KR20130138807A

KR20130138807A - 농도 독립 반응성을 나타내는 ｃｅｓｔ 시스템

Info

Publication number: KR20130138807A
Application number: KR1020137014354A
Authority: KR
Inventors: 실비오 아이메; 엔조 테레노; 카스텔리 다니엘라 델리; 다리오 리비오 롱고; 프란코 페델리; 풀비오 유제리
Original assignee: 브라코 이미징 에스.피.에이.
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2013-12-19
Also published as: MX2013004825A; CA2816948A1; EP2635311B1; CA2816948C; JP2017078080A; JP6542748B2; JP2013542948A; MX349239B; RU2605823C2; IL226123A0; IL226123A; RU2013125778A; US20190209713A1; US20130195768A1; AU2011325112B2; CN103260652A; AU2011325112A1; CN103260652B; EP2635311A1; US10232060B2

Abstract

본 발명은 레이셔메트리 기반 CEST 이미징 방법에서 CEST제제의 NMR 구별가능 입체이성질체에 속하는 비등가 이동 양성자의 사용, 그리고 농도 독립 CEST 반응제제로서 유용한 용액 중에 적어도 2개의 NMR-구별가능 입체이성질체를 나타내는 란탄족(III) 착체 화합물에 관한 것이다.

Description

농도 독립 반응성을 나타내는 ＣＥＳＴ 시스템{CEST SYSTEMS EXHIBITING A CONCENTRATION INDEPENDENT RESPONSIVENESS}

본 발명은 화학적 교환-의존 포화 이동(CEST)에 기초한 자기 공명 이미징(MRI)의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 이것은 농도 독립 반응성을 나타내는 CEST 시스템 그리고 진단 관심의 물리적 또는 화학적 파라미터의 생체 내 맵핑에서 그것의 사용에 관한 것이다.

화학적 교환 포화 이동(CEST) 양식은 하나 이상의 교환가능 양성자(들) 풀을 함유하는 분자(CEST제제)의 사용에 기초한 최근에 도입된 이미징 방법이다(예를 들어, Balaban RS., Methods in Biomedical Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy. Chichester, UK: John Wiley & Sons; 2000. Vol.1. p 661-6667; Young IR, editor 참고).

이 이미징 기술은 이중 공명 실험으로서 고해상도 NMR에서 알려진 현상에 의존하는데, 제 2라디오 주파수(RF) 펄스가 적용되고, NMR 스펙트럼으로부터 유도가능한 이동 양성자의 공명 주파수에서 미세하게 집중되어, 그것의 스핀을 포화시킨다. 따라서 포화된 자화가 만들어져 이것은 화학적 교환에 의해 "벌크" 물로 이동되어, 벌크 물 신호의 순감소를 가져온다. 이 효과는 포화 이동(Saturation Transfer) 또는 ST 효과로서 언급된다. 결과되는 CEST 기반 MR 이미지의 콘트라스트는 이동의 정도에 의해 측정된다: 물 양성자로 이동된 포화된 자화의 양이 많을수록, 결과되는 물 신호의 강도가 작아지고, 기록된 MRI 이미지의 콘트라스트(음성 콘트라스트)는 강해진다.

CEST제제에 대한 기본 요건은 교환 부위의 활성화와 포화 이동을 둘 다 허용하도록 벌크 물 양성자와의 적당한 교환 속도(K_ex) 및 적합한 화학적 이동 분리를 갖는, 이동 양성자(들)(또는 교환가능 양성자, 본원에서 서로 바꾸어 사용됨)의 존재이다. 대략, 이 조건은 k _ex 가 Δν(K_ex

Δν)에 접근할 때 도달되며, 여기서 Δν는 2개의 교환 풀들 사이의 Hz인 화학적 이동 분리이다. 알려진 CEST 조영제는 반자성 및 상자성 시스템으로 주로 분류된다. 저분자량 반자성 CEST제제(DIACEST)의 적합한 예는 본 분야에서 대부분의 작업을 수행했던 Balaban에 의해 WO 00/66180호에서 먼저 제공되었다. 대신에, 거대분자 반자성 제제는 예를 들어, J. Am. Chem. Soc 2001; 123:8628-8629에 개시된다.

DOTA의 거대환 테트라-아미드 유도체를 주로 포함하는 상자성 CEST제제(PARACEST)는 Sherry에 의해 먼저 보고된 4개의 자기 등가물, 또는 유사-등가물, N-H 이동 양성자 풀들을 위해 제공된다(예를 들어, J. Am. Chem. Soc 2001; 123:1517-1518 참고). 상자성 CEST제제에 대한 중요한 발견은 Magn. Reson. Med 2002; 47:639-648에서 또한 논의된다.

Woods et. al은 또한 OH기가 적어도 건조 용매의 사용을 포함하는 특정 실험 조건하에서 PARACEST 프로브를 갖는 CEST 실험에서 이용될 수 있다는 것을 증명하였다(예를 들어, J. Am. Chem. Soc 2006; 128:10155-10162 참고). 그러나, 시험된 착체를 순수에서 용해시킴으로써, CEST 효과는 히드록실 및 금속 결합 물 양성자로부터 검출되지 않고, 따라서 "생체 내" CEST 적용을 위한 이것의 가능한 사용을 막는다.

나중에, Morrow 및 동료는 알콜 공여기로부터의 CEST 효과가 펜던트 알콜기를 포함하는 중성 리간드를 갖는 3개-양하전된 Ln(III) 거대환 착체를 사용함으로써 순수에서 검출될 수 있다는 것을 증명하였다(예를 들어, Inorg. Chem. 2009; 48: 7237-7243 참고). 사용된 시클렌 유도체의 다수 입체이성질체의 존재가 이 문헌에서 논의되는데, 이 문헌은 용액 중에 단지 하나의 부분입체이성질체 형태를 갖는 Ln(III) 착체가 PARACEST 실험을 위해 잠재적으로 유리하다고 결론을 내리고 있다.

특히 매우 민감한 상자성 CEST제제의 추가 부류는 LIPOCEST, 수성 내부 공동에서 물 양성자에 대한 상자성 이동 시약을 함유하는 리포솜이 대표적이다(예를 들어, Angew. Chem. Int Ed Engl 2003; 42: 4527-4529 참고).

CEST제제들 중에서, 특정 관심있는 부류는 "반응"제제, 즉 적어도 하나의 교환가능 양성자가 부여된 조영제가 대표적인데, 이것의 포화 이동 능력은 제제가 분포하는 미세환경의 진단 관심의 물리-화학적 파라미터와 상관된다. 이들 제제는 전형적인 CEST제제로서 작용하고 CEST 콘트라스트를 제공하는 것 이외에, 그것들이 분포하는 신체 기관 또는 영역에서 pH, 온도, 대사물 또는 특정 이온 농도, O₂ 또는CO₂ 부분압, 단백질 또는 효소 활성으로부터 전형적으로 선택된 상기 파라미터의 변화에 대하여 보고할 수 있으므로, 따라서 이들 변화에 엄격히 관련된 특정 질환의 유용한 바이오마커로서 작용할 수 있다(예를 들어, Top Curr. Chem. 2002, 221, 123-164 참고).

이 정도로, CEST 방법에서 관찰된 포화 이동(ST)의 양은 물 및 CEST 프로브 함량 즉, 관련 조직에서 그것의 국소 농도에 의존한다. 결과에 의해, 이들 제제에 의해 나타낸 고유 반응성 성질은 실제로 그것의 실제 농도가 알려질 때만 적당히 이용될 수 있다.

대신에, 생체 내 측정에서 효과적으로 이용가능하기 위해, CEST 반응제제는 농도 독립 모드로 그것의 반응성을 나타내야 한다.

이 과제는 ST 효과가 관심있는 물리-화학적 파라미터로부터 다른 의존성을 나타내는, 적어도 두 세트의 자기적으로 비등가인 양성자를 함유하는 CEST제제를 사용함으로써 달성될 수 있다.

이 경우에, 사실, 레이셔메트리(ratiometric) 접근방법이 Balaban 및 Ward(상기 식에서 어떤 상세설명을 위해 예를 들어, Magn. Reson. Med. 2000; 44:799-802 참고)에 의해 개척되어 개시된 하기 식(1)에 기초하여 이용되고,

상기 식에서 부위 1 및 부위 2로서 각각 확인된 2개의 다른 공명의 선택적인 조사에 의해 유도된 ST 효과들 사이의 비교 비율을 이용할 수 있는데, 이것은 측정된 ST 양 및 차례로 평가된 진단 파라미터를 투여된 CEST 프로브의 절대 농도에 독립적이게 만든다.

이 레이셔메트리 접근방법의 이용을 허용하는 반응제제의 예는 2개의 자기적으로 비등가인 양성자 부위를 함유하는 단일분자 란탄족(Ln) 착체를 포함하며, 통상적으로 하나는 금속 이온에 배위된 펜던트 암(arm)(들) 상에 일차 아미드기(들)에 속하며, 두 번째는 킬레이트화된 착체의 Ln 중심에 배위된 물 분자(들)에 의해 전형적으로 나타내어진다(예를 들어, Angew. Chem. Int Ed 2002; 41: 1919-1921 및 4334-4336 참고).

CEST-활성 양성자의 2개 풀을 함유하는 5,6-디히드로우라실 및 이오파미돌과 같은 반자성 분자가 농도-독립 pH 보고자로서 또한 성공적으로 경험되었다(예를 들어, Magn. Reson. Med. 2000; 44:799-802, Invest. Radiol. 2004; 39:235-243; Magn. Reson. Med. 2005; 53: 830-834 및 J. Am. Chem. Soc 2005; 131: 1380-1381 참고).

대안으로, 동일한 생체분포 패턴을 가지나 예를 들어 각각 다른 양성자 풀(들)을 제공하는, 배위된 Ln(III) 이온에 의존하는 매우 다른 NMR 성질을 갖는 2개(또는 그 이상) CEST 프로브를 포함하는 CEST 시스템이 이용될 수 있다(예를 들어, Magn. Reson. Med. 2002; 47: 639-648 참고).

그러나, 반응성 CEST제제의 개발은 주로 농도-독립 반응성을 나타내는 CEST 시스템의 제한된 수 때문에 여전히 만족스럽지 못하다.

상기 과제에 따라서, 본 발명은 CEST-기반 농도 독립 반응성 방법을 설정하도록 허용하는 자기적으로 비등가인 이동 양성자의 대안의 공급원의 확인하는 것과 농도-독립 반응성을 나타내는 대안의 CEST 시스템에 관련된다.

본 발명의 해결책은 상자성 CEST제제의 NMR-구별가능 입체이성질체를 자기적으로 비등가인 교환가능 양성자의 대안의 공급원으로서 사용하는 것과 관련된다.

더 구체적으로, 본 발명은 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법을 설정하기 위해 자기적으로 비등가인 이동 양성자의 공급원으로서 상자성 CEST제제의 NMR-구별가능 이성질체의 사용에 관한 것이다.

추가 구체예에서 본 발명은 상자성 CEST제제의 적어도 2개의 NMR-구별가능 이성질체에 속하는 자기적으로 비등가인 이동 양성자를 이용하는 단계를 포함하는, 레이셔메트리-기반 CEST MRI 방법에 관한 것이다.

다른 구체예에서 본 발명은 용액 중에 적어도 2개의 NMR-구별가능 입체이성질체를 나타내는 킬레이트화 리간드의 펜던트 암 상에 양성자-교환기가 부여된 란탄족(III) 착체 화합물의 부류, 그리고 농도 독립 CEST 콘트라스트를 제공하기 위해 농도 독립 CEST 조영제로서 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법에서 이들 착체 화합물의 사용에 관한 것이다.

추가 구체예에서 본 발명은 농도-독립 반응성 CEST제제로서 상기 확인된 란탄족(III) 착체 화합물의 사용, 그리고 사람 또는 동물의 신체 기관, 체액 또는 조직에서 진단 관심의 물리적 또는 화학적 파라미터의 농도 독립 맵을 제공하기 위해 그것의 사용을 포함하는 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법에 관한 것이다.

도 1: D₂O 중의 YbHPDO3A의 ¹HNMR 스펙트럼(278K, 600 MHz).
도 2: 패널 a) 착체의 2개 구별가능 이성질체의 OH 양성자를 교환함으로써 나타낸 다른 화학적 이동(20℃에서 각각 72 및 99 ppm)이 하이라이트인, D₂O(아래) 및 H₂O(위)에서 YbHPDO3A 스펙트럼의 확대; 패널 b) YbHPDO3A의 Z 스펙트럼(24 mM 용액, 293K, pH 7.31, 조사 출력 24 μT, 조사 시간 2초).
도 3: 패널 a) 모두 24 mM 농도를 가지나 다른 pH(모세관 1-11)를 갖고, 또는 동일한 pH(7.31)를 가지나 다른 농도(3 내지 24 mM)(모세관 7, 12-14)를 갖는 YbHPDO3A의 용액들을 함유하는 팬텀의 시험관 내 MR 이미지(양성자 밀도); 패널 b) 팬텀 범례; 패널 c) 72 ppm에서 히드록실 양성자의 조사시 얻어진 ST 맵(20℃; 조사 출력 펄스 24 μT); 패널 d) 99 ppm에서 히드록실 양성자의 조사시 얻어진 ST 맵(20℃, 조사 출력 펄스 24 μT); 패널 e) 각각 72 ppm(정사각형) 및 99 ppm(원형)(보정 곡선)에서 2개 이성질체의 히드록실 양성자의 조사시 얻어진 pH의 변동을 갖는 ST 효과의 변동(24 mM 용액, 20℃; 조사 펄스 24 μT; 조사 시간 2초); 패널 f) 패널 e)의 ST 곡선에 레이셔메트리 접근방법의 적용에 의해 가져오는 pH로부터 레이셔메트리 값의 의존성을 나타내는 레이셔메트리 곡선. 도면에서, 레이셔메트리 값(그래프의 세로축(y)에 나타냄)은 각각 72 ppm(부위 1) 및 99 ppm(부위 2)에서 이동 양성자의 조사시 상기 식(1)을 사용함으로써 계산된 값을 의미한다.
도 4: 패널 a) 온도로부터 ST 효과의 의존성을 나타내는 레이셔메트리 곡선(20℃(정사각형) 및 37℃(원형)에서 각각 기록된 ST 보정 곡선에 레이셔메트리 접근방법의 적용에 의해 얻어진, 레이셔메트리 값); 패널 b) 37℃(검은 선) 및 20℃, 동일한 pH(회색 선)에서 24 μT의 조사 펄스를 사용함으로써 기록된 YbHPDO3A의 Z-스펙트럼(24 mM 용액, pH 7.31).
도 5: 패널 a) YbHPDO3A의 용액으로 배양(모세관 2) 또는 전기천공(모세관 3)되거나, 또는 PBS로 세포 배양되고 기준으로서 사용(모세관 1)된, MSH 세포의 3개의 다른 펠렛을 함유하는 팬텀의 시험관 내 MR 이미지. 빈 모세관(4)이 또한 팬텀에 포함됨; 패널 b) 및 c) 72 및 99 ppm에서 각각 팬텀을 조사하여 수집된 ST 맵.
도 6: 200 ㎕의 YbHPDO3A의 150 mM 용액으로 주사된 마우스의 방광으로부터 얻고 Bruker Avance300 분광기로 기록된 Z-스펙트럼. 기록된 스펙트럼에서 검은 선은 맞춤 곡선에 해당하고 밝은 선은 0 ppm에 해당하는 Z 스펙트럼의 최소값을 갖기 위해 이동시킨 맞춤 곡선에 해당한다.
도 7: 실시예 6에 대해 33°로 기록된 보정 곡선으로부터 얻어진 시험관 내에서 측정된 YbHPDO3A의 레이셔메트리 곡선.
도 8: YbHPDO3A의 정맥내 주사 전(PRE) 및 주사 직후(Post)의 마우스의 종양 영역에 기록된 형태 이미지(왼쪽 이미지) 및 ST 맵. 각각 66.2 및 91.6 ppm에서 조사시 계산된 ST 효과는 종양 영역이 밝은 영역(실제 관찰된 이미지에서는 붉은색)으로서 나타난 해당 해부 이미지에 중첩되었다. 도면에서, 기호 @는 포화 이동을 촉진하기 위해 사용된 조사 주파수, 즉 상기와 같이 66.2 및 91.6 ppm을 나타낸다.
도 9: YbHPDO3A의 4합체 유도체의 식 다르게는 (Yb³ ⁺)₄HPDO3A-4합체 또는 단순히 4합체로서 확됨.
도 10: 패널 a) YbHPDO3A-4합체의 2개 이성질체의 히드록실 양성자를 조사하고 레이셔메트리 접근방법의 적용시, 298 내지 312K의 범위의 다른 온도에서 측정된 레이셔메트리 곡선; 패널 b) YbHPDO3A-4합체의 2개 NMR-구별가능 이성질체에 속하는 히드록실 양성자의 NMR 화학적 이동의 온도로부터의 의존성.
도 11: 0.26 내지 8.4 mM(pH 7.4 및 298K)의 범위의 다른 농도에서 YbHPDO3A-4합체를 함유하는 팬텀의 MRI 이미지. 왼쪽 T₂ 가중 이미지; 오른쪽 얻어진 ST 맵.
도 12: 패널 a) D₂O에서 EuHPDO3A의 ¹HNMR 스펙트럼; 패널 b) 생리적 온도에서 구별가능한(Advance 600 분광기), 화학적 이동 20.5 및 16.7을 각각 갖는(pH 2 및 20℃), 2개의 NMR 구별가능 이성질체의 존재를 확인하는 D₂O, 278K, pH 2(위)에서 그리고 H₂O, 310K, pH 2(아래)에서 EuHPDO3A NMR 스펙트럼의 확대.
도 13: 패널 a) 다른 출력 펄스에서 pH 5.92 및 37℃에서 EU(III)HPDO3A(20 mM)의 Z-스펙트럼; 패널 b) 다른 출력 펄스에서 pH 7.46 및 37℃에서 EU(III)HPDO3A(20 mM)의 Z-스펙트럼; 패널 c) pH 7.46, 37℃ 및 24 μT의 조사 출력에서 EU(III)HPDO3A 20 mM의 ST-프로파일.
도 14: pH 5.8 및 298K에서 화합물 2의 용액의 7T에서 얻어진 Z-스펙트럼.
도 15: 화합물 2에 의해 나타난 2개의 자기적으로 비등가인 이성질체의 히드록실 양성자의 조사시 얻어진 ST 효과의 pH로부터의 의존성(20℃에서)(보정 곡선).
도 16: 도 15의 ST 곡선에 대한 레이셔메트리 접근방법의 적용에 의해 결과되는 ST의 pH로부터의 의존성을 보고하는 레이셔메트리 곡선(레이셔메트리 값).
도 17: 278K 및 298K에서, 그리고 600 MHz의 자기장에서 D₂O에서 기록된 화합물 3의 ¹HNMR 스펙트럼으로부터의 비교. 저온에서 기록된 고해상도 스펙트럼은 용액 내에서 2개의 주요 이성질체(SAP 및 TSAP)로 인한 두 세트의 신호의 존재를 분명히 나타낸다. 이들 동일한 신호는 실온에서 훨씬 더 넓다.
도 18: 20℃; 자기장 7T, 조사 출력 24 μT에서 6.41 내지 8의 범위의 다른 pH 값들에서 완충된 용액(20 mM)들로부터 기록된 화합물 3의 Z 스펙트럼.
도 19: 293K, 자기장 7T, 조사 출력 24 μT에서 5.08 내지 6.30의 범위의 다른 pH 값들에서 완충된 화합물 4의 수용액(20 mM)들로부터 얻어진, 포화 이동 ST 프로파일(왼쪽) 및 해당 Z-스펙트럼(오른쪽).
도 20: 각각 75 및 100 ppm에서 히드록실 양성자의 조사시 얻어진 ST 곡선으로부터 화합물 4에 대해 계산된 레이셔메트리 값의 pH로부터의 의존성을 나타내는, 레이셔메트리 ST 곡선.
도 21: 20℃; 자기장 7T, 조사 출력 24 μT에서 5.5 내지 8.1의 범위의 다른 pH 값들에서 완충된 수용액(20 mM)들로부터 기록된 화합물 5의 Z 스펙트럼.

본원에 개시된 농도-독립 CEST MRI 방법을 설정하는 것을 허용하는 자기적으로 비등가인 이동 양성자의 공급원은 상자성 CEST제제의 적어도 2개의 NMR-구별가능 이성질체에 속하는 이동 양성자에 의해 나타낸다.

이 점에서, 달리 제공되지 않는 한, 표현 "CEST제제의 NMR-구별가능 이성질체"는 분리되고 따라서 NMR 스펙트럼에서 구별가능하거나, 또는 즉 (NMR 스펙트럼에서) 교환가능 양성자에 대한 분명한 공명, 각각의 NMR-구별가능 입체이성질체 중 하나에 해당하는 공명을 나타내고, 이동 양성자 신호를 제공하는 CEST제제의 입체이성질체를 의미한다.

이 정도로, 이러한 종류의 자기적으로 비등가인 양성자를 제공하는 적합한 CEST제제는 바람직하게는 용액 중에 적어도 2개의 NMR-구별가능 입체이성질체를 나타내는 킬레이트화 리간드 펜던트 암 상에 양성자-교환기를 포함하는 란탄족(III) 착체 화합물이다.

사실, 이들 착체 화합물의 NMR 스펙트럼은 각각이 NMR-구별가능 이성질체 중 하나에 해당하는 교환가능 양성자에 대한 적어도 2개의 분리된 공명을 흥미롭게 나타내는데, 이것은 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법으로 선택적으로 조사될 수 있다.

레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법에서 이용가능한 자기적으로 비등가인 이동 양성자의 공급원으로서 적합한 란탄족(III) 착체 화합물의 NMR-구별가능 이성질체의 사용은 본 발명의 구체예를 구성한다.

생체 내 CEST-기반 방법에서 비등가 이동 양성자의 이러한 대안의 공급원을 적당히 이용하는 것이 이제 분명하고, CEST 프로브로서 사용된 란탄족 착체는 생리적 조건하에서 복수의 NMR 구별가능 입체이성질체를 나타내거나, 또는 즉, Ln(III) 착체에 의해 나타낸 다른 입체이성질체의 교환가능 양성자의 공명은 적합하게 이동되고 실온 및 생리적 pH의 수용액 중에 잘 검출가능한 것이 필요하다.

펜던트 암 상에 히드록실(-OH) 양성자-교환기가 부여된 거대환 킬레이트화 리간드를 포함하는, Ln(III) 착체 화합물의 특정 부류가 본원에 확인되는데, 이것은 복수의 NMR 구별가능 이성질체의 혼합물로서 용액 중에 존재한다. 이롭게, 이들 착체 화합물의 NMR 스펙트럼은 다른 입체이성질체에 해당하는, 교환가능한 OH 양성자에 대한 적어도 2개의 공명을 나타내는데, 이것은 수용액 중에 그리고 생리적 pH 및 온도 조건하에 존재하고 잘 분리된다.

레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법에서 란탄족(III) 착체 화합물의 이 특정 부류의 사용은 본 발명의 바람직한 구체예에 나타낸다.

그러므로 한 구체예에서 본 발명은 각각이 관련 란탄족 착체의 NMR 구별가능 입체이성질체에 의해 제공되는 (적어도 2개의) 자기적으로 비등가인 이동 양성자를 이용하는 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법에서 펜던트 암 상에 히드록실 양성자 교환기가 부여된 킬레이트화 리간드를 포함하는 란탄족(III) 착체 화합물의 사용에 관한 것이다.

적합한 란탄족(III) 금속 이온(또는 Ln(III))은 프라세오디뮴(III), 네오디뮴(III), 디스프로슘(III), 에르븀(III), 테르븀(III), 홀뮴(III), 툴륨(III), 이테르븀(III), 및 유로퓸(III)으로 구성된 군으로부터 선택되며, 유로퓸(III) 및 이테르븀(III)이 바람직하고, 이테르븀(III)이 특히 바람직하다.

다른 면에서, 본 발명에 따르는 적합한 킬레이트화 리간드는 단일 펜던트 암 상에 히드록실(OH) 양성자 교환기가 부여된 거대환 킬레이트화 리간드를 포함한다.

식(I)의 킬레이트화 리간드가 바람직하다.

여기서:

R은 -CH(R₂)-COOH이고,

R₁은 H 또는 O-, -N-, -CO-, -NHCO-, -CONH-기로부터 선택된 기에 의해 선택적으로 방해되고, 하나 이상의 할로겐 원자, 히드록실(-OH)기, 페닐 또는 치환된 페닐기에 의해, 또는 -COOH, -NHR₃ 또는-NR₄R₅로부터 선택된 기에 의해 선택적으로 치환된, 곧은 또는 분기된 C₁-C₅ 알킬쇄이며, R₃, R₄ 및R₅는 H 또는 하나 이상의 히드록실 또는 C₁-C₃ 알콕시기에 의해 선택적으로 치환된 동일한 또는 서로 다른, 곧은 또는 분기된 C₁-C₃ 알킬기이고,

R₂는 H 또는 하나 이상의 C₁-C₃ 알콕시, 또는 히드록시알콕시기에 의해 선택적으로 치환된 C₁-C₅ 알킬쇄이다.

이 정도로 식(I)의 킬레이트화 리간드가 3개-양하전된 란탄족(III) 금속 이온으로 착화될 때, 부분 R의 카르복실기는 해당 탈양성자화(-CH(R₂)-COO^-) 형태인 것이 당업자에게 분명해야 한다.

본 발명의 설명에서, 달리 제공되지 않는 한, 용어 곧은 또는 분기된 C₁-C₅ 알킬기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분기된 알킬쇄로 의도된다. 알킬기에 대한 적합한 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 등을 포함한다.

상기 알킬기는 하나 이상의 할로겐, 히드록실, 알콕시, 아미노, 히드록시알콕시, 페닐 또는 상기 제시된 바와 같이 치환된 페닐기에 의해 더 치환 및/또는 방해될 수 있다.

할로겐 또는 할로겐 원자는 요오드, 염소, 브롬, 또는 불소 원자로 의도되며, 후자가 특히 바람직하다.

용어 치환된 페닐은 하나 이상의 할로겐 원자, 히드록실(OH), 또는 C₁-C₃ 알콕시기, 또는 -(CH₂)_nCOOH, -NO₂, -NHR₃, 또는 -NR₄R₅기로부터 선택된 기에 의해 치환되는 페닐기로 의도되며, 여기서 n은 0 또는 1이고 R₃, R₄, 및 R₅는 상기 정의된 바와 같다.

용어 C₁-C₃ 알콕시는 알킬 부분이 3개 이하의 탄소 원자를 포함하는 어떤 알킬-옥시기로 의도된다.

히드록시알콕시기는 알킬 부분이 히드록실기에 의해 더 치환된 상기 C₁-C₃ 알콕시기 중 어떤 것으로 의도된다.

본 발명의 알콕시 또는 히드록시알콕시기의 적합한 예는 예를 들어, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 히드록시메틸옥시, -2-히드록시에톡시, 2,3-디히드록시프로폭시, 등을 포함한다.

바람직하게는, 식(I)의 화합물 내에서 R₂는 H를 나타내고, R₁은 H 또는 곧은 또는 분기된 C₁-C₄ 알킬쇄이거나, 산소 원자에 의해 선택적으로 방해되거나, 또는 히드록실, C₁-C₃ 알콕시, 니트로 또는 카르복실기에 의해 차례로 치환되거나 또는 치환되지 않을 수 있는 OH, -NH₂ 또는페닐기에 의해 치환된다.

훨씬 더 바람직하게는, 식(I)의 화합물 내에서 R₂는 H이고 R₁은:

-H,

-CH₃,

-CH₂CH₃,

-CH₂OH,

-CH₂-O-CH₃,

-CH(CH₂OH)₂,

-CH₂-CH(OH)-CH₂OH,

-CH₂-O-CH₂-C₆H₅,

-CH₂-O-CH₂-(C₆H₅-COOH), 또는

-CH₂-O-CH₂-(C₆H₅-NO₂)로부터 선택된 기를 나타낸다.

식(I)의 리간드의 Ln(III) 착체는 본 발명에 따라 특히 바람직하며, 여기서 R₂는 H이고 R₁은 -CH₃인 한편, 킬레이트화된 Ln(III) 이온은 Yb(III) 또는 Eu(III)로부터 선택된다.

적당하면, 적합하게 관능화될 수 있는 그것들의 R₁기를 통해 선택적으로 연결되는, 식(I)의 적어도 2개의 킬레이트화 리간드를 포함하는 이합체 또는 다합체 유도체는 본 발명 내에 포함되고, 증가된 민감도로 일반적으로 부여된다.

따라서, 다른 구체예에서 본 발명은 킬레이트화 리간드가 식(I)의 화합물의 이합체 또는 다합체 유도체인 Ln(III) 착체 화합물에 관한 것이다.

이 타입의 화합물의 한 예는 예를 들어, 제조를 위한 스킴과 함께 아래 실시예 1에 개시된다.

실시예 1의 4합체 킬레이트화 리간드, 또는 본원에서 서로 바꾸어 사용되는 HPDO3A-4합체, 그뿐만 아니라 그것의 염 및 4개(이하)의 상자성 금속 이온과의 그것의 킬레이트화된 착체는 신규이고 본 발명의 추가 목적을 구성한다.

이 정도로, 적합한 상자성 금속 이온은 Fe(²⁺), Fe(³⁺), Cu(²⁺), Ni(²⁺), Rh(²⁺), Co(²⁺), Cr(3⁺), Gd(³⁺), Eu(³⁺), Dy(³⁺), Tb(³⁺), Pm(³⁺), Nd(³⁺), Tm(³⁺), Ce(³⁺), Y(³⁺), Ho(³⁺), Er(³⁺), La(³⁺), Yb(³⁺), Mn(³⁺), Mn(²⁺)로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 상자성 금속 이온은 Gd(³⁺)이거나 또는 Yb(³⁺), Eu(³⁺) 또는 Dy(³⁺)로부터 선택된 란탄족 금속이다.

본 발명의 추가 목적은 상자성 또는, 특히, 식(I)의 킬레이트화 리간드의 이합체 또는 다합체 유도체의 Ln(III) 비스- 또는 폴리-킬레이트화된 착체, 또는 MR 이미징에서 사용하기 위한 적합한 첨가제 및/또는 담체와 함께 그것의 생리학적으로 허용가능한 염을 포함하는 진단 조성물이다. 바람직한 구체예에서, 상기 진단 조성물은 도 9의 구조를 갖는 (Yb³ ⁺)₄HPDO3A-4합체를 포함한다.

거대환 골격에 적어도 3개의 카르복실기를 포함하는 식(I)의 킬레이트화 리간드는 생리학적으로 허용가능한 염의 형태로 편리하게 있을 수 있다.

본 발명의 리간드를 염화시킬 수 있는 무기염기의 양이온의 적합한 예는 알칼리 또는 알칼리 토금속 예컨대, 칼륨, 나트륨, 칼슘 또는 마그네슘의 이온을 포함한다.

유기염기의 바람직한 양이온은 1차, 2차 및 3차 아민의 양이온 중에서도, 예컨대, 에탄올아민, 디에탄올아민, 모르폴린, 글루카민, N-메틸글루카민, N,N-디메틸글루카민을 포함한다.

이 목적을 위해 적합하게 사용될 수 있는 무기산의 바람직한 음이온은 할로산의 이온 예컨대, 염화, 브롬화, 요오드화 또는 황산염과 같은 다른 이온을 포함한다.

유기산의 바람직한 음이온은 예를 들어, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 푸마레이트, 말리에이트 또는 옥살레이트와 같은 염기성 물질의 염화를 위한 약학 기술에 정기적으로 사용되는 산들의 그것을 포함한다.

아미노산의 바람직한 양이온 및 음이온은 예를 들어, 타우린, 글리신, 리신, 아르기닌, 오르니틴의 그것들 또는 아스파르트산 및 글루탐산의 그것들을 포함한다.

다른 면에서, 거대환 리간드의 3개의 카르복실기는 3개-양하전된 란탄족 이온의 킬레이트화와 모두 연관된다. 그 결과, 식(I)의 Ln(III) 착체 화합물은 중성이고, 따라서 어떤 추가의 중화 또는 염화(salification) 없이 생체 내 적용에 적합하다.

대신에, 킬레이트화 리간드는 구조에서 추가 산성기를 포함하는 경우에, 예를 들어 상기 열거된 것들로부터 선택된 약학 기술에서 정기적으로 사용되는 양이온과의 중화는 그것의 생리적 허용가능한 염을 제공하는 것이 필요하다.

R₁이 H 및 그것의 이합체 또는 다합체 유도체와 다른, 식(I)의 Ln(III) 킬레이트화된 착체는 펜던트 암 상에 히드록실화된 탄소에 의해 나타낸 키랄(chiral) 중심을 포함한다. 그러므로, 용액 중에, 그것은 본질적으로 아세테이트 암의 레이아웃에서(시계방향 또는 반시계방향 배향됨) 거대환 고리의 2개 형태에서 그리고 키랄 중심의 형태(R,S)에서 다른 복수의 입체이성질체 형태를 나타낸다. 이 정도로 당업자는 R₁이 H일 때 상기 탄소는 그것의 키랄성을 잃지만, 아세테이트 암의 레이아웃에 대해 또는 고리의 형태에 대해 다른 이성질체가 존재하는 것을 안다.

본 발명은 수용액 중에 나타난 부분입체이성질체가 실온에서 착체 화합물의 이 바람직한 부류에 의해 NMR 스펙트럼에서 구별가능하다는 관찰에 기초한다. 더 구체적으로, 본 발명자들은 본 발명에 의해 제시된 식(I)의 Ln(III) 착체 화합물이 생리적 온도 및 pH의 용액 중에 착체의 다른 NMR-구별가능 부분입체이성질체에 각각 해당하는, 교환가능한 OH 양성자에 대해 적어도 2개의 적합하게 이동된 공명을 나타내는 것을 발견하였다. 이롭게, 동일한 착체의 다른 입체이성질체는 시간에 걸쳐 동일한 생체 내 생체분포 및 동일한 상대 농도 비율을 가지는 것이 입증되었다. 그러므로, 식(I)의 Ln(III) 착체 화합물의 NMR-구별가능 입체이성질체가 용액에서 나타내는 복수의 적합하게 이동된 OH 양성자 공명은 생체 내 조건에서 이용가능한 레이셔메트리-기반 CEST-MRI 방법을 설정하는데 유익하게 사용되어, 관련 착체의 국소 농도에 의해 영향받지 않는 생체 내 CEST 이미지를 제공할 수 있다.

게다가, 흥미롭게, 본 발명에 따르는 Ln(III) 착체 화합물의 OH 교환가능 양성자의 선택적인 포화에 의해 얻어진 포화 이동 ST의 양은 분포한 미세환경의 물리적 또는 화학적 파라미터에 대해 뚜렷하게 민감성이거나 또는 즉 반응성이다. 그 결과, 본 발명에 의해 제시된 Ln(III) 착체 화합물의 특정 부류는, CEST 이미징 방법에 이용가능하여 농도-독립 CEST 콘트라스트를 제공하는 것 이외에, 특히 생체 내 측정 및 제제 자체의 국소 농도에 의해 영향을 받지 않는 진단 관심의 물리적 또는 화학적 파라미터의 맵을 제공하는 것을 허용하는 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법에서 반응성 CEST제제로서 또한 유익하게 이용될 수 있다.

따라서, 추가 구체예에서, 본 발명은 특히 진단 관심의 물리적 또는 화학적 파라미터의 생체 내 측정을 위한 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법에서 농도 독립 CEST 반응제제로서 식(I)의 Ln(III) 착체 화합물의 사용에 관한 것이다.

본 발명에서, 달리 표시되지 않는 한, 진단 관심의 물리적 또는 화학적 파라미터는 온도, pH, 산소(pO₂) 또는 이산화탄소(pCO₂)의 부분압, 특정 이온 또는 대사물 농도, 또는 특정 효소 활성으로부터 선택된 파라미터로 의도된다.

이 정도로 조사하에 신체 기관 또는 영역에서 물리적 또는 화학적 파라미터(들)의 값 또는 맵을 앎으로써, 의사는 상기 평가된 파라미터(들)에 엄격히 의존하는 진단 관심의 생리적 또는 대사 방법의 진단 평가를 제공할 수 있다는 것이 이제 분명하다.

추가 구체예에서 본 발명은 적합한 라디오-주파수 펄스를 이용하는 즉, 조사하는 단계, 따라서 적합한 CEST 프로브의 2개 이상의 NMR-구별가능 입체이성질체에 의해 제공되는 벌크 물 신호, 적어도 2개의 자기적으로 비등가인 이동 양성자로의 포화 이동을 포함하는 단계를 포함하는 레이셔메트리-기반 CEST MRI 방법에 관한 것이다.

이 정도로 어떤 적합한 CEST 프로브의 NMR-구별가능 이성질체에 속하는 자기적으로 비등가인 이동 양성자를 이용하는 레이셔메트리-기반 CEST MRI 방법은 본 발명 내에 포함되는 것이 당업자에게 분명해야 한다. 바람직한 구체예에서, 관련 CEST 프로브는 상자성 CEST제제이고, 더 바람직하게는 본 발명에 의해 제시된 Ln(III) 착체 화합물이다.

특히 바람직한 구체예에서, CEST 프로브는 HPDO3A 킬레이트화 리간드의 Ln(III) 착체, 또는 그것의 이합체 또는 다합체 유도체의 비스- 또는 폴리-킬레이트화된 착체, 또는 그것의 생리학적으로 허용가능한 염이다.

따라서, 그것의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 농도 독립 생체 내 CEST 이미징을 제공하도록, 식(I)의 Ln(III) 착체 화합물 또는 그것의 이합체 또는 다합체 유도체를 사용하는 단계를 포함하는 레이셔메트리-기반 CEST MRI 방법에 관한 것이다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 레이셔메트리-기반 CEST MRI 방법은 CEST제제의 국소 농도에 의해 영향을 받지 않는 사람 또는 동물의 신체 기관, 체액 또는 조직에서 진단 관심의 물리적 또는 화학적 파라미터의 생체 내 측정을 위해 사용된다.

더 구체적으로, 바람직한 구체예에서 본 발명은,

a) 식(I)의 Ln(III) 킬레이트화된 착체 또는 그것의 이합체 또는 다합체 유도체를 사람 또는 동물 대상에게 투여하고, 선택적으로 관심있는 사람 또는 동물의 신체 기관 영역, 체액 또는 조직의 MRI 형태 이미지를 바람직하게는 T₂ 가중 시퀀스를 사용함으로써 기록하는 단계,

b) 투여된 란탄족 착체의 NMR-구별가능 입체이성질체에 속하는 2개의 자기적으로 비등가인 이동 양성자의 공명 주파수에서 미세하게 조정된 주파수의 범위에서 Z 스펙트럼을 수집하고, 이들 2개의 이동 양성자 풀에 대해 측정된 포화 이동 효과(ST)로부터 레이셔메트리 값을 계산하는 단계,

c) 상기 사람 또는 동물의 신체 기관 영역, 체액 또는 조직의 농도 독립 이미지를 얻는 단계를 포함하는 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직의 이미지를 얻기 위한 농도-독립 CEST 이미징 방법에 관한 것이며,

방법 중 단계 C는 관련된 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직의 이전에 기록된 형태 이미지에서, 방법 중 단계 b)에서 측정된 ST 효과로부터 얻어진, 레이셔메트리 값 맵을 중첩하는 단계를 바람직하게 포함한다. 이 정도로, 단계 b)에서 2개의 자기적으로 비등가인 이동 양성자의 공명 주파수는 이미 알려지지 않으면, CEST 이미징 전에 적합하게 기록될 수 있는 착체의 NMR 스펙트럼으로부터 얻어진다.

상기 CEST 이미징 방법은 시험관 내(생체 밖)에서 또는, 바람직하게는 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직의 생체 내 이미지를 얻기 위해 생체 내에서 시행될 수 있다.

다른 바람직한 구체예에서 본 발명은,

i) 식(I)의 Ln(III) 킬레이트화된 착체 또는 그것의 이합체 또는 다합체 유도체를 사람 또는 동물 대상에게 투여하고, 선택적으로 관심있는 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직의 MRI 형태 이미지를 기록하는 단계,

ii) 투여된 란탄족 착체의 NMR-구별가능 입체이성질체에 속하는 2개의 자기적으로 비등가인 이동 양성자의 공명 주파수에서 미세하게 조정된 주파수의 범위에서 Z 스펙트럼을 수집하고, 이들 2개의 이동 양성자 풀에 대해 측정된 포화 이동 효과(ST)로부터 레이셔메트리 값을 계산하는 단계,

iii) 계산된 ST로부터 관련된 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직에서 관심있는 파라미터의 농도 독립 맵(또는 레이셔메트리 맵)을 얻고, 선택적으로 형태 이미지에서 상기 맵을 중첩하는 단계를 포함하는 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직에서 진단 관심의 CEST MRI 기술, 물리적 또는 화학적 파라미터의 사용에 의해, 측정하기 위한 방법에 관한 것이며,

상기 측정은 시험관 내(생체 밖)에서 또는, 바람직하게는 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직의 생체 내에서 수행된다.

특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 HPDO3A 킬레이트화 리간드의 Ln(III) 킬레이트화된 착체, 또는 그것의 이합체 또는 다합체 유도체, 또는 그것의 생리학적으로 허용가능한 염의 NMR-구별가능 입체이성질체에 속하는 2개의 자기적으로 비등가인 이동 양성자를 이용하는 단계를 포함하는 관심있는 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직에서 pH의 생체 내 맵을 얻기 위한 농도-독립 CEST 이미징 방법에 관한 것이다.

이 정도로, 당업자는 이동 양성자 주파수를 조사하는 단계, Z-스펙트럼을 수집하는 단계, 레이셔메트리 ST 효과를 계산하는 단계, 및 이전에 수행된 보정 곡선을 사용함으로써 신체 기관 또는 영역에서 원하는 물리적 또는 화학적 파라미터의 맵을 얻는 단계를 포함하는, 상기 상세한 이미징 단계는 본 발명의 진단 실시에서 사용된 방법에 따라서, 그리고 예를 들어 실험 섹션에서 및 본원에 참고자료로 포함된 인용된 문헌에서 제공된 이미징 프로토콜에 개시된 데이터 처리 과정을 사용함으로써 일단 적당히 설정되면, 토모그래피에 의해 자동적으로 수행된다는 것을 안다.

본 발명의 방법에서, 본 발명에 따르는 CEST제제로서 작용하는 식(I)의 Ln(III) 착체 화합물(또는 그것의 이합체 또는 다합체, 또는 그것의 생리학적으로 허용가능한 염)은 적합한 약학 제제의 형태로 투여된다.

이 정도로, 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 상기 CEST-기반 방법들은 둘 다 본 발명에 따르는 적합한 양의 란탄족 착체 화합물을 포함하는 약학 제제로 적합하게 사전-투여되는 사람 또는 동물 신체에서 수행된다. 즉, 특히 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따르는 적합한 양의 란탄족(III) 착체 화합물을 포함하는 약학 제제로 적합하게 사전-투여된 사람 또는 동물 신체에 수행되는 CEST-기반 자기 공명 이미징 기술의 사용에 의해, 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직에서 진단 관심의 물리적 또는 화학적 파라미터의 CEST MRI 기술의 사용에 의해, 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직의 생체 내 이미징을 위한 혹은 생체 내 평가 또는 맵핑을 위한 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 "적합한 양"은 의도된 진단 목적(들)을 이행: 즉, 예를 들어 CEST 기반 MRI 이미징 기술의 사용에 의해 관련된 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직에서 농도 독립 콘트라스트된 이미지를 얻거나 또는 관심있는 파라미터의 농도 독립 맵을 제공하기에 충분한, 본 발명의 조영제 또는 그것의 약학 조성물의 어떤 양으로 의미된다.

이 점에서, 상기 투여 또는 사전-투여는 예를 들어 혈관내 주사(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 심실내 주사, 등)에 의해 또는 척추강내로, 복강내로, 림프관내로, 강내로, 경구로 또는 장으로 일어날 수 있다.

식(I)의 란탄족(III) 착체 화합물의 주사가능한 약학 조제물은 활성 성분, 즉 란탄족 착체 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 약리학적 관점에서 적합한 순도의 물에 용해시킴으로써 전형적으로 제조된다. 결과되는 조제물은 적합하게 멸균되어 그대로 사용되거나 또는 대안으로 사용 전에 동결건조되고 복원될 수 있다.

이들 조제물은 진단 요건에 따라 0.01 내지 0.5 mmol/kg 체중의 투여 범위의 농도로 투여될 수 있다.

이전에 언급된 바와 같이, R₂는 H이고 R₁은 -CH₃인 한편, 킬레이트화된 Ln(III) 이온은 Y(III) 또는 Eu(III)로부터 선택되는 식(I)의 리간드의 Ln(III) 착체가 본 발명에 따라 특히 바람직하다. 따라서, 이 리간드의 란탄족 착체 화합물은 본 발명의 나타내는 예를 비제한 예로서 사용하였다.

이 리간드는 이름 HPDO3A로 본 분야에 알려져 있고 Gd³ ⁺를 갖는 그것의 킬레이트화된 착체는 종래의 MRI 이미징으로서 사용되고 ProHance™로서 오랜 시간 시판되는 잘 알려진 조영제이다. 이 제제에 의해 나타낸 매우 낮은 독성 및 우수한 내성은 오랜 시간부터 본 분야에 알려져 있고, CEST 이미징 방법에서 이것의 사용을 특히 이롭고 안전하게 하며, 심지어 투여에서 이 기술은 종래의 MRI에서 전형적으로 사용된 것의 10배의 투여량(0.1 mmol/Kg)을 요한다.

HPDO3A의 Gd(III) 및 Yb(III) 착체의 구조는 x-선에 의해 측정되었다(예를 들어, Kumar, K.; Chang, C. A.; Francesconi, L. C.; Dischino, D. D.;Malley, M. F.; Gougoutas, J. Z.; Tweedle, M. F. Inorg. Chem.1994, 33, 3567-75 참고). 인용된 문헌에서 심지어 라세미 용액으로부터 시작하면서, 키랄 2-히드록시프로필기를 포함하는 비대칭 유닛의 존재는 거대환의 비교 형태와 다른 부분입체이성질체 형태를 갖는 2개의 독립 착체를 가져오는 한편, 2개의 분리된 착체의 배위 암은 모두 동일한 배향을 가지며, 즉 동일한 방향에서 트위스트되는 것이 기록된다.

용액 중에, 하기 구조를 갖는 HPDO3A의 Ln(III) 착체(OH 이동 양성자에 동그라미가 그려짐)는 8개의 이성질체 형태, 더 상세하게는 스킴 1에 개략화된 4개의 부분입체이성질체 및 4개의 거울상체를 전형적으로 나타낸다.

스킴 1

동일한 형태이성질체의 각각 R 및 S 형태에 대부분 기여가능할 것 같은, 부분입체이성질체 형태 중 2개는 NMR 스펙트럼(도 1에 나타냄)에서 그리고 특히, 2개의 주요 부분입체이성질체에 합리적으로 기여가능한 포화 이동의 2개 영역을 분명히 나타내는, Yb-HPDO3A의 Z-스펙트럼(도 2b에 기록됨)에서 검출가능하다. 대신에, 다른 2개의 부분입체이성질체의 증거는 다른 온도에서 기록된 착체의 NMR 스펙트럼의 비교에 의해 유도될 수 있다.

상기 모두와 전체로 일치하여, 착체의 2개 NMR-구별가능 부분입체이성질체의 히드록실기는 도 2a)에 나타난 20℃에서 각각 72 및 99 ppm에서 다른 화학적 이동 및 다른 교환 속도를 잘 나타내는데, 이것은 본 발명에 따르는 레이셔메트리-기반 방법을 설정하는데 이용될 수 있다.

pH를 향한 이 착체에 의해 나타낸 반응성은 실험 섹션에서 상세히 기록된 시험관 내 MRI 실험에 의해 또한 확인되었다.

얻어진 결과는 Yb-HPDO3A 부분입체이성질체의 각각의 OH 이동 양성자에 의해 나타낸 pH에서 포화 이동의 의존성이 다른 것을 확인한다. 이것은 중간엽 줄기 세포로 수행된 시험에서 세포 내 pH의 농도-독립 평가를 가능하게 하는 레이셔메트리 접근방법의 이용을 허용하였다.

흥미롭게, 도 5의 b 및 c에 각각 나타낸 이 시험으로부터 얻어진 ST 맵은 ST 효과가 YbHPDO3A로 배양 또는 전기천공된 세포에 대해서만 나타낼 수 있는 한편, 어떤 포화는 착체의 부재로 기록되는 것을 확인한다. 관찰된 ST 효과는 7.00±0.2의 측정된 pH에 해당하는 전기천공된 세포에 대해 더 높은 한편, 세포 2의 펠렛에서 측정된 pH는 6.8±0.3였다.

현저히, pH를 향한 Yb(III)HPDO3A에 의해 나타낸 높은 민감도는 도 8에 나타낸 바와 같이 그것의 효과적인 사용을 종양 영역(피하 종양)의 환경 pH의 측정에서 허용하였다. 본 발명자들의 지식에 대하여 이 결과는 CEST제제를 사용한 이전에는 결코 달성되지 않았다.

환경 온도를 향한 Yb(III)HPDO3A에 의해 나타낸 반응성이 또한 시험되었다. 얻어진 결과는 특히 2개의 NMR-구별가능 부분입체이성질체의 2개 히드록실 양성자의 화학적 이동에 의해 나타낸 온도에 대한 관련 민감도를 강조하였다. 따라서, 화학적 이동은 농도에 의존하지 않기 때문에, 환경의 온도는 단순히 착체의 Z-스펙트럼에서 관찰된 화학적 이동의 값에 의해 정확하게 얻어질 수 있다.

예상된 바와 같이, 특히 온도를 향해 많이 증가된 민감도는 각각의 구별가능한 입체이성질체에 대한 4개 이하의 OH 이동 양성자를 포함하는, Yb(III)HPDO3A의 4합체 유도체로 관찰되었다.

Yb(III)HPDO3A에 의해 나타낸 pH를 향한 동일한 반응성은 해당 Eu(III) 착체 화합물에 대해 또한 입증되었다. 도 12에 나타낸 이 착체의 NMR 스펙트럼은 2개의 주요 이성질체의 존재를 분명히 나타낸다. 이들 이성질체의 히드록실기에 속한 신호는 EuHPDO3A를 물 및 D₂O에 각각 함유하는 2개의 다른 용액의 NMR 스펙트럼을 비교함으로써 지정되었다. 따라서, (2개의 부분입체이성질체의 OH 양성자에 대한) 2개의 화학적 이동은 pH=2 및 37℃에서 20.5 ppm(물로부터) 및 16.7 ppm에서 각각 지정되었다. 그러나, 도 13으로부터 나타낸 바와 같이, 생리적 값을 향한 용액 pH를 증가시킴으로써, 양성자 교환 속도는 증가하고 어려운 그것의 선택적인 조사를 제공하는 이들 2개의 신호 사이의 화학적 이동의 분리는 생리적 조건하에서 감소한다. 그러나, ST 프로파일은 2개의 분명한 공명을 둘 다 관찰한 다음 레이셔메트리 측정을 수행하는 것을 가능하게 하는 한편, 포화 이동은 어떤 경우에서 (실제 흡수 주파수에 대하여) 중간체 값의 공명 주파수, 즉 약 18 ppm을 사용함으로써 관찰가능한 것을 6 μT(조사 출력)에서 작용시킴으로써 나타내는, 다른 조사 펄스를 사용함으로써 기록되었다.

상기 모두로부터 YbHPDO3A 및 EuHPDO3A은 pH 및 온도의 생체 내 평가에 대한 반응성 CEST제제로서 효과적으로 사용될 수 있다는 것으로 귀착된다.

이 정도로, Yb- 및 Eu-HPDO3A는 둘 다 ProHance®, 해당 가돌리늄 착체에 의해 나타낸 생체분포, 분비 및 내성에 관하여 동일한 성질을 갖는다는 것을 안전하게 추정할 수 있고, 따라서 그것들은 촉진시키는 동일한 종류의 종래의 해부 이미징을 가능하게 할 수 있다. 이롭게, 그러나, Yb- 및 Eu-착체의 사용은 CEST-기반 해부 이미지의 포착을 허용하고, 제제가 분포하는 상기 향상된 해부 영역의 pH 및/또는 온도와 관련한 추가 정보를 갖는 종래의 MRI에서 ProHance®에 의해 이미 가능한 해부 정보를 더 보충하고 통합하는 것을 허용하였다.

원리의 추가 증거로서, 하기 식을 갖는 4-[2-히드록시-3-[4,7,10-트리스[카르복시메틸 2-(1,1-디메틸에톡시)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데크-1-일]프로폭시]벤조산의 Yb(III) 착체(이하에 화합물 2)에 의해 나타낸 pH에 대한 반응성이 또한 평가되었다.

화합물 2의 Z-스펙트럼(도 14에 기록됨)은 용액 내에서 착체의 2개 주요 부분입체이성질체에 기여가능한 포화 이동의 2개 영역을 나타낸다. 2개의 분명한 부분입체이성질체의 존재는 각각 50 및 94 ppm에서 2개의 적합하게 이동된 OH 양성자 공명을 제공한다.

이 착체로 수행된 반응성 시험으로 pH에 대한 그것의 민감도를 확인하였는데 이것은 도 15 및 16으로부터 나타낸 바와 같이, 이동 양성자 Yb(III)HPDO3A를 통해 이 착체의 부분입체이성질체의 히드록실 양성자에 의해 나타낸 더 높은 교환 속도로 인하여, 바람직하게는 5.5 내지 6.2의 범위의 보다 산성의 pH에서 더 높다.

본 발명에 따르는 pH 반응제제의 추가 예는 하기 식을 갖는 1-(2-히드록시에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-4,7,10-트리아세트산의 Yb³ ⁺착체(이하에 화합물 3)가 대표적이다.

도 17에 기록된 이 화합물의 NMR 스펙트럼은 화합물의 SAP 및 TSAP의 형태에 해당하는, 2개의 주요 이성질체의 존재에 기인하는 두 세트의 신호를 나타낸다. 실제로, 4개의 이성질체가 아세테이트 암의 레이아웃 또는 거대환 고리의 형태에 대해 다른 용액에 존재한다. 이들 이성질체는 한 쌍의 거울상체이기 때문에, 거울상체가 NMR 관점으로부터 구별할 수 없음에 따라, 두 세트의 신호가 NMR 스펙트럼에서 실제로 예상된다. 상기와 완전히 일치하여, 화합물 3의 Z-스펙트럼(각각의 시험된 pH 값에 대해 도 18에 기록됨)은 공명이 78 및 99 ppm에서 각각 이동되는 이 화합물에 의해 제공된 2개의 다른 엇사각기둥(square antiprism) 및 트위스트된 엇사각기둥(SAP 및 TSAP) 이성질체의 히드록시에틸 암 상에 OH기에 기여가능한 2개의 포화 영역의 존재를 나타낸다.

도 18에 제공된 6.4 내지 8의 pH 범위에서 이 화합물로 수행된 반응성 시험의 결과는 pH를 향한 그것의 민감도를 확인한다.

본 발명에 따르는 Ln(III) 착체 화합물의 다른 예는 하기 식을 갖는 1[2,3-디히드록시-3-아민프로필]1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-4,7,10-트리아세트산의 Yb(III) 착체(이하에 화합물 4)이다.

이 경우에, 2개의 분명한 부분입체이성질체의 존재는 각각의 2개 다른 SAP 및 TSAP 이성질체에서 2개의 다른 히드록실 -OH기에 속하는, 4개의 비등가 이동 양성자에 대해 제공해야 한다.

실제로, 화합물 4의 Z-스펙트럼 및 포화 이동 ST 프로파일(도 19에 기록됨)은 각각 10, 75, 및 100 ppm에서 3개의 적합하게 이동된 양성자 공명의 존재를 확인한다. 그것들 중, 높게 이동된 공명(각각 75 및 100 ppm에서)은 용액 중에 화합물의 2개 분명한 이성질체(SAP 및 TSAP)에 의해 제공된 금속 중심의 배위 구형에 가장 가까운 OH기의 교환 양성자에 합리적으로 기여하는 한편, 이동된 신호가 나머지 OH기의 교환하는 양성자에 덜 기인할수록, 금속 중심으로부터 더 거리가 있다. 1/4 교환 풀은 아마도 NMR 시간스케일에서 너무 빠른 교환 속도로 인하여 스펙트럼에서 검출할 수 없다.

시험관 내에서 이 착체 화합물로 수행된 반응성 시험은 도 19 및 20으로부터 나타낸 바와 같이 pH에 대한 그것의 민감도를 확인한다.

특히, 얻어진 결과는 각각 75 ppm 및 100 ppm에서 2개의 부분입체이성질체의 OH 이동 양성자에 의해 나타낸 pH로부터 포화 이동의 의존성이 다른 것을 확인한다. 이것은 6.8의 pH 값을 수득하는 이 착체 화합물로 표지된 쥐류 대식 세포(J774)로 수행된 시험에서 세포 내 pH의 농도-독립 평가를 가능하게 하는 레이셔메트리 접근방법의 이용을 허용하였다.

추가 예로서, 하기 구조를 갖는 1[1,3,4-트리히드록시부탄-2-일]1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-4,7,10-트리아세트산의 Yb 착체(이하에 화합물 5)가 조사되었다.

이 점에서, 이 동일한 킬레이트화 리간드의 Gd³ ⁺착체가 종래의 MRI 이미징에서 사용하기 위해 임상적으로 승인되고 GADOVIST®로서 시판되는, 잘 알려진 조영제인 것은 어떠한 가치도 없다. 그것의 제조는 EP0448191호에 기술된다.

이 화합물의 구조는 예를 들어, Yb(III)HPDO3A를 통해 잠재 입체이성질체의 수를 상당히 증가시키는 2개의 키랄 중심을 포함한다.

도 21로서 제공된, 이 화합물의 스펙트럼 Z는 그것이 허용하는 복수 중에서 2개의 가장 풍부한 입체이성질체 형태로 인하여, 50 및 75 ppm에서 각각 구별가능한 적어도 2개의 피크 나타낸다. 이 화합물의 이동 양성자를 특징으로 하는 높은 교환 속도는 가장 풍부한 NMR-구별가능 이성질체가 5.5 주위의 더 낮은 pH 값에서만 검출가능한 것을 가져온다. 대신에, 더 높은 pH 값에서 -75에서 피크는 화합물 구조의 변화로 인하여 가능하게 스펙트럼에서 나타난다.

본 발명에 따르는 바람직한 식(I)의 란탄족(III) 착체에 의해 포함되지 않지만, 상기 화합물 5는 본 발명에 따르는 농도 독립 CEST 이미징 방법을 설정하는데 허용하고, 용액 내에서 제제의 NMR 구별가능 입체이성질체의 히드록실기에 속하는 비등가 이동 양성자에 대해 제공한다.

따라서, 본 발명에 따르는 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법에서 1[1,3,4-트리히드록시부탄-2-일]1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-4,7,10-트리아세트산의 란탄족(III) 착체의 사용, 그뿐만 아니라 상기 Ln(III) 착체의 2개 NMR-구별가능 이성질체에 의해 제공된 2개의 자기적으로 비등가인 이동 양성자를 이용하는 레이셔메트리 기반 CEST MRI 방법은 본 발명 내에 포함되고 그것의 추가 구체예를 구성한다.

실험 섹션

식(I)의 킬레이트화 리간드는 본 분야에 알려져 있거나 또는 당업자에게 잘 알려진 방법 또는 합성 경로에 따라 쉽게 제조될 수 있다.

게다가, 합성 방법의 비제한 예는 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법에서 본 발명에 따르는 란탄족(III) 착체 화합물의 사용과 관련된 상세설명과 함께 예를 들어 실시예 1-3에서 하기에 포함된다.

CEST 이미징 방법 및 조건

CEST MR 콘트라스트 향상은 Micro2.5 미세이미징 프로브가 장착된 Bruker Avance 300 분광기의 7T에서 얻어진 이미지에서 측정되었다. 3.3밀리초의 에코시간 및 5초의 TR 값을 갖는 전형적인 RARE 스핀-에코 시퀀스(RARE 요인 64)가 사용되었다. 10 mm의 정사각형 FOV를 갖는 64 × 64의 포착 매트릭스가 사용되었다. 전체 시퀀스는 24, 12, 6 μT의 RF 강도로 2초 길이의 연속파 펄스로 구성되는 포화 스킴에 의해 선행되었다. Z-스펙트럼은 MATLAB 플랫폼 작동에서 편찬한 소프트웨어를 광범위하게 사용함으로써 레이셔메트리 값을 측정하기 위해 성공적으로 분석되었으며, 이것은 Development and validation of a smoothing - splines - based correction method for improving the analysis of CEST - MR images, Stancanello J Terreno E, Delli Castelli D, Cabella C, Uggeri F 1, Aime S.; CONTRAST MEDIA & MOLECULAR IMAGING Volume: 3, Issue: 4, Pages: 136-149, 2008; 및 Methods for an improved detection of the MRI - CEST effect. Terreno E, Stancanello J, Longo D, Delli Castelli D, Milone L, Sanders HMHF, Kok MB, Uggeri F, Aime S; CONTRAST MEDIA & MOLECULAR IMAGING; Volume: 4; Issue: 5;Pages: 237-247; 2009에 개시된 바와 같고, 모두는 본원에 참고자료로 포함된다. 용액의 총 상자성 농도는 Bruker Avance 600 분광기(12T)에서 용액의 자기화율의 측정을 통해 측정되었다.

실시예 1

( Yb ³ ⁺ ) ₄ HPDO3A - 4합체의 제조.

4합체 킬레이트화된 착체 YbHPDO3A-4합체는 스킴 2에 개략화된 합성 방법을 사용함으로써 제조되었는데, 이것의 주된 단계를 아래 상세히 나타낸다.

스킴 2

3,6- 디옥사 -8- 노넨산 (I): THF(100 ml) 중의 2-알릴옥시에탄올(112 g; 1.1 mol) 용액을 THF(250 ml) 중의 수소화나트륨(오일 중 60%)(88 g; 2.2 mol) 현탁액에 기계 교반기하에서 방울로 떨어뜨렸다. 실온에서 20시간 후, THF(150 ml) 중의 브로모아세트산(138.9 g; 1.0 mol) 용액을 적가로 첨가하여, 용매의 자발적 환류를 야기하였다. 용액을 환류하에서 2시간 동안 유지한 다음, 에탄올(50 ml)로 희석하고, 30분 후 현탁액을 농축시켰다. 잔류물을 물(400 ml)에 용해시키고 용액을 에틸 에테르(3 × 100 ml), 디클로로메탄(2 × 100 ml)으로 세척하고; 수상을 염산 37%로 pH 1까지 산성화시키고 생성물을 디클로로메탄(300 ml + 4 × 50 ml)으로 추출하였다. 유기상을 물(4 × 50 ml), 염수(40 ml)로 세척하고 증발시킨 액체 잔류물을 67 Pa의 압력의 진공하에서 증류하여, 3,6-디옥사-8-노넨산(I)을 무색 액체로서 얻었다(119.5 g; 0.746 mol). 수율 75%. p.eb₆₇ _- _Pa 98-100℃. 타이틀 93.5%.

12,12'- 비스 [2- 아자 -3-옥소-5,8- 디옥사 -11- 운데칸일 ]-1,13- 디엔 -4,7,17,20-트리옥사-9,15- 디옥소 -10,14- 디아자트리코산 ( II )

3,6-디옥사-8-노넨산(I)(40.1 g; 0.25 mol), 디이소프로필에틸아민(42.6 ml; 32.4 g; 0.25 mol) 및 O-(벤질트리아졸-1-일)-N,N, N' , N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트[HBTU](96.0 g; 0.25 mol)를 디메틸포름아미드(200 ml) 중의 2,2'-비스-아미노메틸렌-1,3-디아미노프로판(7.2 g; 0.050 mol) 현탁액에 첨가하였다. 5일 후 용액을 증발시킨 잔류물(200 g)을 에틸 에테르(4 × 400 ml, 4 × 50 ml)로 처리하고; 에테르 용액을 5% NaHCO₃ 용액(6 × 50 ml), 염수로 세척하고, 증발시킨 잔류물(84.6 g)을 물(2 × 100 ml)로 처리한 다음 고진공(50 Pa)하에서 건조시켜, 12,12'-비스[2-아자-3-옥소-5,8-디옥사-11-운데칸일]-1,13-디엔-4,7,17,20-트리옥사-9,15-디옥소-10,14-디아자트리코산(II)을 고체 잔류물(34.5 g)로서 얻었다.

12,12'- 비스 [2- 아자 -3-옥소-5,8- 디옥사 -10,11- 옥시란운데실 ]-(1,2)(22,23)- 디옥시란 -4,7,17,20- 트리옥사 -9,15- 디옥소 -10,14- 디아자트리코산 ( III )

클로로포름(500 ml) 중의 m-클로로퍼벤조산(70.5%)(MCPBA)(36.9 g; 0.150 mol) 용액을 물로부터 분리하고, 클로로포름(300 ml) 중의 12,12'-비스[2-아자-3-옥소-5,8-디옥사-11-운데칸일]-1,13-디엔-4,7,17,20-트리옥사-9,15-디옥소-10,14-디아자트리코산(II)(17.5 g; 0.025 mol) 용액으로 교반기하에서 적가하였다. 실온에서 2일 후, 용액을 m-클로로퍼벤조산 및 m-클로로벤조산이 둘 다 완전히 제거할 때까지 5% NaHCO₃ 용액으로 세척한 다음, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 용액을 증발시킨 잔류물에서, 12,12'-비스[2-아자-3-옥소-5,8-디옥사-10,11-옥시란운데실]-(1,2)(22,23)-디옥시란-4,7,17,20-트리옥사-9,15-디옥소-10,14-디아자트리코산(III)을 왁스-유사 고체(20.0g)로서 얻었다.

1,23- 비스 [4,7,10- 트리아세틱 [1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -(1)-일]]-12,12'-비스[11[4,7,10- 트리아세틱 )-[1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -(1)-일]]2- 아자 -3-옥소-5,8- 디옥시 -10- 히드록시운데칸일 ]2,22-디히드록시-4,7,17,20-테트록시-9,15-디옥소-10,14-디아자트리코산(V)

아세토니트릴(50 ml) 중의 12,12'-비스[2-아자-3-옥소-5,8-디옥사-10,11-옥시란운데실]-(1,2)(22,23)-디옥시란-4,7,17,20-트리옥사-9,15-디옥소-10,14-디아자트리코산(III)(3.6 g; 0.0047 mol), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리아세트산의 1,1-디메틸에틸 트리스-에스테르(10.3 g; 0.020 mol) 및 디이소프로필에틸아민(4.0 ml; 0.047 mol) 용액을 50℃에서 10일 동안 가열하였다. 용액을 증발시켜, 1,23-비스[4,7,10-트리스(1,1-디메틸에틸아세테이트)[1,4,7,10-테트라아자시클로데칸-(1)-일]]-12,12'-비스[11[4,7,10-트리스(1,1-디메틸에틸아세테이트)[1,4,7,10-테트라아자시클로데칸-(1)-일]]-2-아자-3-옥소-5,8-디옥시-10-히드록시운데칸일]-2,22-디히드록시-4,7,17,20-테트록시-9,15-디옥소-10,14-디아자트리코산(IV)을 얻었다. 미정제 잔류물을 얼음욕으로 냉각시키고; 트리플루오로아세트산(20 ml)을 교반기 상에서 첨가하고; 용액 트리스이소프로필실란(100 mcl)을 첨가하였다. 5일 후, 에틸 에테르(200 ml)를 첨가하고 침전물을 여과하고 건조시켰다(13.4g). 고체를 물(15 ml)에 용해시키고 Amberchrome CG161(2.6 × 55cm)(AKTAFPLC)에서 메탄올/물을 용리액으로서 사용함으로써(0 내지 100 v/v%의 구배) 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 순수 분획의 냉동건조 후 원하는 생성물(V)을 흰색 고체(4.4 g)로서 얻었다;

착염 타이틀 = 74%(pH 10에서 황산염아연 0.1N 및 뮤렉시드를 갖음) 주된 불순물은 트리플루오로아세트산으로 나타남.

얻어진 생성물의 NMR(¹³C) 스펙트럼은 킬레이트화 리간드의 구조와 일치한다.

1,23- 비스 [4,7,10-트리아세테이트[1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -(1)-일]]-12,12'-비스[11[4,7,10-트리아세테이트)-[1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -(1)-일]]2- 아자 -3-옥소-5,8- 디옥시 -10- 히드록시운데칸일 ]2,22-디히드록시-4,7,17,20-테트록시-9,15- 디옥소 -10,14- 디아자트리코산 테트라 이테르븀 착체(1:4)( VI );

물(25 ml) 중의 염화이테르븀 6수화물(3.92 mol) 용액을 물(100 ml) 중의 리간드(V)(3.5 g; 0.98 mmol; 리간드의 정확한 몰량은 착염 적정에 의해 측정됨) 용액에 교반기 상에서 첨가하고, 용액을 수산화나트륨 2N(11.4 ml)로 pH 7.0까지 매우 천천히 중화시켰다. 리간드 과량이 0.2% 미만이고 pH가 일정할 때, 용액을 Sephadex G10 컬럼에 의해 탈염시키고 용액 냉동건조 후, 원하는 착체, 1,23-비스[4,7,10-트리아세테이트[1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-(1)-일]]-12,12'-비스[11[4,7,10-트리아세테이트)-[1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-(1)-일]]2-아자-3-옥소-5,8-디옥시-10-히드록시운데칸일]2,22-디히드록시-4,7,17,20-테트록시-9,15-디옥소-10,14-디아자트리코산 이테르븀 착체(1:4)(VI)(2.3g)를 얻었다.

실시예 2

1(2- 히드록시에틸 )-1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -4,7,10- 트리아세트산의 이테르븀 킬레이트 착체(화합물 3)의 제조

화합물 3에 해당하는 이테르븀 킬레이트화된 착체를 스킴 3에 개략화된 일반적인 합성 방법을 사용함으로써 제조하였는데, 이것의 주된 단계를 아래 상세히 나타낸다.

스킴 3

1-[2-[ 테트라히드로피란 -(2-일)-옥소]에틸]-1,4,7,10- 테트라아자시클로 -도데칸-4,7,10- 트리아세틱 -(1,1-디메틸에틸 에스테르)( VIII )

(2-브로모에톡시)테트라히드로피란( VII )을 J. Org. Chem. 1986, 51, 752-755에 기술된 방법에 따라 합성하였다. 이 물질(27.5 mmol; 5.75 g)을 50 ml의 아세토니트릴에 용해시키고 예를 들어 W096/28433호에 개시된 바와 같이 제조된 아세토니트릴(150 ml) 중에 K₂CO₃(75 mmol; 10.37 g) 및 DO3A-트리스-tert-부틸에스테르 브로모히드레이트(25 mmol; 14.89 g) 현탁액에 적가로 첨가하였다. 실온에서 하룻밤 후, 혼합물을 여과하고 증발시켰다. 그 다음 잔류물을 에틸 아세테이트(100 ml)에 용해시키고 물 및 염수로 세척하였다. 유기 용액을 진공에서 농축시키고 미정제 생성물을 에틸 아세테이트/에탄올 구배를 갖는 실리카겔에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획들을 합하고 증발시켜 노란색 오일(8.1 g; 수율 49%)을 얻었다.

¹H-NMR(600 MHz, CD₃Cl) 및 ¹³C NMR(150 MHz, CD₃Cl)은 제안된 구조와 일치한다.

MS [M+H]⁺계산치: 642.46 실측치: 643.64.

1-(2- 히드록시에틸 )-1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -4,7,10-트리아세트산( IX )

중간체 VIII(15 g; 21.5 mmol)를 물(30 ml), THF(60 ml) 및 아세트산(120 ml)에 용해시키고, THP 부분을 제거하기 위해 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 그 다음 혼합물을 농축시키고 트리이소프로필실란(120 ㎕) 및 TFA(40 ml)를 0℃에서 적가로 첨가하였다. 실온에서 3일 후, 미정제 생성물을 디에틸 에테르(200 ml)로 침전시키고 여과하고, 물 중의 0.2% TFA를 갖는 Amberchrom CG161 수지에서 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그 다음 원하는 생성물을 함유하는 분획들을 합하고 냉동건조하고, HCl 1N(60 ml)로 산성화시키고 다시 냉동건조하였다(7.3 g; 수율 80%).

¹H-NMR(600 MHz, D₂O) 및 ¹³C NMR(150 MHz, D₂O)은 제안된 구조와 일치한다.

MS [M+H]⁺계산치: 390.21 실측치: 391.53.

1-(2- 히드록시에틸 )-1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -4,7,10-트리아세테이트(3-) 메탈레이트 (X)

착화 반응을 리간드의 첨가 방법에 의해 pH 6.5에서 수용액 중의 MeCl₃(Me = Yb, Eu, Tm 또는 Dy)로 수행하였다(J. Med. Chem. 2006, 49, 4926 참고). 등몰 양의 수성 MeCl₃ 용액을, NaOH 0.1 N로 pH 값을 6.5로 유지하는 IX의 수용액에 천천히 첨가하였다. 혼합물을 pH가 일정할 때까지 실온에서 교반하였다. 약간 과량의 금속이 도달될 때, 오렌지 크실레놀 어세이로 모니터링하고(Contrast Med. Mol. Imaging 2006, 1, 184 참고) 약간 과량의 리간드를 첨가하였다(2% 미만). 그 다음 착체를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 탈염시키고 냉동건조하였다.

Evans 시험(DM Corsi, C. P. Iglesias, H. van Bekkum, JA Peters, Magnetic Resonance in Chemistry , 2001, 39,(11), 723726)에 의해 측정된 착체의 타이틀은 98%였다.

실시예 3

1[2,3-디히드록시프로필]-1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -4,7,10- 트리아세트산의 이테르븀 킬레이트 착체(화합물 4)의 제조

화합물 4에 해당하는 이테르븀 킬레이트화된 착체를 스킴 4의 합성 방법을 사용함으로써 제조하였는데, 이것의 주된 단계를 아래 상세히 나타낸다.

스킴 4

1[2,3-디히드록시프로필]1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -4,7,10-트리아세트산( XIII )

아세토니트릴(50 ml) 중의 2,3-에폭시프로판올(12.0 g; 0.20 mol), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리아세트산의 1,1-디메틸에틸 트리스-에스테르(10.3 g; 0.020 mol)(XI) 및 디이소프로필에틸아민(8.0 ml; 0.09 mol) 용액을 50℃에서 3일 동안 가열하였다. 용액을 증발시켜 1[2,3-디히드록시프로필]1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-4,7,10-트리스(1,1-디메틸에틸아세테이트)(XII)를 얻었다. 미정제 잔류물을 디클로로메탄(100 ml)에 용해시키고 얼음욕으로 냉각시킨 다음 트리플루오로아세트산(15 ml)을 교반기 상에서 첨가하고; 디클로로메탄을 증발시키고, 트리플루오로아세트산(90 ml) 및 트리이소프로필실란(200 ml)을 첨가하였다. 1일 후, 에틸 에테르(200 ml)를 첨가하고 침전물을 여과하고 건조시켰다(16.5 g). 고체를 물(30 ml)에 용해시키고 물을 용리액으로 하여 Amberlite XAD 1600(5 × 12 cm)(AKTA FPLC) 상에서 정제하였다. 순수 분획의 냉동건조 후 원하는 리간드(XIII)를 흰색 고체로서 얻었다;(10.6 g).

NMR(¹³C) 스펙트럼은 킬레이트화 리간드의 구조와 일치한다.

그 다음 수집된 리간드의 착염 적정을 수행하여(pH 10에서 황산염아연 0.1N 및 뮤렉시드를 갖음) 란탄족 산화물의 완전 착화를 위해 요청된 양을 평가하였다.

얻어진 타이틀(41.9%)은 리간드의 착화 후 제거된 트리플루오로아세트산 및 용매의 잔류 존재를 확인한다.

1[2,3-디히드록시-3- 아민프로필 ]1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -4,7,10-트리아세테이트 메탈레이트( XIV );

금속 산화물(2.21 mmol)을 물(30 ml) 중의 1[2,3-디히드록시프로필]1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-4,7,10-트리아세트산(XII)(4.4 g; 4.43 mmol; 착염 적정에 의해 계산됨) 용액에 교반기 상에서 첨가하고, 용액을 90℃로 가열하였다. 산화물이 용해되었을 때, 용액을 냉각시키고, Millipore 0.45 ㎛로 여과하고 Relite 3ASFB를 pH 7까지 천천히 첨가하고; 수지를 여과하고 용액을 냉동건조하여, 1[2,3-디히드록시프로필]1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-4,7,10-트리아세테이트 메탈레이트(XIV)를 얻었다.

금속	90℃로 가열시간(일)	얻어진 화합물	착체 타이틀 (Evans)	수율
Yb	3	2.31 g	75.6%	67.5%
Eu	1	2.14 g	84.5%	72.0%

리간드의 과량은 크실레놀-오렌지를 지시약으로서 사용함으로써 pH 5.8까지 염화금속 0.001M로 착염 적정에 의해 측정되었다.

착체의 타이틀은 Evans 시험(DM Corsi, C. P. Iglesias, H. van Bekkum, JA Peters , Magnetic Resonance in Chemistry , 39, 11, pages 723726, 2001)에 의해 대신 측정하였다.

실시예 4

시험관 내 시험

pH 를 향한 Yb ( III )HPDO3A의 반응.

pH를 향한 Yb(III)HPDO3A의 반응성은 14개의 모세관을 함유하는 팬텀을 사용함으로써 시험관 내에서 조사되었는데, 그 중 11개가 24 mM 농도 및 5.19 내지 8.75의 범위의 다른 pH를 갖는 YbHPDO3A의 용액을 포함하고(모세관 1-11), 3개가 pH 7.31 및 3 내지 24 mM의 범위의 농도에서 YbHPDO3A의 용액을 함유하였다. CEST MRI 실험을 20℃ 및 37℃에서 수행하였다. 72 및 99 ppm에서 각각 조사된 팬텀의 MR 이미지를 기록하여 도 3에 나타내었다. 특히, 도 3c)는 72 ppm(20℃; 조사 출력 펄스 24 μT)에서 히드록실 양성자의 조사시 얻어진 ST 맵을 나타내는 한편, 도 3d)는 99 ppm(20℃, 조사 출력 펄스 24 μT)에서 히드록실 양성자의 조사시 얻어진 ST 맵을 나타낸다.

얻어진 결과는 용액 내에서 2개의 Yb(III)HPDO3A 부분입체이성질체의 각각의 OH 양성자에 의해 나타난 포화 이동의 pH로부터의 의존성이 다른 것을 확인하며, 이것은 레이셔메트리 접근방법의 이용을 허용하였다. 그 다음 보정 곡선은 도 3e)에 기록된 바와 같이, 각각 72 ppm 및 99 ppm에서 2개 이성질체의 히드록실 양성자의 조사시 얻어진 pH의 변동으로 ST 효과의 변동을 측정함으로써 수행하였고, 도 3f)의 레이셔메트리 곡선을 얻도록 허용하였다.

실시예 5

세포 내 pH 를 평가하기 위한 Yb ( III )HPDO3A의 사용.

중간엽 줄기 세포를 시험을 위한 세포주로서 선택하였다. 실험에 사용된 세포를 쥐류 골수로부터 추출한 다음, 20%의 FBS(소태아혈청)를 갖는 Alpha MEM 배지에 배양하였다. 제 1통과에서 프리모신을 세포에 첨가하였다. 콘플루언스가 약 70%이었을 때 세포를 0.25 트립신-EDTA로 분리하고 PBS로 세척하고 YbHPDO3A 0.15 M의 용액으로 재현탁하였다. 세포의 일부를 37℃에서 3시간 동안 배양하는 한편 일부를 전기천공하였다. 그 다음 세포를 PBS에 세척하고 MRI 실험을 위해 준비하였다.

특히: CEST 맵(도 5에 나타냄)은 1) PBS 37° pH 7.4 중의 0.15 M YbHPDO3A를 함유하는 용액으로 3시간 동안 배양된 MSH 세포의 펠렛(모세관 2); 2) PBS pH 7.4 중의 0.15 M YbHPDO3A 용액으로 전기천공된 MSH 세포의 펠렛(모세관 3); 3) PBS로만 배양되고 기준으로서 사용된 MSH 세포의 펠렛(모세관 1), 그리고 빈 모세관(모세관 4)을 함유하는 팬텀에 대해 얻어졌다. ST% 효과를 각각 72 및 99 ppm에서 팬텀의 조사시 측정하였다. 도 5의 b 및 c에 각각 기록된, 얻어진 ST 맵은 ST% 효과를 YbHPDO3A로 배양 또는 전기천공된 세포에 대해서만 볼 수 있는 한편, 어떤 포화가 착체의 부재에서 기록된 것을 나타내었다. 관찰된 ST 효과는 7.00±0.2의 측정된 pH에 해당하는 전기천공된 세포에 대해 더 높은 한편, 모세관 2의 배양된 세포의 펠렛에서 측정된 pH는 6.8±0.3였다.

실시예 6

생체 내 시험

흑색종의 동물 모델에서 pH 의 평가를 위한 Yb ( III )HPDO3A의 사용

생체 내 측정은 흑색종의 동물 모델에 YbHPDO3A의 1.2 mmol/Kg의 정맥내 주사로 수행되었다. 6 내지 10주령 암컷 C57Bl6 마우스(Charles River Laboratories, Calco, Italy)에게 ATCC(Manassas, VA, USA)로부터 얻고 0% FBS, 2 mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 g/ml 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에서 성장시킨, 약 1×10⁶B16 쥐류 흑색종 세포를 함유하는 0.2 ml의 단일 현탁액을 왼쪽 옆구리에 피하로 접종하였다.

CEST 콘트라스트 향상 MR 이미지를 Micro2.5 미세이미징 프로브가 장착된 Bruker Avance 300(Bruker, Germany) 분광기의 7T에서 얻었다.

마우스에게 세포 접종 7일 후, 즉 종양 덩어리가 약 4 mm의 평균 직경에 도달했을 때, YbHPDO3A의 용액(1.2 mmol/Kg의 CEST제제에 해당하는, 200 ㎕의 150 mM YbHPDO3A 용액, 즉 ProHance®에 대해 임상적으로 승인된 투여량의 3배)을 주사하였다.

Z-스펙트럼은 구형 연속파(square wave) 펄스(기간 2초, 출력 12 μT, 1 ppm 단계에서 -20 내지 20 ppm의 범위의 주파수)에 의해 선행된 RARE 시퀀스(RARE 요인 8, 효과적인 에코시간 4.1밀리초)를 사용함으로써 제제의 정맥내 주사 전 및 직후에 얻어진다. CEST 콘트라스트를 방광, 신장 및 종양에서 측정하였다. 방광에서 수집된 Z-스펙트럼(도 6에 기록됨)은 마취로 인하여 예상된 37℃보다 낮은 생리적 T(33℃)에 해당하는 교환 풀에 대한 이동을 나타내었다. 그 다음 pH로부터 ST 의존성의 보정은 실시예 2에서 이전에 기술된 방법에 이어서 이 온도에서 반복되었다. 얻어진 레이셔메트리 곡선을 도 7에 나타낸다.

그 다음 ST 효과는 레이셔메트리 방법의 적용에 의해 방광, 신장 및 종양에서 측정하여, 방광에서 6.06±0.2, 신장 수질에서 6.24±0.2, 종양 영역에서 6.6±0.2의 pH를 가져왔다.

도 8에서 종양 영역의 계산된 ST 맵은 토모그래프 디스플레이에 나타난 이미지에서는 실제로 밝은 붉은색인, 밝은 영역으로서 나타낸, 해당 해부 이미지에 중첩되었다.

실시예 7

시험관 내 시험

온도를 향한 Yb ( III )HPDO3A의 반응성 성질.

pH 7.31을 갖는 Yb(III)HPDO3A(24 mM)의 용액을 시험을 위해 사용하였다. 20 및 37℃에서 각각 기록된 용액의 스펙트럼 Z는 용액 내에서 NMR 구별가능한 Yb(III)HPDO3A 부분입체이성질체의 히드록실 양성자의 화학적 이동이 온도에 매우 민감한 것을 나타낸다. 사실, 도 4b)에 나타낸 바와 같이, 20° 내지 37℃를 통과할 때, 착체의 2개 다른 입체이성질체에 해당하는 공명 주파수는 99로부터 88로 그리고 72로부터 64.3 ppm으로 각각 변경한다. 양성자 화학적 이동은 제제 농도에 의존하지 않기 때문에, Z-스펙트럼의 단순한 수집은 환경의 온도를 정확하게 측정한 다음 적합한 시험관 내 보정에 의해 pH를 측정하는 것을 허용하였다.

실시예 8

온도를 향한 Yb ( III )HPDO3A- 4합체의 반응성 성질.

시험은 pH 7.4 및 298K의 0.26 내지 8.4 mM의 범위의 다른 농도를 갖는 혈청에서 YbHPDO3A-4합체의 용액을 함유하는 팬텀으로 수행되었다. 온도에 대한 (4합체 착체 입체이성질체의) OH 이동 양성자의 화학적 이동의 의존성을 단량체 화합물에 대해 이전에 기술된 바와 같이 작동함으로써 시험하였다. 도 10에 나타낸, 얻어진 레이셔메트리 곡선은 실시예 7의 단량체 화합물로 얻어진 결과를 실질적으로 확인한다. 그러나, 예상된 바와 같이, 그리고 도 10b)에 나타낸 바와 같이, 4합체 착체의 분자당 민감도가 매우 증가되었다(해당 단량체 착체와 비교할 때).

실시예 9

세포 내 pH 를 평가하기 위해 화합물 4의 사용.

쥐류 대식 세포(J774)를 시험을 위한 세포주로서 선택하였다. 이 화합물로 얻어진 레이셔메트리 곡선의 민감도의 범위는 세포 내 pH의 범위에서 처음에 적당히 조정되었다.

특히, 각각 75 ppm(부위 1) 및 100 ppm(부위 2)에서 2개 더 이동된 이동 양성자 풀의 조사시 pH에 대해 계산된 ST 곡선에 대한 레이셔메트리 접근방법의 적용에 의해, 5.5 내지 7의 범위의 pH에서 레이셔메트리 ST의 pH에 따른 변동을 나타내는 도 20의 레이셔메트리 곡선을 얻도록 허용되었다.

화합물 4를 쥐류 대식 세포(J774)에 내재화하였다. J774를 American Type Culture Collection(ATCC, Manassass, VA)으로부터 얻었다. 세포를 10% 소태아혈청(FBS), 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 Dulbecco's Modified Eagles's Medium(DMEM)에 배양하였다. 그것들을 75-cm² 플라스크에 약 2 × 10⁴개의세포/cm²의 밀도로 시딩하고 37℃에서 가습 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. J774를 70 mM의 화합물 4와 함께 밤새도록 배양하였다. 세포를 세척하고 그것의 성장 배지로 3시간 동안 재배양하였다. 그 다음 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 분리하고 MRI CEST 실험을 위해 제조하였다.

포화 이동의 레이셔메트리 값은 화합물 4와 함께 밤새도록 배양되거나 또는 성장 배지로 배양되는, 세포의 펠렛을 함유하는 팬텀의 Z-스펙트럼을 얻음으로써 계산되었다.

배양된 세포에 대해 관찰된 ST 효과는 6.8의 pH 값을 수득하였다.

실시예 10

시험관 내 시험

pH 를 향한 화합물 4의 반응.

pH를 향한 화합물 4의 반응성은 20 mM 농도 및 5.08 내지 7.4 범위의 다른 pH를 갖는 이테르븀 착체의 용액을 포함하는 6개의 모세관을 함유하는 팬텀을 사용함으로써 시험관 내에서 조사되었다. CEST MRI 실험을 20℃에서 수행하였다. 75 및 100 ppm에서 각각 조사된(조사 출력 24 μT) 팬텀으로부터 수집된 Z-스펙트럼을 도 19에 나타낸다.

pH의 함수로서 얻어진 레이셔메트리 ST 곡선을 도 20에 나타낸다.

Claims

레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법에서 CEST제제의 NMR-구별가능 입체이성질체의 사용.
제 1항에 있어서, CEST제제는 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법의 펜던트 암 상에 히드록실 양성자 교환기가 부여된 거대환 킬레이트화 리간드를 포함하는 란탄족(III) 착체 화합물인 것을 특징으로 하는 사용.
제 2항에 있어서, 란탄족(III) 착체의 란탄족(III) 금속 이온은 프라세오디뮴(III), 네오디뮴(III), 디스프로슘(III), 에르븀(III), 테르븀(III), 홀뮴(III), 툴륨(III), 이테르븀(III), 및 유로퓸(III)으로 구성된 군, 여기서 유로퓸(III) 및 이테르븀(III)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
제 3항에 있어서, 란탄족(III) 이온은 이테르븀(III) 또는 유로퓸(III)인 것을 특징으로 하는 사용.
제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 착체의 거대환 킬레이트화 리간드는 식(I)을 가지는 것을 특징으로 하는 사용.

여기서,
R은 -CH(R₂)-COOH이고,
R₁은 H 또는 O-, -N-, -CO-, -NHCO-, -CONH-기로부터 선택된 기에 의해 선택적으로 방해되고, 하나 이상의 할로겐 원자, 히드록실(-OH)기, 페닐 또는 치환된 페닐기에 의해, 또는 -COOH, -NHR₃ 또는 -NR₄R₅로부터 선택된 기에 의해 선택적으로 치환된, 곧은 또는 분기된 C₁-C₅ 알킬쇄이며, R₃, R₄ 및 R₅는 하나 이상의 히드록실 또는 C₁-C₃ 알콕시기에 의해 선택적으로 치환된 동일한 또는 서로 다른, 곧은 또는 분기된 C₁-C₃ 알킬기이고,
R₂는 H 또는 하나 이상의 C₁-C₃ 알콕시, 또는 히드록시알콕시기, 또는 그것들의 이합체 또는 다합체 유도체에 의해 선택적으로 치환된, C₁-C₅ 알킬쇄이다.
제 5항에 있어서, 식(I)에서 R₂는 H이고 R₁은,
-H,
-CH₃,
-CH₂CH₃,
-CH₂OH,
-CH₂-O-CH₃,
-CH(CH₂OH)₂,
-CH₂-CH(OH)-CH₂OH,
-CH₂-O-CH₂-C₆H₅,
-CH₂-O-CH₂-(C₆H₅-COOH), 또는
-CH₂-O-CH₂-(C₆H₅-NO₂)로부터 선택된 기를 나타내는 것을 특징으로 하는, 란탄족(III) 착체 화합물의 사용.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 식(I)에서 R₂는 H이고 R₁은 CH₃이고란탄족 금속 이온은 Yb(III) 또는 Eu(IIII)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, CEST제제는 1[1,3,4-트리히드록시부탄-2-일]1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-4,7,10-트리아세트산의 란탄족(III) 킬레이트화된 착체인 것을 특징으로 하는 사용.
농도-독립 CEST 조영제로서, 제 5항 또는 제 6항에서 정의된 식(I)의 란탄족(III) 착체 화합물, 또는 그것의 이합체 또는 다합체 유도체, 또는 제 8항의 란탄족(III) 킬레이트화된 착체의 사용.
제 9항에 있어서, 진단 관심의 물리적 또는 화학적 파라미터의 농도 독립 맵을 얻기 위해, CEST 반응제제로서 란탄족(III) 착체 화합물의 사용.
CEST제제의 NMR-구별가능 입체이성질체에 속하는 자기적으로 비등가인 교환가능 양성자를 이용하는 단계를 포함하는 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법.
제 11항에 있어서, 상기 CEST제제는 제 2항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 정의된 Ln(III) 착체 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 농도 독립 생체 내 CEST 이미징을 제공하는 것을 특징으로 하는 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 사람 또는 동물의 신체 기관, 체액 또는 조직에서 진단 관심의 물리적 또는 화학적 파라미터의 농도-독립 생체 내 맵을 얻는 것을 특징으로 하는 레이셔메트리-기반 CEST 이미징 방법.
i) 선택적으로 관심있는 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직의 MRI 형태 이미지를 기록하는 단계,
ii) 사전-투여된 란탄족 착체의 NMR-구별가능 입체이성질체에 속한 2개의 자기적으로 비등가인 이동 양성자의 공명 주파수에서 미세하게 조정된 주파수의 범위에서 Z 스펙트럼을 수집하고, 이들 이동 양성자 풀에 대해 측정된 포화 이동 ST 효과로부터 레이셔메트리 값을 계산하는 단계,
iii) 계산된 ST 값으로부터 관련된 사람 또는 동물의 신체 기관, 영역, 체액 또는 조직에서 관심있는 파라미터의 농도 독립 맵을 얻고, 선택적으로 상기 맵을 형태 이미지에 중첩시키는 단계를 포함하는, CEST MRI 기술에 의해 식(I)의 Ln(III) 킬레이트화된 착체 또는 그것의 이합체 또는 다합체 유도체로 사전-투여된 사람 또는 동물 대상에서 진단 관심의 물리적 또는 화학적 파라미터를 측정하는 방법.
상자성 금속 이온과의 HPDO3A-4합체, 그것의 염 및 그것의 킬레이트화된 착체.
적합한 생리학적으로 허용가능한 첨가제 및/또는 담체와 함께 (Yb³ ⁺)₄HPDO3A-4합체를 포함하는 진단 조성물.