KR20140015059A

KR20140015059A - 칼슘이온 함유 염지하수 또는 암반지하수를 이용한 미세조류 배지 조성물

Info

Publication number: KR20140015059A
Application number: KR1020120082753A
Authority: KR
Inventors: 김미경; 이철균
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-02-06
Also published as: KR101520864B1

Abstract

본 발명은 미세조류(예, Dunaliella salina) 배양용 배지 조성물에 관련되며, 구성에 특징을 살펴보면, 염지하수 또는 암반지하수에 증류수(혹은 지하수)를 함유하는 것을 특징으로 한다.
이에 따라, 본 발명의 배지 조성물은 칼슘이온이 다량 함유된 염지하수에 증류수를 혼합함으로써 Dunaliella salina를 포함한 미세조류를 매우 효과적으로 배양할 수 있다.

Description

칼슘이온 함유 염지하수 또는 암반지하수를 이용한 미세조류 배지 조성물{Culture media composition of microalgae by using salt underground water or bedrock underground water including calcium ion}

본 발명은 미세조류(예, Dunaliella salina) 배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Dunaliella salina를 포함한 미세조류의 생장을 촉진시켜 배양효율을 높이기 위한 조성물에 대한 것이다.

미세조류인 듀나리엘라 살리나(Dunaliella salina)는 염분을 좋아하는 호염성 단세포 미생물로서, 건강 식품 시장 용도, 의약품, 화장품 등 다양한 용도로 활용될 수 있는 해양 미세조류로 알려져 있다.

그러나, 대부분의 Dunaliella salina는 변형된 존슨(modified Johnson) 배지(1968, F/2 Guilard, Hejazi et al. 2003 )에서 배양이 이루어짐에 따라 미세조류들을 배양시키기 위해 요구되는 높은 비용과 높은 에너지 소모에 기인하여, 비생산적인 요인을 내포하므로, 대부분의 배양방법에 소요되는 비용 및 에너지 소모가 미세조류 배양 과정들로부터 유도되는 수익 및 에너지를 초과한다. 부가적으로, 미세조류 배양 과정들은 비교적 짧은 기간에 효율이 미세조류들을 배양하기에는 비효율적이다.

이에 종래에 개시된 Dunaliella salina 배양방법을 살펴보면, 특허 등록번호 10-1124466호에서 해수에 석탄 및 수산화나트륨(NaOH)를 첨가하여, 우유빛 탁도 생성 물질이 제거된 전처리 해수를 제조하는 단계, 천연 해수를 산화처리하는 단계, 및 상기 전처리 해수에 상기 산화처리된 천연해수를 혼합하여 pH 7.4~7.6, 염분 농도 55~65psu로 조절하는 단계;로 구성되어, 기존 J/M 배양액에 비하여 2배 이상 저가의 제조 비용이 소요됨에도 불구하고, 두날리엘라 배양시 클로로필 a 및 카로티노이드 함량이 더 높은 두날리엘라 배양액을 제조할 수 있도록 하는 기술이 선등록된바 있다.

그러나, 천연해수에는 Dunaliella salina의 생장 촉진에 필요한 대사 촉진인자인 칼슘 이온(Ca2+)의 농도가 낮아 짧은 기간에 높은 효율의 미세조류들을 대량생산하기에는 비효율적이면서 산업적으로 이용 가능성이 매우 떨어지는 문제점이 있다.

상기와 같이 Dunaliella salina를 포함한 유용한 나노클로롭시스(Nannochloropsis) 속 미세조류의 대량생산 방법은 현재 존재하지 않으며, 특히 Nannochloropsis 속 미세조류는 대량 배양시 생산량 저하, 배지 오염, 생물량의 불안정 등으로 인해 산업적으로 이용 가능성이 매우 떨어지는 문제점이 있다. 또한 상기 Nannochloropsis 속 미세조류 중에서 바이오 소재로 활용 가치가 매우 높은 미세조류를 개발한다면 산업적으로 효과적으로 이용될 수 있다.

이에 따라 본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위해 착안 된 것으로서, 낮은 생산 비용 및 낮은 에너지 수요를 가지면서 높은 효율의 미세조류들을 효과적인 방식으로 대량 생산하기 위한 Dunaliella salina 미세조류 배지 조성물을 제공하는 것에 그 목적이 있다.

이러한 목적을 달성하기 위해 본 발명의 특징은, 염지하수 또는 암반지하수에 증류수 또는 지하수를 함유하는 것을 특징으로 하며, 상기한 염지하수 또는 암반지사하수는 칼슘이온의 농도가 3000~8000mg/L인 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 증류수 또는 지하수는 염지하수 또는 암반지하수 부피 기준으로 30~50%로 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 증류수 또는 지하수에 의해 희석된 염지하수 또는 암반지하수 배양액 조건에 BM(생물활성수)을 부피비로 3~7% 함유한 것을 특징으로 한다.

상기에서 염지하수 또는 암반지하수는 바닷물과 담수가 지하로 스며들어 섞인 물로서 암반을 거쳐 지하로 스며들기 때문에 미네랄이 풍부하다. 이와 같이 바닷물과 섞인 물이라는 이유로 염지하수 또는 암반에서 얻어진 물이라는 이유로 암반지하수로 불려지고 있다.

또한, 생물활성수(Bacteria Mineral Water)(참고문헌: 히로시 N. 1998. 세균이 지구를 구한다 - BMW 기술의도전. 도서출판 푸른 평화, 216pp.)는 돼지의 뇨 등 축산폐수를 재활용한 활성수로서, 축산폐수가 유입된 용기에 암석과 부식토 펠레트를 투입하여 폭기시켜 발효시킨 최종처리수이다.

이상의 구성 및 작용에 의하면, 본 발명의 배지 조성물은 칼슘이온이 다량 함유된 염지하수 또는 암반지하수에 증류수 또는 지하수를 혼합함으로써 Dunaliella salina를 포함하는 미세조류의 생장 촉진에 필요한 대사 촉진인자인 칼슘 이온(Ca2+)의 농도가 높아 짧은 기간에 매우 효과적으로 미세조류를 배양할 수 있게 된다.

또한, 이와 같이 짧은 기간에 대량배양이 가능하므로, 이들 미생물을 화장품 등의 상업적 용도로 사용하는 것이 가능해지는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 남해 염지하수의 희석 농도별 D. salina의 색소변화 실험 결과를 나타내는 도면
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 염지하수의 희석 농도별 D. salina의 세포 흡광도 변화 1차 실험결과를 나타내는 도면.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 염지하수의 희석 농도별 D. salina의 세포 흡광도 변화 2차 실험결과를 나타내는 도면.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 각각의 0.5톤 수조에 배양된 D. salina의 남해 염지하수의 희석 농도별 세포 밀도 변화 3차 실험결과를 나타내는 도면.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 실시예에 사용된 염지하수 또는 암반지하수(이하 염지하수로 통칭함)는 남해 염지하수로서, 남해 염지하수의 수질분석은 수질분석 지정기관인 경북해양바이오산업연구원에서 실시하였고, 염도, pH 등은 YSI63으로 측정, 영양염(질산성질소, 인산염, 총질소, 총인 등)은 영양염분석기, Na, Mg, Ca, K, Fe, Pb, Mn, Hg, Zn, As, Ag,B, Bi, Cr, Al, F, Cl-, Br, SO42- 분석은 ICP분석기로 측정이 되었으며, 그 결과는 표 1과 같다.

항목		분석결과	비고
기본항목	염분	175%	YSI 63
	수소이온농도	7.82
	영양염류 (mg/L)	질산성질소	2.05	영양염 자동분석기
		아질산성 질소	ND
		인산염인	0.042
		총질소(T-N)	2.44
		총인(T-P)	0.15
주요원소 (mg/L)		나트륨(Na)	1396.5	ICP 분석기
		마그네슘(Mg)	52.1
		칼슘(Ca)	5238.5	경도:13,305
		칼륨(K)	6.7
		유해영향 물질 및 이온물질 (mg/L)	철(Fe)	0.054	ICP 분석기
			납(Pb)	0.006	"
			망간(Mn)	0.02	"
			수은(Hg)	ND	"
			아연(Zn)	0.048	"
			비소(As)	ND	"
			은(Ag)	0.007	"
			보론(B)	0.415	"
			비스뮴(Bi)	0.006	"
			크롬(Cr)	0.0004	"
			알루미늄(Al)	ND	"
			불소(F)	0.086	IC 분석
			염소이온(Cl-)	122.2	"
			브롬이온(Br)	0.745	"
			황산이온(SO₄ㅂ-)	6.421	"
			경도(Hardness)	11.3	Photometer

표 2는 타지역의 염지하수 분석결과이다.

항 목		분석결과				비 고
		표층수 (울릉도)	해양심층수
		표층수 (울릉도)	울릉도 1,500m	강원 고성 300m	강원 고성 500m
	기 본 항 목	염 분	33.8	32.2	32.1	31.8	YSI 63
		수소이온농도	7.90	7.68	7.61	7.64	YSI 63
		대장균군	-	-	-	-	해양심층수 수질공정 실험방법
	영 양 염 류 (mg/L)	질산성 질소	1.35	0.473	0.243	0.321	Bran+Luebbe AACS Ⅴ (영양염 분석기)
			인산인	0.124	0.017	0.026		0.048
			규산규소	-	0.184	0.324		0.124
			질소인 비율 (N/P)	10.89	27.8	9.31		6.69
주요 원소 (mg/L)	나트륨(Na)		4,866	10,357	10,264	10,367	ICP 분석
	마그네슘(Mg)		1,314	1,271	1,272	1,258	″
	칼슘(Ca)		401	374	367	389	″
	칼륨(K)	230	276	243	282	″
	일정 성분비	21.1:5.7:1.7 :1.0	37.5:4.6:1.3:1.0	42.2:5.2:1.5:1.0	36.7:4.4:1.3:1.0	Na:Mg:Ca:K
	유해 영향 물질 (mg/L)	카드뮴(Cd)	-	-	-	-	ICP분석
		납(Pb)	-	-	-	-	″
		구리(Cu)	-	-	-	-	″
		수은(Hg)	-		-	-	″
		경도 (Hardness)	6258	6019	6005	6004	환산식 이용 (2.5 x Ca + 4 x Mg)

상기 표1 및 표 2와 같이 남해 염지하수의 Ca이온의 농도(5238.5 mg/L)가 동해안 울릉도 표층수(401 mg/L), 해양심층수(374 mg/L)와 강원도 고성의 해양심층수(367~389 mg/L )에 비해 14배 높은 것으로 측정되었다.

또, 남해 염지하수의 경도는 13,305이고, 일반 해수 및 해양심층수 경도(6004~6258)의 2배 높게 나타났고, (주)아리메드의 염지하수 경도 8,117보다 1,6배가 높게 측정되었다.

또한, 미세조류의 먹이원 및 영양원이 되는 질산성 질소와 총인도 타 해수에 비해 높게 측정되었다.

따라서 이화학적 수질분석 data만으로 분석하여도 남해 염지하수는 상당히 경쟁력이 있는 천연 미네랄수 임을 알 수 있다.

그리고, 염지하수에 포함된 칼슘이온은 미세조류의 생장에 필요한 대사 촉진인자로 작용하므로 염지하수에 함유된 칼슘이온의 농도는 3000~8000mg/L가 바람직하다.

또한, 아래 표 3은 남해 염지하수 방사성 핵종 분석결과표로서, 방사선이 기준치 이하이거나 측정되지 않았다. 따라서 염지하수 기준법에 저촉됨이 없어 식수로도 가능하다. (Cs-137, I-131, K-40 등의 방사선 분석은 (주)한국방사선가술연구소에 의뢰를 하여 분석 실시하였음.)

분석 핵종	시료종류	방사능 농도(mBq/L)	MDA(mBq/L)
감마핵종(Cs-137)	남해 염지하수	N.D	-
감마핵종(I-131)	남해 염지하수	N.D	-
감마핵종 (K-40) (자연방사능)	남해 염지하수	138.44ㅁ17.19	-
Sr-90	남해 염지하수	MDA 이하	0.56
삼중수소	남해 염지하수	MDA 이하	1.444
분석기관: 한국방사선기술연구소 N.D : Not Detected
MDA : Minimum Detectable Activity

상기 염지하수를 이용하여 Dunaliella salina 해양 조류를 배양하는 실험은 다음과 같다.

1. 생장률 측정방법

미세조류의 생장률 측정은 배지에 접종한 날부터 일정한 간격으로 시료를 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 미세조류의 단일세포를 측정하고, 세포분열율(K)을 아래 수학식 1(Guillard 1975)로 계산한다.

[수학식 1]

상기에서 N _o 는 초기 개체수이며, N ₁ 는 최종 개체수, t₀는 초기 개체수일 때 배양일, 그리고, t₁은 최종 개체수일 때 배양일을 의미한다.

- 본 실험에서는 엽록소 a의 농도 계산을 위해 흡광광도계를 이용하여 엽록소 a의 함량 측정은 시료 3 mL를 유리섬유여과지(GF/C, 45 ㎜)로 여과시킨 후, 여과지를 아세톤과 물을 9:1로 비율로 섞은 후, 10 mL를 추가한 후, 마쇄한 시료를 원심 분리관에 넣고, 밀봉하여 4℃ 어두운 곳에서 원심분리(4000 rpm, 20 min)하였다.

이와 같이 원심분리 후 상등액의 일부를 흡수셀에 옮겨 흡광광도계(Cary 50 Conc, Varian, USA)로 검액하며, 바탕시험액으로 아세톤:물(9:1)용액을 취하여 대조액으로 하여, 663 nm, 645 nm, 630 nm와 750 nm에서 검액의 흡광도를 측정하고, 엽록소 a의 농도는 Standards Methods(APPA 1995)를 기준으로 수학식 2에 따라 계산한다.

[수학식 2]

Y = 엽록소 a 의 양(μL L^-1) = 11.64 X₁ - 2.16 X₂ + 0.10 X₃

X₁ = OD₆₆₃ - OD₇₅₀

X₂ = OD₆₄₅ - OD₇₅₀

X₃ = OD₆₃₀ - OD₇₅₀

엽록소 a의 광합성효율은 형광 분석기 (Phyto-PAM, Walz, Germany)에 의해 470 ㎚, 535 ㎚와 620 ㎚의 파장에서 PSII에서의 최대 광량자(quantum)를 측정한다.

[수학식 3]

Fv/Fm = (Fm'-Ft) / Fm' = dF / (Ft+dF)

상기에서 수학식 3에서 Fv/Fm 는 PSII에서 발산하는 형광값의 역치로 이는 광계의 광합성효율을 의미하고, dF는 형광 효율 증가치, Ft는 순간 형광률, Fm'는 최대 형광률을 의미한다.

그리고, 대조구 배지는 D배지를 활용하고, 실험구 배지는 배지에 질소함량을 차별화 하고 본 발명의 염지하수 배지를 활용한다.

접종된 미세조류는 일정한 명암주기(14h/L, 10h/D)와 24℃, 130 μmol m^-2s^-1의 광량으로 배양을 하였다.

또한, 배양수조 0.5톤을 활용하여 330μmol m^-2s^-1의 광량으로 배양하였다.

<본 실험에 활용한 대조구 D배지 조성물>

2. 염지하수를 이용한 D. salina를 배양 시험

1) 염지하수의 희석 농도별 D. salina의 색소변화

D. salina를 도 1에 나타내는 바와 같이 농도별로 접종하여 배양을 시도한 1차 실험 결과, 염지하수 40% 희석한 배지 조건에서 세포 밀도 변화가 가장 가파르게 상승하였다.(도 2)

이때, 염지하수는 증류수를 이용하여 희석하고, 희석비율은 염지하수 부피 기준으로 30~50%로 함유하나, 바람직하게는 염지하수를 40% 희석하도록 증류수를 함유하는 것이 바람직하다.

또, 2차 실험결과, 염지하수 40% 희석한 배지 조건에 BM(생물활성수)을 3~7%(바람직하게는 5% 함유) 추가한 배지에서 최종 밀도가 증가되었다.(도 3)

도 3에서 SW는 염지하수, W는 증류수를 나타낸다.

또한, 0.5톤 배양수조에서 배양한 3차 실험결과에서는 염지하수를 33%희석한 배지에서 D. salina의 세포 활동성이 가장 높았고, 세포의 크기가 상대적으로 크고 세포밀도와 색소가 높게 나타났다. (도 4)

이처럼, 염지하수(예컨대, 남해 염지하수)는 일반해수와 해양심층수에 비해 칼슘농도가 14배나 높아 D. salina의 생장에 필요한 광합성 대사 촉진인자로 작용하므로, 실제 바이오매스는 D 배지에서 생장한 D. salina보다 270%가 증가하였다.

이에 따라, D. salina 대량배양 단가 절감을 위한 본 발명의 염지하수 배지는 현장 실증배양 규모로 확대하거나 유전자변형종과 연계하여 대량배양을 적용하거나 대량배양 실증배양장의 배지로 활용이 가능함을 알 수 있다.

Claims

칼슘이온의 농도는 3000~8000mg/L인 염지하수 또는 암반지하수,
상기 염지하수 또는 암반지하수에 증류수 또는 지하수가 첨가된 것을 특징으로 하는 미세조류 배양용 배지 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 증류수 또는 지하수는 염지하수 또는 암반지하수 부피 기준으로 30~50%로 함유하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양용 배지 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 증류수 또는 지하수에 의해 희석된 염지하수 또는 암반지하수 배지 조건에 생물활성수(BM)를 3~7% 함유한 것을 특징으로 하는 미세조류 배양용 배지 조성물.