KR20140015043A

KR20140015043A - 대장균에서 인간 유전자를 대량발현 시킬 수 있는 ｔ７ 프로모터 및 ｎ-말단 ｈａ 태그서열을 포함하는 포유동물 세포 발현 벡터의 이용

Info

Publication number: KR20140015043A
Application number: KR1020120082718A
Authority: KR
Inventors: 임향숙; 김구영; 문정미
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-02-06
Also published as: KR101423696B1

Abstract

본 발명은 T7 RNA 중합효소를 포함하지 않는 대장균에서 T7 프로모터의 조절 하에 외래 단백질, 바람직하게는 인간 단백질을 발현시키는 기술에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 T7 프로모터 및 N-말단 HA 태그서열을 포함하는 벡터를 이용하여 T7 RNA 중합효소를 포함하지 않는 대장균에서 외래 단백질 발현을 증진시키는 용도, 상기 벡터를 포함하며 T7 RNA 중합효소가 없이도 외래 단백질을 발현이 증진된 대장균, 상기 대장균을 이용한 외래 단백질 발현 또는 생산 방법, 및 외래 단백질의 기능 분석 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 인간 유전자의 세포 내 발현과 독성을 대장균에서 간단하고 빠르게 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

대장균에서 인간 유전자를 대량발현 시킬 수 있는 Ｔ７ 프로모터 및 Ｎ-말단 ＨＡ 태그서열을 포함하는 포유동물 세포 발현 벡터의 이용 {A use of mammalian vector including T7 promoter and N-terminal HA tag for the over-expression of human genes in E. coli}

대장균(Escherichia coli)은 지금까지 생리학적, 생화학적 및 유전학적 연구가 가장 많이 이루어져 있는 박테리아로서, 특히 생명공학에서 재조합 단백질을 생산하거나 그 기능을 연구하는 데 많이 쓰이는 유용한 균주이다. 대장균을 이용하여 재조합 단백질을 생산하게 되면 생산 효율이 높고, 시간과 비용을 단축할 수 있는 등 여러 가지 장점이 있다. 그러나, 이종에서 유래한 유전자 발현 프로모터를 함유한 벡터를 대장균에 도입 시, 대장균에 내생적으로 존재하는 유전자 발현 시스템에 그 벡터를 발현하는데 필요한 성분들이 존재하지 않는 경우에는, 대장균에서 재조합 단백질이 생산되지 않는다.

그 대표적인 예로, 분자 클로닝에 널리 사용되는 pcDNA 및 pCS2+ 포유동물 발현 벡터를 들 수 있다. 이들 벡터는 포유동물 세포에서 전사를 위한 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 프로모터와, 인 비트로 전사를 위한 박테리오파아지 T7 및/또는 SP6 프로모터를 함께 포함하고 있다. 박테리오파아지 유래 T7 프로모터는 대장균 유래 프로모터보다 훨씬 강력한 프로모터로 알려져 있는데, T7 프로모터는 각각 고유의 RNA 중합효소 (RNAP)에 엄격한 특이성을 가지기 때문에 T7 프로모터를 사용하는 발현 벡터를 T7 RNAP가 존재하지 않는 일반적인 대장균에 형질전환시킬 경우 단백질 발현이 저조하게 된다. 특히, 분자 클로닝에 널리 사용되는 대장균 DH5α 균주와 TOP10 균주의 경우 T7 RNAP가 존재하지 않아 T7 프로모터의 조절을 받는 타겟 유전자의 전사가 거의 일어나지 않는 것으로 알려져 있다 (Melton, D.A., et al., 1984. 12(18): p. 7035-56; Studier, F.W. and B.A. Moffatt, J Mol Biol, 1986. 189(1): p. 113-30; Chamberlin, M., J. McGrath, and L. Waskell, Nature, 1970. 228(5268): p. 227-31; McAllister, W.T., Cell Mol Biol Res, 1993. 39(4): p. 385-91).

이에, 종래에는 대장균에서 상기 벡터들을 클로닝된 유전자의 발현 목적이 아니라, 이 벡터 플라스미드 DNA의 복제를 통해 높은 카피 수의 플라스미드 DNA를 얻고자 하는 목적으로 주로 이용하였다. 또는, 상기 벡터들에서 T7 프로모터의 조절 하에 클로닝된 유전자를 발현시키고자 하는 경우에는, 대장균에서 T7 프로모터를 이용하기 위해 T7 RNAP 유전자를 대장균에 도입하거나, 대장균 lac 프로모터 조절 하에 T7 RNAP 유전자 삽입되도록 대장균 형질을 변화시켜 사용해야 했다.

이와 관련된 선행 특허문헌들로, 국내특허등록 제0262867호는 대장균에서 T7 프로모터의 조절 하에 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자를 발현시키기 위하여, T7 RNAP 를 발현하도록 형질을 변형시킨 대장균 BL21(DE3)을 숙주로 사용하면서 T7 프로모터의 하부에 lac 작동자(operator)를 삽입한 벡터를 사용하고 있고, 국내특허등록 제0389378호는 대장균에서 T7 프로모터의 조절 하에 CSBP-2(Cytokine-Suppressive Anti-inflammatory Drug-Binding Protein 2) 단백질을 발현시키기 위하여, T7 RNAP 를 발현하도록 형질을 변형시킨 대장균 BL21(DE3)을 숙주로 사용하면서 상기 대장균을 저온 배양하는 기술을 제공하고 있다. 이와 같이, 종래에 대장균에서 T7 프로모터에 의해 외래 단백질을 발현하기 위해서는 해당 대장균이 T7 RNAP 를 가지고 있어야 하는 문제가 있었다.

따라서, T7 RNAP가 존재하지 않더라도, 대장균에 내생적으로 존재하는 유전자 발현 시스템을 이용하여 포유동물 세포 발현 벡터 pcDNA 등을 통해 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다면, 포유동물 세포에서의 인간 유전자 발현은 물론, 사용가능한 대장균 균주의 범위가 넓어지고 대장균을 이용하여 단백질의 기능을 연구하거나 산업적으로 유용한 단백질을 대량 생산하는 데 큰 도움이 될 것으로 기대된다.

본 발명의 목적은 T7 프로모터 및 N-말단 HA 태그서열을 포함하는 벡터를 이용하여 T7 RNA 중합효소를 포함하지 않는 대장균에서 외래 단백질 발현을 증진시키는 기술을 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면, 상기 벡터를 이용하여 기존의 세포 특이적 프로모터 유도 발현 현상을 극복한, 대장균에서의 외래 단백질 발현 및 생산방법을 제공할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 T7 프로모터, HA 태그를 코딩하는 염기서열, 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 5' 에서 3' 방향으로 순차적으로 포함하는 벡터를 포함하는, T7 RNA 중합효소를 포함하지 않는 대장균에서의 외래 단백질 발현 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 T7 프로모터, N-말단 HA 태그, 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하고, T7 RNA 중합효소를 포함하지 않으며, 상기 벡터로부터 외래 단백질을 발현하는 대장균을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 대장균을 배양하여 외래 단백질을 발현 및 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 대장균을 배양하여 외래 단백질의 기능을 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 벡터 시스템을 이용하여 세포독성 물질을 스크리닝하기 위한 조성물 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명은 T7 RNA 중합효소를 포함하지 않는 대장균에서 T7 프로모터의 조절 하에 외래 단백질, 바람직하게는 인간 단백질을 발현시키는 기술에 관한 것이다.

HtrA1(High temperature requirement A1)은 박테리아부터 인간까지 기능이 고도로 보존되어 있는 세린 프로테아제이다. HtrA1은 자이모겐(zymogen) 상태로 존재하다가 N-말단 영역의 프로세싱을 통해 단백질 분해 활성을 지니는 활성형으로 성숙되며, 포유동물 세포에서 HtrA1 과발현은 세린 프로테아제에 의존적으로 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 세포질 내에서의 HtrA1 의 기능을 연구하기 위하여 HtrA1을 코딩하는 유전자를 pcDNA3 플라스미드에 클로닝하여 대장균에 도입하여 배양하던 중, 놀랍게도, 상기 플라스미드에 의하여 대장균에서 HtrA1의 발현이 유도되어 세린 프로테아제에 의존적으로 대장균의 생장이 억제되는 것을 확인하게 되었다.

이에, T7 RNAP가 존재하지 않는 대장균에서 상기 플라스미드의 어떤 구성인자들이 HtrA1 의 발현을 위한 시스-작용요소(cis-acting elements)로 작용하였는지를 알아보기 위하여, 프로모터, 타겟 유전자 및 태그의 다양한 조합들을 실험해본 결과, 포유동물 벡터 시스템에서 T7 프로모터 및 N-말단 HA 태그를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 대장균에서 타겟 유전자의 발현을 유도한다는 것을 최초로 규명하였다 (도 1). 나아가, 본 발명자들은 이러한 현상이 HtrA1 에 특이적인 것이 아니라, T7 프로모터 및 N-말단 HA 태그를 포함하는 벡터 시스템에서 HtrA1 대신 다른 타겟 유전자를 적용하여도 그 타겟 유전자가 대장균에서 성공적으로 발현한다는 사실을 규명하였다 (도 2).

상기 결과들을 바탕으로, T7 프로모터 및 N-말단 HA 태그를 포함하는 염기서열이, 다운스트림에 위치한 외래 유전자를 발현시키는 시스-작용요소임을 알 수 있다. 특히, 본 발명에서는, 종래에 재조합 단백질의 정제와 분리 수단으로 사용되었던 HA 태그 서열이, 놀랍게도 외래 단백질 발현을 유도 및 증진하는 기능을 할 수 있음을 새로이 규명한 데 특징이 있다. 이에, 본 발명자들은 T7 RNAP 가 존재하지 않는 대장균에, T7 프로모터, N-말단 HA 태그, 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입함으로써, T7 프로모터의 조절 하에 외래 단백질을 발현시킬 수 있는 신규한 벡터 시스템을 제공하는 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 벡터 시스템은 대장균에 T7 RNAP가 존재하지 않더라도, 대장균에 내생적으로 존재하는 유전자 발현 시스템을 이용하여 T7 프로모터의 조절 하에 재조합 단백질의 발현 및 생산이 가능하게 하므로, 대장균을 이용하여 단백질의 기능을 연구하거나 산업적으로 유용한 단백질을 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명의 벡터 시스템은 포유동물 세포에서 적용하기 전 대장균에서 타겟 유전자 발현 여부를 손쉽게 미리 테스트하기 위한 목적으로 활용할 수 있다. 일반적으로 포유동물 세포에 벡터를 도입하여 타겟 유전자의 발현 및 기능을 규명하는데 적어도 1주일 이상의 시간이 소요되는 실정이므로, 본 발명의 벡터 시스템을 이용하여 대장균에서 사전 테스트를 수행함으로써 실험 시간을 최소화하고(바람직하게는, 24시간 이내에 측정 가능) 타겟 유전자의 발현과 그 기능을 좀 더 효율적으로 평가할 수 있다.

실제로, 본 발명자들은 본 발명의 벡터 시스템을 대장균과 포유동물 세포에 각각 적용하여 HtrA1 단백질을 발현시켜 본 결과, 종래에 포유동물 세포의 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있었던 HtrA1 단백질이, 대장균에서 발현된 경우 유사하게 생장 억제 현상을 유도한다는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4). 이와 같이 포유동물 세포와 대장균 균주에서 타겟 유전자의 발현 및 기능이 동등하게 나타남을 확인함으로써, 대장균에서의 사전 평가 시스템으로서의 본 발명의 활용 가능성을 검증하였다.

더 나아가, 원하는 기능을 가지는 타겟 유전자를 스크리닝하기 위한 목적으로 본 발명의 벡터 시스템을 활용할 수 있다. 바람직한 일 구현예로서, 포유동물 세포에 대해 독성이 있거나 세포사멸을 유도하는 유전자를 선별하기 위한 사전 테스트 단계에 본 발명의 벡터를 적용하여, 유전자의 세포독성 여부를 보다 더 신속하게 판정할 수 있는 스크리닝 시스템으로도 활용 가능하다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 T7 프로모터, HA 태그, 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 5' 에서 3' 방향으로 순차적으로 포함하는 벡터를 포함하는, 대장균에서의 외래 단백질 발현 증진용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기에서 기술한, T7 프로모터, HA 태그, 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 5' 에서 3' 방향으로 순차적으로 포함하는 벡터를 포함하며, T7 RNA 중합효소를 포함하지 않으며, 상기 벡터로부터 외래 단백질을 발현하는 대장균에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명에서 벡터 도입 대상인 숙주로 사용되는 대장균은, T7 RNA 중합효소가 존재하지 않아, 내생적으로 존재하는 유전자 발현 시스템으로는 T7 프로모터의 조절 하에서 외래 단백질을 발현할 수 없거나 그 발현이 매우 저조한 대장균일 수 있다. 이러한 대장균의 예로는 E. coli DH5α 균주, E. coli TOP10 균주, E.coli JM109 균주, E. coli XL1-Blue 균주 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포, 바람직하게는 대장균에서 외래 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 외래 단백질이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 벡터는 플라스미드, 파아지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 등일 수 있으나, 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 외래 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 본 발명에서 T7 프로모터 및 HA 태그는, 그 다운스트림에 위치한 외래 단백질 코딩 핵산의 발현을 유도 및 조절하는 부위로서, 외래 단백질 코딩 핵산서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 재조합 벡터는 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 벡터는 외래 단백질 발현 유도 부위로서, T7 프로모터 및 N-말단 HA 태그를 포함함을 특징으로 한다. 특히, 종래에는 HA 태그가, 발현된 단백질의 정제와 분리를 용이하게 하기 위한 수단으로 사용되었으나, 본 발명에서는 HA 태그 서열이 T7 프로모터의 하류 및 외래 단백질 코딩 서열의 5' 부위에 위치할 경우, 외래 단백질 발현을 유도 및 증진하는 기능을 할 수 있음을 새로이 규명하였다.

본 발명에서 용어, "프로모터"란 중합효소에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 다운스트림 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)에 위치한 비해독된 핵산 서열을 말한다. 본 발명에서 사용되는 프로모터는, T7 프로모터임을 특징으로 한다.

T7 프로모터는 박테리오파아지 T7 에서 유래한 프로모터를 말하는 것으로, 바람직하게, 상기 T7 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서 HA 태그는 인간 인플루엔자 헤마글루티닌에서 유래한 단편을 말하는 것으로, 종래에는 일반적으로 발현 벡터에 포함되어 정제 및 분리를 용이하게 하기 위한 태그 용도로 사용되었으나, 본 발명에서는 외래 단백질 코딩 부위의 5' 인접 부위에 위치하여 외래 단백질의 발현을 유도 및 증진하는 용도로 사용되었다. 상기 HA 태그는 서열번호 2의 아미노산 서열 (YPYDVPDYA)을 가지는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열 (TAC CCT TAC GAT GTA CCG GAT TAC GCA)에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 프로모터 및 HA 태그 서열은, 상기 서열과 다소 차이가 있더라도, 외래 단백질 발현을 유도하는 데 있어서 실질적으로 동등한 활성을 가지는 서열 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 서열 변이체는 서열번호 1, 2, 또는 3의 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지는 서열 변이체일 수 있다.

본 발명의 벡터에서 외래 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 프로모터 및 HA 태그의 다운스트림에 삽입되어 발현된다. 본 발명 벡터에 의해 발현 가능한 외래 단백질은 특별한 제한은 없으며, 당업자가 원하는 모든 단백질에 적용될 수 있다. 구체적으로, 펩타이드, 폴리펩타이드, 결합 단백질, 결합도메인, 부착 단백질, 구조 단백질, 조절 단백질, 독소 단백질, 효소, 효소 저해제, 호르몬, 호르몬 유사체, 항체, 신호 전달 단백질, 단쇄 항체, 항원, 사이토카인, 조절 인자 또는 그 일부 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 벡터 시스템을 이용하여 대장균에서 HtrA1(high temperature requirement protein A1; Genbank Accession No. NM_002775), XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein; Genbank Accession No. BC032729), MIF(macrophage migration inhibitory factor; Genbank Accession No. AF469046) 및 Parkin (Genbank Accession No. AB009973)단백질을 각각 성공적으로 발현시킬 수 있음을 보여주었다. 그러나 이는 대표적인 예시에 불과한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터는, 추가적으로, 숙주세포 당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, 벡터가 도입된 숙주세포를 선별하기 위한 선별 마커(예, 항생제 내성 유전자, 영양 요구성 마커 등), 폴리아데닐화 서열, 시그널 서열, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열, 및 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위 등을 포함할 수 있다. 또는, 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 벡터와 외래 DNA를 용이하게 연결(ligation)할 수 있다.

본 발명의 벡터 시스템을 제조하는 방법에는 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 일 구현예로서, T7 프로모터를 포함하고 있는 상업적으로 입수가능한 벡터를 기본 벡터로 사용함으로써 보다 용이하게 본 발명의 벡터 시스템을 제조할 수 있다. 예를 들어, pcDNA 또는 pRSET 시리즈 벡터 등을 사용할 수 있다. 상기 벡터들은 T7 프로모터를 포함하고 있으므로, 인접 부위에 HA 태그 서열을 삽입하고, 그 다운스트림에 목적 단백질 코딩 서열을 삽입함으로써 본 발명의 벡터 시스템을 구축할 수 있다.

이와 같이 구축된 본 발명의 벡터 시스템은, 대장균에서 외래 단백질을 발현 또는 생산하는데 사용될 수 있고, 이를 이용하여 세포의 증식과 사멸에 대한 기능이 미확인된 외래 단백질의 기능을 분석하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 포유동물 세포에 적용하기 전에 대장균에서 타겟 유전자 발현 여부를 사전 테스트하기 위하여 사용될 수 있고, 나아가 원하는 기능을 가지는 타겟 유전자를 스크리닝하기 위한 목적으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 벡터 시스템을 이용하는 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 벡터가 도입된 대장균을 배양하는 단계를 포함하는, 외래 단백질을 발현 또는 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 대장균으로 벡터를 "도입"한다고 함은, 외부의 DNA를 대장균 내부로 전달하는 것을 의미하며, 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입 등을 포괄한다. 대장균 내로 본 발명의 벡터를 도입하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 염화칼슘 침전법, 레트로바이러스 감염, 미세주입법 (microinjection), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 방법 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터 시스템이 도입된 대장균의 배양은 당업계에서 통상적으로 사용되는 배양 방법을 통하여 배양될 수 있으며, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 당업자가 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있으며, 상업화된 배지를 이용할 수 있다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예로는 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예로는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

상기 대장균에서 발현된 외래 단백질은 다양한 형태로 세포 내에 존재하거나, 세포 외부로 분비될 수 있다. 외래 단백질이 미생물의 세포 내부에 존재하는 경우, 세포 파쇄 공정 후 발현된 단백질에 일차 항체를 결합시키고, 형광을 나타내는 화합물로 표식된 이차 항체를 반응시켜 염색한 다음, 발색으로 발현 여부를 관찰할 수 있으며, 단백질의 활성을 측정하거나 각각의 단백질에 대한 정량을 통해 확인할 수 있다. 발현된 외래 단백질이 세포 외부로 유출된 경우, 원심분리로 세포 및 고형물을 분리한 후 상기와 동일한 방법으로 관찰할 수 있다.

또한, 배양물로부터의 외래 단백질의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 이러한 분리 방법에는 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터는 회수되는 외래 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 벡터의 제조시 필요에 따라 다른 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 추가적으로 포함될수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등을 사용할 수 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다. 단백질의 정제는, 당업계에 알려진 다양한 크로마토그래피법을 이용하여 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용한 친화성 크로마토그래피법을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.

본 발명의 벡터 시스템을 이용하는 또 하나의 양태로서, 본 발명은 기능이 미확인된 외래 단백질의 기능을 분석하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태로서, 본 발명은

(a) T7 프로모터, HA 태그, 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 5' 에서 3' 방향으로 순차적으로 포함하는 벡터가 도입된 대장균을 배양하는 단계; 및

(b) 상기 대장균의 형질 변화 및 생장 저해 정도를 분석하는 단계를 포함하는,

외래 단백질의 기능 분석 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 외래 단백질의 기능 분석 방법은 포유동물 세포에서 적용하기 전 대장균에서 타겟 유전자 발현 여부 및 기능을 사전 평가하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포사멸 관련 유전자로 추정되는 신규발굴 유전자의 발현과 기능연구를 진행할 경우, 또는 인간을 포함한 포유동물에서 마이크로어레이 기법을 통하여 정상 조직과 질환 조직에서 발현량의 차이를 보이는 돌연변이 유전자들이 스크리닝된 경우, 본 발명의 벡터 시스템을 이용하여 대장균에서 이들 유전자를 과발현시켜 균주의 형질 변화와 균주 생장 저해 정도를 확인하고 이를 정상 균주의 형질과 비교 분석함으로써, 이들 유전자의 발현과 기능을 신속하게 사전 검증하는데 사용될 수 있다

또한, 대장균에서 발현된 단백질이 인간 유래의 단백질이 아닌 경우에는, 인간 단백질과 대장균에서 발현된 단백질 간의 기능적 상보성을 확인하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 이를 통하여 인간 유전자의 기능 분석이나 약물 스크리닝 등에 활용할 수 있다.

본 발명의 벡터 시스템을 이용하는 또 하나의 양태로서, 본 발명은 원하는 기능을 가지는 타겟 유전자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 일 구현예로서, 본 발명의 벡터를 세포 독성이 있거나 세포사멸을 유도하는 유전자를 선별하기 위한 스크리닝 시스템에 적용할 수 있다.

이를 검증하기 위하여, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 벡터 시스템을 이용하여 대장균에서 HtrA1 단백질을 발현하였을 때 콜로니가 거의 형성되지 않으며 세포 생장이 억제된다는 것을 확인하였고, 포유동물 세포에서 발현시에도 유사하게 세포 사멸이 유도되는 것을 확인한 바 있다 (도 3 및 도 4). 이와 같이, 본 발명의 벡터 시스템을 활용할 경우, 포유동물 세포에서 타겟 유전자의 세포 사멸 유도나 세포 독성이 일어날 지 여부를 대장균에서 10 ~ 24 시간 내에 신속하게 선별 가능하다는 장점이 있다.

따라서, 본 발명은 T7 프로모터, HA 태그, 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 5' 에서 3' 방향으로 순차적으로 포함하는 벡터를 포함하는, 대장균에서 세포독성 물질의 스크리닝용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 T7 프로모터, HA 태그, 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 5' 에서 3' 방향으로 순차적으로 포함하는 벡터를 이용한 대장균에서 세포독성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

바람직한 양태로서, 본 발명은

(a) T7 프로모터, HA 태그, 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 5' 에서 3' 방향으로 순차적으로 포함하는 벡터를 대장균에 도입하는 단계;

(b) 상기 벡터를 도입한 대장균의 생장 정도를, 상기 벡터를 도입하지 않은 대조군 균주와 비교하는 단계; 및

(c) 상기 벡터를 도입한 대장균이 상기 벡터를 도입하지 않은 대조군 균주에 비하여 생장이 감소하는 경우 벡터에 포함된 외래 유전자가 세포독성 유전자라고 판단하는 단계를 포함하는,

대장균에서의 세포독성물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

상기에서, 대조군 균주는 상기 벡터를 도입하지 않은 균주를 말하는 것으로, 야생형 균주 또는 외래 유전자를 포함하지 않는 벡터만 도입한 대장균를 사용할 수 있다.

상기 단계 (a) 에서, 상기 벡터 및 대장균에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

상기 단계 (b) 에서, 균주의 생장 저해 정도를 측정하는 것은 당업계에 알려진 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 액체 배양시 세포를 포함하는 배양액을 이용하여 흡광도를 측정하거나, 고체 배양시에는 성장한 세포의 밀도를 육안으로 확인하거나 콜로니의 수를 계수하는 방법 등에 의하여 균주의 생장 저해 정도를 확인할 수 있다.

또한, 측정한 균주의 성장 정도를 야생형 균주의 성장과 비교하는 것은, 예를 들어 액체 배양시의 측정된 흡광도를 컴퓨터 프로그램으로 분석하여 대조군 균주가 약물에 영향받는 정도를 기준점 0으로 정하고, 대조군 균주에 비해 상대적으로 생장이 저해받은 정도를 마이너스(-) 값으로 결정하여 이 값이 -0.2(20 % 이상)이하의 값이 나온 경우의 균주를 선별하거나, 고체 배양시 세포의 밀도가 야생형 균주의 세포 밀도에 비해 급격히 감소한 균주를 선별할 수 있다.

이러한 방법에 의하여 세포독성을 가지거나 세포사멸을 촉진하는 단백질을 발굴할 수 있으며, 이와 같이 스크리닝된 단백질은 세포사멸과 관련된 질환, 예를 들어 각종 암이나, 병원성 미생물에 의한 감염성 질환 등의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 벡터 시스템을 이용할 경우 T7 RNAP가 존재하지 않더라도 대장균에 내생적으로 존재하는 유전자 발현 시스템을 이용하여 T7 프로모터의 조절 하에서 외래 단백질을 용이하게 수득할 수 있어, 단백질의 기능을 연구하거나 산업적으로 유용한 단백질을 대량 생산하는데 유용하며, 나아가 원하는 기능성 유전자를 스크리닝하는 데 유용하다.

도 1a 는 본 발명에서 제작한, 성숙-HtrA1(M-HtrA1) 유전자를 포함하는 다양한 포유동물 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이다. S328A는 HtrA1에서 328 아미노산 잔기의 세린을 알라닌으로 치환한 돌연변이를 나타내고, h 는 인간(human), s 는 원숭이(simian), p 는 프로모터(promoter), GST 는 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase)를 나타낸다.
도 1b 는 대조군 벡터(pcDNA3.0), pHA-M-HtrA1, pHA-M-S328A 및 pCS-M-HtrA1를 각각 E. coli 에 도입하여 배양한 경우 600 nm에서 흡광도를 측정함으로써 E. coli 생장 정도를 비교 분석한 그래프이다.
도 1c 는 pHA-M-HtrA1, pHA-M-S328A, pCS-M-HtrA1 및 pCS-HA-M-HtrA1를 각각 E. coli 에 도입한 경우 M-HtrA1 의 발현 여부를 면역블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 1d 는 각 플라스미드 1 ng을 E. coli DH5α에 형질전환 한 후 형성되는 콜로니 수를 측정하여 E. coli 생장 정도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 2a 는 pHA-M-HtrA1 플라스미드에서 타겟 유전자를 XIAP, MIF로 교체한 경우(pHA-XIAP 및 pHA-MIF)와, 타겟 유전자를 SOD1 으로 교체하고 HA 태그를 제거한 경우(pM-SOD1), E. coli 에서 각 단백질의 발현 여부를 면역블랏을 통해 확인한 결과이다. 흰색 화살표는 비특이적 밴드를 나타내며, + 및 -는 태그 또는 T7 프로모터의 존재 및 부재를 나타낸다.
도 2b 는 pcDNA3.0 벡터 백본에 N-말단에 HA 태그를 포함하는 Parkin 발현 벡터(pHA-Parkin-HA)와 N-말단에 MYC 태그를 포함하는 Parkin 발현 벡터(pMYC-Parkin-HA)의 경우, E. coli 에서 각 단백질의 발현 여부를 면역블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 3a 는 pHA-M-HtrA1 및 pM-HtrA1 플라스미드 의 모식도를 나타낸다.
도 3b 는 pHA-M-HtrA1 및 pM-HtrA1 를 각각 E. coli 에 도입한 경우 M-HtrA1 의 발현 여부를 면역블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 3c 는 pHA-M-HtrA1 및 pM-HtrA1 를 각각 E. coli 에 도입한 후 형성되는 콜로니 수를 측정하여 E. coli 생장 정도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 4a 는 대조군 벡터(pcDNA3.0), pHA-M-HtrA1, pM-HtrA1 및 pCS-M-HtrA1를 각각 HEK293T 세포에 도입하여 배양한 경우 M-HtrA1 의 발현 여부를 면역블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 4b 는 대조군 벡터(pcDNA3.0), pHA-M-HtrA1, pM-HtrA1 및 pCS-M-HtrA1를 각각 HEK293T 세포에 도입하여 배양한 경우 세포 사멸이 일어나는지를 DAPI 염색법으로 확인한 결과이다. scale bar= 10μm, 하얀 화살표는 HtrA1 에 의해 유도된 사멸 세포를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 플라스미드의 제조

본 발명에서 제작한, 성숙-HtrA1(M-HtrA1) 유전자를 포함하는 다양한 포유동물 발현 벡터의 모식도를 도 1a 에 나타내었다. M-HtrA1은 HtrA1 아미노산 (Genbank Accession No. NP_002766) 중 150~480 번째 아미노산 서열을 가지며 (Kim, G.Y., et al., Biotechnol Lett, 2011. 33(7): p. 1319-26), M-HtrA1에서 세린 프로테아제의 촉매 활성 부위인 328 아미노산 잔기의 세린을 알라닌으로 치환하면 HtraA1 의 단백질 분해 활성이 불활성화되는데, 이를 S328A 로 나타내었다. 기본 벡터로는 pcDNA3.0 (Invitrogen (Carlsbad, CA)과 pCS2+ (University of Michigan, Ann Arbor, MI)를 사용하였다.

본 발명 사용한 플라스미드를 표 1에 정리하였다.

플라스미드	기본 벡터^a	프로모터	N-말단	C-말단	포유동물 세포에서 발현을 위한 프로모터
pHA-M-HtrA1	pcDNA3.0 (1)	T7	HA	FLAG	CMV
pHA-M-S328A	pcDNA3.0 (1)	T7	HA	FLAG	CMV
pM-HtrA1	pcDNA3.0 (1)	T7	-	FLAG	CMV
pCS-HA-M-HtrA1	pCS2+ (2)	SP6	HA	FLAG	sCMV
pCS-M-HtrA1	pCS2+ (2)	SP6	-	FLAG	sCMV
pHA-XIAP	pcDNA3.0 (1)	T7	HA	FLAG	CMV
pHA-MIF	pcDNA3.0 (1)	T7	HA	FLAG	CMV
pSOD1	pcDNA3.0 (1)	T7	-	FLAG	CMV
pHA-Parkin-HA	pcDNA3.0 (1)	T7	HA	HA	CMV
pMYC-Parkin-HA	pcDNA3.0 (1)	T7	MYC	HA	CMV
^a괄호 안의 숫자는 벡터의 구입처를 의미함 (1) Invitrogen (Carlsbad, CA); (2) Drs. David Turner and Ralph Rupp (University of Michigan, Ann Arbor, MI)

우선, pcDNA3.0 벡터에 Ha tag 염기서열 (서열번호 3)을 삽입하여 pcDNA3-HA (Biochemical and Biophysical Research Communications 387 (2009) 537-542 참조)를 제조하였고, Dr. Alfonso Baldi (Second University of Naples, Italy)로부터 제공받은 pcDNA-HtrA1 플라스미드를 pst I, Xho I 제한효소 처리 후 pBS 벡터에 삽입하여 pBS-M-HtrA1 를 제조하였다. 상기 pcDNA3-HA 및 pBS-M-HtrA1 를 각각 제한효소 EcoRI 및 XhoI 로 처리하여 pHA-M-HtrA1 및 pHA-M-S328A 을 제조하였다.

pM-HtrA1 플라스미드를 제조하기 위하여, pHA-M-HtrA 1 를 주형으로 하여 PCR 증폭을 수행하였으며 (95℃에서 3분; 95℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃ 에서 1분으로 총 32 사이클, pfu DNA 중합효소 사용; 72℃에서 1분), 다음의 프라이머를 사용하였다. 증폭된 M-HtrA1 cDNA 단편은 제한효소 EcoRI 및 XhoI 을 처리한 후 pcDNA3.0 플라스미드 (Invitrogen, CA)에 삽입하였다.

프라이머	서열	서열번호
정방향 프라이머	AAGCTT ATGCTGCAGCGCGGAGCCTGC (굵게 표시한 부분은 HindIII 제한효소 부위를 나타내고, 밑줄친 부분은 개시 코돈을 나타냄)	6
역방향 프라이머	CTCGAG CTA CTTGTCATCGTCGTCCTTGTA (굵게 표시한 부분은 XhoI 제한효소 부위를 나타내고, 밑줄친 부분은 정지 코돈을 나타내며, 이탤릭체로 표시한 부분은 FLAG 태그 부위를 나타냄)	7

pCS-HA-M-HtrA1 플라스미드를 제조하기 위하여, pHA-M-HtrA1 플라스미드 및 다음의 프라이머들을 이용하여 PCR 을 수행하였다(95℃에서 3분; 95℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃ 에서 1분으로 총 32 사이클, pfu DNA 중합효소 사용; 72℃에서 1분). 증폭된 HA-M-HtrA1 cDNA 단편은 ClaI 및 XhoI 제한효소로 처리한 후 pCS2+ 벡터에 삽입하였으며, pCS-HA-M-HtrA1로 명명하였다.

프라이머	서열	서열번호
정방향 프라이머	ATCGATATGTACCCTTACGATGTACCG (굵게 표시한 부분은 ClaI 제한효소 부위를 나타냄)	8
역방향 프라이머	CTCGAG CTA CTTGTCATCGTCGTCCTTGTA (굵게 표시한 부분은 XhoI 제한효소 부위를 나타내고, 밑줄친 부분은 정지 코돈을 나타내며, 이탤릭체로 표시한 부분은 FLAG 태그 부위를 나타냄)	9

또한, pHA-M-HtrA1 플라스미드는 제한효소 PstI 및 XbaI로 처리한 후 얻어진 단편을 pCS-M-HtrA1 GFP 에 삽입하였고, pCS-M-HtrA1 로 명명하였다.

pHA-MIF 플라스미드를 제조하기 위하여, 인간 brain cDNA library를 주형으로 하여 다음의 프라이머들을 이용하여 PCR 을 수행하였다(Kim, S.S., et al., 생명과학회지, 2005. 15(6): p. 961-7) (95℃에서 3분; 95℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃ 에서 1분으로 총 32 사이클, pfu DNA 중합효소 사용; 72℃에서 1분). 증폭된 MIF 단편은 EcoR I 및 KpnI 제한효소로 처리한 후 pcDNA-HA 벡터에 삽입하였으며, pHA-MIF로 명명하였다.

프라이머	서열	서열번호
정방향 프라이머	GCGCGAATTCGCCATGCCGATGTTCATCGTA (굵게 표시한 부분은 EcoRI 제한효소 부위를 나타냄)	10
역방향 프라이머	GCGCAGATCTGGTACCGGGCGAAGGTGGAGTT (굵게 표시한 부분은 KpnI 제한효소 부위를 나타냄)	11

pHA-XIAP 플라스미드를 제조하기 위하여, 인간 brain cDNA library를 주형으로 하여 다음의 프라이머들을 이용하여 PCR 을 수행하였다(95℃에서 3분; 95℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃ 에서 1분으로 총 32 사이클, pfu DNA 중합효소 사용; 72℃에서 1분). 증폭된 MIF 단편은 EcoR I 및 KpnI 제한효소로 처리한 후 pcDNA-HA 벡터에 삽입하였으며, pHA-XIAP로 명명하였다.

프라이머	서열	서열번호
정방향 프라이머	GCGCGAATTCATGACTTTTAACAGTTTTGAA (굵게 표시한 부분은 EcoRI 제한효소 부위를 나타냄)	12
역방향 프라이머	GCGCAGATCTGGTACCGAGACATAAAAATTTTTTGCTT (굵게 표시한 부분은 KpnI 제한효소 부위를 나타냄)	13

pSOD1 플라스미드를 제조하기 위하여, 인간 brain cDNA library를 주형으로 하여 다음의 프라이머들을 이용하여 PCR 을 수행하였다(Yoon, J.Y., et al., EMM, 2009. 41(9): p. 611-7) (95℃에서 3분; 95℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃ 에서 1분으로 총 32 사이클, pfu DNA 중합효소 사용; 72℃에서 1분). 증폭된 SOD1 단편 (Genbank Accession No. EF151142)은 EcoR I 및 KpnI 제한효소로 처리한 후 pcDNA3.0 벡터에 삽입하였으며, pSOD1로 명명하였다.

프라이머	서열	서열번호
정방향 프라이머	GCGCGAATTCATGGCGACGAAGGCCGTGTGC (굵게 표시한 부분은 EcoRI 제한효소 부위를 나타냄)	14
역방향 프라이머	GCGCGGTACCGTTGGGCGATCCCAATTACACCA (굵게 표시한 부분은 KpnI 제한효소 부위를 나타냄)	15

pHA-Parkin-HA와 pMYC-Parkin-HA 플라스미드를 제조하기 위하여, pMyc-Parkin-FLAG에서 XhoI과 XbaI으로 절단함으로써 Parkin-FLAG이 없어진 pcDNA-Myc vector에 pBS-Parkin-HA(XhoI과 XbaI로 절단)에서 나온 Parkin-HA fragment를 cloning하여 제작하였다. HA-HA는 pcDNA-HA (BamHI과 XbaI로 절단) expression vector에 Parkin-HA fragment를 cloning하여 제작하였다. (Nam, M.K., et al., 생명과학회지, 2005. 15(6): p. 916-22).

실시예 2. E. coli 생장 분석

실시예 1에서 제조한 플라스미드를 염화칼슘 침전법으로 E. coli TOP10 (Invitrogen) 에 도입한 후, 암피실린을 함유하는LB (Luria-Bertani) 브로쓰(LB-amp broth)에 씨딩하고 37℃ 에서 배양하였다. E. coli 의 생장은 분광 광도계(Pharmacia Biotech, UK)를 사용하여 600 nm 에서의 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하여 모니터링하였다. Sigma Plot program version 9.0 에 의하여 생장 곡선 그래프를 나타내었다. 에러바(Error bar)는 세 번의 독립적인 실험에 대한 평균의 표준오차(SEM)를 나타낸다. 통계적 유의성 수준은 means test 의 일원배치분산분석(one-way ANOVA) 및 터키 사후 비교분석(Tukey post-hoc comparison)으로 평가하였다.

상기 플라스미드 1ng 을 DH5α 및 TOP10 컴피턴트 세포에 형질전환하고, 각각 LB-amp 아가 플레이트에서 37℃ 에서 9~12시간 배양하였다. 콜로니들을 CCD 카메라 이미징 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 영상화하고 Image Tool software (UTHSCSA image tool, version 2.0, http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/ provided in the public domain by University of Texas Health Sciences Center, San Antonio, TX)를 사용하여 계수하였다.

실시예 3. 세포 배양 및 트랜스펙션

HEK293T 세포를 8.5% (v/v) 열불활성화된 우태아혈청(Invitrogen)이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 6-웰 플레이트 내의 HEK293T 세포 (2 x10⁵cells/well)에 3μl Fugene HD (Promega) 트랜스펙션 시약을 사용하여 1μg 플라스미드 DNA (0.9μg 타겟 플라스미드 및 0.1μg pCS-EGFP 플라스미드) 를 트랜스펙션하였다. 18시간 후 세포를 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 로 염색하였다. 응축된 또는 단편화된 사멸세포의 핵을 모니터링 하기 위하여 형광현미경 (Carl Zeiss)으로 GFP 양성 세포를 분석하였다.

실시예 4. 면역블랏 ( Immunoblot , IB ) 분석

E. coli 배양에 대한 면역블랏 분석을 위하여, 배양된 E. coli 를 (OD₆₀₀ = 0.6 or 1 x 10⁸ cells per ml) 1분간 16,100 x g 로 원심분리하여 세포를 수집하였다. 세포를 1x SDS 로딩 버퍼58.3 mM Tris-HCl [pH 6.8], 2% SDS, 5% glycerol, 0.004% bromophenol blue, 0.05 mM EDTA, 144 mM β-mercaptoethanol) 80μl 내에서 용균시키고 3분간 열을 가하였다.

HEK293T 세포에 대한 면역블랏 분석을 위하여, 트랜스펙션된 세포를 프로테아제 저해를 함유하는 방사성면역침전 버퍼(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate), 10μg/ml 아프로티닌, 10μg/ml 류펩틴, 및 1 mM 페닐메틸설포닐플로라이드 내에서, 아이스로 30분간 용균시켰다. E. coli (1.8 x 10⁷ cells, 14μg) 유래의 단백질 및 HEK293T 세포 용해물(20μg)을 13% SDS-PAGE 에 용해시키고 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다. 면역블랏 분석을 위하여 항-FLAG 단클론항체(Sigma, CA), 항-HA 다클론항체(Santa Cruz Biotech., CA) 및 항-HtrA1 다클론항체(Ab Frontier, Korea)를 사용하였다. HRP(Horseradish peroxidase)가 결합된 이차 항-마우스 또는 항-래빗 면역글로불린 G(IgG) 는 Santa Cruz Biotechnology 에서 구입하였다. ECL(enhanced chemiluminescence) immunoblotting system SUPEX kit (Neuronex, Korea) 를 사용하여 단백질을 검출하였다. 타겟 단백질 밴드의 밀도는 Multi Gauge V3.1 software (Fuji film)를 사용하여 측정하였다.

실험결과

1. pHA -M- HtrA1 포유동물 발현 벡터에 의하여 E. coli 에서 HtrA1 이 발현되고, HtrA1 세린 프로테아제에 의하여 E. coli 의 생장이 억제되었다.

인간 타겟 유전자를 포유동물 세포 시스템에서 연구하기 위해서는 포유동물 세포에서 타겟 유전자의 과발현은 반드시 필요한 과정이다. 본 발명에서는 인간 HtrA1을 타겟 유전자로 선정하여 pcDNA3.0과 pCS2+ 벡터를 사용하여 다양한 HtrA1 컨스트럭트를 제작하였다(도 1a).

포유동물 세포에서 타겟 유전자 발현은 pcDNA3.0 벡터의 경우 인간 CMV 프로모터 (hCMV p)로부터 유도되고, pCS2+ 벡터의 경우는 hCMV 프로모터에 대한 원숭이에서 대응되는 sCMV 프로모터로부터 유도된다. 이 벡터는 박테리오파지 T7과 SP6로부터 기원된 T7 및 SP6 프로모터를 포함하고 있고, 이들 프로모터는 벡터 내에서 반대 방향으로 위치하고 있어 인 비트로 전사를 통해 센스나 안티센스 프로브를 합성하는데 사용할 수 있는 다목적용 벡터 시스템이다. 분자 및 세포 생물학 연구에서 포유동물 세포에서 과발현한 타겟 단백질을 확인하기 위해서는 타겟 단백질 특이적인 항체 (Ab)가 필수적이다. 그러나 여전히 상업적으로 이용가능한 Ab나 직접 제작한 Ab의 특이성에 대한 한계가 존재한다. 이 한계를 극복하기 위한 일환으로 타겟 단백질의 N- 및/또는 C-말단에 HA (YPYDVPDYA, 서열번호 2), FLAG (DYKDDDDK, 서열번호 4), 및 MYC (EQKLISEEDL, 서열번호 5) 등의 친수성 성질를 가진 소펩타이드를 코딩하는 서열을 태깅하는 기술이 사용되고 있다.

본 발명에서는 성숙-HtrA1(M-HtrA1)의 발현을 보다 더 특이적이고 효율적으로 검출하기 위해 HtrA1의 C-말단에 FLAG을 인프레임으로 태깅하였다. 또한, HtrA1 세린 프로테아제는 프로세싱을 통해 성숙한 형태(mature form)가 형성되나, 아직까지 그 정확한 절단 부위(cleavage site)는 알려져 있지 않기 때문에, M-HtrA1의 N-말단 부위에 HA 태그을 갖도록 하였다(도 1a).

포유동물 세포에 트랜스펙션을 하려면 다량의 플라스미드 DNA가 필요하고, 이를 위해서는 타겟 플라스미드 DNA를 E. coli 시스템에 형질전환하여 복제시킨 후, 타겟 플라스미드 DNA를 확보해야 한다. 이를 위해 각 플라스미드를 함유하고 있는 E. coli 를 배양하던 중, LB-amp broth에서 pHA-M-HtrA1 플라스미드를 함유하고 있는 E. coli 가 다른 플라스미드를 함유하는 E. coli 에 비해 거의 자라지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 이 현상을 확인하고 보다 더 정확히 분석하기 위해, 아가 플레이트와 액체 배양방법으로 E. coli 생장 정도를 비교 분석하였다. 먼저, 각 플라스미드 1 ng을 E. coli DH5α에 형질전환 한 후 형성되는 콜로니 수를 측정하여 E. coli 생장 정도를 비교하였다. 그 결과, pcDNA3.0을 함유하고 있는 대조군 E. coli 의 경우는 100개 이상의 콜로니를 확인할 수 있었으나, pHA-M-HtrA1 플라스미드를 함유 하고 있는 E. coli 의 경우는 콜로니가 거의 형성되지 않았다 (도 1d)

또한, 유전자 클로닝에 일반적으로 사용되는 또 다른 균주인 E. coli TOP10 세포주에 플라스미드를 형질전환시키고 세포 생장을 시간 간격에 따라 분석하기 위해, 2 시간 간격으로 600 nm에서 흡광도(OD₆₀₀ _, optical density at 600 nm)를 측정함으로써 E. coli 생장 정도를 비교 분석하였다(도 1b). E. coli 는 초기 생장 단계인 유도기(lag phase)에서 비교적 일정한 세포 수를 유지하다가 점차 생장이 빨라지면서 왕성한 생장을 하는 대수기(exponential or log phase)에 도달한다. 대수기에서 세포 수는 20-30 분마다 배가 되어 세포 분열이 일정한 비율로 일어난다. 본 실험에서, pcDNA3.0을 함유하고 있는 대조군 E. coli 의 경우, 4 시간 정도의 유도기 (세포 증식 전 준비 단계) 에 머무르다가(OD₆₀₀ = 0.1), 점차적으로 왕성한 생장을 나타내는 대수기로 진입하였다(OD₆₀₀ = 1.8 at 10 hr incubation). 그러나, pHA-M-HtrA1를 함유하는 E. coli 는 10 시간 배양 시간까지도 전혀 자라지 않고 여전히 유도기를 유지하고 있다가 (OD₆₀₀ = 0.1 at 12 hr incubation) 서서히 생장 하기 시작하는 것을 관찰했다. 6 시간 동안의 배양 결과를 비교했을 때, pHA-M-HtrA1를 함유하는 E. coli 세포 수는 대조군 E. coli 세포 수의 0.02% 정도였다. 이는 pHA-M-HtrA1를 함유하는 E. coli 세포에서 HtrA1 이 발현되어 세포 생장을 억제한 결과로 볼 수 있다.

한편, pHA-M-HtrA1과 동일한 pcDNA3.0 플라스미드 백본을 가지고 있으나 HtrA1 단백질 분해활성이 불활성화된 돌연변이(세린 프로테아제의 촉매 활성 부위인 328 아미노산 잔기의 세린을 알라닌으로 치환)를 코딩하는 pHA-M-S328A 플라스미드를 함유하는 E. coli 의 경우, 대조군 E. coli 와 거의 동일하게 성장하였다. 또한, pCS-M-HtrA1의 경우는 야생형 HtrA1을 가지고 있는데도 불구하고 대조군 E. coli 수준으로 생장하는 것을 관찰하였다. 이러한 현상은 E. coli DH5α 경우에서 나타난 결과와 유사하기 때문에 특정 E. coli 균주에서만 나타나는 제한적인 현상이 아님을 알 수 있다.

이들 결과로부터 pHA-M-HtrA1 플라스미드로부터 M-HtrA1 단백질이 발현되며, HtrA1의 단백질 분해 활성이 E. coli 의 생존에 중요한 역할을 할 것이라는 가능성을 제시할 수 있다. 이를 조사하기 위해, HtrA1의 발현 여부를 면역블랏 분석으로 조사하였다(도 1c). M-HtrA1의 C-말단에 융합된 FLAG 태그에 특이적으로 반응하는 FLAG 항체로 면역블랏을 실시한 결과, pHA-M-HtrA1 및 pHA-M-S328A로부터 39-kDa의 단백질 밴드가 검출되었고, HtrA1에 특이적인 항-HtrA1 항체를 사용하여 이 39-kDa 밴드가 M-HtrA1임을 확인하였다. 그러나 pCS-M-HtrA1 플라스미드로부터는 M-HtrA1이 전혀 발현되지 않음을 확인하였다.

본 실험을 통해 E. coli 에서는 타겟 단백질 발현을 기대할 수 없는 포유동물 발현 벡터인 pHA-M-HtrA1 플라스미드로부터 M-HtrA1 단백질이 E. coli 에서 발현되며, 발현된 HtrA1는 세린 프로테아제 의존적인 방식으로 E. coli 의 생존에 영향을 끼친다는 사실을 규명하였다.

2. E. coli 에서 타겟 유전자 발현을 위해서는, 발현 벡터 내에 T7 프로모터 및 5'-인접 서열 코딩 HA 태그가 필요하다.

포유동물 모델 시스템에서 사용하는 발현 벡터에는 CMV 프로모터나 sCMV 프로모터와 함께 인 비트로 전사에 사용되는 박테리오파아지 T7, SP6 프로모터가 존재한다. 내생 E. coli RNA 중합효소 자체는 T7/SP6 프로모터에 대한 선택성(selectivity)이 굉장히 낮아, T7/SP6 RNA 중합효소가 존재하지 않는 E. coli TOP10 및 E. coli DH5α에서는 T7/SP6 프로모터로부터 타겟 유전자의 발현이 거의 유도되지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에서는 전혀 예상하지 못 하게도, E. coli 에서 pHA-M-HtrA1 포유동물 벡터 시스템으로부터 HtrA1이 확연하게 발현되는 것을 확인하였다. 이는 pHA-M-HtrA1 포유동물 발현 벡터에 존재하는 특정 요소가 인간 타겟 유전자의 발현에 중요하게 작용할 수 있다는 가능성을 제시한다.

본 발명자들은, 이 현상이 HtrA1 특이적인지 여부를 조사하기 위해, pHA-M-HtrA1 플라스미드에서 HtrA1 대신 다른 타겟 유전자를 가지는 플라스미드를 제작하여 E. coli 에서 타겟 유전자의 발현 여부를 면역블랏 분석으로 결정하였다(도 2a). 그 결과, 상기 HtrA1 에서의 결과와 마찬가지로 HA 태그를 사용한 XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein)와 MIF(macrophage migration inhibitory factor)의 경우 E. coli 에서 발현되는 것을 확인할 수 있으나, HA 태그를 사용하지 않은 SOD1(superoxide dismutase 1)의 경우는 T7 프로모터가 존재하고 있음에도 불구하고 발현을 확인할 수 없었다. 또한, 5' 부위에 SP6 프로모터를 포함하는 pCS-M-HtrA1로부터는 M-HtrA1이 전혀 발현되지 않았으나, N-말단 HA 태그가 존재하는 pCS-HA-M-HtrA1의 경우, pHA-M-HtrA1 플라스미드로부터 발현 되는 양의 20배 정도 적은 양이지만, M-HtrA1이 발현되는 것을 관찰할 수 있었다(도 1c).

다음으로, 이 타겟 유전자의 발현 현상이 HA 태그를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적인 것인지 여부를 조사하기 위해, pcDNA3.0 벡터 백본에 N-말단에 HA와 MYC이 각각 태깅되어 있는 Parkin의 발현을 면역블랏으로 비교하였다(도 2b). 그 결과, HA-태깅된 Parkin의 발현은 확인할 수 있으나, Myc-태깅이 된 Parkin의 발현은 전혀 확인할 수 없었다.

이들 결과는, 포유동물 벡터 시스템에서 인 비트로 전사를 위해 사용하고 있는 T7 프로모터와 단백질 발현을 검출하기 위해 사용하고 있는 HA 태그를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이, 타겟 유전자의 발현을 E. coli 에서도 지시할 수 있는 시스-작용요소(cis-acting elements)로 작용할 수 있음을 시사한다. 또한, 이 현상은 HtrA1에만 특이적으로 일어나는 현상이 아니라, 여러 타겟 유전자에도 일어나는 일반적인 현상임을 알 수 있다.

아직까지 그 정확한 메커니즘은 알 수 없으나, 아마도 T7 프로모터의 다운스트림에 존재하는 HA 코딩 뉴클레오타이드 서열이 E. coli RNAP의 T7 프로모터를 인식할 수 있는 능력을 강화시키거나, processivity를 증가시키는데 작용하여 타겟 유전자 발현을 증가시킬 것으로 생각한다.

3. pHA -M- HtrA1 포유동물 발현 벡터는 E. coli 에서 인간 타겟 유전자의 발현 및 기능을 평가하기 위한 시스템으로 사용가능하다.

일반적으로, 포유동물 발현 벡터에 타겟 유전자를 클로닝한 후, 포유동물 세포에서 타겟 유전자의 발현 및 기능을 규명하기 위해서는 적어도 1 주일 이상의 시간이 소요된다. 또한, 타겟 유전자를 발현 벡터 시스템에 클로닝한 후 포유동물 세포에 트랜스펙션 실험을 진행 시, 타겟 단백질 발현을 확인하지 못 하는 경우가 종종 발생한다. 따라서 실험 시간을 최소화하고 클로닝한 벡터의 발현 여부를 좀 더 효율적으로 평가할 수 있는 시스템이 필요하다.

본 발명에서 발견한 결과들은, pHA-M-HtrA1 포유동물 발현 벡터의 포유동물 세포에서 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 포유동물 세포에 적용하기에 앞서 E. coli 에서 타겟 유전자 발현과 그 기능(예컨대, 세포독성)을 사전 평가할 수 있는 시스템으로 활용할 수 있는 가능성을 제시한다.

이를 검증하기 위해, 본 발명자들은 E. coli (도 3)와 포유동물 세포 (도 4)에서 HtrA1의 발현과 세포독성 정도를 비교 분석하였다. 우선, pcDNA3.0 플라스미드에 존재하는 T7 프로모터와 함께 N-말단 HA 태그의 존재가 E. coli 에서 HtrA1의 발현과 E. coli 생장에 영향을 주는지 여부를 한 번 더 증명하기 위해, pHA-M-HtrA1 플라스미드로부터 HA 태그를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제거한 pM-HtrA1 플라스미드를 제작하였다(도 3a). 결과적으로, pHA-M-HtrA1 플라스미드 경우와는 달리, pM-HtrA1 플라스미드를 함유하는 E. coli 로부터는 HtrA1 발현을 전혀 관찰할 수 없었다(도 3b). 더불어 HtrA1 발현이 되지 않으므로 E. coli 생장에 영향을 끼치지 않아, 대조군 벡터를 함유하고 있는 E. coli 와 유사한 수의 콜로니를 형성하는 것을 관찰할 수 있었다 (도 3c).

상기 pHA-M-HtrA1 및 pM-HtrA1 플라스미드들이 포유동물 세포에서도 작동하는지 여부를 확인하기 위해, HEK293T 세포에 이들 플라스미드를 트랜스펙션하여 HtrA1 발현 여부와 발현에 따른 세포독성 여부를 DAPI 염색법으로 조사하였다. 그 결과, 두 플라스미드 모두 HEK293T 세포에서 37-kDa의 M-HtrA1가 발현 되었고(도 4a), 세포사멸도 유사하게 일어나는 것을 확인하였다(도 4b).

결론적으로, 우리의 데이터는 E. coli 에서 T7 프로모터와 함께 N-말단 HA 태그 코딩 서열의 존재로 인해 인간 타겟 유전자가 발현 된다는 것을 처음으로 규명하였다. 이 연구에서 발견한 결과를 근거로, pHA-M-HtrA1 포유동물 벡터 시스템을 이용하면 E. coli 에서 타겟 단백질의 발현을 24 시간 이내에 측정할 수 있으므로, 포유동물 세포에서 타겟 유전자 발현 여부를 미리 진단하기 위한 벡터 시스템으로 활용할 수 있다. 또한, 포유동물 세포에서 타겟 유전자의 세포 사멸 유도나 세포 독성이 일어날 지 여부를 E. coli 에서 10 ~ 24 시간 내에 신속하게, 진단하기 위한 전 단계 시스템으로 적용 가능하다. 더 나아가 포유동물 발현 클로닝 등의 분자 생물 연구에서 발생할 수 있는 E. coli 생장 문제의 해결에 대한 새로운 통찰력를 제공한다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A use of mammalian vector including T7 promoter and N-terminal HA tag for the over-expression of human genes in E.coli <130> DPP20122395KR <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Bacteriophage T7 <220> <221> promoter <222> (1)..(20) <223> T7 promoter <400> 1 taatacgact cactataggg 20 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HA tag <400> 2 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HA tag <400> 3 tacccttacg atgtaccgga ttacgca 27 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tag <400> 4 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MYC tag <400> 5 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 aagcttatgc tgcagcgcgg agcctgc 27 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 7 ctcgagctac ttgtcatcgt cgtccttgta 30 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 8 atcgatatgt acccttacga tgtaccg 27 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 9 ctcgagctac ttgtcatcgt cgtccttgta 30 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 10 gcgcgaattc gccatgccga tgttcatcgt a 31 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 11 gcgcagatct ggtaccgggc gaaggtggag tt 32 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 12 gcgcgaattc atgactttta acagttttga a 31 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 13 gcgcagatct ggtaccgaga cataaaaatt ttttgctt 38 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 14 gcgcgaattc atggcgacga aggccgtgtg c 31 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 15 gcgcggtacc gttgggcgat cccaattaca cca 33

Claims

T7 프로모터, HA 태그를 코딩하는 염기서열, 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 5' 에서 3' 방향으로 순차적으로 포함하는 벡터를 포함하는, T7 RNA 중합효소를 포함하지 않는 대장균(Escherichia coli) 에서의 외래 단백질 발현 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 대장균은 E. coli DH5α 균주 또는 E. coli TOP10 균주인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 T7 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 HA 태그는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 외래 단백질은 인간 유래 단백질인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 인간 유래 단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드, 결합 단백질, 결합도메인, 부착 단백질, 구조 단백질, 조절 단백질, 독소 단백질, 효소, 효소 저해제, 호르몬, 호르몬 유사체, 항체, 신호 전달 단백질, 단쇄 항체, 항원, 사이토카인, 조절 인자 및 그 일부로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
제6항에 있어서, 상기 인간 유래 단백질은 HtrA1(high temperature requirement protein A1), XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein), MIF(macrophage migration inhibitory factor) 또는 Parkin 단백질인 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물의 벡터를 포함하며, T7 RNA 중합효소를 포함하지 않으며, 상기 벡터로부터 외래 단백질을 발현하는 대장균(Escherichia coli).
제8항의 대장균을 배양하는 단계를 포함하는,
외래 단백질을 발현 또는 생산하는 방법.
제8항의 대장균을 배양하는 단계, 및
상기 대장균의 형질 변화 및 생장 저해 정도를 분석하는 단계를 포함하는,
외래 단백질의 기능 분석 방법.