KR20140011311A

KR20140011311A - Ｐｉ３ｋ 억제제 및 ｍｅｋ 억제제를 포함하는 조성물 및 암을 치료하기 위한 이의 용도

Info

Publication number: KR20140011311A
Application number: KR1020137017879A
Authority: KR
Inventors: 로랑 드뷔슈; 카를로스 가르시아-에쉐베리아; ?궈 마; 스튜어트 맥밀란; 자넷 앤 모이러 오그던; 루아 벵상
Original assignee: 사노피; 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2014-01-28
Also published as: DOP2013000131A; WO2012078832A1; UY33790A; MA34815B1; MX2013006319A; AU2011338354A1; TW201306837A; NZ611581A; CN103402518A; ZA201303687B; PE20140702A1; US20140024653A1; SG190368A1; AR084216A1; RU2013131241A; BR112013014198A2; CR20130246A; CA2820748A1; JP2013544892A; CL2013001643A1

Abstract

본 발명은 유효량의 MEK 억제제 및 유효량의 PI3K 억제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. MEK 및 PI3K 억제제들이 병용된 조성물이 또한 기술된다.

Description

ＰＩ３Ｋ 억제제 및 ＭＥＫ 억제제를 포함하는 조성물 및 암을 치료하기 위한 이의 용도{COMPOSITIONS COMPRISING A PI3K INHIBITOR AND A MEK INHIBITOR AND THEIR USE FOR TREATING CANCER}

본 발명의 교차 참조

본 출원은 2010년 12월 9일에 출원된 미국 가출원 제61/421,465호 및 2011년 1월 26일에 출원된 미국 가출원 제61/436,258호 및 2011년 3월 25일에 출원된 미국 가출원 제61/467,485호의 우선권에 대한 이익을 주장하며, 상기 모든 출원들은 본 명세서에 참고로서 인용된다.

당해 기술 분야에서 암 치료에서 더욱 효과적인 방법 및 조성물이 요구되고 있다. 본 출원은, 일반적으로 암 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이며, 보다 특히 미토겐 활성화 단백질 키나제(mitogen activated protein kinase; MEK) 및/또는 포스포이노시티드 3-키나제(phosphoinositide 3-kinase; PI3K) 경로의 억제제들을 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

MEK 키나제의 억제제로 치료되는 종양 세포는 전형적으로 ERK 인산화의 억제, 사이클린 D의 하향-조절, G1 정지(arrest)의 유도 및 최종적으로 겪는 아폽토시스를 통해 반응한다. 약리학적으로, MEK 억제는 전적으로 BRaf 이종이식(xenograft) 종양에서의 종양 성장을 폐지시키는 반면, Ras 돌연변이 암은 대부분의 경우 부분 억제만을 나타낸다[참조: D. B. Solit et al., Nature 2006; 439: 358-362]. 따라서, MEK는 암 치료제 개발에서 지대한 관심의 대상이 되어왔다.

N-((S)-2,3-디하이드록시프로필)-3-(2-플루오로-4-요오도-페닐아미노)이소니코틴아미드(MSC1936369 또는 AS703026으로도 지칭됨)는 MEK의 신규 알로스테릭(allosteric) 억제제이다. 이는 비교적 높은 효력과 선택도를 가지며, 10 μM에서 시험시 217개의 키나제 또는 90개의 비-키나제 표적에 대해서 활성을 나타내지 않는다. AS703026의 생체내 PK 프로파일은 마우스와 랫트에서 허용가능하고, 비교적 높은 경구 생체이용율(52 내지 57%), 중간 또는 높은 청소율(0.9 내지 2.6 L/h/kg) 및 중간 또는 긴 반감기(2.2 내지 4.7 h)를 갖는다. 이 화합물은 마우스에서 비교적 내약성이 우수하고, 60mg/kg BID의 2주 최대 허용 용량을 나타낸다.

N-(3-{[(3-{[2-클로로-5-(메톡시)페닐]아미도}퀴녹살린-2-일)아미노]설포닐}페닐)-2-메틸알라닌아미드(XL147 또는 SAR245408로도 공지되어 있음) 및 2-아미노-8-에틸-4-메틸-6-(1H-피라졸-5-일)피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(XL765 또는 SAR245409로도 공지되어 있음)은 클래스 I PI3K 지질 키나제의 선택적 억제제이다. XL147은 다운스트림 이펙터 Akt 및 S6 리보솜 단백질(S6RP)의 인산화를 억제하며, 오직 PI3K 이소형(isoform)만을 표적화한다(억제제 농도, 즉 IC₅₀ 값(나노몰(nM)): PI3Kα39, PI3Kβ383, PI3Kδ36, PI3Kγ23). XL765는 PI3K 이소형(IC₅₀ 값들(단위 nM): PI3Kα39, PI3Kβ113, PI3Kδ43, PI3Kγ9) 및 mTOR(157 nM)를 모두 표적화한다.

XL147 또는 XL765 단독의 경구 투여는, PTEN-결핍 PC-3 전립선 선암종(adenocarcinoma), U87-MG 교모세포종(glioblastoma), A2058 흑색종(melanoma) 및 WM-266-4 흑색종, 또는 PIK3CA 변종 MCF7 유암종(mammary carcinoma)과 같은 PI3K 시그널링이 활성화되어 있는 이종이식을 갖는 마우스에서 종양 성장을 억제한다. XL147은 현재 고형 종양 및/또는 림프종 환자에 대해 수개의 I상 임상 시험 및 자궁내막 또는 호르몬 수용체-양성 유방암 환자에 대해 II상 임상 시험이 진행되고 있다. XL765은 현재 고형 종양, 림프종 또는 교모세포종 환자에 대한 I상 임상 시험 및 호르몬 수용체-양성 유방암 환자에 대해 I/II상 임상 시험이 진행되고 있다.

그러나, 더욱 효과적으로 세포 증식과 종양 성장을 억제하면서도 환자 독성이 최소화된 암 요법이 여전히 요망된다. 특히 당업계에서 통상적으로 이용되는 MEK 또는 PI3K 억제제의 용량을 실질적으로 증가시키지 않고, 또는 심지어 그 용량을 유지하거나 감소시키면서도 MEK 또는 PI3K 억제제 요법을 더욱 효과적으로 만들 필요가 있다.

하나의 측면에서, 조성물 및 이의 다양한 암 치료에서의 용도가 제공된다.

특정한 양태에서, 하기 화학식 1의 화합물과 화학식 2a 및 2b로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 조성물이 제공된다.

화학식 1

(MSC1936369 또는 AS703026 또는 MSC6369)

화학식 2a

(XL147 또는 SAR245408)

화학식 2b

(XL765, SAR245409 또는 MSC0765)

다른 측면에서, 암 환자 치료 방법이 제공되고, 상기 방법은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 화학식 2a 또는 화학식 2b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 병용하여 치료학적 유효량으로 상기 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

하나의 양태에서, 암 환자를 치료하는 방법은 상기 환자에 제1 용량(first dosage)의 MEK 억제제 및 제2 용량의 PI3K 억제제를 투여하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 MEK 억제제는 하기 화학식 1을 가지며, 상기 PI3K 억제제는 화학식 2a 및 2b로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:

화학식 1

화학식 2a

화학식 2b

일부 양태에서, 상기 방법은 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 유방암, 췌장암, 간암, 전립선암(prostate cancer), 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 직장결장암(colorectal cancer), 간암, 근육암(muscle cancer), 혈액암(hematological malignancies), 흑색종(melanoma), 자궁내막암(endometrial cancer) 및 췌장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암 치료에 관련된다. 다른 양태에서, 암은 직장결장암, 자궁내막암, 혈액암, 갑상선암, 유방암, 흑색종, 췌장암 및 전립선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 양태에서, 본 명세서에 기술된 조성물 및 사용 방법은 환자에서 종양 용적을 상승적으로 감소시키는 양으로(즉, 조성물 또는 투여된 용량으로) 존재한다. 추가의 양태에서, 상승적 병용물은 종양 정체(tumor stasis) 또는 종양 퇴행(tumor regression)을 달성한다.

다른 측면에서, 암 치료에 사용하기 위한 병용물(combination)이 제공되며, 상기 병용물은 (A) 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 (B) 화학식 2a 또는 화학식 2b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 치료학적 유효량으로 포함한다.

하나의 양태에서, (A) 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 (B) 화학식 2a 또는 화학식 2b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 치료학적 유효량으로 포함하는 병용물을 암 치료에 사용하기 위한 약제를 제조하기 위해 제공한다.

다른 측면에서, (A) 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; (B) 화학식 2a 또는 화학식 2b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 (C) 사용 설명서(instructions for use)를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명에 따라 명백하게 될 것이다. 하기 상세한 설명 및 특정 실시예는 오직 설명을 위해 제공되고, 이러한 상세한 설명으로부터 본 발명의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 가능함은 당업자에 명백할 것이다. 또한, 실시예는 본 발명의 원리를 예시하며, 선행기술에서 당업자에게 명백히 유용한 모든 실시예로 본 발명의 적용을 구체적으로 나타낼 수 없음이 예상된다.

도 1은 사람 HCT 116을 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2b)(30mg/kg) 및 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(5mg/kg)의 항종양 활성 평가 동안 체중 변화를 나타낸 도표이다.
도 2는 사람 HCT 116을 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2b)(30mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(5mg/kg)의 항종양 활성을 나타낸 도표이다.
도 3은 사람 HCT 116을 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(5mg/kg)의 항종양 활성을 나타낸 도표이다. 박스는 치료학적 상승 작용(synergy)를 달성하는 병용물을 나타낸다.
도 4는 사람 HCT 116을 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2b)(20mg/kg) 및 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(10 및 20mg/kg)의 항종양 활성 평가 동안 체중 변화를 나타낸 도표이다.
도 5는 사람 HCT 116을 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2b)(20mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(10 및 20mg/kg)의 항종양 활성을 나타낸 도표이다.
도 6은 사람 HCT 116을 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(10mg/kg)의 항종양 활성을 나타낸 도표이다.
도 7은 사람 HCT 116을 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(10 및 20mg/kg)의 항종양 활성 평가 동안 체중 변화를 나타낸 도표이다.
도 8은 사람 HCT 116을 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(10 및 20mg/kg)의 항종양 활성을 나타낸 도표이다. 박스는 치료학적 상승 작용을 달성하는 병용물을 나타낸다.
도 9는 사람 HCT 116을 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2b)(20mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(10 및 20mg/kg)의 항종양 활성 평가 동안 체중 변화를 나타낸 도표이다.
도 10은 사람 HCT 116을 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2b)(20mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(10 및 20mg/kg)의 항종양 활성을 나타낸 도표이다.
도 11은 화합물 (1)(5mg/kg) 및 화합물 (2a)(50mg/kg) 단독으로 또는 병용물로 치료한 MiaPaCa-2 종양을 갖는 마우스의 체중 퍼센트를 나타낸 도표이다.
도 12는 화합물 (1)(5mg/kg) 및 화합물 (2b)(30mg/kg) 단독으로 또는 병용물로 치료한 MiaPaCa-2 종양을 갖는 마우스의 체중 퍼센트를 나타낸 도표이다.
도 13은 화합물 (1)(5mg/kg) 및 화합물 (2a)(50mg/kg) 단독으로 또는 병용물로 치료한 MiaPaCa-2 종양을 갖는 마우스의 평균 종양 용적을 나타낸 도표이다.
도 14는 화합물 (1)(5mg/kg) 및 화합물 (2b)(30mg/kg) 단독으로 또는 병용물로 치료한 MiaPaCa-2 종양을 갖는 마우스의 평균 종양 용적을 나타낸 도표이다.
도 15a, 15ba 및 15bb는 특정 치료학적 적용을 확인하는 다양한 종양 세포주에 대한 화합물(1)의 z-점수 값을 나타낸 차트를 도시한 것이다. 화합물(1)에 대한 특정 치료학적 적용의 선택. 각 세포주에 대한 개별 z-점수 값은 종양 기원(tumor origin)에 해당하는 하나의 그룹내에 도시하였다. 하나의 그룹내 모든 값에 대한 평균값을 녹색 세모로 나타내었으며, 이는 하나의 그룹내 화합물 (1) 활성에 대한 지시자로 작용할 수 있다. 개별적 z-점수에 대해, 0 이하의 z-점수는 강한 활성을 의미하며, 반면 z-점수>0는 저항성(resistance)에 가깝다.
도 16a, 16ba 및 16bb는 특정 치료학적 적용을 확인하는 다양한 종양 세포주에 대한 화합물(2b)의 z-점수 값을 나타낸 차트를 도시한 것이다. 화합물(2b)에 대한 특정 치료학적 적용의 선택. 각 세포주에 대한 개별 z-점수 값은 종양 기원에 해당하는 하나의 그룹내에 도시하였다. 하나의 그룹내 모든 값에 대한 평균값을 녹색 세모로 나타내었으며, 이는 하나의 그룹내 화합물 (2b) 활성에 대한 지시자로 작용할 수 있다. 개별적 z-점수에 대해, 0 이하의 z-점수는 강한 활성을 의미하며, 반면 z-점수>0는 저항성에 가깝다.
도 17a 및 도 17b는 다양한 종양 세포주에 대한 화합물 (2b)와 병용된 화합물(1)의 z-점수 값을 나타낸 차트를 도시한 것이다.
도 18a, 18b, 18c, 18d, 18e 및 18f는 CRC 종양 세포주에서 화합물 (2b)와 화합물(1)의 병용 결과를 보여주는 도표와 그래프이다(상승 플롯팅 및 돌연변이 분석).
도 19a 및 19b는 췌장 종양 세포주에서 화합물 (2b)와 화합물(1)의 병용 결과를 보여주는 도표와 그래프이다(상승 플롯팅 및 돌연변이 분석).
도 20a 및 20b는 NSCLC 종양 세포주에서 화합물 (2b)와 화합물(1)의 병용 결과를 보여주는 도표와 그래프이다(상승 플롯팅 및 돌연변이 분석).
도 21은 사람 원발성 결장 종양 CR-LRB-009C를 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2b)(20mg/kg) 및 화합물 (2a)(75mg/kg)와 병용된 화합물 (1)(20mg/kg)의 항종양 활성 평가 동안 체중 변화를 나타낸 도표이다.
도 22는 사람 원발성 결장 종양 CR-LRB-009C를 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2b)(20mg/kg) 및 화합물 (2a)(75mg/kg)와 병용된 화합물 (1)(20mg/kg)의 항종양 활성을 나타낸 도표이다.
도 23은 사람 원발성 결장 종양 CR-LRB-013P를 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2b)(20mg/kg) 및 화합물 (2a)(75mg/kg)와 병용된 화합물 (1)(20mg/kg)의 항종양 활성 평가 동안 체중 변화를 나타낸 도표이다.
도 24는 사람 원발성 결장 종양 CR-LRB-013P를 갖는 SCID 암컷 마우스에 대해 화합물 (2b)(20mg/kg) 및 화합물 (2a)(75mg/kg)와 병용된 화합물 (1)(20mg/kg)의 항종양 활성을 나타낸 도표이다.
도 25는 HCT116 이종이식에서 화합물 (2a) 또는 화합물 (2b)을 단독으로 또는 화합물 (1)과 병용하여 치료한 후 수행된 에반스 블루 종양 혈관외 유출의 Icyte 생체외 영상화 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 26a 및 26b는 HCT116 이종이식에서 요법 3일 후, 화합물 (1), 화합물 (2a) 또는 화합물 (2b)을 단독으로 또는 병용하여 치료한지 4시간 후, 아넥신V-750 투여 3시간 후, FMT 영상화 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 종양 형광은 형광체를 pmol 단위로 정량화하였으며 종양 용적으로 표준화하였다. 통계: 랭크된 데이터에 대한 2원 분산분석 후 뉴먼 쿨스 검증(Newman-Keuls after 2way Anova on Ranked data), NS: P<0.05.
도 27a 및 27b는 화합물 (1), 화합물 (2a) 또는 화합물 (2b)을 단독으로 또는 선택된 병용물로 치료한 후 종양 추출물에서 절단된 PARP 및 카스파제-3의 단백질 수준을 그래프로 나타낸 것이다. 통계: 1원 분산분석 후 하나의 인자에 대한 던네트 검증(Dunnett's test for one factor after one way Anova), NS: P<0.05.
도 28은 화합물 (1)(10mg/kg), 화합물 (2a)(50mg/kg) 또는 화합물 (2b)(20mg/kg) 단독으로 또는 병용하여 치료한 HCT 116 종양을 갖는 마우스의 종양 용적을 나타낸 도표이다. 아폽토시스를 정량화하기 위하여, 형광성 아넥신-비보(Annexin-Vivo)-750를 치료 시작 3일 및 7일 후에 일일 치료 1 시간 후 iv 주사하였다. 동물은 프로브 주사 3시간 후에 FMT로 영상화하였다.

하나의 측면에서, 암 환자의 치료 방법이 제공된다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 후술하는 바와 같이, 치료학적 유효량의 MEK 억제제 및 치료학적 유효량의 PI3K 억제제를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

하나의 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 하기 화학식 1을 갖는 MEK 억제제를 포함한다:

화학식 1

화학식 1에 따른 MEK 억제제는 본 명세서에서 "화합물 (1)"로 지칭되며 MSC1936369, AS703026 또는 MSC6369로도 알려져 있다. 화합물 (1)의 제조, 특성 및 MEK-억제 능력은, 예를 들면, 국제특허공보 WO 06/045514, 특히 실시예 115 및 표 1에 제공되어 있다. WO 06/045514의 모든 내용은 본 명세서에 참조로 인용된다. 화학식 1의 화합물의 중성 및 염 형태도 본 명세서에서 모두 고려된다.

다른 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 하기 화학식 2a 또는 2b 중 하나를 갖는 PI3K 억제제를 포함한다:

화학식 2a

화학식 2b

화학식 2a에 따른 PI3K 억제제는 본 명세서에서 "화합물 (2a)"로 지칭되며 XL147 또는 SAR245408로도 알려져 있다. 화학식 2b에 따른 PI3K 억제제는 "화합물 (2b)"로 지칭되며 XL765, SAR245409 또는 MSC0765로도 알려져 있다. 화합물 (2a)의 제조와 특성은 예를 들면, 국제특허공보 WO 07/044729, 특히 실시예 357에 개시되어 있다. WO 07/044729의 모든 내용은 본 명세서에 참조로 인용된다. 화합물 (2b)의 제조와 특성은 예를 들면, 국제특허공보 WO 07/044813, 특히 실시예 56에 개시되어 있다. WO 07/044813의 모든 내용은 본 명세서에 참조로 인용된다.

일부 양태에서, 전술한 화합물들은 비용매화된다. 다른 양태에서, 본 방법에 사용된 화합물 중 하나 또는 둘 다는 용매화된 형태이다. 당업계에 알려진 바와 같이, 용매화물은 물, 에탄올 등과 같은 임의의 약제학적으로 허용가능한 용매일 수 있다. 일반적으로, 용매화물의 존재 또는 부재는 전술한 MEK 또는 PI3K 억제제의 효능에 실질적인 영향을 미치지 않는다.

화학식 1, 화학식 2a 및 화학식 2b의 화합물은 중성 형태로 묘사되어 있으나, 일부 양태에서, 이들 화합물은 약제학적으로 허용되는 염 형태로 사용된다. 염은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수득될 수 있으며, 예를 들면, 본 명세서에 참고로 인용되는 WO 07/044729에 방법 및 염 형태가 상술되어 있다. 화합물의 "약제학적으로 허용되는 염"은 약제학적으로 허용가능하며 약리학적 활성을 보유하는 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염은 비-독성임이 이해된다. 적합한 약제학적으로 허용되는 염에 관한 추가적인 정보는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, 또는 S. M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts,"J. Pharm. Sci., 1977;66:1-19]에서 찾을 수 있으며, 이들 문헌은 모두 본 명세서에 참조로 인용된다.

약제학적으로 허용되는 산 부가염의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산과 같은 무기산으로 형성된 염 뿐만 아니라 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄포르설폰산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 무콘산, p-톨루엔설폰산 및 살리실산과 같은 유기산으로 형성된 염들을 포함한다.

제1 세트의 양태에서, 화학식 1의 MEK 억제제는 화학식 2a 또는 2b의 PI3K 억제제와 동시에 투여된다. 동시 투여는 통상적으로 둘 다의 화합물이 정확하게 동일한 시간에 환자에게 도입되는 것을 의미한다. 그러나, 동시 투여는 또한 MEK 억제제 및 PI3K 억제제가 다른 시간에 환자에게 도입되지만 먼저 투여된 화합물이 두번째 투여된 화합물이 도입되기 전에 환자에 효과를 나타낼 시간이 제공되지 않을 정도로 시간 차가 매우 적을 가능성도 포함한다. 이러한 지연된 시간은 통상적으로 1분 미만, 통상적으로 30초 미만에 해당한다.

하나의 예에서, 화합물은 용액 내에 있고, 동시 투여는 화합물의 병용물을 함유하는 용액을 투여함으로써 달성될 수 있다. 또다른 예에서, 각각 MEK 억제제를 포함하는 용액 및 PI3K 억제제를 포함하는 다른 용액과 같이 별개의 용액들을 동시에 투여하는 것도 이용될 수 있다. 화합물이 고형인 경우, 동시 투여는 화합물의 병용물을 함유하는 조성물을 투여함으로써 달성될 수 있다.

다른 양태에서, MEK 및 PI3K 억제제는 동시에 투여되지 않는다. 이와 관련하여, 먼저 투여된 화합물은 두번째 투여된 화합물이 투여되기 전에 환자에 효과를 나타낼 시간이 제공된다. 일반적으로 시간차는 먼저 투여된 화합물이 환자에서 효과를 종결하는 시간 또는 먼저 투여된 화합물이 완전히 또는 실질적으로 환자에서 제거되거나 불활성화되는 시간을 넘어서지 않는다. 하나의 세트의 양태에서, MEK 억제제는 PI3K 억제제 전에 투여된다. 다른 세트의 양태에서, PI3K 억제제는 MEK 억제제 전에 투여된다. 비-동시 투여에서 시간차는 통상적으로 1분을 초과하며, 예를 들면, 정확하게 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 60분, 2시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 24시간, 36시간, 또는 48시간이거나, 이들 시간 이상, 이하 또는 미만일 수 있다.

하나의 양태에서, MEK 및 PI3K 억제제 중 하나 또는 둘 다는 치료학적 유효량(즉, 치료량) 또는 용량으로 투여된다. "치료학적 유효량"은 환자에게 투여시 그것만으로 효과적으로 암을 치료하는(예를 들면, 종양 성장을 억제하고, 종양 성장을 중지시키거나 종양 퇴행을 야기함) MEK 또는 PI3K 억제제의 양이다. 특정 피험자에서 "치료학적 유효량"으로 입증된 양이 유사하게 질병 또는 상태가 치료되는 100%의 피험자에서 효과를 나타내지 않는 경우도 고려될 수 있으나, 그러한 용량도 당업자에게 "치료학적 유효량"으로 간주된다. 치료학적 유효량에 해당하는 화합물의 양은 암의 타입, 암의 단계, 치료되는 환자의 연령 및 다른 인자에 강하게 의존한다. 일반적으로, 이들 화합물들의 치료학적 유효량은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 상기 인용한 참조 문헌들에 제공되어 있다.

다른 세트의 양태에서, MEK 및 PI3K 억제제 중 하나 또는 둘 다는 서브(sub)-치료학적 유효량 또는 용량으로 투여된다. 이 서브-치료학적 유효량은 환자에게 투여시 그것만으로는 시간에 따라 원하는 표적의 생물학적 활성을 완전히 억제하지는 않는 MEK 또는 PI3K 억제제의 양을 말한다.

치료학적 유효량으로 투여되든 서브-치료학적 유효량으로 투여되든, MEK 억제제 및 PI3K 억제제의 병용물은 암 치료에 효과적이어야 한다. MEK 억제제의 서브-치료학적 유효량은 PI3K 억제제와 병용될 때 병용물이 암 치료에 효과적인 경우 유효량일 수 있다.

일부 양태에서, 화합물의 병용물은 암 치료 특히 환자의 종양 용적을 감소시키는데 있어 상승 효과(synergistic effect)(즉, 상가 효과(additive effect)보다 더 큼)를 나타낸다. 다른 양태에서, 사용된 병용물 및 유효량에 의존하여, 화합물의 병용물은 종양 성장을 억제하고, 종양 정체를 달성하거나 심지어 종양의 실질적 또는 완전 퇴행을 달성할 수 있다.

일부 양태에서, 화합물 (1)은 약 7 내지 120mg의 용량으로 투여(po qd)된다. 한편 화합물 (2a)는 약 12 내지 600mg의 용량으로 투여(po qd)될 수 있으며, 화합물 (2b)는 약 15 내지 90mg의 용량으로 투여(po qd)될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 일반적으로 값의 10%, 5%, 또는 1% 이하의 가능한 변동(variation)을 의미한다. 예를 들면, "약 25mg/kg"은 일반적으로, 가장 넓은 의미로 22.5 내지 27.5mg/kg의 값, 즉, 25 ± 10mg/kg을 가리킨다.

MEK 및 PI3K 억제제의 양은 암의 효과적인 치료를 야기하여야 하지만, 병용 시 그 양이 바람직하게는 환자에 과한 독성은 아니어야 한다(즉, 상기 양은 바람직하게는 의학적 가이드라인에 의해 수립된 독성 한계 내에 있다). 일부 양태에서, 과잉 독성을 예방하고/하거나 더욱 효과적인 암 치료를 제공하기 위해, 전체 투여 용량에 대한 제한이 제공된다. 통상적으로, 본 명세서에 고려된 양은 1일당 용량이다; 그러나, 반나절 및 2일 또는 3일 주기도 고려된다.

상이한 용량 용법(dosage regimen)이 암 치료에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 전술한 임의의 예시적 용량과 같은 일일 용량은 1일 1회, 2회, 3회 또는 4회로 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일간 투여된다. 암의 단계 및 중증도에 따라 고용량 단기 치료 시간(예, 5일 이하) 또는 저용량 장기 치료 시간(예, 10일 이상, 수주, 또는 1달 이상)으로 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 1일 1회 또는 2회 용량이 격일로 투여된다. 일부 양태에서, 각 용량은 MEK 및 PI3K 억제제 모두를 포함하며, 반면, 다른 양태에서, 각 용량은 MEK 또는 PI3K 억제제를 포함한다. 또한 다른 양태에서, 일부 용량은 MEK 및 PI3K 억제제 모두를 포함하고, 다른 용량은 오직 MEK 또는 PI3K 억제제만을 포함한다.

본 발명으로 치료될 암 타입의 예는 비제한적으로, 림프종, 육종 및 암종을 포함하며, 예를 들면, 섬유육종(fibrosarcoma), 믹소육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골육종(osteogenic sarcoma), 척삭종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 내피종(endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 윤활막종 (synovioma), 중피종(mesothelioma), 림프관내피종(lymphangioendotheliosarcoma), 유잉종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장 암종(colon carcinoma), 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 위암, 식도암, 편평 세포암종, 바닥 세포암종, 선암종(adenocarcinoma), 땀샘 암종(sweat gland carcinoma), 피지선 암종, 유두암종(papillary carcinoma), 유두선암종(papillary adenocarcinomas), 낭선암종(cystadenocarcinoma), 수질암종(medullary carcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 신장세포암종, 간암, 담도암종, 융모막암종(choriocarcinoma), 고환종(seminoma), 배아암종(embryonal carcinoma), 윌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 비-소세포폐암종, 소세포 폐 암종, 방광암종, 상피암종(epithelial carcinoma), 신경아교종(glioma), 별아교세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 뇌실막종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경초종(acoustic neuroma), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 수막종(meningioma), 흑색종, 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma); 백혈병, 예를 들면, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수세포 백혈병(골수모구 백혈병, 전골수세포 백혈병, 골수단핵구 백혈병, 단핵구 백혈병 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수세포(과립구) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성적혈구증가증(polycythemia vera), 림프종(호지킨병 및 비호지킨병), 다발골수종(multiple myeloma), 발데스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia) 및 중쇄병(heavy chain disease)을 포함한다.

일부 양태에서, 치료될 암은 비-소세포폐암, 유방암, 췌장암, 간암, 전립선암, 방광암, 자궁경부암, 갑상선암, 직장결장암, 간암 및 근육암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 암은 직장결장암, 자궁내막암, 혈액암, 갑상선암, 삼중음성 유방암(triple negative breast cancer) 또는 흑색종으로부터 선택된다.

본 명세서에서 고려된 환자는 통상적으로 사람이다. 그러나, 환자는 암 치료가 요망되는 임의의 포유동물일 수 있다. 따라서, 본 방법은 사람 및 수의학 적용 모두에 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 본 방법이 적어도 비정상적인 세포 증식을 경감시키는 것을 가리킨다. 예를 들면, 본 방법은 환자에서 종양 성장 속도를 감소시키거나 연속적인 종양의 성장을 예방하거나 심지어 종양의 크기를 감소시킬 수 있다.

다른 측면에서, 동물에서의 암을 예방하는 방법이 제공된다. 이에 관해, 예방은 질병에 노출되거나 걸리기 쉽지만 아직 질병을 경험하거나 증상이 없는 동물에서 질병의 임상적인 증상이 발병하지 않도록 하는 것을 의미한다. 본 방법은 전술한 바와 같이 환자에게 MEK 억제제 및 PI3K 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 예에서, 동물에서의 암의 예방 방법은 동물에게 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 화학식 2a 및 화학식 2b로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 병용하여 투여하는 것을 포함한다.

MEK 및 PI3K 억제 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 형태를 순수한 형태 또는 적합한 약제학적 조성물의 형태로, 당업계에 공지된 임의의 제제 또는 허용된 투여 방식을 통해 투여할 수 있다. 화합물은 예를 들면, 경구, 코, 비경구(정맥내, 근육내 또는 피하), 국소, 경피, 질내, 소포내, 수조내 또는 직장으로 투여될 수 있다. 용량형은 예를 들면, 고체, 반고체, 동결분말, 또는 액체 용량형, 예를 들면, 정제, 알약, 연질 탄성 또는 경질 젤라틴 캡슐, 분말제, 용액제, 현탁액제, 좌제, 에어로졸 등일 수 있으며, 바람직하게 정확한 용량을 간단하게 투여하기에 적합한 단위 용량 형태일 수 있다. 특정 투여 경로는 경구이며, 특히 치료될 질병의 중증도에 따라 일일 용량 용법이 편리하게 조정될 수 있는 것이 바람직하다.

다른 측면에서, 본 출원은 화학식 1로 나타낸 MEK 억제제 및 화학식 2a 및 2b로 나타낸 화합물로부터 선택되는 PI3K 억제제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 조성물은 전술한 MEK 및 PI3K 억제제만을 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 고형의 MEK 및 PI3K 억제제, 임의로 하나 이상의 고형의 보조제(예: 아쥬반트) 또는 약제학적으로 활성인 화합물을 포함하는 고체 형태(예, 분말 또는 정제)이다. 다른 양태에서, 조성물은 당업계에 공지된 임의의 하나 또는 조합된 약제학적으로 허용되는 담체(즉, 비히클 또는 부형제)를 추가로 포함하여, 액체 용량형을 제공한다.

보조제 및 아쥬반트는 예를 들면, 보존제, 습윤제, 현탁화 제제, 감미제, 향미제, 착향제, 유화제 및 분포제(dispensing agent)를 포함할 수 있다. 미생물 작용을 예방하기 위해 통상적으로 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등을 제공할 수 있다. 등장제, 예를 들면, 당, 나트륨 클로라이드 등이 또한 포함될 수 있다. 주사가능한 약제학적 형태의 흡수를 지연시키기 위해, 흡수지연제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용할 수 있다. 보조제는 또한 습윤제, 유화제, pH 완충제 및 항산화제, 예를 들면, 시트르산, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 부틸화 하이드록시톨루엔 등을 포함할 수 있다.

비경구 주사에 적합한 용량형은 생리적으로 허용가능한 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼 및 멸균 주사용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물유(예를 들면, 올리브유) 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸올레에이트 등을 포함한다. 적합한 유동도는 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하거나, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하고 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.

경구 투여용 고체 용량형은 캡슐제, 정제, 알약, 분말제 및 과립제를 포함한다. 이러한 고체 용량형에서, 활성 화합물은 나트륨 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 적어도 하나의 불활성 통상적인 부형제(또는 담체) 또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예를 들면, 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코스, 만니톨 및 실릭산, (b) 결합제, 예를 들면, 셀룰로스 유도체, 전분, 알지네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 슈크로스 및 검 아카시아, (c) 보습제, 예를 들면, 글리세롤, (d) 붕해제, 예를 들면, 아가-아가, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 크로스카멜로스 나트륨, 콤플렉스 실리케이트 및 나트륨 카보네이트, (e) 용액 지연제, 예를 들면, 파라핀, (f) 흡수 촉진제, 예를 들면, 사급 암모늄 화합물, (g) 습윤제, 예를 들면, 세틸알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트 등, (h) 흡착제, 예를 들면, 카올린 및 벤토나이트, 및 (i) 윤활제, 예를 들면, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트 또는 이들의 혼합물과 혼합한다. 캡슐제, 정제 및 알약의 경우, 용량형은 완충제도 포함할 수 있다.

전술한 고체 용량형은 코팅제 및 쉘(shell), 예를 들면, 장용 코팅 및 당업계에 널리 공지된 기타 코팅제로 제조될 수 있다. 이들은 진정제(pacifying agent)를 포함할 수 있으며, 활성 화합물 또는 화합물들을 장관내 특정 부위에 지연된 방식으로 방출하는 조성물의 형태일 수 있다. 사용될 수 있는 매봉된 조성물(embedded composition)의 예는 중합체성 물질 및 왁스이다. 활성 화합물은 또한 적합한 경우, 하나 이상의 전술한 부형제와 함께 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 용량형은 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 용액제, 현탁액제, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 이러한 용량형은 예를 들면, 본 명세서에 기술된 MEK 또는 PI3K 억제제 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염 및 임의의 약제학적 보조제를 물, 식염수, 액체 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 담체; 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 에틸알콜, 이소프로필 알콜, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이드, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포름아미드; 오일, 특히 면실유, 땅콩유, 옥수수 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름, 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴알콜, 폴리에틸렌글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르; 또는 이들 물질의 혼합물 등에 용해시키거나 분산시켜 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조된다.

현탁액제는 활성 화합물 이외에 현탁화 제제, 예를 들면, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트 또는 이들 물질의 혼합물 등을 포함할 수 있다.

직장 투여용 조성물은 예를 들면, 코코아버터, 폴리에틸렌글리콜 또는 좌약용 왁스와 같은, 보통 온도에서는 고체이나 체온에서는 액체여서 적합한 체강에서 녹아서 활성 성분을 방출하는 적합한 비자극성 부형제 또는 담체와 함께 본 명세서에 기술한 화합물을 혼합시켜 제조될 수 있는 좌제이다.

국소 투여용 용량형은 예를 들면, 연고, 분말제, 스프레이 및 흡입기를 포함할 수 있다. 활성 성분은 멸균 조건하에서 생리학적으로 허용가능한 담체 및 임의의 보존제, 완충액, 또는 필요한 경우 추진제와 함께 혼합된다. 안과적 제형, 안연고, 분말제 및 용액제도 이용될 수 있다.

일반적으로, 의도되는 투여 방식에 따라, 약제학적으로 허용되는 조성물은 약 1중량% 내지 약 99중량%의 본 명세서에 기술된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 99중량% 내지 1중량%의 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유할 것이다. 하나의 예로, 조성물은 약 5중량% 내지 약 75중량%의 본 명세서에 기술된 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있고, 나머지는 적합한 약제학적 부형제를 포함한다.

이러한 용량형을 제조하는 실제 방법은 알려져 있거나 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들면, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990]을 참조할 수 있다.

일부 양태에서, 조성물은 하나 이상의 다른 항암 화합물을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 조성물은 하나 이상의 다른 항암 화합물을 포함한다. 예를 들면, 투여된 조성물은 치료를 위해 선택된 종양의 타입에 대한 표준 치료제를 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 키트가 제공된다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함하는 패키지(들)를 포함한다. 하나의 양태에서, 키트는 화합물 (1), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.

"패키지(package)"라는 어구는 본 명세서에 제시된 화합물 또는 조성물을 함유하는 임의의 용기(vessel)를 의미한다. 일부 양태에서, 패키지는 박스 또는 포장(wrapping)일 수 있다. 약제학적 제품을 포장하는데 사용되는 포장 물질은 당업자에게 잘 알려져 있다. 약제학적 포장 물질의 예는, 비제한적으로, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 컨테이너, 주사기, 병 및 선택된 제형 및 의도된 투여 방식 및 치료에 적합한 임의의 포장물질을 포함한다.

키트는 또한 패키지 내가 아니라 패키지 외면에 부착된 품목, 예를 들면, 피펫 등을 포함할 수 있다.

키트는 본 발명의 화합물 또는 조성물을 환자에게 투여하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 미국 식약청과 같은 규제 관청에 의해 승인된 화합물의 용도에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본 발명의 화합물에 대한 라벨이나 제품 인서트를 포함할 수 있다. 패키지(들) 및/또는 임의의 제품 인서트(들)는 그 자체가 규제 관청에 의해 승인된 것일 수 있다. 키트는 패키지내에 고체상 또는 액체상(예를 들면, 제공된 완충액) 중에 화합물을 포함할 수 있다. 키트는 또한 본 방법을 수행하기 위한 용액을 제조하기 위한 완충액 및 한 용기에서 다른 용기로 액체를 옮기기 위한 피펫을 포함할 수 있다.

설명을 위한 목적으로 본 발명의 특정한 양태를 기술하기 위해 실시예를 후술하였다. 그러나, 특허청구범위는 기재된 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되지 않는다.

실시예 1. 화합물 (2b)와 병용한 화합물 (1)의 시험관내 활성

본 연구는 개별 항암제 화합물 (1), 화합물 (2b) 뿐만 아니라 이들의 병용물의 81개 암 세포주의 패널에서의 활성을 기술한다. 세포주는 많은 상이한 유전적 변경 및 생화학적 특성을 갖는 17개의 상이한 징후(indication)를 나타내도록 선택되었다. 또한, 본 연구는 비증식 세포의 모델로서, 휴지 상태의 말초 혈액단핵구 세포(resting Peripheral Blood Mononuclear Cells; PBMC)를 포함하였다. 개별적인 활성 프로파일 결과는 추가로 81개 세포주의 패널을 사용하여 화합물 (1) 및 화합물 (2b)의 병용 연구를 수행하는데 사용되었다. 본 연구는 또한 화합물 (1) 및 화합물 (2b)의 활성 프로파일을 300개가 넘는 공지된 항암제의 프로파일과 비교하였다.

시험관내 병용 연구 전에, 개별적인 제제의 활성을 82개 세포주의 패널을 사용하여 연구하였다. 개별적인 제제를 시험하는 목적은 이들 작용의 독립성을 결정하기 위함이었다. 또한, 공지된 항암제의 활성 프로파일과의 비교는 화합물의 작용의 가능한 기전에 관한 가설을 만드는데 도움이 될 것이다.

물질 및 방법

세포주는 직접적으로 ATCC, NCI, CLS, 및 DSMZ 세포주 컬렉션에서 구매하였다. 마스터 뱅크(master bank)와 작업 분취량(working aliquot)을 제조하였다. 연구에 사용되는 세포는 20 계대(passages) 미만을 겪었다. 잠재적 오염 및 잘못된 할당이 없음을 보장하기 위해, 모든 세포주는 전체 게놈 어레이(Agilent, USA) 상에서 STR 분석에 의해 시험하였다. 연구에 사용된 모든 세포주에서 마이코플라즈마 및 SMRV 오염이 없는 것이 확인되었다.

세포주는 100 U/ml 페니실린 G 및 100 μg/ml 스트렙토마이신의 존재하에 10% FCS(PAN, Germany)가 공급된 공급자 추천 배지내에서 성장되었다. RPMI 1640, DMEM, 및 MEM 얼(Earle) 배지는 Lonza(Cologne, Germany)에서, 보충물 2mM L-글루타민, 1 mM Na-피루베이트 및 1% NEAA는 PAN(Aidenbach, Germany)에서, 2.5% 말 혈청 및 1 unit/ml 인슐린은 시그마-알드리치(Munich, Germany)에서 구매하였다. RPMI 배지는 하기 세포주의 배양에 사용되었다: 5637, 22RV1, 786O, A2780, A431, A549, ACHN, ASPC1, BT20, BXPC3, CAKI1, CLS439, COLO205, COLO678, DLD1, DU145, EFO21, EJ28, HCT15, HS578T, IGROV1, JAR, LOVO, MCF7, MDAMB231, MDAMB435, MDAMB436, MDAMB468, MHHES1, MT3, NCIH292, NCIH358M, NCIH460, NCIH82, OVCAR3, OVCAR4, PANC1005(인슐린 첨가), PBMC, PC3, RDES, SF268, SF295, SKBR3, SKMEL28, SKMEL5, SKOV3, SW620, U2OS, UMUC3, 및 UO31.

DMEM은 A204, A375, A673, C33A, CASKI, HCT116, HEPG2, HS729, HT29, J82, MG63, MIAPACA2(말 혈청 첨가), PANC1, PLCPRF5, RD, SAOS2, SKLMS1, SKNAS, SNB75, T24, 및 TE671에 사용되었다.

MEM 얼(Earle) 배지는 CACO2, CALU6, HEK293, HELA, HT1080, IMR90, JEG3, JIMT1, SKHEP1, SKNSH, 및 U87MG에 사용되었다.

세포를 5% CO₂ 대기에서 HeraCell 150 인큐베이터(Thermo Scientific, Germany) 내에서 성장시켰다.

아래는 본 연구에 사용된 화합물 목록이다:

화합물 (1) 및 화합물 (2b)의 원액(stock solution)은 상기 표에 표시된 대로 DMSO(Sigma-Aldrich, Germany) 내에 제조되었다. 원액은 추가로 분취(aliquoted)되고 아르곤하에서 -20℃에서 저장하였다.

10% w/v의 트리클로르아세트산, TCA(Sigma-Aldrich, Germany)는 증류수내에 제조되었다. 0.08% wt/v 설포로다민 B, SRB(Sigma-Aldrich, Germany) 용액은 1% 아세트산(Sigma-Aldrich) 내에 제조되었다. 트리스 염기는 Karl Roth(Germany)에서 구매하였다.

세포 성장 및 처리는 96-웰 마이크로타이터 플레이트 CELLSTAR®(Greiner Bio-One, Germany)에서 수행하였다. 트립신화에 의해 지수기 상 배양액에서 수확한 세포를 최적 시딩 밀도에서 150㎕의 배지에 플레이팅하였다. 각 세포주에 대해 최적 시딩 밀도를 측정하여 시험 기간 동안 지수 성장을 보증하도록 하였다. 항암제 부재로 성장하는 모든 세포는 육안 검사에 의해 결정된 대로 치료 완료시 서브-컨플루언트(sub-confluent)하였다.

DMSO내 화합물 희석은 96-웰 경질 PCR 플레이트에서 수행하였다. 이후 화합물을 RPMI 배지에서 1:250 희석하였다.

24-시간 전-성장 주기(pre-growth period) 후에, 150㎕의 세포를 배지를 함유하는 50㎕의 화합물과 함께 혼합하여 처리하였다(결과적으로 최종 0.1%의 DMSO 농도가 됨). 세포는 37℃에서 72 시간 동안 성장시켰다. 또한, 모든 시험은 세포를 갖는 수개의 플레이트를 포함하고, 이는 24시간 회수 기간 후 즉시 측정하기 위해 처리되었다. 이 플레이트는 처리 전, 0 시간에, 존재한 세포수에 대한 정보를 포함하며, 세포독성을 산출하는데 사용되었다.

처리 후, 10% TCA를 가하여 세포를 침전시켰다. 고정화 전, 배지를 기술된 대로 흡인하였다. 4℃에서 1시간 항온배양한 후, 플레이트를 400㎕의 탈이온수로 두번 세척하였다. 이후 세포는 100㎕의 0.08% wt/v SRB로 염색하였다. 플레이트를 적어도 30분간 방치하고, 1% 아세트산으로 6회 세척하여 미결합 스테인(stain)을 제거하였다. 실온에 플레이트를 방치하여 건조시키고, 결합 SRB를 100㎕의 10 mM 트리스염기로 용해시켰다. 광학 밀도(optical density)는 560nm에서 Victor 2 플레이트 리더(Perkin Elmer, Germany)로 측정하였다. A375 및 H460 세포주에 대한 SRB 값은 거의 포화에 가까웠는데(2.5 OD units), 이는 세포 컨플루언스에 의한 것이 아니라 이들 세포의 높은 단백질 양으로 인한 것이다. 이들 세포에 대한 측정은 560nm 대신 520nm에서 수행되었다.

시험관내 병용 연구 전에, 80개 세포주의 패널을 이용하여 개별적인 제제의 활성을 연구하였다. 개별적인 제제를 시험하는 목적은 이들 작용의 독립성을 결정하기 위함이었다. 또한 알려진 항암제의 활성 프로파일과의 비교는 화합물의 작용의 가능한 기전에 관한 가설을 만드는데 도움이 될 것이다.

계산은 DTP NCI에 의해 도입된 명명법을 사용하였다. 각 마이크로타이터 플레이트로부터의 미처리 광학밀도 데이터는 MS 엑셀이나 텍스트 파일로 데이터뱅크에 저장하였다. 데이터 처리의 첫번째 단계는 세포 없이 배지를 함유하는 웰에서 유도되는 각 플레이트에 대한 평균 배경값을 산출하는 것이다. 이후 평균 배경 광학밀도를 적합한 대조값(약물 추가 없이 세포를 함유함), 항암제를 처리한 세포를 대표하는 값 및 0시간에 세포를 함유하는 웰의 값에서 뺀다. 따라서, 각 실험에 대해 하기 값이 수득되었다: 대조군 세포 성장, C; 항암제 존재하의 세포 T_i 및 0시간에 화합물 처리 전 세포 T_z (또는 일부 공보에서는 T₀).

Z-인자는 검정 수행의 품질을 평가하는데 통상적으로 사용되는 파라미터이며, 하기 식에 따라 계산된다:

여기서, μ_c+ 및 μ_c-는 양 및 음의 대조 시그널의 수단을 나타내고, σ_c+ 및 σ_c-는 이들의 표준편차이다. 어떤 면에서는, Z'-인자는 기록된 측정의 동적 범위의 유의성을 반영하며 >0.5이어야 한다. 본 연구에서, Z'-인자는 T_z 및 C 값에 대해 배경을 넘어가는 시그널의 유의성을 결정하기 위해 적용되었다. 스크리닝 결과는 Z-인자가 각 경우에 대해 0.5를 넘는 경우에만 허용되었다.

비선형 곡선 피팅 산출이 인-하우스 개발된 알고리즘 및 가시화 도구를 사용하여 수행되었다. 알고리즘은 전술한 것과 유사하며, 평균제곱오차 또는 MSE 모델로 보충하였다. 이는 상업적 응용, 예를 들면, XLfit(ID Business Solutions Ltd., Guild-ford, UK) 알고리즘 "205"에 비교될 수 있다. 계산은 최선 근사선, 50% 효과를 위한 95% 신뢰 간격을 갖는 용량 반응 곡선을 포함하였다(하기 참조).

항암제 효과를 나타내는 일반적 방법은 세포 생존력 및 시험약의 존재하에서의 생존을 % T/C × 100로 측정하는 것이다. 생존력 및 용량과의 관계는 용량반응곡선으로 불린다. 곡선을 보일 필요없이 이 관계를 기술하는데 두개의 주요값이 사용된다: 50%의 %T/C 값, 또는 50% 성장 억제를 나타내는 시험 제제의 농도(IC₅₀) 및 10%의 % T/C 값, 또는 90% 성장 억제를 나타내는 시험 제제의 농도(IC₉₀).

이 측정값을 이용하여, 화합물 활성에 기인한 세포 성장의 불완전 억제(GI), 세포 성장의 완전 억제(T GI) 및 순 세포 소실(LC)에 대한 세포 반응을 산출할 수 있다. 50%의 성장 억제(GI₅₀)는 100×[(T_i-T_z)/(C-T_z)] = 50으로 산출된다. 이는 약물 항온배양 기간 동안 대조군 세포내 순 단백질 증가에 비교하여 50% 감소를 일으키는 약물 농도이다. 환언하면, GI₅₀은 0시간에 대해 보정된 IC₅₀이다. IC₉₀와 유사하게, 산출된 GI₉₀ 값은 모든 시험된 화합물에 대해 보고된다. TGI는 T_i = T_z에서 산출되었다. LC₅₀은 처음과 비교하여 약물 항온배양 기간의 말기에 측정된 단백질의 50% 감소를 일으키는 약물 농도이다. 이는 100×[(T_i-T_z)/T_z] = -50으로 산출된다. 그러나, 72 시간의 처리로 인하여, 낮은 세포 시딩 밀도가 요구되며, LC₅₀은 거의 달성될 수 없었다.

IC₅₀, IC₉₀, GI₅₀, GI₉₀ 및 T GI 값은 자동적으로 계산되었다. 모든 용량반응 곡선의 가시적 분석은 피팅 알고리즘의 품질을 확인하기 위해 수행되었다. 효과가 도달하지 않거나 초과된 경우에서, 값은 근사치 또는 "-"로 표시되었다. 본 연구에서 모든 값은 시험된 최대 약물 농도를 초과하였다. 이 경우에서 그 값들은 분석에서 배제되거나 또는 IC₁₀ 및 GI₁₀의 근사값이 분석에 사용되었다.

모든 값은 분석을 위해 log10-전환되었다. 이 전환은 어떤 통계 도구를 적용시키는데 선결조건인 정상 분포에 피팅되는 더 좋은 데이터를 보증한다. 통계 분석은 데이터베이스 분석 도구로서 통합된 온코리드사에서 개발된 전용 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 그러나, 데이터베이스 비교를 제외하고, 분석은 MS 엑셀 또는 STATISTICA®(StatSoft, Hamburg)를 사용하여 재현될 수 있다. MS 엑셀을 사용하여: 평균, 예를 들면, 평균 GI₅₀(기능: "평균")의 확인; 델타 δ의 산출(GI₅₀ -평균 GI₅₀); 및 z-점수("표준화" 기능). 화합물 (1) 및 화합물 (2b) 교차-상호관계의 활성 프로파일의 비교는 피어슨 및 스피어먼 상관관계(Pearson and Spearman correlations)를 사용하여 수행될 수 있었다(예를 들면, STATISITCA®를 사용하여). 또한, 피어슨 쌍대 비교(pairwise comparisons) 및 스피어먼 쌍대 비교는 결과의 신뢰성을 증가시키는데 사용되었다. 쌍대 비교는 데이터베이스 내 모든 시험된 제제에 대한 제제의 쌍대 유사성에 기초하여 산출되었다.

z-점수는 절대 델타 및 평균값 보다는 표준 편차를 보고하는 방법이다. 이는 그 값이 표준 편차 단위에서 평균에서 얼마나 멀리 벗어나 있는지를 보여준다:

여기서, X는 단일 측정값, 예를 들면, GI₅₀이고 μ는 모든 측정값의 평균(평균 GI₅₀)이며, σ_x는 X의 표준 편차이다.

NCI에 의해 도입된 평균 그래프 개념은 모든 세포에서 주어진 항암제에 대한 세포 활성 파라미터의 가시화를 허용한다. 이 그래프는 가시적 비교를 위한 풍부한 정보를 제공하는 특징적 패턴을 산출한다. 값은 평균값으로부터 수평바로 도시된다. 따라서, 각 바는 모든 세포주에서 평균으로부터 이탈되는, 주어진 세포주에서의 화합물의 비교 활성을 나타낸다. NCI와 대조적으로 절대 델타보다 z-점수가 도시된다. 통계적 용어에서, z-값은 일종의 정규화를 제공하는 표준 편차를 표시하며 상이한 활성 분포를 갖는 화합물간의 비교를 단순화한다. 또한 평균 결합된 z-점수는 동일 기원의 세포주에 대해 산출되었다.

z-점수 및 검사된 농도 범위가 모든 가시화에 포함되었다. 제제 활성이 정규 분포를 따르지 않으면 z-점수 그래프의 적용성은 조심스럽게 고려되어야 한다.

박스-플롯 그래프(box-plot graph)를 사용하거나 또는 각 제제에 대한 z-점수를 사용하여 8개의 최고 및 최저로 민감한 세포주를 선택함으로써, 가장 민감한 세포주 및 비-민감성 세포주가 가시화되었다. 이는 제제의 활성이 측정될 수 없는 세포주에도 적용되었다. 박스 플롯은 5개의 값으로부터 구축되었다: 최소값(최저 위스커(whisker)), 제1 사분위수(quartile)(박스의 최저 경계), 중간값(중간의 정사각형), 제3 사분위수(박스의 최상 경계) 및 최대값(최고 위스커).

잠재적인 상승적 병용을 결정하기 위해 스크리닝이 설계되었다. 5x5 또는 7x7 매트릭스의 전부 및/또는 일부가 연구를 설계하는데 사용되었다. 달리 언급되지 않는 한, 블리스 독립성(bliss independence)이 계산의 기초로 사용되었다. 하기 파라미터가 산출되었다:

δ_i = 측정값_i - 이론값_i

여기서, i = [1..n]은 사용된 매트릭스의 값 중 하나이며, 이론값_i은 블리스 독립 방법에서 기술된 방법으로 산출되었다. 벡터합(vector sum)은 하기와 같이 결정되었다:

이 식에서 벡터합은 약간 스칼라를 표시한다:

-0.5 미만의 평균값은 강한 상승 효과를 나타낸다: (-0.5, -0.02)- 상승 효과, (-0.2, 0.02)-제로 효과(상가), (0.02, 0.5)-잠재적 길항작용, 및 0.5 초과-강한 길항작용. 그러나, 병용 효과는 상승적이 아니지만(또는 심지어 길항적), 여전히 각 제제 단독보다는 더 좋을 수 있다. 더구나, 생체내에서 단일 제제보다 더 좋은 효과는 임상적으로 양성(또는 상승적)으로 간주된다. 이 경우, 가장 높은 단일 제제 HSA 모델에 의해 측정될 수 있는 두 제제의 잠재적 상호작용을 고려한다. 이 모델은 혼합물에서와 동일한 농도에서 단일 제제 중 하나에 의해 산출된 더 큰 효과간 차이를 결정한다.

우수한 단일 제제_i = [제제 1_i; 제제 2_i] 중 우수한 것

그리고, 두 제제에 대한 델타 HSA_i는 아래와 같이 결정될 수 있다:

델타 HSA_i = δHSA_i = 측정된 값_i - 우수한 단일 제제_i

시험관내 결과 요약

화합물 (1)의 효능은 민감성 세포주에서 4 - 5 nM에서 대부분의 비-민감성 세포주에서 50 μM에서 최소 활성을 나타내는 것에 이르기까지 다양하다. 시험 조건하에서, 하기 암 세포주에 대해 최소 활성이 결정될 수 있었다: A673, HEK293, J82, JAR, JEG3, MDAMB436, MDAMB468, MHHES1, NCIH82, PANC1, PLCPRF5, 및 SF268. 세포주 CLS439, EFO2,1 PC3, SAOS2, SF295, 및 SKOV3에 대한 활성은 50 μM의 최고 시험 농도 초과로 추정되었다. 동시에, 시험된 세포주 50%에서 500 nM(중간값 490 nM) 미만의 민감도를 나타내었으며, 82개 세포주 중 27개의 세포주가 화합물 (1)의 100 nM의 미만에서 민감성을 나타내었다. 화합물 (1) 및 화합물 (2b)의 작용은 다수의 사람 암 세포주에서 상승적이었으며, 이는 화합물의 작용 기전이 상호 보완적임을 제안한다. A673 세포는 화합물 (1) 또는 화합물 (2b) 단독의 작용에 대해서는 비-민감성이었으나, 병용시에는 강한 상승을 나타낼 수 있다. A549 및 MCF7 세포는 둘 다의 제제 모두에 약간 민감성을 나타내었으며, 병용에 의해 더욱 강력할 수 있다. SKBR3 세포주는 화합물 (2b)에 매우 민감하다. 그러나, 둘 다의 제제의 병용에 의해 효과가 더욱 증강될 수 있다. 이 발견은 HER2 유전자를 과잉 발현하는 모든 유방종양 세포주에 관련될 것이다.

가장 민감한 세포주는 HT29, COLO205, TE671, A375, SKMEL5, COLO678, SKNAS 및 NCIH292이었으며, 이들에서 화합물 (1)은 4.8 내지 8 nM의 활성을 나타내었다. 가장 민감한 세포주와 가장 덜 민감한 세포주간 차이는 10,000배로 컸다. 이러한 큰 활성 창(window of activity)으로 인해 활성 분포는 넓고 정규 분포를 따르지 않는다. 이러한 경우, z-점수는 통계적 의미가 거의 없다; 그럼에도 여전히 예를 들면, 치료학적 징후에 따른 그룹 활성에 적용될 수 있다.

화합물 (1)의 활성 순위(또는 z-점수 순위)는 적용할 수 있는 또 다른 도구이다. 화합물 (1)의 특성은 다양한 분석 도구를 사용할 필요성 및 항암제를 시험하는 넓은 농도 범위를 보장할 필요성을 강조한다. 하나의 가능성은 화합물 (1)이 특이적인 작용 기전을 가지며 종양 세포의 하위-집단(sub-population)에만 작용하는 것이다.

81개의 사람 암 세포주는 17개의 상이한 종양 기원을 대표하였다. 도 15a, 15ba 및 15bb는 하나의 종양 기원 그룹내 개별적인 z-점수 및 각 치료학적 징후에 대한 조합된 z-점수를 평균값(녹색 삼각형)으로 나타낸다. 개별적 z-점수의 경우에서와 같이, 좌측 점으로의 방향이 화합물 작용에 대한 민감도를 가리킨다. 제로라인(zeroline)은 평균 활성에 해당한다. 데이터는 폐, 췌장, 결장 및 흑색종 세포주가 일반적으로 화합물 (1)에 더 민감한 것을 제안하는데, 평균 z-점수가 좌측에 있기 때문이다. 거의 하나의 췌장(PANC1) 세포주가 화합물 (1) 작용에 매우 민감하다. HT1080은 또한 매우 민감한 세포주이다.

세포주에서 화합물 (2b)의 활성 GI₅₀ 값은 A204, IMR90, MDAMB468, SKBR3, CAKI1 및 IGROV1 (z-점수 < -1.5로 측정된 바와 같이 가장 민감함)에서의 < 500 nM 내지 SW620, COLO678 및 HCT116(비-민감성 세포주, z 점수 > 1.5)에서의 > 4 μM의 범위를 나타내었다. 이 결과는 평균에서 가장 강한 음성 편차의 z-점수를 나타내는 세포주가 다른 생물학적 시스템, 예를 들면, 마우스 이종이식 모델에서 활성을 나타낼 것임을 가리킬 수 있다. 81개 세포주에서 평균 GI₅₀ 값은 log10-변환 데이터에 기초하여 산출시 1.3 내지 1.4 μM이었다. 정지 상태의 PBMC에서 어떠한 활성도 나타나지 않았는데, 이는 화합물 (2b)가 바람직하게 증식 세포에 작용하는 것을 제안한다. 도 16a, 16ba 및 16bb는 활성 분포는 좁지만, 민감한 세포주가 잘 식별됨을 보여준다.

화합물 (2b) 활성 프로파일을 300가 넘는 상이한 항암제를 포함하는 내부 데이터뱅크와 비교하여 다수의 제제를 확인하였다. 가장 유사한 제제(0.8 초과의 평균 유사성)는 MSC2208382A이었다. 보다 약한 유사성(0.7 초과)이 GDC-0941 비스메실레이트 및 ZSTK474의 사용시 검출되었고, MSC2313080A에 일정 정도의 유사성을 나타내었다. GDC-0941 비스메실레이트는 PI3K/mTOR 이중 억제제인 PI-103의 아날로그이고 클래스 I PI3K 효소 뿐만 아니라 ZSTK474의 비교적 특이적인 억제제로 고려된다. 화합물 (2b)는 PI3K 억제제 클래스에 속하는 것으로 제안될 수 있다.

개별적인 z-점수의 경우에서와 같이, 좌측 점으로의 방향이 화합물 작용에 대한 민감도를 가리킨다. 제로라인은 평균 활성에 해당한다. 난소암 및 전립선종양이 특이적 치료학적 영역이 될 수 있다. 적어도 모든 시험된 세포주에 대해, z-점수가 0 미만이다. 유방암, 폐 종양 및 신장 종양에 대한 적용도 고려될 수 있다. 그러나, 각 징후는 화합물 (2b) 활성에 매우 민감성이거나 또는 비-민감성인 세포주도 포함한다.

비록 대다수의 세포주가 화합물 (1) 및 화합물 (2b)의 시험관내 병용물에 대해 잠재적 상승 효과를 나타내었으나, -1 미만의 벡터합을 갖는 결과가 유의한 것으로 고려될 수 있다. 표 1 및 도 17a 및 도 17b는 이러한 결과를 요약한 것이다. 세포주 A673은 화합물 (1) 또는 화합물 (2b) 단독 작용에 대해서는 비-민감성이나, 병용물에서는 강한 상승작용을 나타내었다. 그러나, 생체내 또는 임상적 전망에서, 4 및 5개의 세포주 그룹이 아마도 더 관련이 있다. 화합물 (1)의 활성(GI₅₀)은 A549 및 MCF7 세포에서 각각 300 nM 및 150 nM이며, 이는 가장 민감한 세포주에서 100 nM 활성에 필적한다. 화합물 (2b)의 활성(GI₅₀)은 A549 및 MCF7 세포에서 각각 1.15 μM 및 1.6 μM이며, 이 제제의 평균 활성 1.3 내지 1.4 μM에 근접하거나 아래이다. 이들 세포주에 대한 병용 지수(combination index)는 -1에 가깝고, 이는 상승작용을 나타낸다. 다른 예는 SKBR3이다. 이들 세포주는 화합물 (2b)에 매우 민감하고 화합물 (1)에 비-민감성이다. 그러나, 둘 다의 제제의 병용에 의해 효과가 더 증가될 수 있다.

화합물 (1) 및 화합물 (2b)는 증식하는 세포에 작용하며, 휴지 상태의 PBMC에서는 아무런 활성을 나타내지 않았다. 그러나, 이들 제제는 활성에 있어 서로 다르다. 화합물 (1)에 대해 가장 민감한 세포주와 가장 덜 민감한 세포주간 차이는 10,000배만큼 컸다. 가장 덜 민감한 세포주에 대해 저항은 시험된 농도 범위 > 50μM을 넘었다.

따라서, 화합물 (1)은 특이적 작용기전을 가질 수 있고, 오로지 종양 세포의 하위-집단에만 작용하는 것으로 보인다. 임상에서 치료학적 징후의 선택은 돌연변이 분석에 의해 보완될 수 있다. 대조적으로, 화합물 (2b)는 세포주에서 좁은 활성을 나타낸다. 민감성 및 비민감성 세포주간의 분리는 통계적으로 유의하나 활성의 차이는 10 내지 20배의 범위이다. 화합물 (2b)의 활성 프로파일은 PI3K 억제제, 예를 들면, PI-103 또는 이의 파마로그(pharmalog) GDC-0941과 유사하다. EGFR, PTEN 및 PI3K와 같은 PI3K 경로의 활성화에 관련된 유전자의 돌연변이 상태 및 제제의 활성에 대하여 어떠한 예측도 가능하지 않았다. 일부 마커들은 이 PI3K 억제제의 작용으로 아폽토시스가 유도됨을 예측할 수 있다: EGFR(돌연변이), HER2(증폭), MET(돌연변이/증폭). 간접적으로, 이 사실은 SKBR3 세포(HER2 증식)이 가장 민감성 세포주 중에 있다는 관찰에 의해 뒷받침될 수 있다.

화합물 (1) 및 화합물 (2b)는 병용되어 모든 세포주에서 7x7 매트릭스를 사용하여 시험되었으며, 편차는 각 제제에 대한 모든 세포주에서 평균화된 GI₅₀ 근처이다. 이 농도를 선택하는 이유는 다음과 같다. 먼저, 이 농도는 세포 모델에서의 항암제 효능, 즉 평균 GI₅₀ 미만에서 유의적 효과를 나타내는 유일한 세포주를 기술하는 참조 농도이다. 두 번째로, 10 내지 30%를 보고한 인용 문헌들(citations)을 기초로 하여 볼 때 항암제의 효능이 제한적으로 알려져 있다. 따라서, 평균 GI₅₀의 선택은 약 50%의 예상 효능에 대응될 것이다. 세번째로, 7 x 7 매트릭스(평균 GI₅₀로부터 양 방향으로 거의 10배)로 걸쳐진 편차는 두 제제간 임의의 잠재적 상호작용이 있는지 여부의 문제를 거론하는데 충분한 범위를 허용한다.

거의 모든 경우에서, 화합물 (1) 및 화합물 (2b)의 병물물은 블리스 독립 모델(참조: Yan et al., BMC Systems Biology, 4:50 (2010) 참조)에 의해 측정된 바와 같이 잠재적 상승 효과를 나타내었다(도 17a 및 도 17b). 도 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 18f, 19a, 19b, 20a, 20b도 참조한다.

그러나, 가장 강한 상승 효과는 어느 하나의 제제의 활성이 약할 때 검출되었다. 이는 적어도 부분적으로, 제제 단독으로는 세포상에서 어떠한 효과도 거의 일으키지 않는 경우 병용물의 임의의 효과가 유의한 것으로 간주되는, 실험적 설정(set-up) 때문으로 생각된다. 대안적으로, 단독 제제의 효과가 너무 강하여 효과증가를 검출할 수 없을 수 있다. 후자의 경우, HSA 모델은 두 제제간의 잠재적 상호작용에 대해 더 나은 견해를 제공한다.

실시예 2. 피하 사람 결장 종양 HCT 116을 갖는 SCID 마우스에 대한 화합물 (2b) 또는 화합물 (2a)와 병용된 화합물 (1)의 생체내 활성

pan-PI3K 억제제 화합물 (2a) 또는 pan-PI3K/mTOR 이중 억제제 화합물 (2b)와 병용된 MEK 억제제 화합물 (1)의 항종양 활성을 평가하기 위해, 사람 결장 종양 HCT 116(KRAS 및 PIK3CA 돌연변이) 이종 이식을 갖는 암컷 SCID 마우스를 사용하여 시험을 수행하였다. 네 개의 연구가 수행되었다:

제1 연구에서, 5mg/kg의 낮은 용량의 화합물 (1)을 30mg/kg의 화합물 (2b)와 50 및 75mg/kg의 화합물 (2a)와 병용하여 시험하였다.

제2 연구에서, 화합물 (1)의 용량을 10 및 20mg/kg으로 증가시키고, 여기에 화합물 (2b)를 20mg/kg으로 병용하고, 10mg/kg의 화합물 (1)를 50 및 75mg/kg의 화합물 (2a)와 병용하였다.

제3 연구는 확인 연구로서 사용되었으며, 화합물 (1)의 용량은 10 및 20mg/kg으로 하고, 여기에 화합물 (2a)를 50 및 75mg/kg으로 병용하였다.

제4 연구는 확인 연구로서 사용되었으며, 화합물 (1)의 용량은 10 및 20mg/kg으로 하고, 여기에, 화합물 (2b)를 20mg/kg으로 병용하였다.

물질 및 방법

8 내지 10주령의 CB17/lCR-Prkdc 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficiency; SCID)/Crl 마우스들은 찰스 리버 유에스에이에서 수득한 계통(strain)으로 찰스 리버 프랑스(Domaine des Oncins, 69210 L'Arbresle, France)에서 사육되었다. 적어도 5일의 적응 시간을 거친 후 치료 시작시 마우스들은 18g이 넘었다. 마우스는 멸균수 및 식이(UAR reference 113, Villemoisson, 91160 Epinay sur Orge, France)에 자유롭게 접근할 수 있었다. 마우스들은 12 시간 명/암 사이클로 수용되었다. 동물 유지관리를 포함하는 환경 조건, 실온(22℃±2℃), 상대 습도(55%±15%) 및 점등 시간은 실험실 동물 과학 및 복지(laboratory animal sciences and welfare; LASW)의 관리자에 의해 기록되고 보관되었다.

사람 결장 암종 HCT 116 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[(ATCC), Rockville, MD, USA)]에서 구매하였다. HCT 116 세포는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM)(Invitrogen)에서 배양하였다. 종양 모델은 SCID 암컷 마우스당 50% 마트리겔(Reference 356234, Becton Dickinson Biosciences)과 함께 혼합된 3x10⁶ 세포를 이식(SC)함으로써 확립하였다.

화합물 (1) 제형은 MEK 억제제를 0.5% CMC 0.25% 트윈 20에 혼입시켜 제조하였다. 제제를 4℃에서 저장하고 사용전에 와류하여 재현탁하였다. 화합물의 경구 형태는 3일마다 제조하였다. 마우스당 투여 용적은 10mL/kg이었다.

화합물 (2a) 제형은 주사용수에서 제조하였다. 원액은 4℃ 암실에서 7일간 화학적으로 안정하였다. 마우스당 투여 용적은 10mL/kg이었다.

화합물 (2b) 제형은 1N HCl 및 주사용수에서 제조하고 5개 사이클로 와류 및 초음파 처리하였다. 최종 용액의 pH는 3이었다. 원액은 4℃ 암실에서 7일간 화학적으로 안정하였다. 마우스당 PO 투여 용적은 10mL/kg이었다.

종양 세포의 피하 이식을 위해, 마우스의 옆구리 피부를 알콜이나 베타딘(Betadine)®(Alcyon) 용액을 사용하여 소독하고, 종양 세포 현탁액을 23 G 니들을 사용하여 0.2mL의 용적으로 한쪽 옆구리에(unilaterally) 접종(SC)하였다.

단독 제제로서 또는 병용물로 사용되는 화합물 (1), 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)의 종양 성장에 대한 활성을 네 가지 다른 연구에서 평가하였다. 각 연구에 대한 투여 용량 및 스케쥴은 결과 섹션에 기재되어 있고 하기 표에 상세하게 기재되어 있다.

0일에 주어진 실험을 시작하기 위해 필요한 동물들을 모아 한쪽 옆구리에(monolaterally) 이식하였다. 치료는 측정가능한 종양에 투여되었다. 고형 종양은 원하는 용적 범위만큼 성장되도록 하였다(원하는 범위에 속하지 않는 종양을 갖는 동물들은 배제되었다). 이후 마우스들을 모으고 다양한 치료군 및 대조군으로 비선택적으로 분포시켰다. 치료는 HCT 116 종양 세포 이식 11일 후부터 시작하였으며, 이를 결과 섹션 및 각 표에 나타내었다. 용량은 치료 시작시 체중을 기초로 하여 mg/kg으로 표시하였다. 매일 마우스들을 확인하고 유해한 임상 반응을 기록하였다. 마우스 각 그룹은 최저 체중(weight nadir)이 도달될 때까지 매일 전체적으로 체중을 측정하였다. 이후, 각 그룹은 실험이 끝날 때까지 매주 1 내지 3회 체중을 측정하였다. 종양은, 종양이 2000㎣에 도달하는 샘플링 시점에 최종 희생될 때까지 또는 동물이 죽을 때까지(어떤 것이 먼저인지는 상관 없음) 매주 2 내지 3회 캘리퍼로 측정하였다. 고형 종양 용적은 2차원 종양 측정으로부터 추정되고 하기 식에 따라 산출되었다.

종양 중량(mg) = 길이(mm) x 너비²(mm²)/2

치사일을 기록하였다. 생존 동물을 희생시키고 흉강 및 복강을 육안으로 검사하였다.

연속 3일간 15%의 체중 감소(BWL)(그룹 평균), 1일간 20% 체중 감소(BWL) 또는 10% 이상의 약물 치사를 일으키는 용량은 과량 독성 용량으로 간주되었다. 동물 체중은 종양 중량을 포함하였다.

제1 효능 종말점은 ΔT/ΔC, 퇴행 퍼센트 중간값(percent median regression), 부분 및 완전 퇴행(PR 및 CR)이다.

각 암에 대한 각 치료군(T) 및 대조군(C)에 대한 종양 용적의 변화는 특정 관찰일의 종양 용적에서 제1 치료일(시작일)의 종양 용적을 제하여 산출하였다. 중간값 ΔT는 치료군에 대해 산출하고, 중간값 ΔC는 대조군에 대해 산출하였다. 이후 비율 ΔT/ΔC를 산출하고 퍼센트로 나타내었다. 용량은 ΔT/ΔC가 40% 보다 적은 경우 치료학적으로 활성으로 간주되고, ΔT/ΔC가 10% 보다 적은 경우 매우 활성인 것으로 간주된다. ΔT/ΔC가 0 이하인 경우, 그 용량은 매우 활성인 것으로 간주되며 퇴행 퍼센트가 표시된다(dated).

종양 퇴행 퍼센트는 치료군에서의 치료 1일에서의 용적과 비교하여 특정 측정일의 종양 용적 감소%로 정의된다. 특정 시점에서 및 각 동물에 대해 퇴행 %가 산출된다. 퇴행 %의 중간값이 하기 식에 의해 그룹에 대해 산출된다:

퇴행% (t에서) = (t₀에서의 용적-t에서의 용적)/t₀에서의 용적) x 100

부분 퇴행(partial regression): 종양 용적이 치료 시작시 종양 용적의 50%까지 감소되는 경우, 부분 퇴행으로 정의된다.

완전 퇴행(complete regression): 종양 용적이 0㎣가 될 때 CR이 달성된다(종양 용적이 기록될 수 없는 경우 CR로서 간주된다).

용어 "치료학적 상승 작용(therapeutic synergy)"은 주어진 용량들의 두 제품의 병용물이 동일한 용량들로 고찰할 때 두 제품 단독의 가장 우수한 효과보다 더 효과적인 경우 사용된다. 치료학적 상승 작용을 연구하기 위해, 각 병용물은 종양 용적 파라미터에 대한 반복 측정(시간 인자)으로 2-원 분산분석에서 얻은 추정치를 사용하여 가장 효과가 우수한 단독 제제와 비교된다.

통계적 분석은 SUN4에 대한 SAS 시스템 8.2판 상에서 Everstat V5 소프트웨어 및 SAS 9.2 소프트웨어를 통해 수행되었다. 5% 미만의 확률(p<0.05)이 유의한 것으로 간주되었다.

생체내 연구 결과

제1 연구: HCT 116을 갖는 SCID 마우스에 대한 화합물 (2b)(30mg/kg) 또는 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg)과 병용된 화합물 (1)(5mg/kg)의 항종양 활성

치료 시작시 종양 부하량 중간값(median tumor burden)은 198 내지 221㎣이었다. 단독 제제로서, 화합물 (1)(5mg/kg/투여(Adm)), 화합물 (2b)(30mg/kg/adm) 및 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg/adm)을 종양 이식 후 11일에서 18일까지 매일 PO 투여하였다. 병용물 그룹에서, 화합물 (1)의 용량은 표 2에 나타낸 바와 같이 각 용량의 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)와 병용되었다.

단독 제제로서 또는 병용물로 사용되는 화합물 (1) 및 화합물 (2a)는 내약성이 우수하고(well-tolerated), 최소 BWL을 유도하였다(도 1 및 표 2). 단독 제제로서, 화합물 (1), 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)는 시험조건하에서 ΔT/ΔC>40%를 달성하였다.

병용물에서, 화합물 (1) 5mg/kg/adm 및 화합물 (2b) 30mg/kg/adm으로의 치료는 27%의 ΔT/ΔC를 달성하였으나(도 2 및 표 1), 표 3에 나타낸 바와 같이 치료학적 상승 작용을 획득하지 않았다(전체 분석에 대해 p = 0.0606). 화합물 (1) 5mg/kg/adm 및 화합물 (2a) 50 및 75mg/kg/adm으로의 치료는 각각 22% 및 21%의 ΔT/ΔC를 달성하였다(도 3 및 표 2). 표 2에 나타낸 바와 같이, 치료학적 상승 작용을 둘 다의 병용물에서 획득하였다(전체적으로 각각 p=0.0091 및 p<0.0001). 표 11A 및 11B를 또한 참조한다.

제2 연구: HCT 116을 갖는 SCID 마우스에 대한 화합물 (2b)(20mg/kg)와 병용된 화합물 (1)(10 및 20mg/kg) 및 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg)와 병용된 화합물 (1)(10mg/kg)의 항종양 활성

치료 시작시 종양 부하량 중간값은 180 내지 198㎣이었다. 단독 제제로서, 화합물 (1)(10 및 20mg/kg/adm), 화합물 (2b)(20mg/kg/adm) 및 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg/adm)를 종양 이식 후 11일에서 18일까지 매일 PO 투여하였다. 병용물 그룹에서, 화합물 (1)의 용량은 표 3에 나타낸 바와 같이 각 용량의 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)와 병용되었다.

단독 제제로서, 화합물 (1), 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)는 내약성이 우수하고, 최소 BWL을 유도하였다(도 4 및 표 4).

단독 제제로서, 화합물 (1)(10 및 20mg/kg/adm)은 각각 20% 및 22%의 ΔT/ΔC를 달성한 반면, 화합물 (2b)는 20mg/kg/adm에서 ΔT/ΔC>40%를 나타내었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 화합물 (2a)는 시험된 둘 다의 용량에서 ΔT/ΔC>40%를 나타내었다.

병용물에서, 화합물 (1) 10 또는 20mg/kg/adm 및 화합물 (2b) 20mg/kg/adm으로의 치료는 0의 ΔT/ΔC를 달성하였으며, 화합물 (1) 10mg/kg/adm(전체적으로 p=0.0004)에서 치료학적 상승 작용을 획득하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 화합물 (1) 20mg/kg/adm(전체적으로 p=0.2169)에서는 치료학적 상승 작용을 획득하지는 못했다. 부분 퇴행(PR)이, 화합물 (1) 10mg/kg/adm 및 화합물 (2b) 20mg/kg/adm의 병용 치료의 경우 7마리의 마우스 중 2마리에서 관찰되었다(도 5 및 표 4). 화합물 (1)이 10mg/kg/adm으로 사용될 때, 화합물 (2a) 75 및 50mg/kg/adm과의 병용물은 각각 5%의 ΔT/ΔC 및 ΔT/ΔC<0을 달성하였으며, 두 병용 치료의 경우 7마리의 마우스 중 1마리에서 PR이 관찰되었다(도 6 및 표 4). 표 5에 나타낸 바와 같이, 둘 다의 병용물(각각 전체적으로 p=0.0063 및 p=0.0019)은 치료학적 상승 작용을 달성하였다. 모든 병용물 그룹에서, 종양 정체가 달성되었다(도 5 및 도 6). 하기의 표 12A 및 12B를 또한 참조한다.

제3 연구: HCT 116을 갖는 SCID 마우스에 대한 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg)와 병용된 화합물 (1)(10 및 20mg/kg)의 항종양 활성

치료 시작시 종양 부하량 중간값은 187 내지 189㎣이었다. 단독 제제로서, 화합물 (1)(10 및 20mg/kg/adm) 및 화합물 (2a)(50 및 75mg/kg/adm)를 종양 이식 후 11일에서 20일까지 매일 PO 투여하였다. 병용물 그룹에서, 화합물 (1)의 용량은 표 6에 나타낸 바와 같이 각 용량의 화합물 (2a)와 병용되었다.

단독 제제로서, 화합물 (1) 및 화합물 (2a)는 내약성이 우수하고, 최소 BWL을 유도하였다(도 7 및 표 6).

단독 제제로서, 화합물 (1)은 20mg/kg/adm의 용량에서 34%의 ΔT/ΔC를 달성하고, 10mg/kg/adm의 용량에서 ΔT/ΔC>40%를 달성하였다(도 7). 표 6에 나타낸 바와 같이, 화합물 (2a)는 시험된 둘 다의 용량에서 ΔT/ΔC>40%를 달성하였다.

병용물에서, 화합물 (1) 10 또는 20mg/kg/adm 및 화합물 (2a) 75mg/kg/adm으로의 치료는, 각각 18% 및 9%의 ΔT/ΔC를 달성하였으며(도 10 및 표 6), 치료학적 상승 작용을 획득하였다(각각 전체적으로 p=0.0109 및 p=0.0003)(표 6). 화합물 (1) 10 또는 20mg/kg/adm 및 화합물 (2a) 50mg/kg/adm으로의 치료는 각각 19% 및 22%의 ΔT/ΔC를 달성하였다(도 10 및 표 6). 오직 화합물 (1) 10mg/kg과의 병용물의 경우에서만 치료학적 상승 작용을 획득하였다(전체적으로 p=0.0088)(표 7). 표 7에 나타낸 바와 같이, 화합물 (1) 20mg/kg/adm을 사용한 경우에서는 치료학적 상승 작용을 획득하지 못했다(전체적으로 p=0.0764). 모든 병용물 그룹에서, 종양 정체가 달성되었다(도 8). 하기 표 13을 또한 참조한다.

제4 연구: HCT 116을 갖는 SCID 마우스에 대한 화합물 (2b)(20mg/kg)와 병용된 화합물 (1)(10 및 20mg/kg)의 항종양 활성

치료 시작시 종양 부하량 중간값은 189 내지 196㎣이었다. 단독 제제로서, 화합물 (1)(10 및 20mg/kg/adm) 및 화합물 (2b)(20mg/kg/adm)을 종양 이식 후 11일에서 20일까지 매일 PO 투여하였다. 병용물 그룹에서, 화합물 (2b)의 용량은 표 8에 나타낸 바와 같이 각 용량의 화합물 (1)과 병용되었다.

단독 제제로서, 화합물 (1) 및 화합물 (2b)는 내약성이 우수하고, 최소 BWL을 유도하였다(도 9 및 표 8).

단독 제제로서, 화합물 (1)(10 및 20mg/kg/adm) 및 화합물 (2b)(20mg/kg/adm)는 ΔT/ΔC>40%를 달성하였다(도 10 및 표 8).

병용물에서, 화합물 (1) 10 또는 20mg/kg/adm 및 화합물 (2b) 20mg/kg/adm으로의 치료는, 각각 30% 및 15%의 ΔT/ΔC를 달성하였으며(도 10 및 표 8), 치료학적 상승 작용을 획득하였다(각각 전체적으로 p=0.0002 및 p=0.0008)(표 9). 하기 표 14를 또한 참조한다.

실시예 3. 피하 사람 췌장 MiaPaCa-2를 갖는 누드 마우스에 대한 화합물 (2a) 또는 화합물 (2b)와 병용된 화합물 (1)의 생체내 활성

pan-PI3K 억제제 화합물 (2a)(50mg/kg) 또는 pan-PI3K/mTOR 이중 억제제 화합물 (2b)(30mg/kg)와 병용된 MEK 억제제 화합물 (1)(5mg/kg)의 항종양 활성을 평가하기 위해, 사람 췌장 MiaPaCa-2(KRAS 돌연변이) 이종 이식을 갖는 암컷 누드 마우스를 사용하여 시험을 수행하였다.

5mg/kg의 저용량의 화합물 (1)을 화합물 (2b) 30mg/kg 및 화합물 (2a) 50mg/kg과 병용하여 시험하였다.

물질 및 방법

사람 췌장암 세포주 MiaPaCa-2(American Type Culture Collection, Manassas VA)는 10% 태아 소혈청, 1% 필수아미노산, 1% 나트륨 피루베이트(Life Technologies, Carlsbad, CA)를 함유하는 MEM 배지에서 배양되었다. 세포는 로그 성장기동안 60 내지 85% 컨플루언스에서 트립손화하고, 수집하고 PBS로 1회 세척하였다. 세포를 PBS(Life Technologies, Carlsbad, CA) 내에서 재현탁한 후, 마트리겔(BD Biosciences, San Jose, CA)과 1:1 혼합하였다. 세포들은 이식될 때까지 4℃에 보관하였다.

MiaPaCa-2 세포(200μl PBS: 마트리겔 (1:1) 현탁액 내 10x10⁶)는 암컷 누드(Crl:NU-Foxn1nu) 마우스(6-8주령, Charles River Laboratories, Wilmington, MA)의 오른쪽 옆구리 영역내 피하주사하였다. 본 연구에서 모든 마우스는 EMD-세로노 기관 케어(Serono Institutional Care) 및 동물 사용 위원회(IACUC), #07-003에 의해 승인된 가이드라인을 따라 사용되었다.

물 중 0.5% CMC(카복시메틸셀룰로스; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 0.25% 트윈 20(Acros Organics, Morris Plains, NJ)의 용액이 본 연구의 비히클로서 사용되었다. 화합물 (1)(Lot #27)은 물 중 0.5% CMC 0.25% 트윈 20mL 중 10mg의 화합물을 현탁하여 0.5mg/mL(5.0mg/kg) 투약 용액을 만들어 제조하였다.

화합물 (2a)를 칭량하고(용액 1mL에 대해 5mg) 주사용 물을 가하였다(60%의 최종 용적, 즉 0.60 ml). 용액은 5개 사이클의 와류 및 각 1분간 초음파 수욕(sonicating water bath) 내에서 초음파 처리하여 혼합하였다. 투약을 위해 물을 사용하여 완성하였다. 화합물 (2b)를 칭량하고(용액 1mL에 대해 3mg), 10㎕ HCl 1N을 가한 후 주사용 물을 가하였다(60%의 최종 용적 즉 0.60 ml). 용액을 5개 사이클의 와류 및 각 1분간 초음파 수욕 내에서 초음파 처리하여 혼합하였다. 1N NaOH를 가해 pH를 3까지 조정하고 주사용 물로 최종적으로 완성하였다.

암컷 누드 마우스의 우측 옆구리 영역에 위치된 종양의 발병은 디지털 캘리퍼로 경시적으로 측정하였다. 세포 이식 7일 후, 종양은 충분한 수의 마우스에서 평균 165㎣의 용적에 도달하였으며, 연구를 시작하였다. 평균 종양 용적에서 상당히 다른 종양을 갖는 마우스는 연구에서 배제되었다. 나머지 종양을 가지고 있는 마우스를 랜덤하게 7개의 실험군(n=9)으로 무작위화하여, 각 군이 동일한 평균 종양 용적을 갖도록 하였다.

모든 병용물 그룹에서, 둘 다의 제제는 동시에 서로 약 5 내지 10분 이내에 동물에게 투여되었다. 데이터 평가 목적으로 0일로 지정된 Miapaca-2 세포의 이식한 후 7일째부터 치료를 시작하였다. 동물은 21일간 치료하였다. 체중 및 종양 용적은 치료 시작 후 일주일에 2번씩 평가하였다. 22일째에 모든 동물들은 CO₂로 점진적으로 저산소증을 유발시켜 안락사시켰다.

효능은 종양 용적 및 ΔT/ΔC 퍼센트(%ΔT/ΔC)를 분석함으로써 결정하였다. 종양 용적은 종양 길이(l) 및 너비(w) 측정치를 사용하고, l*w²/2의 식으로 용적을 산출하였다. 길이는 종양의 가장 긴 축을 따라 측정하고 너비는 상기 길이에 수직으로 측정하였다. 치료에 의해 억제된 실제 종양 성장의 평균 퍼센트는 다음과 같이 계산되었다: [%ΔT/ΔC= ((TV_f - TV_i/TV_fCtrl - TV_iCtrl)) x 100%], 여기서, TV=종양 용적, f=최종, i=시작 및 Ctrl=대조군. 내약성(Tolerability)은 치료 기간 동안 체중 차이 퍼센트에 대해 평가하였다. 체중 차이 퍼센트는 하기와 같이 계산되었다: [체중 차이 % = (BW_c - BW_i) / BW_i x 100%], 여기서, BW = 체중, c = 현재, i = 시작이다.

종양 용적 데이터 및 체중 차이 퍼센트는 반복 측정 분산분석(RM-ANOVA)후 터키 사후 다중 쌍대 비교(Tukey's post-hoc multiple pair-wise comparisons)(α = 0.05)로 분석하였다.

생체내 연구 결과

어떤 그룹도 연구 동안 5% 초과의 체중 감소를 경험하지 않았다. 화합물 (2a)(도 11)과의 병용물 또는 화합물 (2b)(도 12)과의 병용물에 대해 어떠한 임상적 징후도 언급되지 않았다.

단독 제제로서, 화합물 (1)(5mg/kg/adm), 화합물 (2a)(50mg/kg/adm) 및 화합물 (2b)(30mg/kg/adm)는 이 검정에서 ΔT/ΔC>40%를 달성하였다(도 13과 14 및 표 10).

병용물에서, 화합물 (1) 5mg/kg/adm 및 화합물 (2b) 30mg/kg/adm으로의 치료는, 27.3%의 ΔT/ΔC를 달성하였으며(도 14 및 표 10), 치료학적 상승 작용을 획득하였다(p<0.05)(표 10). 대조적으로, 화합물 (1) 5mg/kg/adm 및 화합물 (2a) 50mg/kg/adm으로의 치료는 ΔT/ΔC>40%를 달성하였고(도 13 및 표 10), 치료학적 상승 작용을 획득하지 못했다(p>0.05)(표 10).

생체내 결과 요약

여기에 제시된 생체내 작업은 경구의 강력하고 선택적인 알로스테릭 MEK1/2 억제제 화합물 (1)과 경구의 강력하고 특이적인 클래스 I PI3K 지질 키나제 억제제들인 pan-PI3K 억제제 화합물 (2a) 및 pan-PI3K 및 mTOR 이중 억제제 화합물 (2b)의 병용물의 생체내 항종양 활성을 보고한다. 이 작업은 MEK 억제에 대한 민감성을 감소시키는 것으로 알려진 PIKC3A의 활성 돌연변이 및 KRAS의 G13D 활성 돌연변이를 내포하는 사람 결장 암종 HCT 116 이종이식에 대해 및 KRAS 돌연변이를 내포하는 사람 췌장 MiaPaCa-2 이종이식에 대해 수행되었다.

전술한 연구에서, 병용 치료는 치료기 동안 지속적인 종양 정체를 유도하고 치료학적 상승 작용을 실현하는데 매우 효과적이었다.

결론적으로, PIKC3A 및 KRAS 돌연변이 HCT 116 구동 이종이식 모델에서 MEK1/2 억제제 화합물 (1)을 pan-PI3K 억제제 화합물 (2a)와 병용할 때 치료학적 상승 작용과 함께 강력한 항종양 활성이 달성되고, PIKC3A 및 KRAS 돌연변이 HCT 116 구동 이종이식 모델 및 KRAS 돌연변이 MiaPaCa-2 구동 이종이식 모델 둘 다에서 화합물 (1)을 pan-PI3K 및 mTOR 이중 억제제인 화합물 (2b)와 병용하였을 때 치료학적 상승 작용과 함께 강력한 항종양 활성이 달성되었다.

실시예 4. 피하 사람 결장 종양 HCT 116을 갖는 SCID 마우스에 대한 화합물 (2b) 또는 화합물 (2b)와 화합물 (1)의 병용물의 형광 분자 단층촬영 연구

pan-PI3K 억제제 화합물(2a) 또는 pan-PI3K/mTOR 이중 억제제 화합물(2b)와 병용된 MEK 억제제 화합물 (1)의 아폽토시스 활성을 평가하기 위해, 사람 결장 암종 HCT 116(KRAS 및 PIK3CA 돌연변이) 이종 이식을 갖는 암컷 SCID 마우스를 사용하여 시험을 수행하였고, 여기서, 아폽토시스 유도는 형광 분자 단층촬영(fluoresence molecular tomography; FMT)을 사용하여 비-침습적으로 모니터하였다.

방법

HCT116 종양 세포를 SCID 마우스의 견갑골내(intra-scapular) 영역에 피하 이식하였다. 이식된 동물들에 11일부터 17일까지 단독 제제로서 또는 화합물 (1) 10mg/kg과 병용하여 화합물 (2a) 50mg/kg 또는 화합물 (2b) 20mg/kg을 투여하였다. 각 제제는 매일 스케쥴에 따라 경구 경로로 제공되었다. 종양을 캘리퍼로 측정함으로써 실험 전체에 걸쳐 종양 성장을 모니터하였다. 아폽토시스를 정량화하기 위해, 치료 시작후 3일 및 7일에 매일의 치료 1시간후에 형광 아넥신-비보-750(Annexin-Vivo-750)을 정맥내로 주사하였다. 프로브 주사 3시간후 FMT로 동물을 영상화하여 종양내에 형광 아넥신 흡수를 기록하였다. 절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP 검출을 위한 메조 스케일 발견 검정(Meso Scale Discovery assay)를 사용하여 종양 용해물(tumor lysate)에 대해 생체외 아폽토시스를 평가하였다.

결과

이러한 용법하에서, 단독 제제로 사용된 화합물 (1), 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)는 HCT116 종양 성장에 대해 시험 말기에 각각 ΔT/ΔC = 40% (NS), 36%(p= 0.023) 및 80%(NS)의 한계 활성(marginal activity)을 나타내었다(도 28). 반대로, 화합물 (1)과 병용된 화합물 (2a) 및 화합물 (2b) 모두 강력한 종양 성장 억제를 유도하였다(화합물 (2a)/화합물 (1)에 대해 ΔT/ΔC <0과 23% 종양 퇴행 중간값(p<0.0001) 및 화합물 (2b)/화합물 (1)에 대해 ΔT/ΔC <0 및 5% 종양 퇴행 중간값(p= 0.0009)). 둘 다의 병용 요법은 4일간 치료후 생체외 절단된 카스파제-3(3.7 및 5.2배)(도 27b)과 절단된-PARP(8.4 및 12.8 배)(도 27a)의 명백한 증가를 수반하였다. 화합물 (2a)/화합물 (1)의 병용 요법은 종양에서 아넥신-V-750 흡수의 상당한 증가를 수반하였으며, 이는 3일 및 7일의 병용 요법후 아폽토시스 유도를 반영한다(p=0.005 및 <0.0001)(도 26B). 대조군에 대한 동물 치료군에서의 아넥신 형광의 비는 각각 3일 병용 요법후 2.1 및 7일 병용 요법후 3.8이었다(도 26A).

요약

pan-PI3K 억제제 화합물 (2a) 또는 pan-PI3K/mTOR 화합물 (2b)와 MEK1/2 억제제 화합물 (1)의 병용물은 KRAS/PIK3CA 이중 돌연변이 종양 이종이식 모델에서, 둘 다의 병용물에 대한 생체외로 입증된 바와 같이 및 화합물 (2a)/화합물 (1)의 병용물에 대한 종축 FMT 영상을 사용하여 생체내로 입증된 바와 같이, 종양 아폽토시스의 상승적 유도와 함께, 상당히 증강된 항종양 활성을 야기하였다.

실시예 5. 피하 사람 결장 종양 CR-LRB-009C를 갖는 SCID 암컷 마우스에 대한 화합물 (2b) 또는 화합물 (2a)와 병용된 화합물 (1)의 생체내 활성

pan-PI3K 억제제 화합물(2a) 또는 pan-PI3K/mTOR 이중 억제제 화합물(2b)와 병용된 MEK 억제제 화합물 (1)의 항종양 활성을 평가하기 위해, 사람 원발성 결장 종양 CR-LRB-009C(KRAS 및 PIK3CA 돌연변이) 이종 이식을 갖는 암컷 SCID 마우스를 사용하여 시험을 수행하였다. 이 연구에서, 화합물 (1) 20mg/kg을 화합물 (2b) 20mg/kg 또는 화합물 (2a) 75mg/kg과 병용하여 시험하였다.

물질 및 방법

8 내지 10주령의 CB17/lCR-Prkdc 중증 복합형 면역결핍증(SCID)/Crl 마우스들은 찰스 리버 유에스에이에서 수득한 계통이며 찰스 리버 프랑스(Domaine des Oncins, 69210 L'Arbresle, France)에서 사육되었다. 적어도 5일의 적응 시간을 거친후 치료 시작시 마우스들은 18g이 넘었다. 마우스는 멸균수 및 식이(UAR reference 113, Villemoisson, 91160 Epinay sur Orge, France)에 자유롭게 접근할 수 있었다. 마우스들은 12 시간 명/암 사이클로 수용되었다. 동물 유지관리를 포함하는 환경 조건, 실온(22℃±2℃), 상대 습도(55%±15%) 및 점등 시간은 실험실 과학 및 복지(LASW: laboratory animal sciences and welfare) 관리자에 의해 기록되고 보관되었다.

사람 원발성 결장 암종 CR-LRB-009C 종양 모델은 작은 종양 단편을 이식(SC)하여 확립하고, 연속 계대(serial passages)를 이용하여 SCID 암컷 마우스에 유지되었다.

화합물(2a) 및 (2b) 제형은 1N HCl 및 주사용수에서 제조하여 최종 pH는 3이었고, 5개 사이클의 와류 및 초음파 처리를 하였다. 원액은 4℃ 암실에서 7일간 화학적으로 안정하였다. 마우스당 PO 투여 용적은 10mL/kg이었다.

종양 세포의 피하 이식을 위해, 마우스의 옆구리 피부를 알콜이나 베타딘® (Alcyon) 용액을 사용하여 소독하고, 종양 세포와 현탁액을 23 G 니들을 사용하여 0.2mL의 용적으로 한쪽 옆구리에 피하 접종하였다.

단독 제제로서 또는 병용물로 사용되는 화합물 (1), 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)의 투여 용량 및 스케쥴은 결과 섹션 및 하기 표 15 내지 17에 자세히 기재되어 있다.

0일에 주어진 실험을 시작하기 위해 필요한 동물들을 모으고, 한쪽 옆구리에 이식하였다. 치료는 측정 가능한 종양에 투여되었다. 고형 종양은 원하는 용적 범위만큼 성장되도록 하였다(원하는 범위에 속하지 않는 종양을 갖는 동물들은 배제되었다). 이후 마우스들을 모으고 다양한 치료군 및 대조군으로 비선택적으로 분포시켰다. 치료는 CR-LRB-009C 종양 단편 이식후 11일에 시작하였으며, 이를 결과 섹션 및 각 표에 나타내었다. 용량은 치료 시작시 체중을 기초로 하여 mg/kg으로 표시하였다. 매일 마우스들을 확인하고 임상적 부작용을 기록하였다. 마우스 각 그룹은 최저 체중이 도달될 때까지 매일 전체적으로 체중을 측정하였다. 이후, 각 그룹은 실험이 끝날 때까지 매주 1 내지 3회 체중을 측정하였다. 종양은, 종양이 2000㎣에 도달하는 샘플링 시점에 최종 희생될 때까지 또는 동물이 죽을 때까지 (어떤 것이 먼저인지는 상관 없음) 매주 2 내지 3회 캘리퍼로 측정하였다. 고형 종양 용적은 2차원 종양 측정으로부터 추정되고 하기 식에 따라 산출되었다.

종양 중량(mg) = 길이(mm) x 너비² (mm²)/2

제1 효능 종말점은 ΔT/ΔC, 퇴행 퍼센트 중간값, 부분 및 완전 퇴행 (PR 및 CR)이다. 통계적 분석은 SUN4에 대한 SAS 시스템 8.2판 상에서 Everstat V5 소프트웨어 및 SAS 9.2 소프트웨어를 통해 수행되었다. 5% 미만의 확률(p<0.05)이 유의한 것으로 간주되었다.

생체내 연구 결과

치료 시작시 종양 부하량 중간값은 126 내지 144㎣이었다. 단독 제제로서, 화합물 (1)(20mg/kg/adm) 및 화합물 (2b)(20mg/kg/adm) 및 화합물 (2a)(75mg/kg/adm)를 종양 이식 후 11일부터 21일까지 매일 PO 투여하였다. 병용물 그룹에서, 화합물 (1)의 용량은 표 15에 나타낸 바와 같이 각 용량의 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)와 병용되었다.

단독 제제로서 또는 병용물로 사용되는 화합물 (1), 화합물 (2b) 및 화합물 (2a)는 내약성이 있고, 약간의 BWL을 유도하였으나 독성에 이르지는 않는다(도 21 및 표 15). 단독 제제로서, 화합물 (1) 및 화합물 (2b)는 ΔT/ΔC >40%를 달성한 반면 화합물 (2a)는 시험 조건하에서 39%의 ΔT/ΔC를 달성하였다.

병용물에서, 화합물 (1) 20mg/kg/adm 및 화합물 (2b) 20mg/kg/adm으로의 치료는, 4%의 ΔT/ΔC를 달성하였으며(도 22 및 표 15), 표 16에서 나타낸 바와 같이 치료학적 상승 작용을 획득하였다(전체적 분석에 대해 p < 0.0001). 화합물 (1) 20mg/kg/adm 및 화합물 (2a) 75mg/kg/adm으로의 치료는 21%의 ΔT/ΔC를 달성하였으며(도 22 및 표 15), 표 16에 나타낸 바와 같이, 치료학적 상승 작용이 달성되었다(전체적으로 p=0.0386). 또한 표 17을 참조한다.

생체내 결과 요약

여기에 제시된 생체내 작업은 경구의 강력하고 선택적인 알로스테릭 MEK1/2 억제제 화합물 (1)과 경구의 강력하고 특이적인 클래스 I PI3K 지질 키나제 억제제들인 pan-PI3K 억제제 화합물 (2a) 및 pan-PI3K 및 mTOR 이중 억제제 화합물 (2b)의 병용물의 생체내 항종양 활성을 보고한다. 이 작업은 MEK 억제에 대한 민감성을 감소시키는 것으로 알려진 KRAS 및 PIKC3A의 이중 돌연변이를 내포하는 사람 원발성 결장 암종 CR-LRB-009C 이종이식에 대해 수행되었다.

본 연구에서, 병용 치료는 치료기 동안 지속적인 종양 정체를 유도하고 치료학적 상승 작용을 획득하였다.

따라서, PIKC3A- 및 KRAS-돌연변이 CR-LRB-009C 구동 이종이식 모델에서, MEK1/2 억제제 화합물 (1)을 pan-PI3K 억제제 화합물 (2a) 또는 pan-PI3K 및 mTOR 이중 억제제인 화합물 (2b)와 병용하였을 때 치료학적으로 상승된 강력한 항종양 활성을 달성하였다.

실시예 6. 피하 사람 결장 종양 CR-LRB-013P를 갖는 SCID 암컷 마우스에 대한 화합물 (2a) 또는 화합물 (2b)와 병용된 화합물 (1)의 생체내 활성

pan-PI3K 억제제 화합물 (2a) 또는 이중 pan-PI3K/mTOR 억제제 화합물 (2b)와 병용된 MEK 억제제 화합물 (1)의 항종양 활성을 평가하기 위해, 사람 원발성 결장 종양 CR-LRB-013P(KRAS 돌연변이) 이종 이식을 갖는 암컷 SCID 마우스를 사용하여 시험을 수행하였다. 이 연구에서, 화합물 (1) 20mg/kg을 화합물 (2b) 20mg/kg 또는 화합물 (2a) 75mg/kg과 병용하여 시험하였다.

물질 및 방법

8 내지 10주령의 CB17/lCR-Prkdc 중증 복합형 면역결핍증(SCID)/Crl 마우스들은 찰스 리버 유에스에이에서 수득한 계통으로 찰스 리버 프랑스(Domaine des Oncins, 69210 L'Arbresle, France)에서 사육되었다. 적어도 5일의 적응 시간을 거친후 치료 시작시 마우스들은 18g이 넘었다. 마우스는 멸균수 및 식이(UAR reference 113, Villemoisson, 91160 Epinay sur Orge, France)에 자유롭게 접근할 수 있었다. 마우스들은 12 시간 명/암 사이클로 수용되었다. 동물 유지관리를 포함하는 환경 조건, 실온(22℃±2℃), 상대 습도(55%±15%) 및 점등 시간은 LASW 관리자에 의해 기록되고 보관되었다.

사람 원발성 결장 암종 CR-LRB-013P 종양 모델은 작은 종양 단편을 이식(SC)하여 확립하고, 연속 계대를 이용하여 SCID 암컷 마우스에 유지되었다.

종양 세포의 피하 이식을 위해, 마우스의 옆구리 피부를 알콜이나 베타딘®(Alcyon) 용액을 사용하여 소독하고, 종양 세포 현탁액을 23 G 니들을 사용하여 0.2mL의 용적으로 한쪽 옆구리에 피하 접종하였다.

단독 제제로서 또는 병용물로 사용되는 화합물 (1), 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)의 투여 용량 및 스케쥴은 결과 섹션에 기재되어 있고 하기 표에 상세하게 기재되어 있다.

0일에 주어진 실험을 시작하기 위해 필요한 동물들은 모으고, 한쪽 옆구리에 이식하였다. 치료는 측정 가능한 종양에 투여되었다. 고형 종양은 원하는 용적 범위만큼 성장되도록 하였다(원하는 범위가 아닌 종양을 갖는 동물들은 배제되었다). 이후 마우스들을 모으고 다양한 치료군 및 대조군으로 비선택적으로 분포시켰다. 치료는 CR-LRB-013P 종양 단편 이식후 33일에 시작하였으며, 이를 결과 섹션 및 각 표에 나타내었다. 용량은 치료 시작시 체중을 기초로 하여 mg/kg으로 표시하였다. 매일 마우스들을 확인하고 임상적 부작용을 기록하였다. 마우스 각 그룹은 최저 체중이 도달될 때까지 매일 전체적으로 체중을 측정하였다. 이후, 각 그룹은 실험이 끝날 때까지 매주 1 내지 3회 체중을 측정하였다. 종양은, 종양이 2000㎣에 도달하는 샘플링 시점에 최종 희생될 때까지 또는 동물이 죽을 때까지(어떤 것이 먼저인지는 상관 없음) 매주 2 내지 3회 캘리퍼로 측정하였다. 고형 종양 용적은 2차원 종양 측정으로부터 추정되고 하기 식에 따라 산출되었다.

종양 중량(mg) = 길이(mm) x 너비² (mm²)/2

제1 효능 종말점은 ΔT/ΔC, 퇴행 퍼센트 중간값, 부분 및 완전 퇴행(PR 및 CR)이다. 통계적 분석은 SUN4에 대한 SAS 시스템 8.2판 상에서 Everstat V5 소프트웨어 및 SAS 9.2 소프트웨어를 통해 수행되었다. 5% 미만의 확률(p<0.05)이 유의한 것으로 간주되었다.

생체내 연구 결과

치료 시작시 종양 부하량 중간값은 144 내지 162㎣이었다. 단독 제제로서, 화합물 (1)(20mg/kg/adm) 및 화합물 (2b)(20mg/kg/adm) 및 화합물 (2a)(75mg/kg/adm)를 종양 이식 후 33일부터 50일까지 매일 PO 투여하였다. 병용물 그룹에서, 화합물 (1)의 용량은 표 18에 나타낸 바와 같이 각 용량의 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)와 병용되었다.

단독 제제로서 또는 병용물로 사용되는 화합물 (1), 화합물 (2b) 및 화합물 (2a)는 내약성이 있고, 약간의 BWL을 유도하였으나 독성에 이르지는 않는다(도 23 및 표 18). 시험 조건하에서 단독 제제로서, 화합물 (2a) 및 화합물 (2b)는 ΔT/ΔC>40%를 달성한 반면, 화합물 (1)는 30%의 ΔT/ΔC를 달성하였다.

병용물에서, 화합물 (1) 20mg/kg/adm 및 화합물 (2b) 20mg/kg/adm으로의 치료는, 1/7의 부분 퇴행과 함께 26%의 ΔT/ΔC를 달성하였으며(도 24 및 표 18), 표 19에서 나타낸 바와 같이 치료학적 상승 작용을 획득하였다(전체적 분석에 대해 p = 0.0302). 화합물 (1) 20mg/kg/adm 및 화합물 (2a) 75mg/kg/adm으로의 치료는 5/7의 부분 퇴행과 함께 -5%의 ΔT/ΔC를 달성하였으며(도 24 및 표 18), 표 19에 나타낸 바와 같이, 치료학적 상승 작용이 달성되었다(전체적으로 p<0.0001). 또한 표 20을 참조한다.

생체내 결과 요약

여기에 제시된 생체내 작업은 경구의 강력하고 선택적인 알로스테릭 MEK1/2 억제제 화합물 (1)과 경구의 강력하고 특이적인 클래스 I PI3K 지질 키나제 억제제들인 pan-PI3K 억제제 화합물 (2a) 및 pan-PI3K 및 mTOR 이중 억제제 화합물 (2b)의 병용물의 생체내 항종양 활성을 보고한다. 이 작업은 KRAS 돌연변이를 내포하는 사람 원발성 결장 암종 CR-LRB-013P 이종이식에 대해 수행되었다.

본 연구에서, 병용 치료는 치료기 동안 지속적인 종양 정체 또는 부분 퇴행을 유도하고 치료학적 상승 작용을 획득하였다.

따라서, KRAS 돌연변이 CR-LRB-013P 구동 이종이식 모델에서, MEK1/2 억제제 화합물 (1)을 pan-PI3K 억제제 화합물 (2a) 또는 pan-PI3K 및 mTOR 이중 억제제인 화합물 (2b)와 병용하였을 때, 강력한 항종양 활성과 치료학적 상승 작용이 달성되었다.

실시예 7. 종양 투과성 평가

하기 실험은 화합물 (2a) 및 화합물 (2b) 단독 또는 이와 화합물 (1)과의 병용물의 종양 혈관 투과성에 대한 영향을 평가하기 위해 수행되었다.

방법

HCT116 종양 세포를 SCID 마우스의 견갑골내 피하 이식하였다. 이식된 동물들은 11일부터 13일까지 단독으로 또는 화합물 (1) 10mg/kg과 병용하여 화합물 (2a) 50mg/kg 또는 화합물 (2b) 20mg/kg을 투여받았다(그룹당 5마리). 각 제제는 매일 스케쥴에 따라 경구 경로로 제공되었다. 종양을 캘리퍼로 측정함으로써 실험 전체에 걸쳐 종양 성장을 모니터하였다. 종양 혈관 투과성을 정량하기 위해, 13일째 마지막 치료 4시간 후에, 0.5% 에반스 블루 iv 주사 30분 후 및 덱스트란-피트(Dextran-Fitc) 100mg/kg iv 주사 2분 후, 케타민/실라진(120/6mg/kg ip) 마취하에 종양을 절제하였다. 이후 종양을 스냅 동결하고(snap frozen), 형광 정량화를 위해 25μm 섹션을 수득하였다. 종양 섹션은 혈관 덱스트란-피트 측정을 위해 Icyte로 488nm에서, 에반스-블루 혈관외 유출 측정을 위해 633nm에서 영상화하였다. 각각의 형광은 형광 강도의 인테그럴 팬텀(integral phantoms)의 합으로 정량화되었으며, 에반스-블루 신호/덱스트란-피트 신호의 평균 비로 표시되었다.

결과

진행된 피하 이식된 HCT116 사람 KRAS/PI3KCA 돌연변이 결장 암종에서 이러한 시험 조건하에서, 단독 제제로 사용된 화합물 (1)과 화합물 (2a) 및 화합물 (2a)/화합물(1)의 병용물은 종양 투과성을 상당히 변경하지 않았으며, 각각 대조군에 대비하여 에반스-블루/덱스트란-피트 비율의 -9%, -8% 및 4% 감소를 나타내었다. 반면 화합물 (2b) 또는 화합물 (2b)/화합물 (1)의 병용물로 3일간 치료는 명백한 에반스-블루/덱스트란-피트 비율의 변화를 유도하였으며, 단독 제제의 경우 50% 감소를 나타내고 병용물의 경우 45% 감소를 나타내었다. 도 25를 참조한다.

요약

단독 제제로서 또는 화합물 (1)과 병용하여 사용된 화합물 (2b)는 진행된 피하 이식된 HCT116 사람 KRAS/PI3KCA 돌연변이 결장 암종에서 치료 3일 후 종양 혈관 투과성을 변화시킨다. 이러한 HCT116 종양 혈관 투과성 변화는 FMT 영상화를 위한 생체내 형광-아넥신 종양 분포를 파괴시키고 이 방법에 의한 아폽토시스 검출을 방해한다.

치료 시작시 종양 크기는 162 내지 352㎣이었고, 그룹당 종양 부하량 중간값은 198 내지 221㎣이었다. 약물 제형: 화합물 (1) = 물 중 카복시메틸셀룰로스 0.5%, 트윈 20 0.25%; 화합물 (2b) = 물, pH3; 화합물 (2a) = 물. 치료 지속시간: 화합물 (1), 화합물 (2b), 화합물 (2a) 및 병용물 = 8일. 사용된 약어: BWL = 체중 감소, ΔT/ΔC=치료군 및 대조군간 기준선 중간값으로부터 종양 용적의 변화 비율 (TVday - TV0) / (CVday - CV0) * 100, HNTD = 최고 비독성 용량, HDT = 시험된 최고 용량.

^a 각 병용물을 파라미터 종양 용적(SAS 9.2 소프트웨어의 proc mixed)에 대한 반복 측정(시간 인자)을 사용하는 2-원 분산분석에서 얻어진 추정치를 사용하여 가장 효과가 우수한 단독 제제와 비교하였다. 5% 미만의 확률(p<0.05)이 유의한 것으로 간주되었다.

치료 시작시 종양 크기는 126 내지 294㎣이었고, 그룹 당 종양 부하량 중간값은 180 내지 198㎣이었다. 약물 제형: 화합물 (1) = 물 중 카복시메틸셀룰로스 0.5%, 트윈 20 0.25%; 화합물 (2b) = 물, pH3; 화합물 (2a) = 물. 치료 지속시간: 화합물 (1), 화합물 (2b), 화합물 (2a) 및 병용물 = 8일. 사용된 약어: BWL = 체중 감소, △T/△C =치료군 및 대조군간 기준선 중간값으로부터 종양 용적의 변화 비율 (TVday - TV0) / (CVday - CV0) * 100, HNTD = 최고 비독성 용량, HDT = 시험된 최고 용량.

^a 17일째, 마우스는 10mg/kg 대신 20mg/kg을 투여받았다.

치료 시작시 종양 크기는 112 내지 319㎣이었고, 그룹 당 종양 부하량 중간값은 187 내지 189㎣이었다. 약물 제형: 화합물 (1) = 물 중 카복시메틸셀룰로스 0.5%, 트윈 20 0.25%; 화합물 (2a) = 물. 치료 지속시간: 화합물 (1), 화합물 (2a) 및 병용물 = 10일. 사용된 약어: BWL = 체중 감소, ΔT/ΔC = (TVday - TV0) / (CVday - CV0) * 100, HNTD = 최고 비독성 용량, HDT = 시험된 최고 용량.

치료 시작시 종양 크기는 144 내지 294㎣이었고, 그룹 당 종양 부하량 중간값은 189 내지 196㎣이었다. 약물 제형: 화합물 (1) = 물 중 카복시메틸셀룰로스 0.5%, 트윈 20 0.25%; 화합물 (2b) = 물, pH3. 치료 지속시간: 화합물 (1), 화합물 (2b) 및 병용물 = 10일. 사용된 약어: BWL = 체중 감소, ΔT/ΔC = (TVday - TV0) / (CVday - CV0) * 100, HNTD = 최고 비독성 용량, HDT = 시험된 최고 용량.

치료에 의해 억제된 실제 Miapaca-2 종양 성장의 평균 퍼센트는 다음과 같이 산출되었다: [%ΔT/ΔC= (TV_f - TV_i/TV_fCtrl - TV_iCtrl) x 100%], 여기서, TV=종양 용적, f = 최종, i = 시작 및 Ctrl = 대조군.

[표 11A]

[표 11B]

[표 12A]

[표 12B]

치료 시작시 종양 크기는 100 내지 221㎣이었고, 그룹 당 종양 부하량 중간값은 126 내지 144㎣이었다. 약물 제형: 화합물 (1) = 물 중 카복시메틸셀룰로스 0.5%, 트윈 20 0.25%; 화합물 (2b) 및 화합물 (2a) = 물, pH3. 치료 지속시간: 화합물 (1), 화합물 (2a), 화합물 (2b) 및 병용물 = 11일. 사용된 약어: BWL = 체중 감소, △T/△C =치료군 및 대조군간 기준선 중간값으로부터 종양 용적의 변화 비율 (TVday - TV0) / (CVday - CV0) * 100, HDT = 시험된 최고 용량.

치료 시작시 종양 크기는 108 내지 245㎣이었고, 그룹 당 종양 부하량 중간값은 144 내지 162㎣이었다. 약물 제형: 화합물 (1) = 물 중 카복시메틸셀룰로스 0.5%, 트윈 20 0.25%; 화합물 (2b) 및 화합물 (2a) = 물, pH3. 치료 지속시간: 화합물 (1), 화합물 (2a), 화합물 (2b) 및 병용물 = 18일. 사용된 약어: BWL = 체중 감소, △T/△C =치료군 및 대조군간 기준선 중간값으로부터 종양 용적의 변화 비율 (TVday - TV0) / (CVday - CV0) * 100, HDT = 시험된 최고 용량.

현재 본 발명의 바람직한 양태로 간주되는 것들이 보여지고 기술되었으나, 당업자는 첨부된 특허청구범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 가할 수 있다.

Claims

화학식 1을 갖는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및
화학식 2a 및 2b로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물:
화학식 1

화학식 2a

화학식 2b
제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물 및 상기 화학식 2a 또는 화학식 2b의 화합물이, 상기 조성물을 환자에게 투여하는 경우 환자에서 종양 용적을 감소시키는데 있어서 상승 효과를 나타내는 양으로 존재하는, 조성물.
화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 화학식 2a 또는 화학식 2b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 병용하여 치료학적 유효량으로 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 환자를 치료하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 유효량이 상기 환자에서 종양 용적을 감소시키는데 있어서 상승 효과를 달성하는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 유효량이 상기 환자에서 종양 정체(tumor stasis)를 달성하는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 암이 비-소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 간암, 전립선암, 방광암, 자궁경부암, 갑상선암, 직장결장암, 간암, 근육암, 혈액암, 흑색종, 자궁내막암 및 췌장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 암이 직장결장암, 자궁내막암, 혈액암, 갑상선암, 유방암, 흑색종, 췌장암 및 전립선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 방법이 화학식 2a의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 방법이 화학식 2b의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
(A) 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 (B) 화학식 2a 또는 화학식 2b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 치료학적 유효량으로 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 병용물.
(A) 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; (B) 화학식 2a 또는 화학식 2b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 (C) 사용 설명서를 포함하는 키트.
(A) 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 (B) 화학식 2a 또는 화학식 2b의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 치료학적 유효량으로 포함하는 병용물의, 암 치료에 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한 용도.