KR20140011086A - Kit and method for detecting food-borne bacteria - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 식중독균 검출 키트 및 이를 이용하여 3종의 식중독균을 동시에 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a food poisoning bacteria detection kit and a method for simultaneously detecting three food poisoning bacteria using the same.
항체(antibody)의 대체물질로 인식되는 앱타머는 항체와 마찬가지로 검출분석시스템에서 분자를 인식할 수 있는 바이오센서의 요소로 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 기반의 앱타머는 단백질 기반의 항체에 비하여 몇 가지 장점을 가지는데 첫째, 앱타머의 수득은 생체 외(in vitro)에서 이루어지며, 둘째, 독소를 비롯한 다양한 유기물과 무기물들이 앱타머의 표적 분자로 이용될 수 있으며, 셋째, 일단 표적분자에 특이적으로 결합하는 특정 앱타머가 확인되어 수득되면 자동화된 올리고머 합성방법에 의해 낮은 비용과 높은 일관성(batch-consisitency)으로 재생산이 가능하다. 또한, 앱타머는 형광분자 또는 광반응성 그룹 등과 같은 유용한 기능 그룹들을 도입하는 것이 항체에 비해 상대적으로 용이하며, 그 구조도 열에 의한 변성-회복과정(denaturation-renaturation)이 가역적이므로 항체에 비해 긴 시간의 활성을 가질 수 있다.Aptamers recognized as replacements for antibodies can be used as components of biosensors that can recognize molecules in detection and analysis systems, just like antibodies. Oligonucleotide-based aptamers have several advantages over protein-based antibodies. First, the aptamer is obtained in vitro, and second, various organic and inorganic materials including toxins can be used as target molecules of the aptamer, and third, specific binding to the target molecule. Once aptamers have been identified and obtained, they can be reproduced with low cost and high batch-consisitency by automated oligomer synthesis. In addition, aptamers are relatively easy to introduce useful functional groups, such as fluorescent molecules or photoreactive groups, and their structure is reversible due to thermal denaturation-renaturation. It can have activity.
이러한 장점을 지난 앱타머 중 RNA 앱타머는 반복된 생체 외 선별과정을 통해 임의의 RNA 라이브러리로부터 특이적인 RNA분자, 즉 앱타머를 선별하는데, RNA라이브러리의 사이즈가 크고 생체 외 효소작용에 의하므로 RNA 라이브러리는 고 친화도 앱타머를 선별하기 위한 다른 생물학적 라이브러리 또는 합성 라이브러리보다 우수하다. 이리하여 치료제로서 RNA 앱타머의 잠재적인 용도에 대한 흥미가 증가하고 있으며 고 친화도 RNA 앱타머는 SELEX 과정에 의해 선별될 수 있다.Of these aptamers, RNA aptamers select specific RNA molecules, namely aptamers, from random RNA libraries through repeated in vitro screening. RNA libraries are large because of their large library size and in vitro enzymatic reactions. Is superior to other biological or synthetic libraries for screening high affinity aptamers. Thus there is increasing interest in the potential use of RNA aptamers as therapeutic agents and high affinity RNA aptamers can be selected by the SELEX process.
또한, RNA 앱타머는 표적 단백질에 넓은 결합부위를 제공하기 때문에 작은 화학물질보다 억제제로서 이점이 있다. 또한, 병리학적인 단백질-단백질 상호작용은 RNA 앱타머의 훌륭한 표적이 될 수 있는데 이는 고 친화도 RNA가 표적 단백질에 결합하여 복합체에서 다른 단백질과의 결합을 방해하기 때문이다. 더욱이 RNA 앱타머는 세포에서 RNA 벡터시스템을 이용하여 인트라머로 발현될 수 있다.RNA aptamers also have an advantage as inhibitors rather than small chemicals because they provide a broad binding site for the target protein. In addition, pathological protein-protein interactions can be a good target for RNA aptamers because high affinity RNA binds to the target protein and interferes with binding to other proteins in the complex. Moreover, RNA aptamers can be expressed as intramers in cells using RNA vector systems.
그리하여 이러한 앱타머를 이용한 다양한 검출 키트에 대한 특허들이 제안된 바 있으나, 대장균, 살모넬라 및 포도상구균을 한번에 검출할 수 있는 RNA 앱타머를 이용한 검출 키트에 대해서는 공개되어 있지 않은 실정이다.Thus, although patents for various detection kits using such aptamer have been proposed, a detection kit using an RNA aptamer capable of detecting E. coli, Salmonella, and Staphylococci at a time is not disclosed.
일 구체예는 3종의 RNA 앱타머를 포함하는 식중독균 검출 키트를 제공한다.One specific example provides a food poisoning bacteria detection kit comprising three kinds of RNA aptamers.
다른 구체예는 상기 검출 키트를 사용하여 3종의 식중독균을 동시에 검출하는 방법을 제공한다.Another embodiment provides a method for detecting three kinds of food poisoning bacteria simultaneously using the detection kit.
일 양상은 살모넬라(Salmonella typhimurium)의 ompC 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머;One aspect is Salmonella an RNA aptamer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 which specifically binds to the ompC protein of typhimurium ;
포도상구균(Staphylococcus aureus)의 테이코산(teichoic acid)에 특이적으로 결합하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머; 및 Staphylococcus an aptamer comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 which specifically binds to teichoic acid of aureus ; And
대장균(Escherichia coli) O157:H7의 LPS(lipopolysaccharide)에 특이적으로 결합하는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머를 포함하는 식중독균 검출 키트를 제공한다. Escherichia coli ) And an RNA aptamer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, which specifically binds to LPS (lipopolysaccharide) of O157: H7.
본 명세서에서 용어, "앱타머(aptamer)"는 높은 친화도 및 특이성으로 표적 단백질과 결합할 수 있는 짧은 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 이러한 앱타머들은 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 효율적으로 그 기능을 억제하는 등, 표적 단백질을 검출하고, 그 기능을 알아내는데 이용될 수 있다.As used herein, the term "aptamer " refers to a short strand of oligonucleotides capable of binding a target protein with high affinity and specificity, and these aptamers are capable of specifically binding to a target protein But can be used to detect a target protein and to find out its function, such as efficiently suppressing its function.
본 발명에서 사용된 RNA 앱타머는 3종으로, 살모넬라, 포도상구균 및 대장균 O157:H7을 동시에 검출하기 위한 수단으로 사용될 수 있으며, 상기 RNA 앱타머는 각각 살모넬라의 ompC 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열, 포도상구균의 테이코산(teichoic acid)에 특이적으로 결합하는 서열번호 2의 염기서열 및 대장균 O157:H7의 LPS(lipopolysaccharide)에 특이적으로 결합하는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 상기 염기서열에 임의의 염기서열을 추가로 포함하는 것이라도 상기 특이적 결합에 영향을 미치지 않은다면, 실질적으로 상기 RNA 앱타머와 동일하다고 볼 수 있다.The RNA aptamer used in the present invention is classified into three species, Salmonella, Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157: H7, wherein the RNA aptamer is selected from the group consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 which specifically binds to ompC protein of Salmonella, the nucleotide sequence which specifically binds to teichoic acid of Staphylococcus aureus The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, It is preferable that the polypeptide has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 that specifically binds to LPS (lipopolysaccharide) of O157: H7, but even if the nucleotide sequence additionally contains an arbitrary nucleotide sequence does not affect the specific binding , It can be regarded as substantially the same as the RNA aptamer.
일 구체예에 따르면, 상기 RNA 앱타머는 링커를 통해 고체 지지체에 고정되어 있는 것일 수 있다.According to one embodiment, the RNA aptamer may be anchored to a solid support via a linker.
상이한 RNA 앱타머들은 고체 지지체에 부착될 수 있고 시료 내의 서로 다른 식중독균을 동시에 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 형광 파장을 갖는 검출가능한 표지를 서로 다른 앱타머에 사용할 수 있고, 그에 따라 서로 다른 식중독균에 대한 특이적인 결합에 의해 각각의 식중독균이 동시에 검출될 수 있도록 한다. Different RNA aptamers can be attached to solid supports and can be used to simultaneously detect different food poisoning bacteria in a sample. For example, detectable labels with different fluorescence wavelengths can be used for different aptamers, thereby allowing each food poisoning bacteria to be detected simultaneously by specific binding to different food poisoning bacteria.
상기 앱타머의 고정을 위한 고체 지지체의 바람직한 형태의 예는 금, 은과 같은 금속 플레이트, 폴리스티렌, 아비딘 코팅된 폴리스티렌 비드 셀룰로즈, 나일론, 아크릴아미드 겔 및 활성화된 덱스트란, 통제된 공극 유리(controlled pore glass: CPG), 유리 플레이트 및 고 교차-결합(highly cross-linked) 폴리스티렌을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 이러한 고체 지지체들은 화학적 안정성, 기능화(functionalization)의 용이함 및 잘 규정된 표면 면적 때문에 혼성화 및 진단 연구에서 바람직하게 사용될 수 있다.Examples of preferred forms of the solid support for fixing the aptamer include metal plates such as gold and silver, polystyrene, avidin coated polystyrene bead cellulose, nylon, acrylamide gel and activated dextran, controlled pore glass glass: CPG), glass plates, and highly cross-linked polystyrenes. These solid supports can be advantageously used in hybridization and diagnostic studies due to their chemical stability, ease of functionalization and well defined surface area.
한편, 상기 앱타머는 고체 지지체에 다양한 방식으로 부착될 수 있다. 예를 들면, 상기 앱타머는 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드를 상기 고체 지지체에 부착하는 것에 의해 상기 고체 지지체에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 상기 앱타머는 고체 지지체로부터 거리를 두도록 하는 링커에 의해 상기 고체 지지체에 부착될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에 부착하는데 사용할 수 있는 다양한 종류의 링커가 당업계에 알려져 있다. 링커는 표적 물질이 고체 지지체에 부착된 앱타머와 결합하는 것을 현저하게 방해하지 않는 임의의 화합물로 형성될 수 있다. 링커는 자동화된 합성에 의해 링커에 쉽게 첨가될 수 있는 동종중합체 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 폴리 A tail)로 형성될 수 있다. 또는, 기능화된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머가 상기 링커로서 사용될 수 있다.On the other hand, the aptamer can be attached to the solid support in various ways. For example, the aptamer can be attached to the solid support by attaching 3 ' or 5 ' terminal nucleotides to the solid support. Preferably, the aptamer can be attached to the solid support by a linker that leaves a distance from the solid support. A variety of linkers are known in the art that can be used to attach oligonucleotides to solid supports. The linker may be formed of any compound that does not significantly interfere with binding of the target substance to the aptamer attached to the solid support. Linkers can be formed of homopolymeric oligonucleotides (e.g., poly A tail) that can be easily added to the linker by automated synthesis. Alternatively, polymers such as functionalized polyethylene glycols may be used as the linker.
일 구체예에 따르면, 상기 RNA 앱타머는 말단에 검출가능한 표지를 더 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment, the RNA aptamer may further comprise a detectable label at its terminus.
용어 "검출가능한 표지(detectable label)"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자의 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자로, 상기 검출 가능한 표지는 형광물질일 수 있으며, 예를 들어, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Cy2, Cy3.18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR Green, YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 및 티아졸 오렌지(thiazole orange) 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.The term "detectable label" is an atom or molecule that allows the detection of a molecule including a label, among molecules of the same kind without a label, wherein the detectable label may be a fluorescent material, For example, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, 18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44 SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, Green, YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 And thiazole orange. However, the present invention is not limited thereto.
일 구체예에 따르면, 상기 키트는 서열번호 1 내지 3의 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머 내의 우라실(U) 및 시토신(C)의 2' 히드록실기가 플루오르로 치환된 것일 수 있다. 이러한 변형으로 인해, 상기 RNA 앱타머는 RNA 분해효소에 쉽게 분해되지 않도록 하여 좀더 안정적이고, 효율적으로 식중독균을 검출하는데 사용될 수 있다.
According to one embodiment, the kit may be one in which the 2 'hydroxyl group of uracil (U) and cytosine (C) in the RNA aptamer containing the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 3 is substituted with fluorine. Due to such a modification, the RNA aptamer is not easily degraded to the RNA degrading enzyme, so that the RNA aptamer can be more stably and efficiently used for detecting food poisoning bacteria.
다른 양상은 식중독균을 포함하는 생물학적 시료를 상기 식중독균 검출 키트와 접촉시키는 단계; 및 상기 키트 내의 RNA 앱타머와 식중독균의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 식중독균 검출 방법을 제공한다.Another aspect is a method for detecting a pathogenic bacterium comprising contacting a biological sample containing food poisoning bacteria with the food poisoning bacteria detection kit; And confirming whether or not the RNA aptamer and the food poisoning bacteria are bound to each other in the kit.
상기 식중독균을 포함하는 생물학적 시료는 예를 들어, 식중독균이 포함되어 있을 것이라 의심되는 시료(예를 들어, 식품 등)를 당업계에 공지된 배지에 접종하고 배양하여 얻은 균체일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 완충액 등에 적절한 농도로 희석하여 상기 키트에 직접적으로 접촉시켜 상기 키트 내의 앱타머와 결합을 유도시킬 수 있다.The biological sample containing the food poisoning bacterium may be, for example, a cell obtained by inoculating and culturing a sample (for example, food or the like) suspected of containing food poisoning bacteria in a medium known in the art. The biological sample may be diluted to an appropriate concentration in a buffer or the like and directly contacted with the kit to induce binding with the aptamer in the kit.
일 구체예에 따르면, 상기 식중독균은 살모넬라(Salmonella typhimurium), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli) O157 : H7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 3종의 식중독균을 동시에 검출하는 것일 수 있다.According to one embodiment, the food poisoning bacterium is Salmonella typhimurium , Staphylococcus aureus ), Escherichia coli ) O157 : H7 , and most preferably may be one which simultaneously detects the above three food poisoning bacteria.
상기 키트 내의 RNA 앱타머와 식중독균의 결합 여부를 확인하기 위해, 광학현미경을 사용할 수 있다. 또는, 상기 RNA 앱타머에 검출가능한 표지(예를 들어, 형광물질)가 포함되어 있는 경우라면 상기 검출가능한 표지의 검출 여부를 확인할 수 있다.An optical microscope can be used to confirm the binding of RNA aptamer and food poisoning bacteria in the kit. Alternatively, if the RNA aptamer contains a detectable label (e.g., a fluorescent substance), the detection of the detectable label can be confirmed.
일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하면, 3종의 식중독균을 동시에 효율적으로 검출할 수 있다.When the kit for detecting food poisoning bacteria according to one embodiment is used, three kinds of food poisoning bacteria can be efficiently detected at the same time.
도 1은 일 구체예에 따른 식중독균 검출 키트의 예시로서, 슬라이드 칩 상에서 형성된 앱타머-세균 결합체 모형을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 일 구체예에 따른 식중독균 검출 키트의 형태를 나타낸 것이다.
도 3은 일 구체예에 따른 식중독균 검출 키트를 사용하여 영상처리를 통해 3종의 식중독균을 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다. (a)는 본 발명에 따른 3종의 앱타머가 칩 상에 고정된 위치를 나타내고, (b)는 3종의 식중독균의 접촉 전 초기 칩의 영상을 나타내며, (c)는 3종의 식중독균과 본 발명에 따른 3종의 앱타머가 고정된 칩을 접촉시킨 후, 식중독균의 검출 결과를 나타낸 영상이다.Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a diagram illustrating an example of a food poisoning bacteria detection kit according to one embodiment, which is a model of an aptamer-bacterial complex formed on a slide chip.
FIGS. 2A and 2B show a form of a food poisoning bacteria detection kit according to an embodiment.
FIG. 3 shows the results of simultaneous detection of three kinds of food poisoning bacteria through image processing using the food poisoning bacteria detection kit according to one embodiment. (a) shows the positions of the three kinds of aptamers according to the present invention fixed on the chip, (b) shows images of the initial chip before contact of the three kinds of food poisoning bacteria, (c) 3 is a view showing detection results of food poisoning bacteria after contacting three kinds of aptamers according to the invention with a fixed chip.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, one or more embodiments will be described in more detail by way of examples. However, these embodiments are intended to illustrate one or more embodiments, and the scope of the invention is not limited to these embodiments.
실시예 1: 3종의 식중독균 검출을 위한 RNA 앱타머의 제작Example 1: Preparation of RNA aptamer for detection of three food poisoning bacteria
본 발명에서 사용된 RNA 앱타머는 살모넬라(Salmonella typhimurium)의 세포 표면에 존재하는 세포막 단백질인 OmpC(Outer Membrane Porin protein C) 단백질을 항원으로 하여 OmpC 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머(서열번호 1), 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 세포벽 성분 중 하나인 테이코산(teichoic acid)에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머(서열번호 2), 대장균(Escherichia coli) O157:H7의 LPS(lipopolysaccharide)에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머(서열번호 3)이다.The RNA aptamer used in the present invention is an RNA aptamer that specifically binds to an OmpC protein using an OmpC (Outer Membrane Porin protein C) protein, which is a cell membrane protein existing on the cell surface of Salmonella typhimurium , as an antigen ), An RNA aptamer (SEQ ID NO: 2) that specifically binds to one of the cell wall components of Staphylococcus aureus , teichoic acid, Escherichia (SEQ ID NO: 3) that specifically binds to LPS (lipopolysaccharide) of E. coli O157: H7 .
서열번호 1의 앱타머는 43 mer이고, 서열번호 2의 앱타머는 92 mer이며, 서열번호 3의 앱타머는 99 mer로서 상기 앱타머들의 기본 골격은 상기 각각의 세균이 특이적으로 결합이 가능하도록 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)라고 칭하는 생체외 리간드선별증폭법에 의해 제작하였다(조용진 등. 식품나노기술개발. 연구보고서 E0111300-11102, 한국식품연구원, 성남 (2011)).The aptamer of SEQ ID NO: 1 is 43 mers, the aptamer of SEQ ID NO: 2 is 92 mers, the aptamer of SEQ ID NO: 3 is 99 mers, and the basic framework of the aptamers is SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (Cho YJ, et al., Food and Nano Technology Development Research Report E0111300-11102, Korea Food Research Institute, Seongnam (2011)).
상기 앱타머들은 RNA 내의 피리미딘(C 및 U)의 2' 탄소에 플루오르(F)를 붙여서 오염원의 RNase에 대한 저항성을 부여하여 RNA 분자의 안정성을 증가시켰다는 특징을 갖는다. 또한, 이 앱타머 분자와 결합하는 dT-리간드 분자와의 결합을 위해 3' 말단에 A가 16개의 반복된 poly(A) tail이 추가되었다.The aptamers are characterized in that fluorine (F) is attached to the 2 'carbon of pyrimidine (C and U) in the RNA to increase the stability of the RNA molecule by imparting resistance to contaminating RNase. In addition, 16 repeating poly (A) tails were added at the 3 'end to bind to the dT-ligand molecule bound to this aptamer molecule.
한편, 상기 앱타머를 기판에 고정화하거나, 검출가능한 표지를 부착하는 목적으로 사용된 링커(linker) 분자는 dT가 반복된 분자(16개 내지 30개)로서, 5' 말단에 티올기(-SH)가 부착될 수 있다.
The linker molecule used for immobilizing the aptamer on a substrate or attaching a detectable label is a molecule (16 to 30) in which dT is repeated, and a thiol group (-SH ) May be attached.
실시예Example 2: 2: RNARNA 앱타머를Aptamer 이용한 3종의 식중독균 동시 검출 Simultaneous detection of three foodborne pathogens using
E. coli O157:H7, Staphylococcus aureus 및 Salmonella Typhimurium을 Nutrient Broth 배지에서 37의 진탕 배양 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 3500 x g에서 10분 원심분리하여 수확하고, 동일 부피의 PBS(pH 7.0)로 현탁하여 세균 이외의 분순물을 제거하였다. 이 세균-PBS 현탁액의 세균 농도를 A600에서 흡광도를 측정하여 1 x 109 으로 세균시료를 제조하였다. E. coli O157: H7, Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium were cultured in Nutrient broth medium for 12 hours under 37 shaking culture conditions. The culture was harvested by centrifugation at 3500 xg for 10 minutes, and suspended in the same volume of PBS (pH 7.0) to remove impurities other than bacteria. The bacterial concentration of this bacterial-PBS suspension was measured by absorbance at A600 to prepare a bacterial sample at 1 x 10 < 9 & gt ;.
상기 세균시료를 실버 마이크로칩 위에 고정화된 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머의 스팟에 올리고 상온에서 30분 동안 반응시켜 결합을 유도한 다음, 결합되지 않은 것을 PBS(pH 7.0) 용액으로 세척하여 제거하였다.The bacterial sample was spotted on a spot of RNA aptamer containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 immobilized on silver microchip and reacted at room temperature for 30 minutes to induce binding. 7.0). ≪ / RTI >
슬라이드 칩 상에서 형성된 앱타머-세균 결합체 모형을 도 1에 나타내었으며, 상기 결과를 형광현미경을 통해 관찰한 결과, 40배 대물렌즈를 사용하여 관찰할 때, 크기가 100x100㎛인 스팟을 20 의 간격을 두고, 1개의 비교구를 포함하여 4개의 스팟을 형성하면 3종의 세균을 동시에 관찰할 수 있었다. 또는, 20배의 대물렌즈로 관찰할 때는 크기가 200x200㎛인 스팟도 적합한 것을 확인할 수 있었다(도 2a 및 도 2b). 한편, 세균의 개체를 보다 크게 관찰하기 위해 60배 대물렌즈를 사용하더라도 광학현미경에서 4개의 스팟을 동시에 관찰할 수 있었다.The aptamer-bacterial complex model formed on the slide chip is shown in FIG. 1. As a result of observing the above results with a fluorescence microscope, it was found that spots having a size of 100 × 100 μm were observed at intervals of 20 When four spots were formed including one comparison well, three kinds of bacteria could be observed at the same time. Alternatively, when observing with an objective lens of 20 times magnification, it was confirmed that a spot having a size of 200x200 mu m is suitable (Figs. 2A and 2B). On the other hand, in order to observe more of the bacteria, we could observe 4 spots in the optical microscope at the same time even using the 60 times objective lens.
한편, 형광표지 앱타머를 부가적으로 결합하게 되면, 앱타머-세균-형광표지앱타머 복합체를 형광현미경을 통해 관찰할 수 있다. 이를 위한 형광표지 앱타머 결합체 제조법은 다음과 같다. 즉, FAM-서열번호 3의 염기서열을 포함하는 앱타머, Cy3-서열번호 2의 염기서열을 포함하는 앱타머, 그리고 Cy5-서열번호 1의 염기서열을 포함하는 앱타머 용액을 E. coli O157:H7, Staphylococcus aureus 그리고 Salmonella typhimurium의 식중독 세균이 결합되어 있는 마이크로칩의 챔버에 스팟팅하고 상온에서 30분 반응시킨 후, PBS(pH 7.0) 용액으로 세척하여 제거하여 형광표지앱타머-식중독세균-고정화앱타머의 복합체를 마이크로칩 상에 유도하였다.On the other hand, when the fluorescent-labeled aptamer is additionally bound, the aptamer-bacterial-fluorescent-labeled aptamer complex can be observed through a fluorescence microscope. The method for preparing a fluorescently labeled aptamer conjugate for this purpose is as follows. Namely, aptamer containing the nucleotide sequence of FAM-SEQ ID NO: 3, Cy3-aptamer containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and Cy5-aptamer solution containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 were introduced into E. coli O157 : H7, Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium were incubated for 30 minutes at room temperature. The cells were washed with PBS (pH 7.0) to remove the fluorescent-labeled aptamer-food poisoning bacteria-immobilized aptamer Complex was induced on the microchip.
도 3은 일반 영상처리를 통해 도색된 3종의 식중독 세균을 동시에 검출한 예를 나타낸 것이다. 도 3에서 보는 바와 같이, E. coli O157:H7는 4개체(좌상), Staphylococcus aureus(우상) 및 Salmonella typhimurium(좌하)는 각각 3개체가 검출됨을 확인할 수 있었다(도 3의 (c)). 즉, 본 발명에 따르면, 슬라이드 칩 상에 고정된 상기 각각의 앱타머에 결합한 식중독 세균 이외에는 어떠한 비특이적인 결합도 보이지 않아 매우 특이적으로 3종의 식중독 세균을 동시에 검출할 수 있다.FIG. 3 shows an example of simultaneous detection of three kinds of food poisoning bacteria colored through general image processing. As shown in FIG. 3, E. coli O157: H7 was found in 4 individuals (upper left), Staphylococcus aureus (idol) And Salmonella typhimurium (bottom left) were detected in three individuals (FIG. 3 (c)). That is, according to the present invention, any nonspecific binding other than the food poisoning bacteria bound to each of the aptamers fixed on the slide chip is not visible, and thus three kinds of food poisoning bacteria can be detected very specifically.
<110> Korea Food Research Institute <120> Kit and method for detecting food-borne bacteria <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clone 25 43mer <400> 1 gggauaccag cuuauucaau uugauuccau cuuccuggac ugucgaaaau ucaguaucgg 60 gagguuacgu auuugguuua uagauaguaa gugcaatcu 99 <210> 2 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 2 <400> 2 gggagagcgg aagcgugcug ggccgggaag uuuugauacg gcuucaugca aguaauguuu 60 uuaucauaac ccagaggucg auggaucccc cc 92 <210> 3 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 40 <400> 3 gggauaccag cuuauucaau uugauuccau cuuccuggac ugucgaaaau ucaguaucgg 60 gagguuacgu auuugguuua uagauaguaa gugcaatcu 99 <110> Korea Food Research Institute <120> Kit and method for detecting food-borne bacteria <160> 3 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clone 25 43mer <400> 1 gggauaccag cuuauucaau uugauuccau cuuccuggac ugucgaaaau ucaguaucgg 60 gagguuacgu auuugguuua uagauaguaa gugcaatcu 99 <210> 2 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 2 <400> 2 gggagagcgg aagcgugcug ggccgggaag uuuugauacg gcuucaugca aguaauguuu 60 uuaucauaac ccagaggucg auggaucccc cc 92 <210> 3 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone 40 <400> 3 gggauaccag cuuauucaau uugauuccau cuuccuggac ugucgaaaau ucaguaucgg 60 gagguuacgu auuugguuua uagauaguaa gugcaatcu 99
Claims (6)
포도상구균(Staphylococcus aureus)의 테이코산(teichoic acid)에 특이적으로 결합하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머; 및
대장균(Escherichia coli) O157 : H7의 LPS(lipopolysaccharide)에 특이적으로 결합하는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머를 포함하는 식중독균 검출 키트. Salmonella an RNA aptamer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 which specifically binds to the ompC protein of typhimurium ;
An RNA aptamer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 that specifically binds to teichoic acid of Staphylococcus aureus ; And
Escherichia coli ) O157 : A food poisoning bacterial detection kit comprising an RNA aptamer comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 that specifically binds to lipopolysaccharide (LPS) of H7 .
상기 키트 내의 RNA 앱타머와 식중독균의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 식중독균 검출 방법.Contacting a biological sample containing food poisoning bacteria with the kit of any one of claims 1 to 4; And
And determining whether the RNA aptamer and the food poisoning bacteria are bound to each other in the kit.
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2012
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