(electron coupling reagent)인 페타진 메토설페이트(phenazine methosulfate(PMS))를 포함하는 혼합물 20㎕를 각 웰에 첨가하고, 다시 1시간 동안 5% CO2, 37℃에서 배양한 후, ELISA 플레이트 리더(enzyme-linked immunosorbent assay plate reader)를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.Human lung cancer cell line A549, gastric cancer cell line ACHN, prostate cancer cell line LNCaP, colon cancer cell line HCT-15, breast cancer cell line MCF-15, and human breast cancer cell line LNCaP were assayed in order to test the cell growth inhibition rate of chlorophyll a and b isolated from soybean, 7 were treated with chlorophyll a and b at concentrations of 50, 100 and 200 μg / ml, respectively, and cell viability was assayed by MTT assay. Each cancer cell line was cultured in a 96-well plate (1 × 10 4 / well), treated with the concentration of each sample, and further cultured for 36 hours. Cell viability was assayed using a commercial kit (Cell Titer 96 non-radioactive cell proliferation assay kit, Promega, Madison, Wis.). The tetrazolium compound MTS (3- (4,5-dimethylthiazol- -carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium, inner salt) and an electron coupling reagent phenazine methosulfate (PMS) , Incubated for another 1 hour at 5% CO 2 at 37 ° C, and then absorbance was measured at 490 nm using an ELISA plate reader (enzyme-linked immunosorbent assay plate reader). The results are shown in Fig.
콩으로부터 분리된 클로로필 a, b의 인간 암세포주에 대한 생육 및 증식억제 효과를 검정하기 위하여 폐암 세포주(A549), 신장암 세포주(ACHN), 결장암 세포주(HCT15), 전립선암 세포주(LNCaP)와 유방암 세포주(MCF-7)를 대상으로 MTT 분석을 수행한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 콩으로부터 분리한 클로로필 a, b의 경우 모든 세포주에 대하여 낮은 암세포 증식 억제 활성을 나타내었다. 이 같은 결과는 클로로필이나 클로로필린과 같은 색소 화합물 및 이들의 유도체의 경우 세포가 발암물질(carcinogen)에 노출되는 동안 발암물질이 세포에 부착되는 것을 막는 효과적인 방어물질로서 작용할 수 있다고 보고한 결과(Dashwood, 2002)와 클로로필린이 발암물질과 복합체를 형성하여 암형성 초기과정에 활성을 나타내는 항암 방어메카니즘을 형성한다는 보고(Xu et al., 2001)와 비교하여 볼 경우, 클로로필과 같은 색소 화합물은 이미 발생된 암세포주에 대한 독성에 근거하는 항암활성이 아닌 암 형성 과정에서 발암물질과 결합하거나 발암물질이 세포와 부착되는 것을 막아 암 발생 과정을 막는 메카니즘을 가질 수 있다고 판단되어진다. 또한, 클로로필 a, b가 페오피틴(pheophytin)으로 전환되거나 실험조건에서 구조의 불안전성에 의해 쉽게 소실되어 질수도 있을 것으로 생각되며, 향후 이러한 색소의 안전성이나 실험조건 내에서 클로로필 a, b가 페오피틴 a, b로 전환되는 전환속도와의 상관관계에 대하여 구명할 필요가 있을 것으로 생각된다. (A549), kidney cancer cell line (ACHN), colon cancer cell line (HCT15), prostate cancer cell line (LNCaP) and breast cancer cell line (LNCaP) to test the growth and proliferation inhibitory effect of chlorophyll a and b isolated from soybean As shown in FIG. 5, the results of MTT analysis of the cell line (MCF-7) revealed that chlorophyll a and b isolated from soybean showed low cancer cell proliferation inhibitory activity against all cell lines. These results indicate that, in the case of chromophoric compounds such as chlorophyll and chlorophyllin and derivatives thereof, the cells may act as effective protective agents for preventing carcinogen from adhering to cells during exposure to carcinogens (Dashwood , 2002), and chlorophyllin forms an anti-cancer defense mechanism that is active in the early stage of cancer formation by forming a complex with carcinogenic substances (Xu et al., 2001) It is considered that the mechanism of cancer development may be prevented by binding to carcinogens or preventing carcinogens from adhering to cells during cancer formation, which is not an anticancer activity based on the toxicity of cancer cells. It is also believed that chlorophyll a, b may be converted to pheophytin or may be easily lost by the instability of the structure under experimental conditions. In the future, chlorophyll a, It is thought that it is necessary to clarify the correlation with the conversion speed to convert into the opietin a and b.
실험예 4.헴(Heme)에 의해 유도된 쥐 대장 상피세포의 과도증식에 대한 클로로필류의 저해효과 검정Experimental Example 4. Inhibitory Effect of Chlorophylls on Transient Proliferation of Mouse Heme Epithelial Cells Induced by Heme
일반적으로 가공육 및 적색고기의 섭취는 흰살 고기의 섭취에 비하여 대장에서의 암 발생의 빈도를 높인다는 보고(Giovannucci et al., 1994; Norat et al., 2002; Chao et al., 2005)가 있으며, 이러한 위험성을 줄이기 위하여 인간은 많은 양의 야채와 과일을 섭취해야 한다(Potter, 1999). 적색고기 섭취로 인한 대장암 발생 위험에 대한 식이요법으로 야채를 섭취한다는 것은 아직 논쟁의 여지가 있으나, 적색고기에 존재하는 헴(heme)은 철-포르피린(iron-porphyrin) 색소로 배설기관에서의 광원에 대한 대장점막세포의 노출이 증가되어짐에 따라 세포독성을 나타낸다고 보고되어지고 있다(Sesink et al., 1999). 그 결과로 대장세포(colonocyte)의 증식이 급속히 일어나게 되고, 이것은 대장암으로의 발달에 있어 중요한 요소로 고려되어지고 있다(Ames et al., 1995).In general, the intake of processed meat and red meat increases the incidence of cancer in the colon compared to the consumption of white meat (Giovannucci et al., 1994; Norat et al., 2002; Chao et al., 2005) To reduce this risk, humans are required to consume large amounts of vegetables and fruits (Potter, 1999). It is still controversial to eat vegetables as a dietary regime for the risk of developing colorectal cancer due to red meat consumption, but the heme present in red meat is iron-porphyrin pigment, It has been reported that cytotoxicity is increased as exposure of the mucosa cells to the light source is increased (Sesink et al., 1999). As a result, the proliferation of colonocytes rapidly occurs, which is considered to be an important factor in the development of colon cancer (Ames et al., 1995).
또한 많은 연구에서 헴(heme)이나 적색고기의 섭취는 광독소를 촉진시키고, 쥐의 대장에서 비정상적인 함몰점(aberrant crypt foci)의 수와 크기를 증대시켜 암발생과 연관된 발암전 전이상태(pre-noplastic lesion)를 유발한다고 보고되어지고 있다(Pierre et al., 2004; Corpetand Tache, 2002). 클로로필은 야채나 과일에 존재하는 색소로서 헴(heme)과 유사하게 평판의 포르피린 골격(porphyrin backbone)을 가지고 있으나, 포르피린 중간에 반응성이 높은 금속 이온 대신에 비반응성의 마그네슘 이온을 가지고 있다. 또한 클로로필이 헴(heme)과 반응하여 "샌드위치" 형태의 소수성 헴-클로로필 복합체(heme-chlorphyll complex)를 형성한다고 보고되어지고 있다(de vogel 등, 2005). In many studies, the intake of heme or red meat promoted phototoxins and increased the number and size of abnormal aberrant crypt foci in the large intestine, leading to pre- Noplastic lesions have been reported (Pierre et al., 2004; Corpetand Tache, 2002). Chlorophyll is a pigment present in vegetables and fruits. It has a flat porphyrin backbone similar to heme, but has a non-reactive magnesium ion instead of a highly reactive metal ion in the middle of porphyrin. It has also been reported that chlorophyll reacts with heme to form a "sandwich" form of a hydrophobic heme-chlorophyll complex (de vogel et al., 2005).
따라서, 본 발명에서는 클로로필이 헴(heme)에 의해서 유도되는 대장 상피세포의 증식에 대한 저해효과가 있을 것으로 판단되어 흰쥐(Rat)의 대장 상피세포에 헴(heme)을 처리하여 세포증식과 발암과정을 유도하고, 여기에 콩으로부터 분리한 클로로필 a, b를 첨가하여 헴(heme)에 의해 유도되는 세포 과도증식에서 클로로필 유도체들의 세포과도 증식 억제능을 검정하였다. Accordingly, in the present invention, chlorophyll is considered to have an inhibitory effect on the proliferation of colon epithelial cells induced by heme. Therefore, heme is treated in the colonic epithelial cells of rat (Rat) , And chlorophyll a and b isolated from soybean were added thereto to test the ability of chlorophyll derivatives to inhibit cell proliferation in cell proliferation induced by heme.
수컷 흰쥐(SPF Wistar rat, 8주령, WU, Harlen)를 대상으로 대장과 소장을 적출하고 균질화한 후, 1 ㎖의 주사기(syringe plunger)를 이용하여 50메쉬의 멸균 스테인레스 스틸 체를 통과 시키고, 셀 리커버리 용액(Cell Recovery Solution, BD Biosciences, San Jose, CA)을 이용하여 4℃에서 16시간 동안 배양하여 상피(epithelium)와 기질(stroma)을 분리하였다. 여기에 10배의 RIPA 완충액을 첨가하여 대장 상피 세포(young adult mouse colon cells, YAMC)를 분리하였다. 분리된 YAMC 세포를 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum), 100units/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, GIBCO BRL)이 첨가된 40~50% confluence in RPMI 1640 glutaMAX media(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)에 접종하고, 37℃ 가습 인큐베이터(humidified incubator)에서 2일 동안 8% CO2 농도로 배양하였다. 세포를 24 웰 플레이트에 초기 농도를 웰 당 1ㅧ 104cell/로 조정하고 헴(heme, Sigma, US)을 웰 당 2.5㎍ 수준으로 처리한 것을 헴(heme) 처리구로 하고, 여기에 다시 물로 희석된 클로로필 a, b를 각각 동일한 농도의 수준으로 처리하여 처리구로 하였다. 여기에 다시 [methyl-3H] 티미딘(thymidine)을 웰 당 0.5mCi의 수준으로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 배지를 제거하고 세포를 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 2회 세척한 후 아이스-콜드 트리클로로아세트산(ice-cold trichloroacetic acid, 5%)을 이용하여 세포를 고정 침전시켰다. 침전된 세포를 0.3N NaOH에 재용해한 후 액체섬광계수기(liquid scintillation counter, MicroBeta™ Trilux, Wallac Oy, Turku, Finland)를 이용하여 [methyl-3H] 티미딘의 결합정도를 측정하여 세포의 증식 억제정도를 검정하였다. 각 처리구에 대한 [methyl-3H] 티미딘의 결합농도를 무처리구의 결합농도에 대한 음과 양의 상대적 수치로 표기하여 그 결과를 도 6에 나타내었고, 또한 각 처리구에 대한 [methyl-3H] 티미딘의 결합수를 도 6 하단에 수치로 표기하였다. Male and female rats (SPF Wistar rats, 8 weeks old, WU, Harlen) were sacrificed and the colon and small intestine were extracted and homogenized. The resultant was passed through a 50 mesh sterilized stainless steel syringe using a 1 ㎖ syringe plunger, The epithelium and stroma were separated from each other by incubation at 4 ° C for 16 hours using a recovery solution (Cell Recovery Solution, BD Biosciences, San Jose, Calif.). To this, 10X RIPA buffer was added to isolate young adult mouse colon cells (YAMC). Separated YAMC cells were cultured in RPMI 1640 glutaMAX media (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin / MD) and cultured in a humidified incubator at 37 캜 for 2 days at a concentration of 8% CO 2 . The cells were adjusted to an initial concentration of 1 10 4 cells / per well in a 24-well plate, treated with heme (Heme, Sigma, US) at a level of 2.5 μg per well and subjected to heme treatment, The diluted chlorophylls a and b were each treated at the same concentration level to form treated sphere. Again, [methyl-3H] thymidine was treated at a level of 0.5 mCi per well and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed and the cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and fixed with ice-cold trichloroacetic acid (5%) . The precipitated cells were redissolved in 0.3 N NaOH and the degree of binding of [methyl-3H] thymidine was measured using a liquid scintillation counter (MicroBeta ™ Trilux, Wallac Oy, Turku, Finland) Inhibition. The binding concentration of [methyl-3H] thymidine for each treatment was expressed as the relative value of the negative and positive amounts relative to the unbounded binding concentration. The results are shown in FIG. 6, and [methyl-3H] thymidine The number of bonds of the dian is indicated by a numerical value at the bottom of Fig.
도 6에 나타낸 바와 같이 YAMC 세포를 대상으로 하여 헴(heme)을 단독으로 처리하여 세포의 증식을 유도(65.76dpm 3H/㎍DNA)한 결과 , 헴(heme)을 처리하지 않은 대조구(38.64dpm 3H/㎍DNA)에 비하여 27.2dpm 3H/㎍DNA 정도 결합농도가 증가하한 반면, 헴(heme)을 처리하고 클로로필 a를 2.5㎍을 처리한 경우 21.82dpm 3H/㎍DNA의 결합농도를 나타내어 대조군에 비하여 16.8dpm 3H/㎍DNA의 결합농도가 감소하였고, 헴(heme)을 처리하고 클로로필 b를 2.5㎍을 처리한 경우 30.13dpm 3H/㎍DNA의 결합농도를 나타내어 역시 헴(heme) 처리에 의한 대조군에 비하여 8.5dpm 3H/㎍DNA의 결합농도가 감소하였다. 클로로필 자체의 [methyl-3H] 티미딘 결합능 증대는 나타나지 않았다. As shown in FIG. 6, when heme was treated alone in YAMC cells, cell proliferation was induced (65.76 dpm 3 H / DNA DNA), and as a result, the heme-treated control (38.64 dpm 3 H / ㎍DNA) 27.2dpm 3 H / ㎍DNA extent combined concentration is increased compared with the lower limit on the other hand, the combined concentration of 21.82dpm 3 H / ㎍DNA when the handle and handle 2.5㎍ chlorophyll-a heme (heme) The binding concentration of 16.8 dpm 3 H / DNA DNA was decreased compared to the control, and when heme was treated and treated with 2.5 μg of chlorophyll b, the binding concentration of 30.13 dpm 3 H / ) Compared with the control group, the binding concentration of 8.5 dpm 3 H / DNA DNA was decreased. There was no increase in [methyl- 3 H] thymidine binding ability of chlorophyll itself.
이 같은 결과를 통하여, 콩으로부터 분리된 클로로필류는 헴(heme)에 의해서 유도되어질 수 있는 대장 상피세포의 증식과 광독성에 의해 유도되어지는 발암과정에서 효과적인 보호제로서 작용할 수 있을 것임을 예측할 수 있었다.These results suggest that chlorophylls isolated from soybeans may act as effective protectants for carcinogenesis induced by heme-induced growth and phototoxicity of colon epithelial cells.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.Although the present invention has been described in terms of the preferred embodiments mentioned above, it is possible to make various modifications and variations without departing from the spirit and scope of the invention. It is also to be understood that the appended claims are intended to cover such modifications and changes as fall within the scope of the invention.
Claims (9)
Pharmaceutical composition having an antioxidant activity, characterized in that it comprises chlorophylls isolated from germinated beans or sprouts as an active ingredient.
상기 클로로필류는 약학적 조성물에 0.1~80중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물.
The method of claim 1,
The chlorophyll is a pharmaceutical composition having an antioxidant activity, characterized in that contained in 0.1 to 80% by weight in the pharmaceutical composition.
상기 클로로필류는 클로로필 a 또는 클로로필 b인 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물.
The method of claim 1,
The chlorophylls are chlorophyll a or chlorophyll b pharmaceutical composition having an antioxidant activity, characterized in that.
상기 클로로필류는 콩의 종실을 발아시키는 단계, 상기 발아된 콩을 건조하고 분쇄하여 유기용제에 침지하고 여과시킨 여액을 감압 농축하여 발아 콩 추출물을 얻는 단계 및 상기 발아 콩 추출물로부터 클로로필을 분리 정제하는 단계로 분리되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물.
The method of claim 1,
The chlorophylls are germinated with seeds of beans, dried and pulverized the germinated beans, immersed in an organic solvent and concentrated under reduced pressure to obtain a germinated soybean extract under reduced pressure. Pharmaceutical composition having an antioxidant activity, characterized in that separated in steps.
Health supplement for antioxidant effect enhancement, comprising chlorophylls isolated from soybeans as an active ingredient.
상기 클로로필류는 건강보조식품에 0.1~50중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항산화 효과 증진용 건강보조식품.
6. The method of claim 5,
The chlorophylls are antioxidant supplements health supplements, characterized in that contained in 0.1 to 50% by weight in health supplements.
상기 클로로필류는 클로로필 a 또는 클로로필 b인 것을 특징으로 하는 항산화 효과 증진용 건강보조식품.
The method according to claim 6,
The chlorophylls are chlorophyll a or chlorophyll b, characterized in that the health supplement food for antioxidant effect enhancement.
Cosmetic composition having an antioxidant activity comprising chlorophylls isolated from soybeans as an active ingredient.
상기 클로로필류는 화장료 조성물에 0.1~40중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물.9. The method of claim 8,
The chlorophyll is a cosmetic composition having an antioxidant activity, characterized in that contained in the cosmetic composition 0.1 to 40% by weight.
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