KR20140012932A - Method for preparing galactooligosaccharide using lactobacillus extract and whey - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 유산균 추출물 및 유청을 이용한 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing galactooligosaccharide using lactic acid bacteria extract and whey.
우유와 유제품의 주요 탄수화물인 유당은 포도당과 갈락토오스로 구성된 이당류로 모든 포유동물의 젖 속에만 함유되어 있으며, 우유 100 g 당 4-5 g의 유당이 함유되어 있다. 그러나 유당은 대다수의 아프리카 흑인 및 아시아 황인 성인들에게 영양학적으로 문제를 야기하는 물질이다. 소장 내에 유당을 분해할 수 있는 효소가 부족하여 섭취된 유당을 분해하지 못하므로 발생하는 복부팽만, 복통, 경련, 설사 등의 증상을 일으키는 유당불내증 또는 유당소화장애증(lactose intolerance)로 인하여 우유의 소비 감소나 유제품 제조 시 품질저하 등의 문제를 야기시켜 왔다(Jang et al., Korean J. Food Sci . Technol., 22(4), 426-433(1990)).Lactose, the major carbohydrate in milk and dairy products, is a disaccharide consisting of glucose and galactose, which is contained only in the milk of all mammals, and contains 4-5 g of lactose per 100 g of milk. However, lactose is a nutritionally problematic substance for the majority of African-American and Asian sulfur adults. The lack of enzymes that can break down lactose in the small intestine prevents the breakdown of ingested lactose, resulting in lactose intolerance or lactose intolerance that causes symptoms such as bloating, abdominal pain, cramps and diarrhea. It has led to problems such as reduced consumption and poor quality in the manufacture of dairy products (Jang et al ., Korean J. Food Sci . Technol ., 22 (4), 426-433 (1990).
유청은 치즈 제조 시 커드로부터 방출되는 불투명하고 황록색의 액체로서 최근 치즈의 소비가 늘어남에 따라 생산량도 늘어나고 있으며 탈지분유 대용품 등으로 중요하게 인식되고 있는 유가공 부산물이다. 치즈 1 kg을 생산할 때 발생하는 평균 유청의 양은 치즈 생산량의 9배인 9 kg이 된다(Yoon et al., Korean J. Food Sci , Ani . Resour., 17(1), 38-44(1997)).Whey is an opaque, yellowish green liquid that is released from curds during cheese production. As whey has increased in recent years, production has also increased and is a dairy processed by-product that is recognized as an important substitute for skim milk powder. The average amount of whey produced per kilogram of cheese is 9 kilograms, nine times the cheese output (Yoon et. al ., Korean J. Food Sci , Ani . Resour ., 17 (1), 38-44 (1997)).
유산균은 소장에 존재하여 유산균이 생장함에 따라 젖산을 분비하여 장내 pH를 낮춰 줌으로서 유해균의 생장을 억제하는 “프로바이오틱스(probiotics)”로 잘 알려져 있다. Lactobacillus acidophilus는 최초로 발견된 프로바이오틱스이고, 이후 다른 유산균종의 프로바이오틱스 효능에 대한 연구들이 활발히 진행되어 왔다. 또한 유산균은 유당불내증의 완화(Mcdonough et al., Am . J. Clin . Nutr., 45, 570-574(1987))와 콜레스테롤을 낮추는 역할(Holzapfel et al., Int J Food Microbiol. 26;41(2):85-101(1998)), 대장암의 위험 감소(Sanders, Int . Dairy J., 8, 341-347(1998))등 많은 연구가 이루어지고 있다.Lactobacillus is well known as "probiotics" that are present in the small intestine to inhibit the growth of harmful bacteria by lowering the pH of the intestine by secreting lactic acid as the lactic acid bacteria grow. Lactobacillus acidophilus is the first probiotics to be discovered, and there have been active studies on the probiotics efficacy of other lactic acid bacteria. Lactobacillus also reduces lactose intolerance (Mcdonough et. al ., Am . J. Clin . Nutr ., 45, 570-574 (1987)) and its role in lowering cholesterol (Holzapfel et. al ., Int J Food Microbiol . 26; 41 (2): 85-101 (1998)), and the reduction of the risk of colorectal cancer (Sanders, Int . Dairy J. , 8, 341-347 (1998)).
생활수준이 향상됨에 따라 건강에 대한 관심이 높아졌고, 국내 식품 회사들도 안전한 천연식품소재 개발에 많은 노력을 기울이고 있다. 이러한 노력의 결과로 다양한 올리고당 제품이 개발 및 시판되고 있다. 올리고당은 당질원료에서 얻은 당액을 가공한 것으로 현재 생산되고 있는 올리고당은 프락토올리고당(fructooligosaccharide), 말토올리고당(maltooligosaccharide), 이소말토올리고당(isomaltooligosaccharide), 갈락토올리고당(galactooligosaccharide, GOS) 등이 있다. 프락토올리고당은 1개 이상의 과당분자가 결합되도록 효소를 작용시켜 얻은 당액이나 당질원료로부터 효소를 이용하여 얻은 당액을 여과, 정제, 농축한 액상 또는 분말상의 것을 말하며, 이소말토올리고당은 당질원료를 포도당 분자가 분지결합의 기본구조를 갖도록 효소를 작용시켜 얻은 당액을 여과, 정제, 농축한 액상 또는 분말상의 것을 말한다. 또한 갈락토올리고당은 당질원료를 이용하여 효소를 작용시켜 얻은 전이갈락토올리고당액 또는 사탕무, 대두 등에서 추출한 라피노스, 스타치오스의 당액을 여과, 정제, 농축한 액상 또는 분말상의 것을 말하며, 말토올리고당은 당질원료를 이용하여 3-10개의 포도당 분자가 직쇄 결합되도록 효소를 작용시켜 얻은 당액을 가공한 액상 또는 분말상의 것을 말한다(식품공전, 2009). As the standard of living improves, there is a growing interest in health, and domestic food companies are making great efforts to develop safe natural food materials. As a result of these efforts, various oligosaccharide products have been developed and marketed. Oligosaccharide is a processed sugar solution obtained from the saccharide raw material, currently produced oligosaccharides (fructooligosaccharides), maltooligosaccharides (maltooligosaccharides), isomalttooligosaccharides (galactooligosaccharides, galactooligosaccharides (GOS)) and the like. Fructooligosaccharide refers to a liquid or powder form obtained by filtering, purifying and concentrating a sugar solution obtained by using an enzyme from a sugar solution or a saccharide raw material obtained by acting an enzyme to combine one or more fructose molecules. Refers to a liquid or powder form obtained by filtering, purifying and concentrating a sugar solution obtained by acting an enzyme so that a molecule has a basic structure of branched bond. In addition, galactooligosaccharide refers to a liquid or powder form obtained by filtering, purifying, and concentrating a sugar solution of raffinose and starchose, which is obtained from a transgalgaltooligosaccharide liquid obtained from an action of an enzyme using a saccharide raw material or sugar beet, soybean, and the like. It refers to a liquid or powdered form of a sugar solution obtained by operating an enzyme such that 3-10 glucose molecules are directly linked using a saccharide raw material (Food Code, 2009).
이들 올리고당은 소장에서 분해되지 않고 대장까지 가서 장내 유용세균인 비피더스균(Bifidobacteria)의 증식인자로 작용하여 장내의 대장균, 장구균 및 부패성세균의 증식을 억제한다. 뿐만 아니라 영양소의 합성, 신진대사의 촉진, 면역기능의 증진과 장의 운동 촉진에 따른 변비의 개선효과를 나타내어 당뇨 등으로 당 섭취가 제한되는 사람에게 유용하다. 또한, 조제분유, 음료수, 아이스크림, 빵 등의 식품소재, 의약품 및 가축사료로도 이용되고 있다(Kim C. R., Korean J. Food Nutr., 12(1), 50-54(1999)).These oligosaccharides do not decompose in the small intestine and go to the large intestine to act as a growth factor for the intestinal useful bacterium Bifidobacteria , thereby inhibiting the growth of intestinal Escherichia coli, enterococci and decaying bacteria. In addition, it is useful for people whose sugar intake is restricted due to diabetes, as it shows the effect of constipation according to the synthesis of nutrients, promoting metabolism, enhancing immune function, and promoting bowel movement. It is also used as food ingredients, pharmaceuticals, and livestock feeds such as formula, milk powder, beverages, ice cream and bread (Kim CR, Korean J. Food). Nutr ., 12 (1), 50-54 (1999)).
장내 유익 세균인 비피더스균의 증식인자로 올리고당의 기능성이 부각되면서 올리고당의 한 종류인 갈락토올리고당을 제조하기 위하여 유당의 가수분해에 오랫동안 사용되어온 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)의 당전이(transgalactosidation/transgalactosylation) 반응을 통해 생산한다(In et al., Korean J. Food Sci . Technol., 29(2), 376-378(1997)). 특히, 갈락토올리고당은 모유의 성분 중에 다량 존재하며 난소화성 물질로 현재 식품산업에서 유제품 등의 첨가제로 널리 이용되고 있다. 이러한 갈락토올리고당을 생산하는 효소인 베타-갈락토시다아제는 락타아제(lactase)라고도 하며 세균, 효모, 곰팡이 등 광범위한 미생물에 의해서 생산되고, 효소원 세균으로는 Bacillus circulans(Fujimoto et al., Glycoconjugate Journal, 15, 155-160(1998)), Bacillus megaerium(Li et al., Appl Biochem Biotechnol, 158, 192-199(2009)), Bifidobacterium adolescentis(Hinz et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 66, 276-284(2004)), Bifidobacterium infantis(Hung et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol., 58, 439-445(2002)), Enterobacter agglomerans(Lu et al ., J. Agric . Food Chem. 54, 4989-4998(2007)), Lactobacillus reuteri(Nguyen et al ., FEMS Microbiol Lett., 269, 136-144(2007)), Streptococcus pneumonia(Jeong et al ., J. Bacteriol., 191(9), 3011-3023(2009)) 등이 연구되었다. 효모로는 Cryptococcus laurentii(Ohtsuka et al., J. Ferment . Bioeng., 70(5), 301-307(1990)), Kluyveromyces fragilis(Ladero et al., Enzyme Micro . Technol., 30, 392-405(2002)), Kluyveromyces lacits(Kim et al., Biotechnol . Lett., 25, 1769-1774(2003)), Sterigmatomyces elviae(Onishi and Tanaka, Appl Environ Microbiol. Nov;61(11):4026-30(1995)) 등이 연구되었다. 곰팡이로는 Aspergillus aculeatus(van Casteren et al., Carbohydr . Res., 329, 75-85(2000)), Aspergillus oryzae(Todorova-Balvay et al., J. Mol . Recognit., 19, 299-304(2006)), Bullera singularis(Cho et al., Biotechnol . Lett., 25, 2107-2111(2003)), Sporobolomyces singularis 등이 연구되었다(표 1-2).
Beta-galactosidase (EC 3.2) has long been used for the hydrolysis of lactose to produce galactooligosaccharides, one of the oligosaccharides, as the growth factor of the intestinal beneficial bacteria bifidus bacteria. 1.23) through the transgalactosidation / transgalactosylation reaction (In et) al ., Korean J. Food Sci . Technol ., 29 (2), 376-378 (1997). In particular, galactooligosaccharides are present in large amounts in the components of breast milk and are widely used as additives such as dairy products in the food industry. Beta-galactosidase, an enzyme that produces galactooligosaccharide, is also called lactase and is produced by a wide range of microorganisms such as bacteria, yeast, and fungi. Bacillus circulans (Fujimoto et al. , Glycoconjugate) Journal , 15, 155-160 (1998)), Bacillus megaerium (Li et al. , Appl Biochem Biotechnol , 158, 192-199 (2009)), Bifidobacterium adolescentis (Hinz et) al . , Appl . Microbiol . Biotechnol . , 66, 276-284 (2004)), Bifidobacterium infantis (Hung et al . , Appl . Microbiol . Biotechnol ., 58, 439-445 (2002)), Enterobacter agglomerans (Lu et al . , J. Agric . Food Chem . 54, 4989-4998 (2007)), Lactobacillus reuteri (Nguyen et al . , FEMS Microbiol Lett ., 269, 136-144 (2007)), Streptococcus pneumonia (Jeong et al . , J. Bacteriol ., 191 (9), 3011-3023 (2009)). As yeast, Cryptococcus laurentii (Ohtsuka et al ., J. Ferment . Bioeng ., 70 (5), 301-307 (1990)), Kluyveromyces fragilis (Ladero et. al ., Enzyme Micro . Technol ., 30, 392-405 (2002)), Kluyveromyces lacits (Kim et al ., Biotechnol . Lett ., 25, 1769-1774 (2003)), Sterigmatomyces elviae (Onishi and Tanaka, Appl. Environ Microbiol . Nov; 61 (11): 4026-30 (1995)). Molds include Aspergillus aculeatus (van Casteren et al ., Carbohydr . Res ., 329, 75-85 (2000)), Aspergillus oryzae (Todorova-Balvay et al ., J. Mol . Recognit ., 19, 299-304 (2006)), Bullera singularis (Cho et al ., Biotechnol . Lett ., 25, 2107-2111 (2003)), Sporobolomyces singularis and others have been studied (Table 1-2).
(℃)Temperature
(℃)
(U mg-1)activation
(U mg -1 )
(Psychrophile)Basophilia
(Psychrophile)
psychrolactophiluspsychrolactophilus
(Mesophiles)Mesophilic bacteria
(Mesophiles)
adolescentis
bifidumbifidum
infantisinfantis
agglomeransagglomerans
acidophilsacidophils
singularissingularis
elviaeelviae
pneumonia
acidocaldariusacidocaldarius
stearothermophilusstearothermophilus
saccharolyticussaccharolyticus
stearothermophilusstearothermophilus
rectivirgula
(Hyperthermophiles)Thermophile
(Hyperthermophiles)
Park and Oh, 2010
Park and Oh, 2010
(℃)Temperature
(℃)
(g L-1)Lactose
(g L -1 )
(Conc, g L-1)GOS a ,%
(Conc, g L -1 )
(g L-1 h-1)productivity
(g L -1 h -1 )
(Crude
enzymes)Raw enzyme
(Crude
enzymes)
longumlongum
stearothermophilusstearothermophilus
thermophilus
(Purified
enzymes)Purified enzyme
(Purified
enzymes)
agglomerans
acidophils
simplicissiumum
rectivirgula
elviae
1995Onishi and tanaka
1995
(Recombinant
enzymes)Recombinant enzyme
(Recombinant
enzymes)
infantis
furiosusfuriosus
stearothermophilus stearothermophilus
R109WR109W
(Toluene-treated cell)Toluene Treated Cells
(Toluene-treated cell)
bifidumbifidum
1996Onishi and Yokizeki
1996
(Immobilized
enzymes)Immobilized Enzyme
(Immobilized
enzymes)
2002Albayrak and Yang
2002
thermophilus
(Immobilized
cells)Immobilized Cells
(Immobilized
cells)
singularissingularis
Park and Oh, 2010
Park and Oh, 2010
효소학적으로 베타-갈락토시다아제는 락타아제로 불리며 락토오스(lactose)의 β(1→4)결합을 가수분해하여 글루코오스와 갈락토오스로 분해하는 효소이고, 락토오스로부터 잘려진 갈락토오스를 다른 락토오스에 붙이는 반응을 통해 갈락토올리고당을 생성하는 효소이다(Park et al., Appl . Microbiol . Biotechnol., 85, 1279-1286(2010)).Enzymatically, beta-galactosidase is called lactase and is an enzyme that hydrolyzes the β (1 → 4) bond of lactose into glucose and galactose, and attaches galactose cut from lactose to other lactose. An enzyme that produces galactooligosaccharides (Park et) al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 85, 1279-1286 (2010)).
식품가공에 이용함에 있어서 대체로 수용성효소는 그 효소활성이 불안정하고 반응 후 생성물과 효소의 분리가 어렵기 때문에 값비싼 효소의 재사용이 불가능하며, 반응공정이 연속화 되지 못하는 난점이 있다. 이의 해결책으로 효소의 고정화가 매우 유용한 방법으로 인정되어 이에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Obet al., Biochem . Educ., 28, 164-168(2000)), (Tanaka et al., J. Biochem., 77(1):241-247(1975)), (Squillante et al., J. Microencapsul., 20(2),153-167(2003)), (Nakkharat et al., World J. Microbiol . Biotechnol., 23(6), 759-764(2006)).In food processing, water-soluble enzymes are generally unstable in their enzyme activity and difficult to separate products and enzymes after the reaction, making it impossible to reuse expensive enzymes. As a solution of this, the immobilization of enzymes is recognized as a very useful method, and research on this is being actively conducted (Ob et. al ., Biochem . Educ ., 28, 164-168 (2000)), (Tanaka et) al ., J. Biochem ., 77 (1): 241-247 (1975)), Squillante et al ., J. Microencapsul ., 20 (2), 153-167 (2003)), Nakkharat et. al ., World J. Microbiol . Biotechnol ., 23 (6), 759-764 (2006).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 유청배지를 이용하여 저렴하게 갈락토올리고당을 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 유산균 배양용 유청배지에서 유산균을 배양하는 단계; 상기 유산균을 갈락토올리고당 생산용 유청배지에 적용하여 갈락토올리고당을 생산하는 단계를 포함하는 신규한 갈락토올리고당 제조 공정을 개발하였다. 이러한 공정에 따르면, 유청배지에서 배양한 유산균을 갈락토올리고당 생산용 유청배지에 적용하여 별도의 정제과정없이 연속적으로 갈락토올리고당을 생산하여 종래 제조 공정에 비해 생산 비용을 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have tried to develop a method for producing galactooligosaccharides at low cost using whey medium. As a result, culturing the lactic acid bacteria in lactic acid bacteria whey culture medium; Applying the lactic acid bacteria to the whey medium for producing galactooligosaccharides has developed a new galactooligosaccharide manufacturing process comprising producing galactooligosaccharides. According to this process, the lactic acid bacteria cultured in whey medium can be applied to the whey medium for producing galactooligosaccharide to produce galactooligosaccharide continuously without further purification process, thereby significantly reducing the production cost compared to the conventional manufacturing process. By confirming, this invention was completed.
따라서, 본 발명의 목적은 유청배지를 이용하여 종래 제조 공정에 비해 간편하며, 생산 비용을 현저하게 감소시킨 갈락토올리고당의 제조방법을 제공하는데 있다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for producing galactooligosaccharide, which is simpler than a conventional manufacturing process using whey medium and significantly reduces production costs.
본 발명의 다른 목적은 유청배지를 이용하여 생산한 갈락토올리고당을 제공하는데 있다.
Another object of the present invention to provide a galactooligosaccharide produced using whey medium.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention and claims.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유청배지를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for preparing galactooligosaccharide using whey medium, comprising the following steps:
(a) 유산균 배양용 유청배지에서 유산균을 배양하는 단계; 및(a) culturing the lactic acid bacteria in lactic acid bacteria whey culture medium; And
(b) 상기 유산균을 갈락토올리고당 생산용 유청배지에 적용하여 갈락토올리고당을 생산하는 단계.(b) applying the lactic acid bacteria to the whey medium for producing galactooligosaccharide to produce galactoligosaccharide.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 10 내지 15 중량%의 유청분말 및 0.5 내지 2 중량%의 유기질소원을 포함하는 유산균 배양용 유청배지에서 유산균을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 유산균을 20 내지 40 중량%의 유청분말을 포함하는 갈락토올리고당 생산용 유청배지에 적용하여 갈락토올리고당을 생산하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법을 제공한다.According to one aspect of the invention, the present invention comprises the steps of (a) culturing the lactic acid bacteria in lactic acid bacteria culture whey medium containing 10 to 15% by weight of whey powder and 0.5 to 2% by weight of organic nitrogen source; And (b) applying the lactic acid bacterium to a whey medium for producing galactooligosaccharide comprising 20 to 40% by weight of whey powder to produce galactooligosaccharide.
본 발명자들은 유청배지를 이용하여 종래 제조 공정에 비해 소요 시간 및 생산 비용을 현저하게 감소시킨 갈락토올리고당의 제조방법을 개발하고자 노력하였다. 본 발명자들은 유산균 배양용 유청배지에서 유산균을 배양하여 유산균을 수득하고, 이를 갈락토올리고당 생산용 유청배지에 적용하여 갈락토올리고당을 생산하는 새로운 갈락토올리고당 제조방법을 도출하였다. 종래 갈락토올리고당 생산에 필요한 락타아제의 제조는 곰팡이 또는 효모에서 이루어졌는데, 곰팡이 또는 효모의 생체 내 유입을 방지하기 위해 최종 단계에서 곰팡이 또는 효모를 제거하고 락타아제를 정제하는 단계를 포함해야 했다. The present inventors endeavored to develop a method for producing galactooligosaccharide, which significantly reduced the time and production cost compared to the conventional manufacturing process using whey medium. The present inventors cultured the lactic acid bacteria in lactic acid bacteria whey culture medium to obtain lactic acid bacteria, and applied to the whey medium for producing galactooligosaccharide to derive a new galactooligosaccharide production method for producing galactooligosaccharide. The production of lactase required for the production of conventional galactoligosaccharides has been done in mold or yeast, which had to include removing the mold or yeast and purifying the lactase in the final step in order to prevent influx of the fungus or yeast in vivo.
본 발명에서는 생체에 유익한 프로바이오틱스인 유산균에서 락타아제를 생산하기 때문에 별도의 정제과정 없이 갈락토올리고당의 생산에 이용할 수 있다. 따라서, 락타아제를 포함하는 유산균의 배양 및 갈락토올리고당 생산에 이르는 일련의 과정을 별도의 정제단계를 포함하지 않고 연속적으로 수행할 수 있어 시간 및 비용을 절감할 수 있다. In the present invention, since lactase is produced by lactic acid bacteria, a probiotic beneficial to the living body, it can be used for the production of galactooligosaccharides without a separate purification process. Therefore, a series of processes leading to the cultivation of lactobacillus-containing lactic acid bacteria and the production of galactoligosaccharides can be continuously performed without a separate purification step, thereby saving time and money.
본 발명자들은 유산균 배양용 유청배지에서 유산균을 배양하는 단계; 및 상기 유산균을 갈락토올리고당 생산용 유청배지에 적용하여 갈락토올리고당을 생산하는 단계를 포함하는 신규한 갈락토올리고당 제조 공정을 구축하였으며, 이러한 공정에 따르면, 락타아제가 포함된 유산균을 유청배지에 적용하여 장내 유익세균의 증식인자인 갈락토올리고당을 생산함으로써 생체에 유익한 유산균 및 갈락토올리고당을 동시에 섭취할 수 있는 갈락토올리고당을 제공할 수 있음을 확인하였다.
The present inventors culturing the lactic acid bacteria in lactic acid bacteria whey culture medium; And applying the lactobacillus to the whey medium for producing galactooligosaccharide, thereby establishing a new galactooligosaccharide manufacturing process comprising producing galactooligosaccharide, and according to this process, the lactobacillus containing lactase is applied to the whey medium. By producing galactooligosaccharide, a growth factor of beneficial intestinal bacteria, it was confirmed that it was possible to provide galactooligosaccharide capable of simultaneously ingesting beneficial lactic acid bacteria and galactooligosaccharides.
본 발명의 방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
The method of the present invention will be described in detail in each step as follows:
단계 (a): 유산균 배양용 Step (a): for lactic acid bacteria culture 유청배지에서On whey badge 유산균 배양 Cultivation of lactic acid bacteria
본 발명에 따르면, 유산균 배양에 앞서 유산균 배양용 유청배지를 제조한다. According to the present invention, the whey medium for lactic acid bacteria culture is prepared prior to the lactic acid bacteria culture.
본 명세서에서 용어“유산균(lactic acid bacteria)”은 탄수화물 대사의 주산물로서 유산을 생성하는 박테리아 군을 의미한다. 본 발명에서의 유산균은 당업계에 공지된 유산균에서 선택하여 사용할 수 있고, 예를 들면 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 콘푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 또는 루코노스톡 메센테리오데스(Leuconostoc mesenteriodes)이고, 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 아시도필러스 또는 락토바실러스 루테리이고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이이다.As used herein, the term “lactic acid bacteria” refers to a group of bacteria that produce lactic acid as the main product of carbohydrate metabolism. Lactobacillus in the present invention can be selected and used from lactic acid bacteria known in the art, for example, Lactobacillus paracasei ( Lactobacillus paracasei ), Lactobacillus rhamnosus ), Lactobacillus brevis ), Lactobacillus confusus ), Lactobacillus reuteri ), Lactobacillus delbrueckii ), Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus < RTI ID = 0.0 > plantarum ), Lactococcus lactis ), Lactobacillus helveticus ) or Leuconostoc mesenteriodes , preferably Lactobacillus paracasei, Lactobacillus helvetticus, Lactobacillus asidophilus or Lactobacillus luterii, more preferably Lactobacillus paracasei to be.
본 발명에서 이용되는 유산균 배양용 유청배지는 탄소원, 질소원 및 유청성분을 포함한다. 본 발명의 유산균 배양용 배지에서 탄소원은 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 글루코오스(포도당), 수크로오스(자당), 말토오스(맥아당), 프럭토오스(과당), 락토오스(유당), 자일로오스, 갈락토오스 또는 아라비노오스이고, 보다 바람직하게는 수크로오스, 프럭토오스, 글루코오스, 갈락토오스, 아라비노오스 또는 락토오스이며, 가장 바람직하게는 글루코오스이다. Lactic acid bacteria whey culture for use in the present invention includes a carbon source, nitrogen source and whey components. In the culture medium for lactic acid bacteria of the present invention, various carbohydrates may be used. Preferably, glucose (glucose), sucrose (sucrose), maltose (maltose), fructose (fructose), lactose (lactose), xyllo Ose, galactose or arabinose, more preferably sucrose, fructose, glucose, galactose, arabinose or lactose, most preferably glucose.
본 발명의 유산균 배양용 배지에서 질소원은 다양한 유기 질소원이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 효모추출물(yeast extract), 소이톤(soytone), 펩톤(peptone), 쇠고기추출물(beef extract), 트립톤(tryptone) 또는 카시톤(casitone)이고, 보다 바람직하게는 효모추출물, 펩톤, 트립톤 또는 소이톤이며, 가장 바람직하게는 효모추출물이다. 질소원으로서 효모추출물이 이용되는 경우, 그 함량은 바람직하게는 0.3-3%, 보다 바람직하게는 0.5-2%, 가장 바람직하게는 0.75-1.2%이다.Nitrogen source in the culture medium for lactic acid bacteria of the present invention may be used a variety of organic nitrogen source, preferably yeast extract (yeast extract), soytone (soytone), peptone (peptone), beef extract (beef extract), tryptone ( tryptone) or casitone, more preferably yeast extract, peptone, tryptone or soytone, and most preferably yeast extract. When yeast extract is used as the nitrogen source, the content thereof is preferably 0.3-3%, more preferably 0.5-2%, most preferably 0.75-1.2%.
상기 유산균 배양용 유청배지의 유청은 포유류로부터 나온 젖 성분이 엉겨서 응고된 뒤 남은 액체로, 액체 상태에서 멸균하여 그대로 사용하거나 동결건조 등의 방법으로 분말화한 상태로 사용할 수 있다. 유청은 동물에서 직접 채취하거나 상업적으로 판매하는 제품을 구입하여 사용할 수 있다. 이러한 유청은 우유, 산양유, 염소유, 낙타유로부터 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 이용되는 유청은 바람직하게는 분말유청이다. The whey of the lactic acid bacteria culture whey medium is a liquid remaining after the milk component from the mammal is tangled and solidified, can be used as it is sterilized in a liquid state or powdered by a method such as lyophilization. Whey can be obtained directly from animals or purchased from commercially available products. Such whey may be prepared from, but is not limited to, milk, goat milk, goat oil and camel oil. The whey used in the present invention is preferably powder whey.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 유산균 배양용 유청배지는 분말유청에 증류수를 넣어 섞은 후 알칼레이즈(alcalase)를 첨가하여 항온수조에서 완전히 녹이고 효모추출물 및 구연산 암모늄염(ammonium citrate)를 첨가하여 멸균한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the whey medium for lactic acid bacteria culture is mixed with powdered whey and then added with an alcalase to completely dissolve in a constant temperature bath and sterilized by adding yeast extract and ammonium citrate (ammonium citrate). do.
상기 유산균 배양용 유청배지에 첨가되는 분말유청은 5-20 중량%이고, 바람직하게는 5-15 중량%이며, 보다 바람직하게는 8-16 중량%이고, 가장 바람직하게는 9-12 중량%이다. Powder whey added to the lactic acid bacteria culture whey medium is 5-20% by weight, preferably 5-15% by weight, more preferably 8-16% by weight, most preferably 9-12% by weight. .
상기 유산균 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. The lactic acid bacteria culture can be carried out through various methods known in the art.
유산균의 접종은 배양 조건하에서 유산균이 충분히 증식할 수 있도록 전배양된 유산균을 적당한 양으로 배양배지에 첨가함으로써 수행된다. 본 발명에서 유산균 전배양에 이용 가능한 배지는 유산균 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 포함하나, 바람직하게는 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 액체배지, APT(All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지이며, 가장 바람직하게는 MRS 액체배지이다.Inoculation of lactic acid bacteria is carried out by adding a suitable amount of pre-cultured lactic acid bacteria to the culture medium so that the lactic acid bacteria can fully grow under culture conditions. In the present invention, the medium that can be used for the pre-culture of lactic acid bacteria includes any medium used for the culture of the lactic acid bacteria strain, but preferably, deMan Rogosa Sharpe (MRS) liquid medium, APT (All Purpose with Tween) medium or BHI (Brain Heart Infusion) ) Medium, most preferably MRS liquid medium.
유산균 조효소액 제조를 위한 유산균 배양은 전배양된 유산균 배양액을 유산균 배양용 유청배지에 1-5%(v/v) 첨가하여 실시할 수 있다. 유산균의 배양은 당업계에 알려진 유산균 배양조건에 따라 실시할 수 있다. 이러한 과정은 당업자에 의해 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다(James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions). 세포의 성장방식에 따라 현탁배양 또는 부착배양 할 수 있으며, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 또는 연속배양식으로 실시할 수 있다. Lactic acid bacteria culture for the production of lactic acid bacteria co-enzyme solution can be carried out by adding 1-5% (v / v) of the pre-cultivated lactic acid bacteria culture medium to lactic acid bacteria culture whey. Cultivation of lactic acid bacteria can be carried out according to the culture conditions of lactic acid bacteria known in the art. This procedure can be easily adapted and used according to strains selected by those skilled in the art (James et al., Biochemical Engineering , Prentice-Hall International Editions). Depending on the growth method of the cells can be suspended or attached culture, depending on the culture method can be carried out in batch, fed-batch or continuous culture.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, MRS 액체배지에 유산균주를 접종하고 배양하여 활성을 키운 후, 상기 유산균 배양용 유청배지에 접종하여 배양한다. 본 발명에 있어서, 유산균 배양 온도는 바람직하게는 20-35℃이고, 보다 바람직하게는 25-32℃이며, 가장 바람직하게는 28-32℃이다. According to a preferred embodiment of the present invention, after inoculating and culturing the lactic acid strain in the MRS liquid medium, the culture is inoculated in the whey medium for lactic acid bacteria culture. In the present invention, the lactic acid bacteria culture temperature is preferably 20-35 ° C, more preferably 25-32 ° C, and most preferably 28-32 ° C.
본 발명의 구체적인 일 실시 예를 참조하여, 상기 단계 (a)를 설명하면 다음과 같다: 유산균주를 MRS 액체배지 10 mL에 접종하여 30℃에서 18시간 동안 전배양하고, 유산균 배양용 유청배지 100 mL에 전배양액을 접종하여 30℃에서 18시간 동안 배양한다.
With reference to a specific embodiment of the present invention, the step (a) is described as follows: lactic acid bacteria inoculated in 10 mL MRS liquid medium and pre-incubated for 18 hours at 30 ℃, lactic acid bacteria culture medium 100 Inoculate the preculture to mL and incubate for 18 hours at 30 ℃.
단계 (b): 유산균을 이용하여 Step (b): using lactic acid bacteria 갈락토올리고당을Galactooligosaccharide 생산 production
상기 유산균을 갈락토올리고당 생산용 유청배지에 적용하여 갈락토올리고당을 생산한다. The lactobacillus is applied to the whey medium for producing galactooligosaccharide to produce galactooligosaccharide.
본 발명에 있어서, 갈락토올리고당은 유당에 락타아제를 작용시켜 생성된 올리고당의 총칭을 의미한다. 일 예로는 상기 갈락토올리고당은 일반식 Gal-(Gal)n-Glc(상기 일반식에서 Gal은 갈락토오스 잔기를 의미하고, Glc는 포도당 잔기를 의미하며, n은 1 내지 4의 정수를 의미한다)로 표현되는 당류일 수 있으며, 바람직하게는 상기 갈락토올리고당은 유당에 갈락토오스가 베타-1,4 결합된 4’-갈락토실 락토오스, 4’-갈락토실 락토오스에 갈락토오스가 베타-1,4 결합된 4당류 내지 6당류 및 전이 2당으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.In the present invention, galactooligosaccharide means a generic term for oligosaccharides produced by applying lactase to lactose. For example, the galactoligosaccharide is represented by the general formula Gal- (Gal) n-Glc (Gal means galactose residue, Glc means glucose residue, and n means an integer of 1 to 4). It may be a saccharide to be expressed, Preferably the galactoligosaccharide is galactose to beta-1,4 bonded lactose to lactose 4'-galactosyl lactose, 4'-galactosyl lactose to beta-1,4 bond At least one selected from the group consisting of tetrasaccharides, hexasaccharides, and disaccharides.
상기 4’-갈락토실 락토스는 라피노스나 락츄로스에 비해 비피도박테리움 알도레센티스(Bifidobacterium aldolescentis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 등의 비피도박테리움균만에 의해 이용이 가능하고, 다른 장내 유해균들은 거의 이용할 수 없어서, 장내 유산균 균형을 유지하는데 도움이 되는 이점이 있는 것으로 보고 되어 있으며(Ohtsuka K. et al., Bifidus Vol 2 pp. 143-149(1989)), 철의 생체이용률을 향상시킨다(D. Perez-Conesa et al., Food Science and Technology International, Vol. 13, pp. 69-77(2007)). 또한, 충치의 원인균인 스트랩토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 등의 세균에 의해 이용되지 않고 불용성 글루칸(glucan)도 생성되지 않아서 저충치성을 특징으로 갖는 장점이 있으며(S. Hata. et al., Oral Microbiology and Immunology , Vol 16 pp. 57-62(2001)), 모유의 대표적인 올리고당인 4’-갈락토실 락토오스는 모유의 대사증진 기능 재현을 위하여 유아용 분유의 구성 성분으로 그 사용이 필수적이다.The 4'-galactosyl lactose BP gambling compared to raffinose or rakchyuroseu Te Solarium Al Dore sentiseu (Bifidobacterium aldolescentis ), Bifidobacterium bifidum ) or Bifidobacterium breb breve) are available only by Bifidobacterium bacteria, etc., and other intestinal harmful bacteria are not able to use almost, is reported to be an advantage to help maintain the balance of intestinal lactic acid bacteria and (Ohtsuka K. et al.,
본 발명에서 이용되는 갈락토올리고당 생산용 유청배지에 첨가되는 분말유청은 20-45 중량%이고, 바람직하게는 25-40 중량%이며, 보다 바람직하게는 30-40 중량%이고, 가장 바람직하게는 30-35 중량%이다.Powder whey added to the galactoligosaccharide production whey medium used in the present invention is 20-45% by weight, preferably 25-40% by weight, more preferably 30-40% by weight, most preferably 30-35% by weight.
본 발명에 있어서, 상기 갈락토올리고당를 생산하는 단계 (b)는 효소가 실활되지 않는 온도 및 배양시간 범위 내에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 상기 단계 (b)는 사용되는 효소의 배양시간 및 온도 범위에서 수행될 수 있다. 상기 단계 (b)는 바람직하게는 2-8시간, 보다 바람직하게는 3-6시간, 가장 바람직하게는 4-5시간 동안 수행할 수 있다. 또한, 상기 단계 (b)는 바람직하게는 20-40℃, 보다 바람직하게는 25-35℃, 가장 바람직하게는 29-32℃에서 수행할 수 있다.In the present invention, the step (b) of producing galactooligosaccharide may be performed at a temperature and incubation time range in which the enzyme is not inactivated, and preferably, the step (b) is a culture time and temperature of the enzyme used. It can be performed in a range. Step (b) may be performed for 2-8 hours, more preferably 3-6 hours, most preferably 4-5 hours. In addition, step (b) may be preferably performed at 20-40 ° C., more preferably 25-35 ° C., and most preferably 29-32 ° C.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 단계 (a) 및 (b) 사이에 단계 (a)에서 수득한 유산균 배양액으로부터 락타아제가 포함된 유산균 조효소액을 얻는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상세하게는, 배양액 중의 유산균체를 회수하고 배양배지를 분리하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 수득한 유산균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동건조 하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 예를 들어 글리세롤 성분을 포함하여 영하 80℃에 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결건조 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 미생물은 당업계에 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, between the step (a) and (b) may further comprise the step of obtaining a lactic acid bacteria coenzyme solution containing lactase from the lactic acid bacteria culture solution obtained in step (a). Specifically, centrifugation or filtration may be performed to recover the lactic acid bacteria in the culture and to separate the culture medium, and this step may be performed according to the needs of those skilled in the art. The obtained lactic acid bacteria can be preserved so as not to lose their activity by freezing or freeze drying according to a conventional method. For example, it may be stored at minus 80 ℃ containing glycerol components or suspended in sterile 10% skim milk can be lyophilized. In addition, the microorganism according to the present invention may be improved or improved to have equivalent activity or better activity by conventional physicochemical mutation methods and the like known in the art.
본 발명에서 이용되는 유산균 조효소액은 상기 유산균 배양액을 원심분리하여 수득한 유산균체를 파쇄하여 얻은 용액이다. The lactic acid bacteria coenzyme solution used in the present invention is a solution obtained by crushing the lactic acid bacteria obtained by centrifuging the lactic acid bacteria culture medium.
본 발명에 따르면, 상기 유산균 조효소액은 락타아제를 포함한다. 상기 락타아제는 베타-갈락토사이드 결합을 가수분해하는 효소로서, 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)라고도 한다.According to the present invention, the lactic acid bacteria coenzyme solution includes lactase. The lactase is an enzyme that hydrolyzes beta-galactosidic bonds and is also called beta-galactosidase.
본 발명에 있어서, 락타아제는 베타-갈락토사이드 결합을 가진 유당을 기질로 하여 갈락토오스와 글루코오스로 가수분해하는 반응을 하는 동시에 유당에 갈락토오스를 전이시켜 갈락토올리고당 생성반응을 동시에 수행한다. 또한, 락타아제는 유당 기질로부터 갈락토오스 잔기를 포함하는 갈락토오스 효소 중간 생성물을 생성하고, 갈락토오스 효소 중간 생성물의 갈락토오스 잔기를 수용하는 물질(갈락토오스 수용체)에 따라서 다른 생성결과물 즉, 다른 종류의 갈락토올리고당이 생성되고, 반응이 계속 진행됨에 따라 생성된 갈락토올리고당을 포함한 반응 결과물이 다시 분해 및 재결합을 계속하여 다양한 결과물이 생성된다. In the present invention, lactase hydrolyzes galactose and glucose with lactose having a beta-galactoseside as a substrate and simultaneously transfers galactose to lactose to perform galactoligosaccharide production. In addition, lactase produces a galactose enzyme intermediate product containing galactose residues from a lactose substrate, and different products, namely, different kinds of galactoligosaccharides, are generated depending on the substance (galactose receptor) that receives the galactose residues of the galactose enzyme intermediate product. As the reaction proceeds, the reaction product including the galactooligosaccharide generated is further decomposed and recombined to produce various products.
본 발명에서 이용되는 유산균 조효소액은 고정화용 담체(carrier)에 고정화(immobilization) 될 수 있다. 바람직하게는, 유산균 조효소액의 교정화용 담체는 셀룰로오스(cellulose), 덱스트란(dextran), 아가로오스(agarose), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 알긴산소다(sodium alginate), 세라믹(ceramic), 슬래그(slag), 또는 플라스틱(plastics)이고, 보다 바람직하게는 셀룰로오스, 덱스트란, 아가로오스, 알긴산소다, 세라믹이며, 가장 바람직하게는 알긴산소다이다. The lactic acid bacteria coenzyme solution used in the present invention may be immobilized to an immobilization carrier. Preferably, the carrier for the correction of the lactic acid bacteria coenzyme solution is cellulose, dextran, agarose, polyacrylamide, sodium alginate, ceramic, slag (slag) or plastics, more preferably cellulose, dextran, agarose, sodium alginate, ceramic, and most preferably sodium alginate.
본 발명에 있어서, 유산균 조효소액 고정화에 사용되는 알긴산소다는 바람직하게는 0.5-3.0 중량%이고, 보다 바람직하게는 1.0-2.0 중량%이며, 가장 바람직하게는 1.3-1.6 중량%이다.In the present invention, the sodium alginate used for lactic acid bacterium coenzyme immobilization is preferably 0.5-3.0 wt%, more preferably 1.0-2.0 wt%, and most preferably 1.3-1.6 wt%.
본 발명의 유산균 조효소액 고정화 방법은 담체결합법으로 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용할 수 있고, 예를 들면 공유결합, 이온결합, 물리적 흡착 또는 생화학적 결합이 있다. The lactic acid bacteria coenzyme immobilization method of the present invention may use various methods known in the art as a carrier binding method, for example, covalent bonds, ionic bonds, physical adsorption or biochemical bonds.
본 발명에 있어서, 상기 유산균 조효소액을 제조하는 단계는 효소가 실활되지 않는 pH 범위 내에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 사용되는 효소의 최적 pH 범위에서 수행될 수 있다. 상기 단계는 바람직하게는 pH 6-8, 보다 바람직하게는 pH 6.0-7.5, 가장 바람직하게는 pH 6.5-7.0에서 수행할 수 있다. In the present invention, the step of preparing the lactic acid bacteria coenzyme solution may be carried out within a pH range in which the enzyme is not inactivated, preferably may be carried out in the optimum pH range of the enzyme used. The step can be carried out preferably at pH 6-8, more preferably at pH 6.0-7.5 and most preferably at pH 6.5-7.0.
본 발명의 구체적인 일 실시 예를 참조하여, 상기 단계를 설명하면 다음과 같다: 유산균 배양액을 원심분리하여 수득한 침전균체(pellet)에 증류수 20 mL을 첨가하여 현탁한 후 라이소자임(mg/mL)을 처리하고 37℃에서 1시간 동안 정치시킨다. 그 다음, 초음파분쇄기로 현탁액을 파쇄하여 유산균 조효소액을 얻는다. 유산균 조효소액을 알긴산소다와 혼합한 후 2% 염화칼슘 용액에 1방울씩 떨어뜨려 효소를 고정화한다. 고정화시킨 유산균 조효소액은 원심분리하여 상등액을 제거하고 세척용액(예컨대, 인산염용액)으로 세척한 후 냉장고에 보관한다. With reference to a specific embodiment of the present invention, the above steps are described as follows: 20 mL of distilled water is added to the precipitated cells obtained by centrifugation of the lactic acid bacteria culture medium, followed by lysozyme (mg / mL). Treat and leave at 37 ° C. for 1 hour. Then, the suspension is crushed by an ultrasonic grinder to obtain a lactic acid bacteria coenzyme solution. After mixing the lactic acid coenzyme solution with sodium alginate, drop 1 drop into 2% calcium chloride solution to fix the enzyme. The immobilized lactic acid bacteria coenzyme solution is centrifuged to remove the supernatant, washed with a washing solution (eg, phosphate solution) and stored in the refrigerator.
본 발명에 따르면, 유청배지에서 고정화된 유산균 조효소액을 이용하여 갈락토올리고당을 생산하면 최대 15.4%의 수율로 갈락토올리고당을 수득할 수 있다. According to the present invention, the production of galactooligosaccharide using lactic acid bacteria coenzyme solution immobilized in whey medium can yield the galactooligosaccharide in a yield of up to 15.4%.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 갈락토올리고당을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a galactooligosaccharide prepared by the above-described method of the present invention.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법에 따라 제조된 갈락토올리고당을 함유하는 유산균 음료 조성물이 제공된다.
In the present invention, a lactic acid bacterium beverage composition containing galactooligosaccharide prepared according to the above method is provided.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명은 유청배지를 이용한 갈락토올리고당의 신규한 제조방법을 제공한다.(a) The present invention provides a novel method for preparing galactooligosaccharides using whey medium.
(b) 본 발명에 따르면, 프로바이오틱스와 동시에 섭취할 수 있는 갈락토올리고당을 제공할 수 있다. (b) According to the present invention, it is possible to provide galactooligosaccharides which can be ingested simultaneously with probiotics.
(c) 본 발명에 따르면, 종래 제조 공정에 비해 갈락토올리고당의 생산 비용을 현저하게 감소시킬 수 있다는 이점이 있다.
(c) According to the present invention, there is an advantage that can significantly reduce the production cost of galactoligosaccharides compared to the conventional manufacturing process.
도 1은 유청분말 배지의 제조 방법을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도 2는 유리된 o-Nitrophenol의 양을 표준 곡선으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 단백질 표준용액으로 하여 단백질 정량 표준 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 4는 락타아제(lactase)의 고정화 방법을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도 5는 유청분말배지(RWP) 또는 유산균배지(MRS)에서 L. paracasei FBT314 배양시 측정한 흡광도 결과를 나타낸 그래프이다.
◆ : 10% RWP, ● : 15% RWP, □ : MRS(control)
도 6은 유청분말배지 또는 유산균배지에서 배양한 L. paracasei FBT314 을 MRS 고체배지에 도말하여 배양한 후 콜로니(colony)를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다.
◆ : 10% RWP, ● : 15% RWP, □ : MRS(control)
도 7은 유청분말배지에 포함되는 질소원에 따른 L. paracasei FBT314의 생육 변화를 나타낸 그래프이다.
□ : 효모추출물, * : 소이톤, ◇ : 쇠고기 추출물, ○ : 맥아 추출물
도 8은 유청분말배지에 포함되는 효모 추출물의 농도에 따른 L. paracasei FBT314의 생육 변화를 나타낸 그래프이다.
▲ : 0%, □ : 0.5%, : 1%, × : 1.5%, △ : 2%
도 9는 분말유청배지에서 배양한 유산균의 침전균체(pellet) 또는 상등액에서 lactic acid bacteria(LAB) 락타아제의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 L. paracasei FBT314 유래 락타아제를 이용한 갈락토올리고당 생산에 있어 유청분말 농도에 따른 갈락토올리고당의 생산 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 L. paracasei FBT314 유래 락타아제를 이용한 갈락토올리고당 생산에 있어 온도에 따른 갈락토올리고당의 생산 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 L. paracasei FBT314 유래 락타아제를 이용한 갈락토올리고당 생산에 있어 반응시간에 따른 갈락토올리고당의 생산 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 분말유청배지에 L. paracasei FBT314 유래 락타아제를 첨가하여 배양한 시료에서 갈락토올리고탕의 유무를 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 통해 확인한 그림이다.
1. 글루코오스, 2. 갈락토오스, 3. 락토오스, 4. 갈락토올리고당
5. 샘플(1/2), 6. 샘플(1/4), 7. 샘플(1/8), 8. 샘플(1/16)
도 14는 갈락토올리고당을 정량적으로 분석하기 위해 HPLC를 수행한 결과를 나타낸 그림이다.
도 15는 고정화 효소로 생산한 갈락토올리고당을 HPLC를 이용하여 정량 분석한 결과를 나타낸 그림이다.1 is a diagram schematically showing a method for preparing whey powder medium.
2 is a graph showing the amount of free o- Nitrophenol as a standard curve.
Figure 3 is a graph showing the protein quantification standard curve using bovine serum albumin (bovine serum albumin) as a protein standard solution.
4 is a diagram schematically showing a method of immobilizing lactase.
Figure 5 is a graph showing the absorbance results measured in culture L. paracasei FBT314 in whey powder medium (RWP) or lactic acid bacteria medium (MRS).
◆: 10% RWP, ●: 15% RWP, □: MRS (control)
FIG. 6 is a graph showing colony count after colonizing L. paracasei FBT314 cultured in whey powder medium or lactic acid bacteria medium in MRS solid medium.
◆: 10% RWP, ●: 15% RWP, □: MRS (control)
7 is a graph showing the growth of L. paracasei FBT314 according to the nitrogen source contained in whey powder medium.
□: Yeast extract, *: Soyton, ◇: Beef extract, ○: Malt extract
8 is a graph showing the growth of L. paracasei FBT314 according to the concentration of yeast extract contained in whey powder medium.
▲: 0%, □: 0.5%,: 1%, ×: 1.5%, △: 2%
Figure 9 is a graph showing the activity of lactic acid bacteria (LAB) lactase in the pellet or supernatant of lactic acid bacteria cultured in powder whey medium.
10 is a graph showing the production of galactooligosaccharides according to whey powder concentration in galactooligosaccharide production using L. paracasei FBT314-derived lactase.
FIG. 11 is a graph showing the production of galactooligosaccharides with temperature in galactooligosaccharide production using L. paracasei FBT314-derived lactase. FIG.
12 is a graph showing the production of galactooligosaccharides with reaction time in the production of galactooligosaccharides using L. paracasei FBT314-derived lactase.
FIG. 13 shows the presence or absence of galactoligotang in a sample cultured by adding L. paracasei FBT314-derived lactase to a powder whey medium by thin layer chromatography (TLC).
1. glucose, 2. galactose, 3. lactose, 4. galactoligosaccharide
5. Sample (1/2), 6. Sample (1/4), 7. Sample (1/8), 8. Sample (1/16)
14 is a diagram showing the results of performing HPLC to quantitatively analyze galacto-oligosaccharides.
15 is a diagram showing the results of quantitative analysis of the galactoligosaccharides produced by the immobilized enzyme using HPLC.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.Throughout this specification, unless otherwise indicated, “%” used to indicate the concentration of a particular substance is solid / solid (weight / weight)%, solid / liquid (weight / volume)%, and Liquid / liquid is (volume / volume)%.
실험 재료Experimental material
재료 및 배지Materials and badges
본 발명에 사용한 유청분말(whey powder)은 국내에서 가공 치즈용 체다 치즈 제조 시에 얻어지는 것으로 (주)삼익유가공에서 제공받았다. 유청배지는 2가지의 조건으로 유산균 배양용 배지와 갈락토올리고당 생산용 배지로 조성을 달리하여 사용하였다. 유산균 배양용 배지의 조성은 유당을 1.75%로 조정하여 사용하였으며, 첨가제로는 효모추출물(yeast extract, BD, 미국) 및 구연산암모늄염(ammonium citrate, Shinyo pure chemicals, 일본)를 사용하였다. 제조 방법과 도 1 및 표 3과 같다. 갈락토올리고당 생산용 유청배지의 조성은 유당을 30%로 조정하여 90℃에서 20분간 살균하여 사용하였으며 조성은 표 4와 같다. MRS 배지는 BD사(미국) 제품을 일반 시약은 Sigma사(미국) 제품을 각각 구입하여 사용하였다.
Whey powder used in the present invention is obtained in the domestic manufacturing of cheddar cheese for processed cheese and was provided by Samik Milk Processing Co., Ltd. Whey media were used in two different conditions as lactic acid bacteria culture medium and galactooligosaccharide production medium. The composition of the culture medium for lactic acid bacteria was adjusted to 1.75% of lactose, and as an additive, yeast extract (yeast extract, BD, USA) and ammonium citrate (Shinyo pure chemicals, Japan) were used. 1 and Table 3 and the manufacturing method. The composition of the whey medium for galactooligosaccharide production was adjusted to 30% lactose and sterilized at 90 ° C. for 20 minutes. The composition is shown in Table 4. MRS medium was purchased from BD (USA) and general reagent was purchased from Sigma (USA).
분말 유청: Samik Dairy company(덴마크), 알칼레이즈: Novozyme(덴마크)
Powder Whey: Samik Dairy company (Denmark), Alcalase: Novozyme (Denmark)
공시 균주 및 효소Disclosure Strains and Enzymes
락타아제 활성을 가진 미생물은 락토오스를 이용할 수 있고, 갈락토올리고당을 합성할 수 있는 기능도 함께 가지고 있다고 판단하여 유일한 탄소원으로 유당을 자화하여 증식할 수 있는 유당이용 유산균을 일차로 선별하였다. 선별한 유산균으로는 시판 요구르트에서 분리한 균주인 Lactobacillus paracasei FBT314, Lactobacillus helveticus FBT1 및 본 발명자들의 보유 균주인 Lactobacillus acidophilus KCCM32820, Lactococcus lactis ATCC11454, Lactobacillus rhamnosus KCCM32405, Lactobacillus brevis KCCM11904, Lactobacillus confusus KCCM40015, Lactobacillus reuteri ATCC23272, Lactobacillus delbrueckii KCCM35468, Lactobacillus plantarum KCCM12116, Leuconostoc mesenteriodes KCCM11324 및 Weissella kimchii KCCM41287 등 총 12주의 공시유산균주로 실험을 진행하였다. 12주의 공시유산균은 조성을 변형시킨 MRS(BD, USA)배지에서 2회 계대하여 활성을 키운 후 유산균 배양용 유청배지를 이용하여 1회 계대 하여 사용하였다.
The microorganisms with lactase activity were able to use lactose and were also capable of synthesizing galactoligosaccharides. Therefore, lactose-using lactic acid bacteria were selected primarily to magnetize and grow lactose as the only carbon source. Lactobacillus , a strain isolated from commercial yogurt, was selected. paracasei FBT314, Lactobacillus helveticus FBT1 and Lactobacillus acidophilus KCCM32820, Lactococcus lactis ATCC11454, Lactobacillus rhamnosus KCCM32405 , Lactobacillus brevis KCCM11904 , Lactobacillus confusus KCCM40015 , Lactobacillus reuteri ATCC23272 , Lactobacillus delbrueckii KCCM35468 , Lactobacillus plantarum KCCM12116 , Leuconostoc mesenteriodes KCCM11324 and Weissella kimchii The experiment was carried out with a total of 12 strains of Lactic acid strains including KCCM41287. For 12 weeks, Lactobacillus strains were passaged twice in MRS (BD, USA) medium with modified composition, and then passaged once using lactic acid bacteria whey culture.
유산균용 Lactic acid bacteria 유청배지Whey badge 제조에 있어 In manufacturing 유청분말Whey powder 농도의 영향 Effect of Concentration
유청분말이 중량비로 10% 및 15% 첨가된 액체배지를 제조하고 대조구는 MRS(BD, USA) 액체배지를 사용하였다. 유산균을 접종한 다음 37℃에서 60시간 동안 배양하면서 균의 성장은 분광광도계(Spectrophotometer, Thermo Scientific, 미국)로 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Whey powder was prepared by adding 10% and 15% by weight of liquid medium, and the control was MRS (BD, USA) liquid medium. The inoculation of the lactic acid bacteria followed by incubation at 37 ° C. for 60 hours, the growth of the bacteria was measured at 650 nm with a spectrophotometer (Spectrophotometer, Thermo Scientific, USA).
유산균용 Lactic acid bacteria 유청배지에서On whey badge 유산균의 증식 및 Proliferation of lactic acid bacteria and 생균수Viable cell count 측정 Measure
환원유청분말배지(RWP) 및 MRS 액체배지를 제조하여 유산균을 접종한 다음 37℃에서 60시간 동안 배양하면서 시간별로 일정량을 취하여 MRS 고체배지에 도말하여 37℃에 60시간 배양하여 고체 배지 상에 자란 전형적인 콜로니의 수를 계수하였다.
Reduced whey powder medium (RWP) and MRS liquid medium were prepared and inoculated with lactic acid bacteria, followed by incubation at 37 ° C for 60 hours, taking a certain amount by time, smearing in MRS solid medium and incubating at 37 ° C for 60 hours to grow on solid medium. The number of typical colonies was counted.
*유산균용 유청배지 제조에 있어 유기질소원의 영향 * Effects of Organic Nitrogen Sources on the Production of Whey Media for Lactic Acid Bacteria
분말유청배지를 기본 배지로 하여 다양한 질소원에 따른 미생물의 증식을 검토하기 위하여 효모추출물(yeast extract, BD, USA), 소이톤(soytone, BD, USA), 쇠고기 추출물(beef extract, BD, USA), 맥아 추출물(malt extract, BD, USA)을 각각 1% 첨가하여 배지를 제조하고 유산균을 접종한 다음 60시간까지 균체의 증식을 650 nm에서 흡광도로 표시하였다.
Yeast extract (BD, USA), soytone (BD, USA), beef extract (beef extract, BD, USA) , 1% of malt extract (BD, USA) was added to prepare a medium, inoculated with lactic acid bacteria, and the proliferation of the cells up to 60 hours was indicated by absorbance at 650 nm.
유산균용 Lactic acid bacteria 유청배지Whey badge 제조에 있어 효모 추출물의 영향 Effect of Yeast Extract on Manufacturing
분말유청배지에 결핍된 유기질소원으로 효모 추출물을 사용하여, 첨가량을 0, 0.5, 1, 1.5 및 2% 조건으로 하여 균체 증식 정도를 분광광도계를 이용하여 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Using the yeast extract as an organic nitrogen source deficient in the powder whey medium, the absorbance was measured at 650 nm using a spectrophotometer with the addition amount of 0, 0.5, 1, 1.5 and 2%.
유산균의 락타아제 효소 활성 확인Confirmation of Lactase Enzyme Activity of Lactic Acid Bacteria
12종의 유산균을 MRS 배지에서 배양한 후 1 mL씩 취하여 원심분리기(Vision, Korea)로 원심분리(2000×g, 20분)하였다. 상등액은 따로 취하고 펠렛(pellet)에 saline(0.85% NaCl)을 1 mL 넣어 재현탁하였다. 원심분리 한 다음 침전된 균체에 saline을 1 mL 넣은 후 현탁하였다. 멸균시험관에 ONPG disc(Sigma, USA)와 saline을 0.1 mL 넣고 상기와 같이 미리 제조해 둔 상등액, 균체 현탁액을 0.1 mL씩 넣고 충분히 진탕한 후 30℃로 배양하면서 발색 유무를 확인하였다. 효소활성은 Nguyen 등(1999)의 방법을 약간 변형하여 o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG, Sigma)로부터 유리되는 o-Nitrophenol(Sigma, USA)의 양을 측정하였다. 효소액 0.5 mL 및 100 mM 인산염 완충액(pH 7.0)을 1.4 mL 빈 시험관에 넣고 혼합한 다음 20 mM ONPG 용액 0.1 mL를 재빨리 가하여 혼합한 후 30℃ 항온수조에서 10분간 반응시켰다. 10분 후 0.2 M Na2CO3 용액 0.2 mL을 가하여 반응을 중지시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 1 U는 반응시간 분당 ONPG로부터 생성되는 o-Nitrophenol 의 μmole 수로 정의하였다. 효소단위는 유리된 o-Nitrophenol의 양을 미리 작성한 표준 곡선으로부터 산출 표시하였다(도 2).
After incubating 12 kinds of lactic acid bacteria in
유산균주를Lactobacillus 이용한 Used 조효소액의Coenzyme 제조 Produce
유산균주를 MRS 액체배지 10 mL에 접종하여 30℃에서 18시간 동안 배양하여 활성을 키운 후 액상 분말유청배지 100 mL에 접종하여 30℃에서 18시간 동안 배양하였다. 유산균 배양액을 2000×g에서 20분간 원심분리하여 상등액은 버리고 펠렛에 증류수로 현탁하여 다시 동일 조건으로 원심분리 하였다. 상등액은 버리고 펠렛에 증류수 20 mL를 첨가하고 라이소자임을 1 mg/mL 되게 첨가한 후 37℃에서 1시간 배양하였다. 이 균체액을 초음파분쇄기(Sonics, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 이를 조효소액으로 하여 무균적으로 100 mM 인산염 버퍼(pH 7.0)을 1.4 mL 넣고 조효소액 500 μL와 20 mM ONPG 스톡 솔루션을 100 μL 첨가하여 30℃에서 10분간 반응시킨 다음 0.2 M Na2CO3 200 μL를 처리하여 효소반응을 정지 후 분광광도계를 이용하여 405 nm로 흡광도를 측정하였다.
The lactic acid bacteria were inoculated in 10 mL of MRS liquid medium and incubated for 18 hours at 30 ° C., and then inoculated in 100 mL of liquid powder whey medium and incubated at 30 ° C. for 18 hours. The lactic acid bacteria culture medium was centrifuged at 2000 × g for 20 minutes, the supernatant was discarded, suspended in pellets with distilled water, and centrifuged again under the same conditions. The supernatant was discarded and 20 mL of distilled water was added to the pellet, lysozyme was added to 1 mg / mL, and then incubated at 37 ° C for 1 hour. The cell solution was disrupted using an ultrasonic mill (Sonics, USA). As a crude enzyme solution, aseptically, 1.4 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) was added, 500 μL of coenzyme solution and 100 μL of 20 mM ONPG stock solution were added, and reacted at 30 ° C. for 10 minutes, followed by 0.2 M Na 2 CO 3 After 200 μL of treatment, the enzyme reaction was stopped, and the absorbance was measured at 405 nm using a spectrophotometer.
락타아제 활성에 대한 온도의 영향Effect of temperature on lactase activity
pH 7.0의 100 mM 인산염 버퍼를 유산균 유래 조효소액과 혼합하여 20, 25, 30, 35 및 40℃ 조건으로 ONPG를 10분간 반응을 하고, 0.2 M Na2CO3 용액 0.2 mL을 가하여 반응을 중지시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
100 mM phosphate buffer of pH 7.0 was mixed with the co-enzyme solution derived from lactic acid bacteria to react ONPG for 10 minutes at 20, 25, 30, 35 and 40 ° C, and 0.2 mL of 0.2 M Na 2 CO 3 solution was added to stop the reaction. Absorbance was measured at 405 nm.
락타아제 활성에 대한 For lactase activity pHpH 의 영향Influence of
100 mM 인산염 버퍼의 pH를 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5으로 조정하고 유산균 유래 조효소액과 혼합하여 ONPG를 10분간 반응을 하였고, 0.2 M Na2CO3 용액 0.2 mL을 가하여 반응을 중지시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
The pH of the 100 mM phosphate buffer was adjusted to 6.0, 6.5, 7.0 and 7.5, and mixed with the lactic acid bacteria-derived coenzyme solution to react the ONPG for 10 minutes, and 0.2 mL of 0.2 M Na 2 CO 3 solution was added to stop the reaction at 405 nm. Absorbance was measured.
조효소액의Coenzyme 단백질 정량 Protein quantification
유산균 유래의 조효소액 농도는 Bradford 방법(1976)에 의하여 Bio-Rad protein assay kit(Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다. 단백질 표준용액으로는 소 혈청 알부민(Bio-Rad)를 사용하였으며 분광광도계를 이용하여 595 nm로 흡광도를 측정하였다(도 3).
The coenzyme concentration derived from lactic acid bacteria was measured using a Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad) by Bradford method (1976). Bovine serum albumin (Bio-Rad) was used as a protein standard solution and the absorbance was measured at 595 nm using a spectrophotometer (FIG. 3).
TLCTLC 를 이용한 Using 갈락토올리고당Galactooligosaccharide 확인 Confirm
최종 선별한 L. paracasei FBT314에서 유래한 락타아제에서 갈락토올리고당을 생산하는 최적 온도를 확인하기 위하여 Itoh 등(1982)의 방법을 변형하여 실험을 실시하였다. 갈락토올리고당 생산용 유청배지를 유청분말 10, 20 및 30%로 하여 각각 15 mL씩 제조하고 조효소액(206 U/protein mg)을 1, 3 및 5 mL씩 각각 첨가하여 20, 30 및 40℃에서 2, 4, 6 및 8시간 동안 배양하여 갈락토올리고당 생산 유무를 TLC(Merck, 독일)로 확인하였다. 전개용매는 이소프로판올-물(4:1)로 하였고 발색시약으로는 아닐린을 아세톤에 1% 녹인 용액과 다이페닐아민을 아세톤에 1% 녹인 용액을 5 mL씩 혼합하고 85% H3PO4를 1 mL 가하여 사용하였다.
In order to determine the optimal temperature for producing galactooligosaccharides from the lactase derived from the final screened L. paracasei FBT314, it was experimented by modifying the method of Itoh et al. (1982). 15 mL of whey powder for galactooligosaccharide production was prepared using 10, 20 and 30% of whey powder, and crude enzyme solution (206 U / protein mg) was added at 1, 3 and 5 mL, respectively, at 20, 30 and 40 ° C. Incubated for 2, 4, 6 and 8 hours in the presence of galactoligosaccharide production was confirmed by TLC (Merck, Germany). The developing solvent was isopropanol-water (4: 1). As a color developing reagent, 5 mL of 1% of aniline dissolved in acetone and 1% of diphenylamine in acetone were mixed, and 85% H 3 PO 4 was added. mL was added and used.
갈락토올리고당의Galactooligosaccharide 확인 및 정량 Identification and Quantification
갈락토올리고당을 정량하기 위하여 시료 15 mL에 활성탄소를 일정량 넣어 끓이고, 필터 페이퍼(Whatman)를 사용하여 한번 여과한 후 주사기로 옮기고 0.45 μm 시린지 필터(Advantec, 일본)로 여과하여 튜브에 담아 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Waters, 미국)를 사용하여 분석하였으며, 분석조건은 표 5와 같다.
To quantify galactooligosaccharides, add a certain amount of activated carbon to 15 mL of sample, boil, filter once using filter paper (Whatman), transfer to syringe, filter with 0.45 μm syringe filter (Advantec, Japan), and put into tube Analysis was performed using chromatography (HPLC, Waters, USA), and the analysis conditions are shown in Table 5.
락타아제 Lactase 조효소액의Coenzyme 고정화 Immobilization
Jang 등(1990)의 방법을 약간 변형하여 고정화용 담체의 최적조건을 확인하기 위하여 알긴산소다(sodium alginate, Yakuri, 일본)를 실험에 사용하였다(표 6). 알긴산소다를 1, 1.5, 2% 농도로 하여 제조한 코팅물질의 점도를 측정하여 최적 조합을 결정하였다. 주사기를 사용하여 조효소액을 2% CaCl2 용액에 1방울씩 적하하여 효소를 고정화하였다. 고정화하는 방법은 도 4와 같다. 조제된 비드(bead)는 100 mM 인산염 버퍼(pH 7.0)로 수회 세척한 후 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
Sodium alginate (sodium alginate, Yakuri, Japan) was used in the experiment to confirm the optimum condition of the carrier for immobilization by slightly modifying the method of Jang et al. (1990) (Table 6). The optimum combination was determined by measuring the viscosity of the coating material prepared with sodium alginate at a concentration of 1, 1.5, or 2%. The enzyme was immobilized by dropping the crude enzyme solution into 2% CaCl 2 solution by using a syringe. The method of immobilization is shown in FIG. The prepared beads were washed several times with 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) and then used in the experiment while storing at 4 ° C.
실험 결과Experiment result
유청배지Whey badge 중 락토스 농도와 유산균의 생육 Medium Lactose Concentration and Growth of Lactic Acid Bacteria
유청배지의 유당의 함량에 따른 유산균의 생육을 알아보기 위하여 통상적으로 유청분말에는 유당 함량이 70% 함유된 것으로 알려져 있다. 유청분말을 10, 15% 첨가된 배지를 제조하여 유산균 배지인 MRS에 유산균을 접종하여 60시간까지 배양하면서 흡광도를 비교 측정한 결과는 도 5와 같다. 또한 흡광도를 측정하는 시간마다 균을 일정량 취하여 MRS 고체배지에 도말하여 30℃에서 60시간 배양하여 콜로니를 계수한 결과는 도 6와 같다. 유산균 배양용 유청배지의 유당함량을 조절한 결과 유산균 배지인 MRS와 유청분말 10% 배지와 거의 비슷한 경향을 보이고, 유청분말 15%의 배지는 균의 생장이 다른 두 배지보다는 떨어지는 것을 알 수 있었다. 이는 유당의 농도가 높아지게 되면 유산균에 존재하는 락타아제의 활성이 락토스를 글루코스(glucose)와 갈락토오스(galactose)로 분해하는 활성보다 갈락토오스를 다른 락토스에 결합시키는 활성이 일어나기 때문인 것으로 생각된다.
In order to determine the growth of lactobacillus according to the lactose content of whey medium, whey powder is known to contain 70% lactose content. 10, 15% of whey powder was prepared to inoculate the lactic acid bacteria in the lactic acid bacteria medium MRS, and cultured for up to 60 hours. In addition, by taking a certain amount of bacteria every time to measure the absorbance and smeared in MRS solid medium and incubated at 30 ℃ for 60 hours to count the colonies are shown in FIG. As a result of controlling the lactose content of the lactobacillus cultured whey medium, the lactobacillus medium showed a similar tendency to the MRS and
유기 질소원이 유산균의 생육에 미치는 영향Effect of Organic Nitrogen Sources on the Growth of Lactic Acid Bacteria
유청배지 내 질소원 종류에 따른 유산균의 생육을 알아보기 위하여 분말유청배지를 기본 배지로 하여 질소원으로 효모추출물, 소이톤, 쇠고기 추출물 및 맥아 추출물을 1%씩 각각 첨가하고 유산균을 접종하여 60시간 동안 배양하면서 12시간 단위로 시료를 취하여 흡광도를 측정하였다. 도 7과 같이 4가지의 질소원에 따른 유산균의 생육의 변화는 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. 분말유청배지에 결핍된 유기질소원으로 가장 대표적인 효모 추출물을 사용하는 것으로 결정하였으며, 효모 추출물의 양을 0%, 0.5%, 1%, 1.5% 및 2%로 하여 유산균의 생장을 60시간까지 측정하였는데, 도 8에서 보면 질소원을 첨가하지 않은 시료에 비해 질소원을 첨가한 시료에서 유산균의 생육이 우수한 것을 알 수 있었다. 6시간까지 모든 시료에서 거의 동일한 균의 생육을 보이는 것은 질소원을 첨가하지 않은 시료는 분말유청에 존재하는 단백질을 통하여 균의 생육을 하고 6시간 이후에는 분말유청에 존재하는 질소원의 소모로 인하여 균의 생육이 저하되는 것으로 판단하였으며, 가격대비 유산균의 생육을 고려하였을 때 질소원은 1% 정도 첨가하는 것이 가장 우수할 것으로 판단하고 차후 실험에서도 질소원으로는 효모 추출물을 1% 첨가하여 유산균 배양용 유청배지를 제조하였다.
In order to examine the growth of lactic acid bacteria according to the type of nitrogen source in whey medium, 1% of yeast extract, soyton, beef extract and malt extract were added as a nitrogen source as a basic medium and inoculated with lactic acid bacteria and incubated for 60 hours. While taking samples in units of 12 hours, absorbance was measured. As shown in FIG. 7, there was almost no difference in the growth of lactic acid bacteria according to four nitrogen sources. It was decided to use the most representative yeast extract as an organic nitrogen source deficient in whey medium, and the growth of lactic acid bacteria was measured up to 60 hours with the amount of
최적 유산균의 선별을 위해 유산균의 락타아제 유무 확인Confirmation of Lactase in Lactobacillus for the Selection of Optimal Lactobacillus
본 발명자들이 분리한 총 12주의 공시 유산균의 락타아제 활성을 알아보기 위하여 ONPG disc를 통하여 침전균체 및 상등액(supernatant) 두 가지의 조건으로 확인한 결과는 표 7-8 및 도 9과 같다. 침전균체에서 락타아제의 효소활성을 확인하였으나 상등액에서는 락타아제 활성을 확인할 수 없었다. 이는 유산균 유래의 락타아제는 세포 외부로 배출하는 것이 아니고 세포내에 존재하는 것임을 알 수 있었다. Nguyen 등(2007)에 의하면 L. acidophilus 락타아제는 세포 내에 존재한다고 판단하여 프렌치 프레스(Aminco, Maryland)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 또한 실험에 사용한 총 12종의 유산균주 대부분에서 효소활성을 확인할 수 있었으나 김치유산균인 Leuconostoc mesenteriodes KCCM11324 및 Weissella kimchii KCCM41287에서는 락타아제 효소활성을 확인할 수 없었다. 이는 김치에 존재하는 유산균은 대부분 식물에 존재하던 유산균이기 때문에 락토오스를 분해하거나 락토오스로부터 갈락토올리고당을 생산하는 기능이 존재하지 않는 것으로 판단하였다.
In order to determine the lactase activity of the lactic acid bacteria of the total 12 weeks isolated by the present inventors, the results confirmed by two conditions of precipitated cells and supernatants through ONPG disc are shown in Tables 7-8 and 9. The enzyme activity of lactase was confirmed in the precipitated cells, but the lactase activity was not confirmed in the supernatant. This suggests that lactase derived from lactic acid bacteria is present in cells rather than excreted outside of cells. Nguyen et al. (2007) determined that L. acidophilus lactase was present in the cells and disrupted the cells using a French press (Aminco, Maryland). You can also check the enzymatic activity of lactic acid bacteria in a week, most of the total 12 kinds of kimchi lactic acid bacteria used in the experiment but a Leuconostoc mesenteriodes KCCM11324 and Weissella kimchii Lactase enzyme activity could not be confirmed in KCCM41287. It was determined that lactic acid bacteria present in kimchi are mostly lactic acid bacteria that existed in plants, so that there is no function of decomposing lactose or producing galactoligosaccharide from lactose.
+, positive; -, negative
+, positive; -, negative
+, positive; -, negative
+, positive; -, negative
GOSGOS 생산용 유산균 락타아제 선별 Selection of Lactobacillus Lactase for Production
ONPG를 이용하여 락타아제 효소활성을 측정한 결과를 바탕으로 현재 국내에서 상업적으로 제조되는 요구르트의 스타터로 널리 이용되고 있는 프로바이오틱스 유산균주 4종을 선별하여 실험을 진행하였다. 4종의 공시 유산균의 락타아제 효소활성을 측정한 결과는 표 9와 같다. 유산균주의 효소활성은 102-1,053 Unit정도로 측정되었으며, L. paracasei FBT314 유래의 락타아제의 효소활성이 가장 높은 것으로 나타났다. 이 락타아제 조효소액의 단백질 함량은 5.1 mg/mL로 측정되어 L. paracasei FBT314 유래 락타아제의 비활성은 206 U/protein, mg으로 계산하였다. Nguyen 등(2006, 2007)에 의하면 L. acidophilus와 L. reuteri 유래의 락타아제의 비활성은 230, 180 U/mg으로 본 발명에서 사용한 L. paracasei 유래 락타아제와 큰 차이를 보이지 않았다.
Based on the results of measuring the lactase enzyme activity using ONPG, four probiotic lactic acid strains, which are widely used as starters of commercial yogurt, are currently selected. The results of measuring the lactase enzyme activity of the four test lactic acid bacteria are shown in Table 9. The enzyme activity of lactic acid bacteria was measured at 102-1,053 Units, and the enzyme activity of L. paracasei FBT314-derived lactase was the highest. The protein content of this lactase coenzyme solution was measured to be 5.1 mg / mL, and the inactivation of L. paracasei FBT314-derived lactase was calculated to be 206 U / protein, mg. Nguyen et al. (2006, 2007) according to L. acidophilus and L. reuteri in the lactase activity of the resulting 230, 180 L. paracasei used in the present invention as U / mg for There was no significant difference from the derived lactase.
* 효소 1 U는 반응시간 분당 ONPG로부터 생성되는 o-Nitrophenol 의 μmole 수로 정의하였다.
* Enzyme 1 U was defined as the μmole number of o-Nitrophenol produced from ONPG per minute of reaction time.
L. L. paracaseiparacasei FBT314FBT314 락타아제 활성에 대한 For lactase activity pHpH 의 영향Influence of
L. paracasei FBT314가 생산하는 락타아제 활성에 대한 pH의 영향을 알아보기 위하여 버퍼를 pH 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5으로 제조하였고, 동일한 방법으로 ONPG 테스트를 실시한 결과는 표 10과 같다. 그 결과, L. paracasei FBT314 유래의 락타아제의 효소활성은 pH 6.5-7.0 정도에서 가장 높은 값을 나타냈으며, 이는 L. paracasei FBT314가 생산하는 락타아제는 중성 pH에서 효소의 활성이 높은 것을 알 수 있었다. Hung 등(1994)은 Bifidobacterium infantis 유래 락타아제의 최적 pH는 6.5으로 보고하였다. Hinz 등(2004)은 B. adolescentis 유래 락타아제의 최적 pH를 6.0으로 보고하였고, Nguyen 등(2007)은 L. acidophilus 유래 락타아제의 최적 pH는 6.5-8.0로 보고하였다.
L. paracasei To determine the effect of pH on lactase activity produced by FBT314, buffers were prepared at pH 6.0, 6.5, 7.0, and 7.5. The results of the ONPG test in the same manner are shown in Table 10. As a result, L. paracasei The enzyme activity of FBT314-derived lactase was the highest at pH 6.5-7.0, indicating that L. paracasei FBT314 produced high enzyme activity at neutral pH. Hung et al. (1994) Bifidobacterium The optimal pH of infantis derived lactase was reported at 6.5. Hinz et al. (2004) reported an optimal pH of B. adolescentis- derived lactase at 6.0, and Nguyen et al. (2007) reported an optimal pH of L. acidophilus- derived lactase at 6.5-8.0.
* 효소 1 U는 반응시간 분당 ONPG로부터 생성되는 o-Nitrophenol 의 μmole 수로 정의하였다.
* Enzyme 1 U was defined as the μmole number of o-Nitrophenol produced from ONPG per minute of reaction time.
L. L. paracaseiparacasei FBT314FBT314 락타아제 활성에 대한 온도의 영향 Effect of temperature on lactase activity
L. paracasei FBT314가 생산하는 락타아제 활성에 대한 온도의 영향을 알아보기 위하여 20, 25, 30, 35 및 40℃조건으로 ONPG 테스트를 실시한 결과는 표 11과 같다. L. paracasei FBT314 유래의 락타아제의 최적 온도는 30℃로 나타났다. 이는 L. paracasei FBT314가 중온성균이므로 이 유산균 유래 락타아제 또한 30℃ 정도에서 높은 효소활성을 가지게 된 것이라고 판단하였다.
L. paracasei In order to determine the effect of temperature on the lactase activity produced by FBT314, the results of the ONPG test under the conditions of 20, 25, 30, 35 and 40 ℃ are shown in Table 11. L. paracasei The optimum temperature for lactase from FBT314 was found to be 30 ° C. This is L. paracasei Since FBT314 is a mesophilic bacterium, it was determined that the lactic acid bacteria-derived lactase also had high enzymatic activity at about 30 ° C.
* 효소 1 U는 반응시간 분당 ONPG로부터 생성되는 o-Nitrophenol 의 μmole 수로 정의하였다.
* Enzyme 1 U was defined as the μmole number of o-Nitrophenol produced from ONPG per minute of reaction time.
갈락토올리고당Galactooligosaccharide 생산에 있어 In production 유청분말Whey powder 농도의 영향 Effect of Concentration
락토스로부터 락타아제가 갈락토올리고당을 생산하는 조건을 확인하기 위하여 유청분말의 농도를 20, 25, 30, 35 및 40%로 하여 갈락토올리고당 생산용 분말유청배지를 만들고 L. paracasei FBT314 유래 락타아제를 첨가하여 갈락토올리고당의 생산을 정량적으로 측정한 결과는 도 10와 같다. 갈락토올리고당의 생산은 30%까지 급격히 증가하다 30% 이후에는 완만하게 증가하는 것을 알 수 있었다. 이를 통하여 분말유청의 농도는 30%가 최적조건이라고 판단하였다.
To determine the conditions under which lactase produces galactoligosaccharides from lactose, whey powder concentrations of 20, 25, 30, 35 and 40% were used to make powdered whey media for galactooligosaccharide production. L. paracasei Quantitatively measuring the production of galactooligosaccharides by the addition of FBT314-derived lactase is shown in FIG. The production of galactooligosaccharides increased sharply to 30% and gradually increased after 30%. Through this, 30% of the whey concentration was determined to be optimal.
갈락토올리고당Galactooligosaccharide 생산에 있어 온도의 영향 Effect of temperature on production
L. paracasei FBT314 유래 락타아제의 최적 갈락토올리고당 생산 온도를 확인하기 위하여 20, 30, 40, 50 및 60℃ 조건으로 실험한 결과는 도 11과 같다. 갈락토올리고당 생산은 30℃ 이후부터 점차 감소하는 것을 알 수 있었는데 ONPG 테스트를 통한 락타아제 효소활성을 측정한 결과와 마찬가지로 30℃가 L. paracasei FBT314 유래 락타아제의 최적 온도임을 알 수 있었다.
In order to confirm the optimum galactooligosaccharide production temperature of L. paracasei FBT314-derived lactase, the results of experiments at 20, 30, 40, 50 and 60 ° C are shown in FIG. 11. Galactooligosaccharide production decreased gradually after 30 ℃, and L. paracasei was found at 30 ℃ as measured by lactase enzyme activity through ONPG test. It was found that the optimal temperature of the FBT314-derived lactase.
갈락토올리고당Galactooligosaccharide 생산에 있어 반응 시간의 영향 Influence of reaction time on production
시간에 따른 갈락토올리고당 생산 수율을 확인하기 위하여 0, 2, 4, 6 및 8시간까지 측정한 결과는 도 12과 같다. 시간이 증가함에 따라 갈락토올리고당 생산 수율도 증가하는 것을 알 수 있었다. L. paracasei FBT314 유래 락타아제는 분말유청배지로부터 갈락토올리고당을 생산하기 위해서는 4시간 이상 배양하는 것이 좋으나 4시간 이후에는 증가폭이 크지 않은 것을 알 수 있었다. 이를 통하여 경제적인 측면에서 4시간을 최적조건으로 하였다.
In order to confirm the production yield of galactooligosaccharides over time, the results measured up to 0, 2, 4, 6 and 8 hours are shown in FIG. 12. As time increased, the yield of galactooligosaccharide was also increased. L. paracasei FBT314-derived lactase was recommended to be cultured for more than 4 hours to produce galactooligosaccharides from powder whey media, but the increase was not significant after 4 hours. Through this, the economic condition was 4 hours as the optimum condition.
L. L. paracaseiparacasei FBT314FBT314 락타아제를 이용한 With lactase 갈락토올리고당의Galactooligosaccharide 생산 및 정량 Production and quantification
30% 분말유청배지를 제조한 후 L. paracasei FBT314 유래 락타아제를 첨가하고 30℃에서 4시간 동안 배양한 배양 산물을 시료로 사용하였다. 시료의 갈락토올리고당의 유무를 TLC를 통하여 확인하였다(도 13). 대조구로는 글루코오스, 갈락토오스, 락토오스, 시판 갈락토올리고당을 사용하였다. 도 13에 5-8는 시료를 희석하여 스팟팅(spotting)한 결과이다. 발색시킨 결과 7-8에서 글루코오스, 갈락토오스 및 락토오스의 반점이 존재하고 락토오스 반점 아래 여러 개의 반점이 존재하는데 이를 갈락토올리고당이라 추정하는 반점이다. 갈락토올리고당은 한 가지의 물질이 아니고 3 mer-5 mer의 물질을 포괄하기 때문에 반점이 이처럼 여러 개가 존재한 것이라고 판단하였다. 생성된 갈락토올리고당을 정량적으로 분석하기 위하여 HPLC를 사용하였다(도 14). 30%의 분말유청배지의 70%가 유당인데 이 유당이 락타아제에 의해 우선적으로 분해되면서 글루코오스와 갈락토오스가 되고, 이 중 갈락토오스는 락타아제에 의해 분해되지 않은 다른 락토스 분자에 결합을 시키는 당전이에 의해 갈락토올리고당이 생성된다. 그러므로 도 14에서 글루코스의 양은 앞의 갈락토오스의 양보다 많은 것을 볼 수 있었다. 또한 갈락토올리고당의 피크를 확인할 수 있었다. 30% 분말유청배지에서 L. paracasei FBT314 유래의 락타아제를 처리하여 최고 19.41%정도의 갈락토올리고당이 생산되었다(표 12).
After preparing 30% whey medium, L. paracasei FBT314-derived lactase was added and the culture product cultured at 30 ° C. for 4 hours was used as a sample. The presence or absence of galactoligosaccharide in the sample was confirmed by TLC (FIG. 13). As a control, glucose, galactose, lactose and commercial galactoligosaccharides were used. 5-8 in Fig. 13 shows the results of spotting the diluted samples. As a result of the development, there are spots of glucose, galactose and lactose in 7-8 and several spots below the lactose spot, which are presumed to be galactoligosaccharides. Since galactooligosaccharides are not one substance but
총 갈락토올리고당 = 갈락토올리고당-이당류 + 갈락토올리고당-삼당류 +4’-갈락토실 락토스+6’-갈락토실 락토스+갈락토올리고당-사당류<
Total galactoligosaccharide = Galactooligosaccharide-disaccharide + Galactooligosaccharide-trisaccharide + 4'-galactosyl lactose + 6'-galactosyl lactose + galactoligosaccharide-sugars <
효소의 고정화를 위해 코팅물질의 점도 측정Viscosity Measurement of Coating Materials for Enzyme Immobilization
1, 1.5 및 2%의 알긴산소다(Yakuri, 일본)와 1% 알긴산소다에 1, 3 및 5% 변성전분(modified starch)을 혼합하여 제조한 코팅물질의 점도를 측정한 결과는 표 13과 같다. 알긴산소다 농도가 높아질수록 점도는 증가하는 것을 알 수 있었다. 고정화 효소의 효소활성을 측정한 결과는 표 14와 같다. 고정화 물질의 점도가 낮을 경우 고정화가 잘 이루어지지 않았고, 고정화 물질의 점도가 높을 경우에는 효소의 활성이 낮게 나타나는 것을 알 수 있었다. L. paracasei FBT314 유래의 락타아제를 알긴산소다로 고정화할 경우 그 농도는 1.5%가 가장 적절한 것으로 판단하였다. The viscosity of the coating material prepared by mixing 1, 1.5 and 2% sodium alginate (Yakuri, Japan) and 1% sodium alginate in 1, 3 and 5% modified starch is shown in Table 13. . It was found that the viscosity increased as the concentration of sodium alginate increased. The results of measuring the enzyme activity of the immobilized enzyme are shown in Table 14. When the viscosity of the immobilized material was low, the immobilization was not well achieved, and when the viscosity of the immobilized material was high, the activity of the enzyme was found to be low. When the lactase derived from L. paracasei FBT314 was immobilized with sodium alginate, the concentration was determined to be 1.5%.
고정화 효소로 생산한 Produced with Immobilized Enzyme 갈락토올리고당의Galactooligosaccharide HPLCHPLC 정량분석 Quantitative analysis
도 15 및 표 15는 고정화 효소로 생산한 갈락토올리고당을 HPLC를 이용하여 정량 분석한 결과이다. 도 15에서 보면 갈락토올리고당의 피크를 확인할 수 있었고 표 15에서는 L. paracasei FBT314 유래의 조효소액을 고정화한 효소를 이용하여 갈락토올리고당을 생산하였을 때 최고 15.4%정도의 수율을 확인할 수 있었다. 고정화하지 않은 조효소액과는 최고 수율에서 큰 차이를 보였으나 평균적으로는 크게 차이가 나지 않았다.
15 and Table 15 show the results of quantitative analysis of the galactoligosaccharides produced by the immobilized enzyme using HPLC. Referring to FIG. 15, the peak of galactooligosaccharide could be confirmed, and in Table 15, a yield of about 15.4% was obtained when galactooligosaccharide was produced by using an enzyme immobilized with a crude enzyme solution derived from L. paracasei FBT314. There was a big difference in the highest yield from the crude enzyme solution without immobilization, but there was no significant difference on average.
총 갈락토올리고당 = 갈락토올리고당-2당류 + 갈락토올리고당-3당류 +4’-갈락토실 락토오스+6’-갈락토실 락토오스+갈락토올리고당-4당류<
Total galactoligosaccharide = Galactooligosaccharide-2 saccharide + Galactooligosaccharide-3 saccharide + 4'-galactosyl lactose + 6'-galactosyl lactose + galactoligosaccharide 4-saccharide <
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (13)
(b) 상기 유산균을 20 내지 40 중량%의 유청분말을 포함하는 갈락토올리고당 생산용 유청배지에 적용하여 갈락토올리고당을 생산하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법.
(a) culturing the lactic acid bacteria in a whey culture medium for lactic acid bacteria comprising 10 to 15 wt% whey powder and 0.5 to 2 wt% organic nitrogen source; And
(B) a method for producing galactooligosaccharide comprising the step of producing the galactooligosaccharide by applying the lactic acid bacteria to the whey medium for galactooligosaccharide production containing 20 to 40% by weight whey powder.
단계 (a) 및 (b) 사이에 상기 유산균으로부터 유산균 조효소액을 제조하는 단계를 추가적으로 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법.
The method of claim 1,
A method for producing galactooligosaccharide further comprising the step of preparing a lactic acid bacteria coenzyme solution from the lactic acid bacteria between steps (a) and (b).
상기 유산균 배양용 유청배지 중에 함유되는 유기질소원이 효모 추출물(yeast extract)인 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
The method of claim 1,
The method for producing galactooligosaccharide, characterized in that the organic nitrogen source contained in the whey culture medium for lactic acid bacteria is a yeast extract.
상기 유산균은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 콘푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플라타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 및 루코노스톡 메센테리오데스(Leuconostoc mesenteriodes)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
The method of claim 1,
The lactobacillus is Lactobacillus paracasei paracasei ), Lactobacillus rhamnosus ), Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis), Lactobacillus konpu Versus (Lactobacillus confusus ), Lactobacillus reuteri ), Lactobacillus delbrueckii ), Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus platarum plantarum ), Lactococcus lactis ), Lactobacillus helveticus ) and Leuconostoc mesenteriodes ( Leuconostoc mesenteriodes ) is a method for producing galactooligosaccharides, characterized in that selected from the group consisting of.
상기 유산균은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)인 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
The method of claim 1,
The lactic acid bacteria is Lactobacillus paracasei ( Lactobacillus paracasei ) method for producing a galactooligosaccharide, characterized in that.
상기 갈락토올리고당 생산은 25℃ 내지 35℃의 온도 조건에서 실시하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
The method of claim 1,
The galactooligosaccharide production method is characterized in that the galactooligosaccharide is carried out at a temperature condition of 25 ℃ to 35 ℃.
상기 갈락토올리고당 생산은 pH 6.5 내지 7.0 조건에서 실시하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
The method of claim 1,
The galactooligosaccharide production method according to claim characterized in that carried out at pH 6.5 to 7.0 conditions.
상기 유산균 조효소액은 락타아제(lactase)를 포함하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
3. The method of claim 2,
The lactic acid bacteria coenzyme solution is a method for producing galactoligosaccharides, characterized in that it comprises a lactase (lactase).
상기 유산균 조효소액은 고정화(immobilization) 되어 있는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
3. The method of claim 2,
The lactic acid bacteria coenzyme solution is a method for producing galactoligosaccharides, characterized in that the immobilization (immobilization).
상기 고정화 시 고정화효소로서 알긴산소다를 사용하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
10. The method of claim 9,
A method for producing galactoligosaccharide, characterized in that sodium alginate is used as an immobilizing enzyme during the immobilization.
상기 알긴산소다는 1 내지 2 중량%의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
11. The method of claim 10,
Sodium alginate is a method for producing galactoligosaccharides, characterized in that used in an amount of 1 to 2% by weight.
Galactooligosaccharide prepared by the method of any one of claims 1 to 11.
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