KR20130121696A - 재생가능한 탄화수소 연료 혼합물의 생분해 - Google Patents

재생가능한 탄화수소 연료 혼합물의 생분해 Download PDF

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Abstract

연료 조성물의 성분으로서의 생물적으로 생성된 아이소부탄올은 재생가능한 성분을 연료 조성물에 도입하기 위한 중요한 메카니즘을 제공하며, 동시에 소정의 환경 구역이 오염된 경우에 연료 조성물의 환경 영향을 감소시킨다.

Description

재생가능한 탄화수소 연료 혼합물의 생분해 {BIODEGRADATION OF RENEWABLE HYDROCARBON FUEL BLENDS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되는 2010년 5월 21일자로 출원된 미국 가출원 제61/347,127호에 관한 것이며, 이의 우선권의 이익을 주장한다.
본 발명은 재생가능한 연료 조성물 및 상기 조성물의 환경에서의 거동 (fate)에 관한 분야에 관한 것이다.
아이소부탄올은 재생가능한 원료로부터 생산될 수 있고, 잠재적으로 에탄올보다 더 매력적인 연료 첨가제가 되게 하는 많은 특성을 가지며; 보다 큰 에너지 밀도, 보다 낮은 수분 흡수, 보다 우수한 혼합력을 갖고, 변형없이 통상적인 연소 기관에 사용될 수 있기 때문에 가솔린에 사용하기에 적합한 바이오연료 분자로서 매력적이다 (Durre, 2007, Biotech. J. 2:1525-1578). 가솔린 성분의 환경 거동 (environmental fate)에 대한 에탄올의 효과에 관해 평가한 결과, 호기성 시스템에서 연료 에탄올이 가솔린의 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 및 자일렌 (BTEX) 성분보다 먼저 우선적으로 생분해되며, 대수층에서의 에탄올 분해가 용존 산소 및 기타 영양분을 급속하게 소비하는 것으로 입증되었다 (Corseuil et al., 1998, Wat. Res. 32:2065-2072; Da Silva and Alvarez, 2002, Appl. Environ. Microbiol. 70:4720-4726; Capiro et al., 2007, Water Research, 41: 656-664). 그 결과, 가솔린 중의 에탄올의 존재는 BTEX 분해 지연을 초래할 수 있으며, 궁극적으로는 강화된 BTEX 플룸 (plume)이 형성된다 (Powers et al., 2001, Environ. Sci. Technol. 35: 24A-30A.). 딥 (Deeb) 등 (2002, J. Environ. Engin. 128: 868-875.)의 모델 시뮬레이션에 따르면, 에탄올의 존재하에서는 벤젠 플룸 길이가 16 내지 34% 증가되는 것으로 예측된 반면에, 다른 이들은 에탄올에 의한 성장에 의해 미생물 바이오매스가 더 많이 생성되는 경우에 벤젠 플룸의 수명이 가솔린 중의 에탄올 농도가 커짐에 따라 감소될 수 있음을 제시하였다 (Gomez and Alvarez, 2009, Water Resour. Res. 45).
마리아노 (Mariano) 및 그의 동료들의 연구 (2009, Biomass and Bioenergy, 33: 1175-1181)는 비오염 토양, 강물, 또는 비오염 토양과 강물의 배합물을 함유하는 호기성 마이크로코즘 (microcosm) 중에서의 가솔린 생분해에 대한 n-부탄올의 영향을 평가하기 위해 간접 측정법 (CO2 발생 및 염료 감소)을 사용하였다. 상기 연구 결과는 n-부탄올이 토양 중의 가솔린 분해를 증대시킬 수 있으며, 증대 계수가 에탄올을 사용하여 달성한 것보다 클 수 있음을 제시하였다. 가르시아-리베로 (Garcia-Rivero) (2007, J. Environ. Eng. Sci. 6: 389-395) 등에 의해 얻어진 결과는 또한 n-부탄올을 탄화수소 혼합물에 첨가하면, 탄화수소 호기성 생분해 속도를 향상시킬 수 있음을 제시하고 있다. 1970년대에 행해진 연구는 아이소부탄올 생분해를 평가하기 위해 생물학적 산소 요구량 (BOD)에 기초한 측정을 이용하였으며 (Price et al 1974, J. Water Pollut. Contr. Fed. 46, 63-77; Dias and Alexander, 1971, Appl. Microbiol. 22: 1114-1118), 및 몇몇 연구 (문헌 [Deeb et al., 2000, Biodegradation, 11;171-185; Pruden and Suidan, 2004, Biodegradation, 15:213-227; Somsamak et al., 2005, Environ. Sci. Technol. 39: 103-109; Vainberg et al., 2002, J. Environ. Eng. 128: 842-851] 참조)에서는 가솔린 산소화 (oxygenate) 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE)의 일차 생분해 생성물인 tert-부틸 알코올 (TBA)의 생분해를 평가하였다 (Hatzinger et al., 2001, Appl. Environ Microbiol. 67: 5601-5607; Steffan et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 4216-4222).
환경 오염의 상황 하에 연료 조성물의 환경 거동과 관련된 환경 악영향을 초래하지 않고서 가솔린의 재생가능한 성분을 증가시키고/시키거나 연료 조성물을 수송할 필요가 있다.
발명의 개요
본 발명은 탄화수소 연료 조성물의 재생가능성을 증가시키면서 환경 방출의 상황 하에서 상기 연료 조성물의 환경 거동을 향상시키는 방법 및 그 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 태양은 탄화수소 연료 조성물에 아이소부탄올을 혼입하여, 가솔린의 하나 이상의 BTEX 화합물의 생분해성을 향상시켜, 상기 조성물의 환경 거동을 향상시키는 방법이다. 일 태양에서, 상기 방법 및 조성물은 혐기성 조건 하에서의 생분해를 향상시킨다. 일 태양에서, 상기 방법 및 조성물은 호기성 조건 하에서의 생분해를 향상시킨다. 일 태양에서, 상기 방법 및 조성물은 질산염 환원 조건 하에서의 생분해를 향상시킨다. 일 태양에서, 탄화수소 연료 조성물에 아이소부탄올을 혼입하여, 벤젠의 생분해를 향상시킨다.
본 발명의 또 하나의 태양은 에탄올을 포함하는 액체 연료 조성물에 아이소부탄올을 첨가하여, 가솔린의 하나 이상의 BTEX 화합물의 생분해를 향상시켜, 상기 조성물의 환경 거동을 향상시키는 방법이다.
본 발명의 다른 태양은 아이소부탄올을 탄화수소 연료 조성물과 배합하는 단계를 포함하는, 에탄올이 환경 구획 (environmental compartment) (예를 들어, 토양, 퇴적물, 지하수)으로 방출된 상기 연료 조성물의 성분인 경우에, 토양 매트릭스 내의 에탄올의 수송을 감소시키는 방법이다.
본 발명의 다른 태양은 탄화수소 조성물의 탄화수소 및 에탄올 성분의 공용매로서 작용하는 아이소부탄올을 적당량 첨가하여, BTEX 플룸을 지연시키고/시키거나 부분적으로 포함시켜 지하수면으로의 이의 누출 가능성을 감소시키는 단계를 포함하는, 임의로 에탄올을 포함하는 탄화수소 조성물의 환경 구획으로의 방출에 의한 BTEX 플룸을 감소시키는 방법이다.
본 발명의 다른 태양은 탄화수소 조성물이 환경 구획을 오염시키는 경우에 상기 조성물의 잠재적인 환경 영향을 증가시키지 않으면서, 상기 조성물의 재생가능성을 향상시키기에 충분한 양의 아이소부탄올, 에탄올 및 탄화수소를 포함하는 액체 연료 조성물에 관한 것이다. 다른 태양에 있어서, 연료 조성물의 재생가능성은 증가되고, 잠재적인 환경 영향은 아이소부탄올의 혼입에 의해 감소되며, 예를 들어 BTEX 플룸 팽창은 특히 호기성 환경 조건 하에서 아이소부탄올이 존재하지 않는 동일한 조성물의 BTEX 플룸 팽창과 비교하여, 감소될 수 있다.
하나 이상의 BTEX 성분의 생분해 속도를 증가시키기에 충분한 양으로 환경 구획에 전자 수용체를 첨가하는 단계를 포함하는, 혐기성 조건 하에서의 환경 구획에서 아이소부탄올을 포함하는 탄화수소 연료 조성물의 환경 거동을 향상시키는 방법도 본 명세서에 제공된다.
탄화수소 연료 조성물을 적당량의 아이소부탄올과 배합하는 단계를 포함하는, 탄화수소 연료 조성물의 재생가능성을 증가시키고, 탄화수소 연료 조성물에 의한 오염 시에 환경 구획에 대한 영향을 제한하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 실시 형태에서, 탄화수소 연료 조성물은 에탄올을 추가로 포함한다. 실시 형태에서, 에탄올은 아이소부탄올의 첨가 전에 연료 조성물의 약 10% 이하로 포함된다. 실시 형태에서, 아이소부탄올은 탄화수소 연료 조성물의 적어도 하나의 BTEX 성분의 생분해를 향상시킨다. 실시 형태에서, 아이소부탄올은 벤젠의 생분해를 향상시킨다. 실시 형태에서, 환경 구획은 토양 매트릭스를 포함하고, 아이소부탄올은 토양 매트릭스 내의 에탄올의 수송을 감소시킨다. 실시 형태에서, 아이소부탄올은 상기 조성물로부터의 BTEX 플룸의 팽창을 저해한다. 실시 형태에서, 아이소부탄올은 탄화수소 연료 조성물의 생분해성을 증가시키기에 적합한 양으로 존재한다. 실시 형태에서, 생분해 향상은 호기성 조건 하에서 일어난다. 실시 형태에서, 생분해 향상은 질산염 환원 또는 황산염 환원 조건 하에서 일어난다.
하나 이상의 BTEX 성분의 생분해 속도를 증가시키기에 충분한 양으로 환경 구획에 전자 수용체를 첨가하는 단계를 포함하는, 혐기성 조건 하에서의 환경 구획에서 아이소부탄올을 포함하는 탄화수소 연료 조성물의 환경 거동을 향상시키는 방법도 제공된다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 철, 황산염 또는 질산염, 또는 이들의 조합이다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 Fe(OH)3이다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 NaNO3이다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 MgSO4이다. 실시 형태에서, 하나 이상의 BTEX 성분은 톨루엔, 자일렌, 또는 벤젠을 포함한다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 질산염이고, 질산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 첨가된다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 황산염이고, 황산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재한다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 질산염이고, 질산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 톨루엔은 아이소부탄올과 거의 동일한 일수로 생분해한다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 황산염이고, 황산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 톨루엔은 아이소부탄올과 거의 동일한 일수로 생분해한다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 질산염이고, 질산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 벤젠은 아이소부탄올과 거의 동일한 일수로 생분해한다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 황산염이고, 황산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 벤젠 생분해는 황산염 환원 조건을 포함하지 않는 이의 생분해와 비교하여 향상된다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 황산염이고, 황산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 벤젠 생분해는 아이소부탄올 부재하에서의 이의 생분해와 비교하여 향상된다. 실시 형태에서, 전자 수용체는 황산염이고, 황산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 벤젠 생분해는 에탄올 존재하에서의 이의 생분해와 비교하여 향상된다.
가솔린, 아이소부탄올, 및 Fe(OH)3, NaNO3 또는 MgSO4 중 적어도 하나를 포함하는 조성물도 본 명세서에 제공된다. 가솔린, 아이소부탄올, 및 Fe(OH)3, NaNO3, KNO3, NHNO3, Na2SO4, CaSO4 , MgSO4, 킬레이트 철, 영가 철 (zero-valent iron) 및 나노 영가 철 중 적어도 하나를 포함하는 조성물도 제공된다.
도면의 간단한 설명
<도 1a>
도 1a는 10일 이하의 아이소부탄올 분해를 나타낸다. 에러 바 (error bar)는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
<도 1b>
도 1b는 50일 이하의 아이소부탄올 분해를 나타낸다.
<도 1c>
도 1c는 50일 이하의 에탄올 분해를 나타낸다.
<도 2a, 2b, 2c, 및 2d>
도 2a, 2b, 2c, 및 2d는 고 농도에서의 BTEX의 생분해에 대한 아이소부탄올의 영향을 나타낸다. (도 2a는 벤젠을 나타내고; 2b는 톨루엔을 나타내며; 2c는 에틸벤젠을 나타내고; 2d는 총 자일렌을 나타낸다.) 에러 바는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
<도 3a, 3b, 3c, 및 3d>
도 3a, 3b, 3c, 및 3d는 다양한 처리군 레벨에서의 BTEX 생분해에 대한 아이소부탄올 및 에탄올 농도의 영향을 비교한다. (도 3a는 벤젠을 나타내고; 3b는 톨루엔을 나타내며; 3c는 에틸벤젠을 나타내고; 3d는 총 자일렌을 나타낸다.) 에러 바는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
<도 4a, 4b, 4c, 및 4d>
도 4a, 4b, 4c, 및 4d는 저 농도에서의 BTEX의 생분해에 대한 아이소부탄올의 영향을 나타낸다. (도 4a는 벤젠을 나타내고; 4b는 톨루엔을 나타내며; 4c는 에틸벤젠을 나타내고; 4d는 총 자일렌을 나타낸다.) 에러 바는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
<도 5a, 5b, 5c, 및 5d>
도 5a, 5b, 5c, 및 5d는 다양한 혐기성 환원 조건 하에서의 아이소부탄올 생분해 - 고 농도 - 를 나타낸다. (도 5a는 처리군 2-미보정을 나타내고; 5b는 처리군 6-질산염 환원을 나타내며; 5c는 처리군 9-철 환원을 나타내고; 5d는 처리군 12-황산염 환원을 나타낸다.) 에러 바는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 처리군 2의 파선은 마이크로코즘이 아이소부탄올로 다시 보정된 경우의 시간을 나타낸다.
<도 6a 및 6b>
도 6a 및 6b는 각각, 처리군 4 (미보정) 및 처리군 14 (황산염 환원)에 있어서의 에탄올 생분해를 나타낸다. 에러 바는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 처리군 4의 파선은 지하수 중의 잔류 황산염이 환원된 후에, 마이크로코즘이 에탄올로 다시 보정된 경우의 시간을 나타낸다.
<도 7a, 7b, 7c, 및 7d>
도 7a, 7b, 7c, 및 7d는 다양한 혐기성 환원 조건 하에 아이소부탄올 (IBA)의 존재 또는 부재 하에서의 벤젠 및 톨루엔 생분해 (고 농도)를 나타낸다. (a 및 b는 각각, 처리군 1, 2, 5, 및 6에 대한 벤젠 및 톨루엔을 나타내고; c 및 d는 각각, 처리군 8, 9, 11, 및 12에 대한 벤젠 및 톨루엔을 나타낸다.) 에러 바는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
<도 8a, 8b, 8c, 및 8d>
도 8a, 8b, 8c, 및 8d는 다양한 혐기성 환원 조건 하에 아이소부탄올 (IBA) 또는 에탄올의 존재 및 부재 하에서의 BTEX 생분해 - 저 농도 -를 나타낸다. (도 8a는 벤젠을 나타내고; 8b는 톨루엔을 나타내며; 8c는 에틸벤젠을 나타내고; 8d는 총 자일렌을 나타낸다.) 에러 바는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
<도 9a, 9b, 9c, 및 9d>
도 9a, 9b, 9c, 및 9d는 아이소부탄올 생분해 - 저 농도 -를 나타낸다. (a는 처리군 3-미보정을 나타내고; b는 처리군 7-질산염 환원을 나타내며; c는 처리군 10-철 환원을 나타내고; d는 처리군 13-황산염 환원을 나타낸다.) 에러 바는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 추가 모니터닝에 의해, 아이소부티르산 농도가 처리군 3의 경우에 주간에는 160 및 처리군 13의 경우에 주간에는 48 (데이터 도시되지 않음)로 분석적 검출 한계 미만으로 감소되었음을 보여주었다.
<도 10a, 10b, 10c, 및 10d>
도 10a, 10b, 10c, 및 10d는 다양한 혐기성 환원 조건 하에 아이소부탄올 (IBA)의 존재 또는 부재 하에서의 고 농도 에틸벤젠 및 총 자일렌 생분해를 나타낸다. (a 및 b는 각각, 처리군 1, 2, 5, 및 6에 대한 에틸벤젠 및 총 자일렌을 나타내고; c 및 d는 각각, 처리군 8, 9, 11, 및 12에 대한 에틸벤젠 및 총 자일렌을 나타낸다.) 에러 바는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
<도 11 및 12>
도 11 및 12는 1.3% 및 2.6%의 물이 초기에 E10 가솔린에 첨가되는 경우의 아이소부탄올의 거동을 입증한다. 도 11에서, 아이소부탄올의 레벨 증가는 상분리 시에 수상 체적이 감소된다. 도 12는 분리가 일어나는 경우에 수성 부분에 에탄올이 덜 존재하는 것을 나타낸다.
<도 13>
도 13은 미생물 분석의 결과를 나타낸다. 에러 바는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. IBA = 아이소부탄올.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충될 경우, 정의를 비롯하여 본 출원서가 좌우할 것이다. 또한, 문맥에 의해 별도로 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이며, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 기타 참조문헌은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
본 발명을 추가로 정의하기 위하여, 하기의 용어 및 정의가 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "구성하다", "구성하는", "포함하다", "포함하는", "갖다", "갖는", "함유하다" 또는 "함유하는" 또는 그들의 임의의 다른 변이형은 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹의 배제가 아닌, 언급된 정수 또는 정수의 그룹의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치는 반드시 그러한 요소만으로 제한되지는 않고, 명확하게 열거되지 않거나 그러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치에 내재적인 다른 요소를 포함할 수도 있다. 더욱이, 명백히 반대로 기술되지 않는다면, "또는"은 포괄적인 '또는'을 말하며 배타적인 '또는'을 말하는 것은 아니다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기 중 어느 하나에 의해 만족된다: A는 참 (또는 존재함)이고 B는 거짓 (또는 존재하지 않음), A는 거짓 (또는 존재하지 않음)이고 B는 참 (또는 존재함), A 및 B가 모두가 참 (또는 존재함)이다.
명세서 및 특허청구범위를 통해 사용되는 것으로서, 본 명세서에서 사용되는 "이루어지다", 또는 "이루어진다" 또는 "이루어지는"과 같은 변이형은 임의의 기재된 정수 또는 정수의 그룹의 포함을 나타내나, 추가의 정수 또는 정수의 그룹이 특정 방법, 구조 또는 조성물에 첨가될 수 없음을 나타낸다.
명세서 및 특허청구범위를 통해 사용되는 것으로서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "본질적으로 이루어지다", 또는 "본질적으로 이루어진다" 또는 "본질적으로 이루어지는"과 같은 변이형은 임의의 기재된 정수 또는 정수의 그룹의 포함, 및 특정 방법, 구조 또는 조성물의 기본 또는 신규 특성을 실질적으로 변경시키지 않는 임의의 기재된 정수 또는 정수의 그룹의 임의의 포함을 나타낸다. 문헌 [M.P.E.P. § 2111.03]을 참조한다.
또한, 본 발명의 요소 또는 성분 앞의 부정 관사 "a" 및 "an"는 요소 또는 성분의 경우, 즉, 출현의 수에 관해서는 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서, 부정 관사 "a" 또는 "an"는 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 판독되어야 하며, 요소 또는 성분의 단수형 단어는 그 수가 단수형을 명백하게 의미하는 것이 아니라면 복수형을 또한 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비제한적인 용어이며, 특정 발명의 임의의 단일의 실시형태를 언급하는 것으로 의도되지 않고, 출원서에 기재된 바와 같은 모든 가능한 실시형태들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 채용된 본 발명의 성분 또는 반응물의 분량을 수정하는 용어 "약"은, 예를 들어, 실제에서 농축물 또는 용액을 제조하는데 사용되는 통상적 측정 및 액체 취급 과정; 이들 과정에서의 우발적인 오차; 조성물을 제조하거나 방법을 실행하기 위해 채용된 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이; 등을 통해 일어날 수 있는 수량 변화를 말한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 혼합물로부터 유도되는 조성물에 대한 상이한 평형 조건으로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의한 수정 여부를 불문하고, 청구범위는 분량의 균등물을 포함한다. 일 실시 형태에서, 용어 "약"은 보고된 수치의 10% 이내, 바람직하게는 보고된 수치의 5% 이내를 의미한다.
본 명세서에 기재되는, 아이소부탄올을 포함하는 탄화수소 연료 조성물은 또한 환경에서 생분해가능한 재생가능한 성분에 기인하는 재생가능성이 증가된 연료 조성물을 제공한다. 아이소부탄올은 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 대수층 마이크로코즘에 첨가된 경우에 급속하게 분해되는 재생가능한 성분이다. 게다가, 본 명세서에 나타낸 결과는 아이소부탄올 자체가 생분해될 뿐만 아니라, 아이소부탄올이 또한 다양한 환경 조건 하에서 가솔린에 대하여 추가의 생분해 이익을 제공하는 것을 입증한다. 당업계에 기술된 바와 같이, 아이소부탄올은 재생가능한 원료, 예컨대 바이오매스로부터 유도되는 탄소 기질을 아이소부탄올로 전환시키는 미생물에 의해 생물적으로 생성될 수 있다. 따라서, 생물적으로 생성된 아이소부탄올은 연료 조성물에 첨가된 경우에, 재생가능한 성분을 연료에 도입하기 위한 중요한 메카니즘을 제공하며, 동시에, 소정의 환경 구역을 오염시킨다면 연료 조성물의 환경 영향을 감소시킨다.
가솔린의 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 및 총 자일렌 (BTEX) 성분이 바람직하지 않은 환경 오염 물질이다는 것은 잘 알려져 있다. 가솔린에 에탄올을 첨가하면, 가솔린의 재생가능성을 증가시킬 수 있으나, 이러한 첨가는 또한 에탄올이 BTEX 플룸 팽창을 초래할 수 있기 때문에 BTEX로 인한 손상을 증가시킬 수도 있다. 대조적으로, 아이소부탄올을 가솔린에 첨가하면, 연료 블렌드가 환경 구역 또는 구획 (예를 들어, 토양, 퇴적물, 지하수)으로 방출된다면, 에탄올을 첨가제로서 첨가한 경우와 비교하여, BTEX 플룸을 증가시키지 않고서 연료의 재생가능한 성분을 증가시키는 메카니즘이 제공된다. 게다가, 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 아이소부탄올의 첨가는 특정한 조건 하에서 에탄올에 관측되는 정도로 BTEX 생분해를 저해하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "생분해" 또는 "분해"는 대상 화합물의 부산물으로의 일차 변환을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "환경 거동 향상"은 환경 구획의 탄화수소 연료 블렌드의 하나 이상의 성분의 양을 감소시키고, 환경 구획의 탄화수소 연료 블렌드의 하나 이상의 성분의 분해 속도를 증가시키며, 탄화수소 연료 블렌드의 하나 이상의 성분에 의해 접촉되는 환경 구획의 크기를 감소시키는 것, 또는 이들의 조합을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "환경 구획"은 연료 조성물과 접촉되는 구역을 말하며, 예를 들어, 토양, 퇴적물, 지하수, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "BTEX 플룸"은 용해상 (dissolved phase) 플룸을 말한다.
연료 조성물과 관련하여 사용되는 경우에, "재생가능성 증가"는 증가된 조성물 부분이 재생가능하지 않는 자원, 예컨대 화석 연료 및 석유와는 대조적으로, 재생가능한 것으로 여겨지는 자원, 예컨대 바이오매스로부터 형성되는 것을 의미한다.
연료 조성물에 아이소부탄올을 포함시켜 연료 조성물의 환경 영향을 감소시키면서 연료 조성물 중의 재생가능한 성분의 양을 동시에 증가시키는 방법이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 개시된 방법에 적합한 연료 조성물의 탄화수소 부분은 불꽃 점화 기관을 포함하나 이에 한정되지 않는 내연 기관에서의 소비를 위한 가솔린을 제조하는데 사용가능한 가솔린 블렌드 스톡을 포함한다. 가솔린 블렌드 스톡은 ASTM 4814, EU 사양 EN228을 충족시키는 가솔린용 블렌드 스톡, 및 개질 가솔린용 블렌드 스톡을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 개시된 방법에 관한 탄화수소 연료 조성물 중의 아이소부탄올의 양 (체적 기준)은 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 적어도 약 7%, 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 15%의 양을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 아이소부탄올의 양 (체적 기준)은 약 2% 내지 약 20%의 양, 및 약 10% 내지 약 16%의 양을 포함한다. 아이소부탄올의 양이 차량 기술의 기능일 수 있음을 이해할 것이다. 그리하여, 실시 형태에서, 아이소부탄올 양은 약 85 vol% 이하일 수 있다. 아이소부탄올은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 연료 조성물의 탄화수소 부분과 배합될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 탄화수소 연료 조성물은 에탄올을 추가로 포함하며, 일부 실시 형태에서, 에탄올은 아이소부탄올의 첨가 전에 탄화수소 조성물의 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 또는 약 50% 이하로 포함된다. 일부 실시 형태에서, 아이소부탄올은 연료 조성물 중에 에탄올 대신에 사용된다. 다른 실시 형태에서, 아이소부탄올은 에탄올을 포함하는 연료 조성물에 첨가된다.
본 명세서에 제공되는 방법은 탄화수소 연료 조성물에 아이소부탄올을 포함시켜, 상기 조성물로부터의 BTEX 플룸 팽창의 지연 방법을 포함한다. 탄화수소 연료 조성물의 잠재적인 환경 영향은 방출이 일어난다면, 영향을 받은 구역에서의 BTEX 플룸의 크기, 및/또는 팽창 속도, 및/또는 BTEX 플룸의 농도를 측정하여 평가될 수 있다. BTEX 플룸의 크기 및 팽창 속도는 지하수의 직접 샘플링과 같은 당업계에 공지된 방법 및 미국 환경 보호청 (U.S. Environmental Protection Agency (EPA)) 방법 SW846과 같은 방법에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 아이소부탄올을 포함하는 연료 조성물의 분해는 에탄올을 포함하나 아이소부탄올을 포함하지 않는 연료 조성물보다 빠르게 일어난다. 연료 성분의 분해는 예를 들어, U.S. EPA 방법 8015를 이용한 가스 크로마토그래피 (GC), 또는 예를 들어 U.S. EPA 방법 8260을 이용한 GC-질량 분석과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 환경 샘플에서 측정될 수 있다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 아이소부탄올은 적어도 에탄올 만큼 빠르게 분해되며, 하나 이상의 BTEX 성분은 에탄올의 존재 하에서보다 아이소부탄올의 존재 하에서 더 빠르게 분해된다. 일부 실시 형태에서, 아이소부탄올은 적어도 약 0.081 d-1의 1차 속도 상수로 분해된다. 일부 실시 형태에서, 아이소부탄올은 적어도 약 0.28 d-1의 1차 속도 상수로 분해된다. 일부 실시 형태에서, 아이소부탄올은 약 0.074 d-1 보다 큰 1차 속도 상수로 분해된다. 어떤 경우에는, 아이소부탄올을 포함하는 연료 조성물은 재생가능한 성분을 포함하지 않는 연료 조성물과 비교하여, BTEX 생분해 속도 증가를 나타내었다. 어떤 경우에는, 아이소부탄올을 포함하는 연료 조성물은 에탄올을 포함하나 아이소부탄올을 포함하지 않는 연료 조성물과 비교하여, BTEX 생분해 속도 증가를 나타내었다.
게다가, 본 명세서에 나타낸 바와 같이 (도 11 및 12 참조), 에탄올을 함유하는 가솔린에 부탄올을 혼입하면, 상분리가 일어난 경우에 수상의 체적이 감소되며, 수상 내에 함유되는 에탄올의 중량%가 제한된다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 물에 용해하기 어려운 탄화수소 분획에 유지시켜 지하수로 침출되는 에탄올의 양을 부탄올에 의해 제한할 수 있는 것으로 여겨진다. 이것에 의해, 토양 매트릭스 내의 에탄올의 수송 감소가 지하수면으로의 BTEX의 팽창을 지연시킬 수 있다.
따라서, 본 명세서에 개시된 방법이 유리하게는 오염 장소를 복원하는데 필요한 시간을 감소시킬 수 있거나, BTEX 플룸의 크기를 제한할 수 있거나, 두 가지 이점을 제공할 수 있으므로, 탄화수소 연료 조성물의 환경 거동을 향상시킬 수 있음을 인지할 것이다.
본 명세서에 제공된 방법은 혐기성 조건 하에서의 환경 구획에서 아이소부탄올을 포함하는 탄화수소 연료 조성물의 환경 거동을 향상시킬 수 있다. 실시 형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 BTEX 성분의 생분해 속도를 증가시키기에 충분한 양으로 상기 구획에 전자 수용체를 첨가하는 것을 포함한다. 적절한 전자 수용체는 NaNO3, NH4NO3, KNO3을 포함하나 이에 한정되지 않는 질산염, 및 MgSO4 및 CaSO4, Na2SO4을 포함하나 이에 한정되지 않는 황산염, 및 Fe(OH)3, 킬레이트 철, 영가 철 및 나노 영가 철을 포함하나 이에 한정되지 않는 철 화합물을 포함한다. 전자 수용체는 슬러리로서의 주입, 고정 (emplacement), 모니터링 웰 (monitoring well)을 통한 주입, 중력 주입, 및/또는 가압 주입, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법을 이용하여, 질산염 환원, 철 환원, 및/또는 황산염 환원 조건을 달성하기에 충분한 양으로 환경 구획에 첨가될 수 있다. 황산염 및/또는 질산염 및/또는 철 화합물의 주입은 황산염 환원 및/또는 질산염 환원 세균을 생물 자극하여, 존재한다면, 지하의 아이소부탄올 함유 가솔린의 방출로 인한 BTEX 오염물을 생분해하는데 사용될 수 있다. 이러한 생물 자극은 세균 생물 활성, 세균 집단, 및/또는 세균 대사의 증가를 가져올 수 있다.
호기성 조건
1차 근사치를 이용하여 아이소부탄올 및 에탄올 생분해 속도를 비교한 바, 일부의 아이소부탄올 처리군에 의해서는 관측된 1차 속도 상수가 0.081 ± 0.0044 d-1 (R2 = 0.80, 처리군 4 및 처리군 5, 실시예 1의 데이터 이용)인 반면에, 에탄올 처리군에 의해서는 관측된 1차 속도 상수가 0.074 ± 0.0023 d-1 (R2 = 0.90)이었음을 나타낸다. 따라서, 아이소부탄올은 고 농도 처리군에서 에탄올보다 큰 속도로 생분해되었다. 저 농도 처리군 (처리군 3)에서는 아이소부탄올에 대하여 0.28 ± 0.054 d-1 (R2 = 0.69)의 속도 상수가 획득되었는데, 이는 고 농도 처리군에서 아이소부탄올 또는 에탄올에 대한 생분해 속도 상수보다 약 3.5 배 크다. 이러한 차이는 세균 성장 단독의 차이로 인한 것은 아니었다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 이러한 차이에 대한 한 가지 설명은 아이소부탄올 생분해 (및 아이소부탄올 분해 세균의 성장)가 대부분의 아이소부탄올 생분해가 일어난 경우에 처음 2주간의 연구에 대해 제한된 양분인 것으로 여겨진다. 양분 제한은 저 농도 아이소부탄올 처리군에서는 심각하지 않을 수 있으며, 저 아이소부탄올 처리군에서 속도 상수 증가를 가져올 수 있다. 아니면, 아이소부탄올 속도 상수 차이는 고 농도에서의 아이소부탄올 기질 저해로 인한 것일 수 있다 기질 저해는 약 3,000 μM 만큼 낮은 농도에서 n-부탄올 생분해 연구 시에 관측되었다 (Alagappan and Cowan, 2001, Biotechnol and Boengin. 75: 393-405).
본 명세서에서는 에탄올이 바람직하지 않게 아이소부탄올보다 크게 BTEX 생분해 속도를 감소시키는 결과를 나타낸다. 흥미롭게도, 벤젠 호기성 생분해가 아이소부탄올의 존재 하에서보다 에탄올의 존재 하에서 약 12 배 더 느렸기 때문에, 벤젠은 BTEX 생분해에 대한 아이소부탄올 및 에탄올의 효과를 비교한 바, 가장 현저한 차이를 나타내었다. 벤젠은 종종 가솔린으로 오염된 위치에서의 지하수 오염의 규제 드라이버 (regulatory driver)이다.
혐기성 조건
본 명세서에 나타낸 결과에 따르면, 아이소부탄올은 질산염 환원, 철 환원, 황산염 환원, 및 메탄 생성 조건 하에 용이하게 생분해되는 것으로 입증된다. 이러한 연구의 조건의 경우, 아이소부탄올은 BTEX 생분해를 더디게 하지 않거나, 아이소부탄올이 BTEX 생분해 속도를 저하시키는 정도가 에탄올이 BTEX 생분해를 더디게 한 정도보다 낮았다. 어떤 경우에는, 아이소부탄올을 첨가하면 관측된 BTEX 생분해 속도가 향상되었다. 따라서, 혐기성 대수층 조건 하에서의 BTEX 생분해에 대한 아이소부탄올의 지속성 및 이의 영향은 에탄올보다 더욱 유리한 것으로 여겨진다.
실시예
실시예 1 - 호기성 시험
물질 및 방법
토양 및 지하수 샘플
실험실 마이크로코즘 시험용 토양 및 지하수를 캘리포니아의 반덴베르그 공군 기지의 부지 (Site) 60 내에서 수집하였다. 이 부지는 가솔린 오염 이력이 있으나, 이 부지에 대하여 광범위한 클린업 프로그램이 행해졌다. 수집된 지하수를 질소 헤드스페이스 하에 멸균 스텐레스 강 소다 케그 (soda keg) (18.5 L)로 컨테이너화하였다. 지표면 아래 (bgs)의 약 8 내지 12 피트에 위치한 토양을 아세테이트 코어 슬리브를 갖는 지오프로브 (Geoprobe)® 6620DT를 사용하여 수집하였다. 아세테이트 슬리브 내의 코어 샘플을 공기 노출을 최소화하도록 현장에서 캡핑하여 밀폐시키고, 하룻밤 동안 실험실의 아이스 상에 보내어, 4℃로 보관하였다.
혐기성 챔버 (Coy Laboratory Products, Inc., Grass Lake, MI) 내의 아세테이트 슬리브로부터 토양을 제거하여, 산소에 노출되었을 수도 있는 코어 단부의 첫 번째의 10 ㎝를 폐기하였다. 수집한 토양은 약간의 자갈 및 큰 돌을 갖는 실트질 모래로 구성되었다. 토양을 0.95 ㎝ 시브 (sieve)를 통과시켜, 균일화한 다음에, 마이크로코즘 세트업이 완성될 때까지 테플론 (Teflon)®으로 안을 댄 캡을 갖는 호박색 유리 자 (jar)에서 4℃로 보관하였다. 베이스라인 토양 및 지하수 데이터를 표 1에 나타낸다. (NA = 분석되지 않음; * SVOC (반휘발성 유기 화합물) 검출은 0.008 mg L-1 페놀 및 0.003 mg L-1 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트를 포함함; ** 표준 단위).
[표 1]
Figure pct00001
마이크로코즘 실험
마이크로코즘 실험에 대한 전반적인 접근방식은 토양-지하수 슬러리 중의 "고" 및 "저" 농도에서 BTEX (벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 및 총 자일렌) 및 아이소부탄올의 생분해를 평가하는 것이었다. 최종 변환 생성물을 측정하지 않았다. 비교를 위해, 아이소부탄올 대신에 에탄올을 사용하여, 하나의 처리군을 제조하였다. 각 BTEX 화합물에 대한 표적 BTEX 농도는 실험적 처리군 매트릭스를 나타내는 표 2의 BTEX 칼럼 아래에 열거되어 있다. 대조군을 염화제이수은 및 포름알데히드로 보정하였다. BTEX 및 알코올 농도를 선택하여, 근원지 이내 및 가까운 다운그래디언트 (downgradient) 플룸 내에서 관측되는 (대략) 잠재적인 지하수 농도를 나타내었다. 본 연구에 사용된 아이소부탄올 농도와 비교하여 에탄올 농도가 큰 것은 지하수 중의 아이소부탄올 및 에탄올의 유효 용해도를 반영하기 위한 것이었다. 에탄올은 수용해도가 아이소부탄올의 약 10배이며, 아이소부탄올의 옥탄올-물 분배 계수는 에탄올의 약 10배이다 (Organization for Economic Co-operation and Development, 2004. SIDS Assessment Report for SIAM 19- Ethanol (CAS No. 64-17-5). Berlin, Germany; Organization for Economic Co-operation and Development, 2004. SIDS Assessment Report for SIAM 19- Isobutanol (CAS No. 78-83-1), Berlin, Germany). 따라서, 본 연구에서 시험하기 위해, 보수적으로 아이소부탄올보다 약 3배 큰 에탄올 몰 농도를 선택하였다. 세트 (SET) 1 처리군을 샘플 수집 4일 이내에 제조한 반면에, 세트 2 처리군을 토양 및 지하수 보존 약 2 개월 후에 제조하였다. 실험적 처리군 매트릭스는 표 2A 및 2B에 나타낸다.
[표 2A]
Figure pct00002
[표 2B]
Figure pct00003
부지 토양 40 g을 54개의 글래스 세럼 바틀 각각 (각각 근사적인 체적 160 ㎖)에 주입하여 마이크로코즘을 제조하였다. 표 2A 및 B에 나타낸 표적 농도를 얻기 위해, BTEX 및 알코올 (아이소부탄올 또는 에탄올)을 처리군 바틀에 첨가하였다. 바틀을 10 ㎖의 헤드스페이스가 남도록 지하수로 채웠다. 대조군을 염화제이수은 (바틀의 700 mg/L)으로 보정하여, 미생물 활성을 억제하였다. 이어서, 4일 후에 대조군을 포름알데히드 (바틀의 1% v/v)로 보정하여, 미생물 활성을 제한하였다. 처리군을 각각 최소 3개 및 8개 이하로 복제하여 제조하였다.
제조된 마이크로코즘을 100 rpm으로 작동하는 회전식 진탕기에서 15℃로 인큐베이션하였다. BTEX 및 산소에 대하여 각 바틀의 헤드스페이스를 모니터링하였다. 수성 BTEX 농도를 헨리의 법칙 (Henry's Law)을 적용하여 계산하였다. 아이소부탄올 및 에탄올 뿐만 아니라, 잠재적인 아이소부탄올 분해 생성물 (아이소부틸알데히드 및 아이소부티르산)에 대해서도 수상의 샘플을 분석하였다. 각 바틀의 헤드스페이스를 산소 가스로 주기적으로 플러싱 (flushing)하여, 바틀 내의 호기성 조건을 유지하였다. 각 대조군 바틀의 헤드스페이스도 산소로 플러싱하여, 플러싱 공정으로 인한 BTEX의 잠재적인 손실을 평가하였다.
분석 방법
260℃의 주입기 온도 및 290℃의 검출기 온도와 함께, FID 및 레스텍 (Restek) QSPLOT 칼럼 (30 m 길이, 0.32 ㎜ 직경)을 갖춘 배리언 (Varian) CP-3900 가스 크로마토그래프를 사용하여 BTEX에 대하여 헤드스페이스 가스를 분석하였다. 펄스 방전 헬륨 이온화 검출기 (PDHID) 및 CP-몰시엔 (Molsiene) 5A 칼럼 및 CP-파라본드 (ParaBond) Q 칼럼 (모두 10 m 길이, 0.32 ㎜ 직경)을 갖춘 배리언 CP-3800 가스 크로마토그래프, 210℃의 주입기 온도, 및 240℃의 검출기 온도를 사용하여 헤드스페이스 산소를 분석하였다. 산소를 1.20 분으로 용출하였다. 처음에 염화제이수은으로 보존된 130 ㎕ 서브샘플을 수집하여, 수성 알코올 농도 (및 아이소부틸알데히드 및 아이소부티르산)를 측정하였다. 플레임 이온화 검출기 (FID) 및 스타빌왁스 (Stabilwax) DA 칼럼 (30 m 길이, 320 ㎛ 직경)을 갖춘 배리언 CP-3800 가스 크로마토그래프, 280℃의 주입기 온도, 및 280℃의 검출기 온도를 사용하여 이들 샘플을 분석하였다.
미생물 분석
본 연구 동안에 미생물 개체군의 변화를 평가하기 위해, 실험의 개시시에, 중도에 (대략) 및 종료 시에 BTEX 및 아이소부탄올로 보정된 마이크로코즘으로부터 샘플 (2 ㎖)을 수집하였다. 방법 SM9215C에 따라 회수한 직후에, 샘플을 순차적으로 희석하여, R2A 한천 (BD Difco) 및 기본 염 배지 (BSM; Hareland et al., 1975, J. Bacteriol. 121: 272-285.) 한천에 플레이팅하였다. BSM 플레이트를 BTEX 또는 아이소부탄올을 포함한 밀폐 용기에서 인큐베이션하여, 이들 기질 상에서 성장가능한 세균을 선택하였다. R2A 한천에 대하여 3일 후에, 선택 배지에 대하여 10일 후에, 콜로니 계수를 수동으로 행하였다. 샘플 (약 8 ㎖)을 또한 -70℃로 즉시 동결시키고, 연구 완료 시에 센서스 (CENSUS) 분석을 위해 미국 테네시주 록퍼드에 소재하는 마이크로비얼 인사이츠 (Microbial Insights)의 드라이 아이스 상으로 수송하였다. 센서스는 진정세균 16S rRNA 유전자 카피의 계수법에 기초하여 총 진정세균을 정량화하도록 정량적 폴리메라제 연쇄 반응 (qPCR) 에세이를 사용하였다 (센서스 방법에 대한 보다 상세한 정보를 위해서는, "Microbial Insights, 2009http://www.microbe.com/how-census-works.html" 및 "http://microbe.com/census-applications/anaerobic-btex.html; 각각 07.07.2009 및 05.08.09에 액세스됨"을 참조).
아이소부탄올 및 에탄올 분해
측정가능한 아이소부탄올 또는 에탄올의 감소 (>10%), 아이소부틸알데히드의 축적 또는 아이소부티르산의 축적이 임의의 대조군에서는 관측되지 않았다. 처리군 3 및 4에서의 아이소부탄올 생분해는 도 1에 나타낸다. 저 농도 처리군 (처리군 3)에서, 아이소부탄올이 7일 이내에 분석적 검출 한계 (3 μM) 미만으로 분해되었다. 아이소부탄올 분해산물인 아이소부틸알데히드 및 아이소부티르산은 처음에 4일간의 인큐베이션 시에 검출되고, 이어서 아이소부틸알데히드는 5일 이내에 검출값 미만으로 감소되었다. 아이소부티르산 농도는 초기에 증가하였으나, 82일후에 취한 샘플은 아이소부티르산이 또한 마이크로코즘에서 추가로 분해한 것으로 확인된다 (데이터 도시되지 않음). 아이소부티르산의 생분해산물은 측정되지 않았으나, 이전의 연구에 따르면, 아이소부티르산이 호기성 조건 하에서 용이하게 생분해되고, 부티레이트는 호기성 조건 하에서 CO2로 용이하게 변환되는 것을 나타내었다 (Miller, 2001, J. Anim. Sci. 79: 2503-2512; Bonartseva, 2003, Appl. Biochem. Biotech. 109: 285-301).
고 농도 처리군 (처리군 4, 도 1b)에서, 아이소부탄올은 23일 이내에 3,400 μM의 초기 농도에서 분석적 검출 한계 미만으로 분해되었다. 아이소부탄올이 분해됨에 따라, 2개의 아이소부탄올 분해산물인 아이소부틸알데히드 및 아이소부티르산의 생성, 이어서 분해가 관측되었다. 아이소부틸알데히드가 9일째에 900 μM의 피크 농도에 이른 다음에, 19일 후에 11 μM의 분석적 검출 한계 미만으로 감소되었다. 아이소부티르산이 25일째에 1,750 μM의 피크 농도로 증가된 다음에, 48일째에 100 μM로 감소되었다. 아이소부탄올 및 에탄올 (처리군 5)을 비교하기 위해 사용된 마이크로코즘의 제 2 세트에서, 아이소부탄올은 유사한 타임 프레임으로 분해되고, 아이소부티르산은 유사한 양으로 관측되었다. 그러나, 다만 미량의 아이소부틸알데히드 (78 μM)가 관측되었다.
에탄올로 보정된 마이크로코즘에서, 에탄올 농도는 약 40 내지 45일 내에 11,000 μM에서 22 μM의 분석적 검출 한계 미만으로 감소되었다 (도 1c). 대조군에서는 에탄올 감소가 관측되지 않았다. 관측된 에탄올 분해가 유효 양분 (available nutrient)에 의해 제한되지 않음을 확보하기 위해, 변형된 기본 염 배지 (Hareland et al., 1975) 형태의 양분을 22일째에 모든 처리군에 첨가하였다. 측정가능한 에탄올 (또는 임의의 다른 화합물) 분해 속도 증가가 관측되지 않았는데, 이는 오염물질 생분해가 실험계에서 22일쯤에 양분 유효도에 의해 제한되지 않았음을 제시한다.
BTEX 분해
아이소부탄올의 존재 및 부재하에서의 고 농도의 BTEX로 보정된 마이크로코즘은 도 2에 나타낸다. 저 농도 BTEX의 결과는 도 4에 주어진다. 관측된 지연 시간 및 회귀 1차 유효 반감기는 일수로 표시되어 표 3에 나타나 있다. 유효 반감기는 회귀 반감기 + 지연 시간이다. (IBA = 아이소부탄올; ± 값은 95% 신뢰 구간을 나타낸다.)
[표 3]
Figure pct00004
고 농도 대조군의 BTEX 농도는 약 25일간을 통해 관측가능한 감소 경향이 없는 것으로 나타나며, 그 시점에서 대조군 농도 감소가 일부의 화합물에 대하여 관측되었다 (약 20% 이하). 대조군은 이어서 포름알데히드로 재보정되어, 추가의 포름알데히드의 미생물 활성을 저해하여, 대조군의 추가의 감소를 저지하였다. 25일까지, 대부분의 BTEX 화합물이 분해되므로, 이러한 손실이 데이터 평가에 영향을 미치지 않았다. 본 실험의 10일간의 지속기간에 걸쳐서 약 25%의 총 자일렌 농도 감소가 관측된 총 자일렌을 제외하고는, 저 농도 BTEX 대조군의 유의한 (>10%) 감소가 관측되지 않았다.
호기성 조건 하에서 BTEX 화합물에 대하여 얻어진 반감기 (표 3)는 통상 다른 것들에 의해 관측된 범위 이내이었다 (미국 지질조사국, 2006의 보고, "Description, properties, and degradation of selected volatile organic compounds detected in groundwater-a review of selected literature. Open File Report 2006-1338 참조). 비교 마이크로코즘 (처리군 4, 5 및 6)에 대한 결과로부터, 에탄올은 일반적으로 BTEX 생분해에 대하여 아이소부탄올보다 더 크게 악영향을 나타낸다는 것을 보여준다 (도 3 및 표 3). 유일한 예외는 에틸벤젠이며, 아이소부탄올 및 에탄올이 유사하게 에틸벤젠 생분해에 영향을 미쳤다. 게다가, 아이소부탄올의 첨가에 의해, 에틸벤젠 및 총 자일렌-아이소부탄올에 대한 분해균 (degrader)의 예기치 않은 증가로 인한 것으로 보이는 작지만 측정가능한 저 농도 처리군 (처리군 1 및 3)의 에틸 벤젠 및 총 자일렌 생분해의 증가를 초래하였다.
처리군 5의 BTEX에 대한 유효 반감기는 처리군 4 (표 3)보다 약 2 내지 5의 배수 미만이었다. 그러나, 이들 2개의 처리군의 아이소부탄올 생분해 속도는 거의 동일하였다.
미생물 특성 평가
미생물 콜로니 계수 및 qPCR 분석의 결과는 도 13에 나타낸다. 이들 데이터는 연구 기간을 통해 증가된 마이크로코즘의 미생물 농도를 나타낸다. 분자 분석에 의해 측정된 진정세균 농도가 미생물 콜로니 계수보다 컸지만, 미생물 콜로니 계수 및 총 진정세균 데이터는 유사한 경향을 나타낸다. 호기성 평판계수와 분자 분석에 의한 총세균수 사이의 차이는 일부의 세균이 모든 한천 평판 상에서 잘 성장하지 않기 때문에 특이한 것은 아니며, 후자의 방법은 배양가능하거나 배양불가능한 혐기성 및 호기성 세균을 측정한다. 평판계수 데이터로부터, 아이소부탄올 및 BTEX를 분해시킬 수 있는 자연 세균 (natural bacteria)이 부지 물질에 존재하고 있음을 확인하였다. 저 농도 처리군에 나타낸 바와 같이, 미생물 성장은 기질 (BTEX 또는 아이소부탄올)이 고갈되는 경우에 제한되었다.
실시예 2 - 혐기성 시험
물질 및 방법
토양 및 지하수
토양 및 지하수 및 샘플 수집 및 취급 방법은 상술한 바와 같다. 베이스라인 토양 및 지하수 데이터를 표 4에 나타낸다. (NA = 분석되지 않음; * SVOC 검출은 0.008 mg L-1 페놀 및 0.003 mg L-1 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트를 포함함; ** 표준 단위)
[표 4]
Figure pct00005
마이크로코즘 제조
마이크로코즘 실험의 경우, 질산염 환원에서 메탄 생성까지에 걸친 조건 하에서의 토양-지하수 슬러리 중의 BTEX 및 아이소부탄올의 생분해를 평가하였다. BTEX 및 아이소부탄올을 "고" 및 "저" 농도 (표 5)에서 평가하였다. 아이소부탄올 대신에 에탄올을 사용하여, 2개의 처리군을 제조하였다. 전자 수용체 농도는 샘플에 첨가된 양을 반영하며, (표 5)는 부지 지하수의 백그라운드 전자 수용체 농도를 포함하지 않는다. BTEX 및 알코올 농도는 근원지 이내 및 가까운 다운그래디언트 플룸 내에서 관측될 수도 있는 잠재적인 지하수 농도를 나타낸다. 본 연구에 사용된 아이소부탄올 농도와 비교하여 에탄올 농도가 큰 것은 지하수 중의 아이소부탄올 및 에탄올의 유효 용해도를 반영하기 위한 것이었다. 에탄올은 수용해도가 아이소부탄올의 약 10배이며, 아이소부탄올의 옥탄올-물 분배 계수는 에탄올의 약 10배이다 (Organization for Economic Co-operation and Development, 2004. SIDS Assessment Report for SIAM 19- Ethanol (CAS No. 64-17-5). Berlin, Germany; Organization for Economic Co-operation and Development, 2004. SIDS Assessment Report for SIAM 19- Isobutanol (CAS No. 78-83-1), Berlin, Germany). 에탄올의 생분해 속도가 아이소부탄올보다 큰 것으로 예측되었기 때문에, 시험을 위해 보수적으로 아이소부탄올보다 약 3배로 큰 에탄올 몰 농도를 선택하였다.
모든 마이크로코즘 제조를 혐기성 챔버에서 행하였다. 40 g의 부지 토양을 160 ㎖의 글래스 세럼 바틀에 주입하여, 마이크로코즘을 제조하였다. BTEX 및 알코올을 표 5에 나타낸 표적 농도를 얻도록 처리군 바틀에 첨가하였다. (각 BTEX 화합물에 대한 표적 BTEX 농도는 BTEX 칼럼 아래에 열거되어 있다.) 바틀을 약 2 ㎖의 헤드스페이스가 남도록 지하수로 채웠다. 대조군 마이크로코즘을 염화제이수은 (바틀의 700 ㎎ L-1) 및 포름알데히드 (바틀의 1 vol%)로 보정하여, 미생물 활성을 제한하였다. 알코올 및 BTEX 분석을 위해 처리군을 최소 3개로 복제하여 제조하였으며, 전자 수용체 및 메탄을 모니터링하기 위해, 처리군 당 1개의 추가의 복제를 사용하였다.
바틀을 테플론으로 안을 댄 부틸 스토퍼로 크림프 시일링하여, 100 rpm으로 작동하는 회전식 진탕기 상에서 15℃로 인큐베이션하였다. 필요하다면, 원하는 환원 조건을 유지하기 위해 추가의 전자 수용체를 첨가하였다. 대조군을 염화제이수은 및 포름알데히드로 보정하였다. 보정된 전자 수용체 농도는 마지막 칼럼에 나타낸다. 변형 기본 염 배지 형태의 양분 (Hareland et al., 1975)을 22일에 모든 처리군에 첨가하였다.
[표 5]
Figure pct00006
분석 방법
플레임 이온화 검출기 (FID) 및 레스텍 QSPLOT 칼럼을 갖춘 배리언 CP-3900 가스 크로마토그래프를 사용하여 BTEX에 대하여, FID 및 레스텍 Rt-알루미나 칼럼을 갖춘 GC를 사용하여 메탄에 대하여 헤드스페이스 가스를 분석하여, 수성 농도를 헨리의 법칙을 적용하여 계산하였다.
FID 및 스타빌왁스 DA 칼럼을 갖춘 배리언 CP-3800 가스 크로마토그래프를 사용하여, 수성 알코올 농도 (및 잠재적인 아이소부탄올 분해산물 아이소부틸알데히드 및 아이소부티르산)를 분석하였다. 이온 크로마토그래피를 통한 음이온 분석을 위해 수성 샘플을 수집하였다 (Dionex DX-120, Sunnyvale, CA). 또한 콴트 (Quant) 질산염 시험 스트립 (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ)을 사용하여, 질산염을 주기적으로 측정하였다. 제조사의 사용설명서에 따라 하크 (Hach) 시험 키트 (Hach, Loveland, CO)를 사용하여, 총 철 및 용해철을 측정하였다.
미생물 분석
본 연구 동안에 미생물 개체군의 변화를 확인하기 위해, 실험의 개시 및 종료 시에, 처리군 2, 6, 9, 및 12로부터 마이크로코즘 슬러리 서브샘플 샘플 (약 8 ㎖)을 얻었다. 샘플을 -70℃로 즉시 동결시키고, (연구 완료 시에) 센서스™ 정량적 PCR법 (Microbial Insights, 2009http://www.microbe.com/how-census-works.html 및 http://microbe.com/census-applications/anaerobic-btex.html, 각각 07.07.2009 및 05.08.09에 액세스됨)에 의해, 총 진정세균, 탈질소 세균, 철 및 황산염 환원 세균, 및 메탄 생성 세균의 정량적 폴리메라제 연쇄 반응 (qPCR)을 위해 미국 테네시주 록퍼드에 소재하는 마이크로비얼 인사이츠의 드라이 아이스 상으로 수송하였다.
아이소부탄올 및 에탄올 분해
아이소부탄올을 고 농도 처리군에서 완전히 분해시키고, 이의 분해 속도를 상이한 혐기성 조건 하에 변화시켰다. 도 5는 고 농도 처리군 (처리군 2, 6, 9, 및 12)의 아이소부탄올 및 전자 수용체 농도를 나타낸다. 백그라운드 황산염 농도는 미보정 처리군에 나타낸다. 대조군 마이크로코즘에서는 아이소부탄올 또는 에탄올의 감소도, 아이소부틸알데히드 또는 아이소부티르산의 축적도 관측되지 않았다. 가장 빠른 아이소부탄올 생분해는 질산염으로 보정된 마이크로코즘에서 관측되었다. 16일 이내에, 아이소부탄올은 질산염 환원 조건 하에서 검출 한계 미만으로 분해되었다 (처리군 6). 질산염은 아이소부탄올 분해와 동시에 사용되어, 14일째에 재보정되기 전에 13일째까지 감소되어 검출되지 않았다. 19일 동안에 측정가능한 백그라운드 황산염의 감소가 처리군 6에서 관측되지 않았다 (데이터 도시되지 않음).
아이소부탄올 생분해는 황산염으로 보정된 처리군 (처리군 12) 및 제한된 백그라운드 황산염이 존재하는 미보정 마이크로코즘 (처리군 2)에서 관측되었다. 황산염의 고갈 (즉, 메탄 생성 조건) 후의 아이소부탄올의 생분해를 평가하기 위해, 처리군 2의 마이크로코즘 바틀은 88일 동안 아이소부탄올 (3,400 μM의 최종 농도)로 리스파이크 (re-spike)되었다. 추가의 아이소부탄올은 약 30일 이내에 분해되었다. 그러나, 황산염의 고갈 후에 다만 미량 (< 2 μM)의 메탄이 처리군 2에서 관측되었으며, 이는 대조군의 메탄 레벨과 유사하다.
철로 보정된 처리군의 아이소부탄올은 약 80일 이내에 분석적 검출 한계 미만으로 생분해되었다. 44일 동안에 걸쳐 모니터링된 제이철 이온은 약 18 내지 36 μM의 범위에 걸친 농도를 나타내었다. 그러나, 다만 비교적 낮은 레벨의 용해된 제일철 이온 (36 μM 이하)이 관측되었다. 뚜렷한 제일철 이온 축적이 없다는 것은 흑색 침전물이 관측됨에 따라, 마이크로코즘 바틀에 황화철이 생성된 것으로 예상되었다. 게다가, 황화철의 생성과 일치하게, 백그라운드 황산염 농도는 철로 보정된 처리군에서 감소되었다. 아이소부탄올 농도의 감소는 황산염 레벨의 감소와 상관 관계가 있었다.
저 아이소부탄올 농도의 마이크로코즘 (처리군 3, 7, 10, 및 13)에서, 아이소부탄올은 철로 보정된 처리군에서 약 25일 이내에 완전히 생분해되며, 미보정 처리군, 질산염으로 보정된 처리군 및 황산염으로 보정된 처리군에서 약 15일 이내에 완전히 생분해되었다 (도 9). 보정된 전자 수용체 이외에도, 각 마이크로코즘은 지하수 물질에 약 100 μM 백그라운드 질산염 레벨을 포함하고, 아이소부탄올 생분해와 상관 관계가 있는 백그라운드 질산염 감소는 인큐베이션 동안에 관측되었다. 1몰의 아이소부탄올의 분해는 이론상 4몰의 질산염이 요구되는데, 이는 질소로 완전히 환원되는 것으로 추정된다 (McCarty, "Bioengineering issues related to in situ remediation of contaminated soils and groundwater" Environmental Technology, in : Omenn, G.S., Reducing risks from environmental chemicals through biotechnology. Plenum press, New York, pp. 143-162, 1988). 증균 배양 실험은 소모된 질산염 및 분해된 벤젠의 몰 비가 10으로 이론수의 2배임을 제시하였다 (Burland and Edwards, 1999, Appl Environ Microbiol 65(2): 529-533). 100 μM의 백그라운드 질산염은 저 농도 처리군에서 초기 아이소부탄올의 18%인 약 13 μM의 아이소부탄올의 생분해를 촉진시킬 수 있었다. 저 농도 처리군에서 백그라운드 황산염 환원이 관측되지 않았다.
아이소부티르산 및 미량의 아이소부틸알데히드가 과도적 생분해 중간체로서 확인되었으며, 이들 화합물의 연속적인 생분해가 모든 처리군에서 관측되었다. 다만 5%의 축적이 관측된 고 농도 질산염으로 보정된 처리군을 제외하고는, 아이소부티르산은 거의 (약 2배) 화학양론적 양으로 축적되었다. 고 농도 질산염 처리군에서의 아이소부티르산의 생성 제한은 용이하게 설명되지 않는다.
에탄올로 보정된 마이크로코즘 (처리군 4 및 14)에서, 에탄올은 황산염 환원 조건 하에 약 60일 내에 분석적 검출 한계 미만으로 분해되었다 (도 6). 메탄은 44일에 처리군 4 및 14 (각각, 4 및 25 μM)에서 검출되었으나, 78일째에는 불검출 레벨로 감소되었다.
황산염의 고갈 후의 에탄올 생분해를 평가하기 위해, 에탄올은 88일에 처리군 4 바틀로 리스파이크되었다. 에탄올의 분석적 검출 한계 미만으로의 후속 생분해는 90일 이내에 일어났다. 이러한 결과는 황산염의 부재 하에서의 발효를 통한 에탄올 생분해에서 입증되는 이전의 혐기성 에탄올 연구와 일치한다 (Laanbroek et al., 1982, Arch. Microbiol. 133: 178-184).
BTEX 분해
대조군에서의 BTEX 농도 감소는 실험 과정 중에 무시할 수 있을 정도 (<15%)이었다. 고 농도 처리군에서의 BTEX 생분해는 도 5 및 7에 나타나 있으며, 저 농도 BTEX 결과 (비교용 에탄올 처리군과 함께)는 도 8에 나타나 있다. BTEX가 처리군 4에서 부주의로 리스파이크되기 때문에, 이 처리군에 대한 최후 2개의 시점에서 데이터를 구할 수 없다.
톨루엔 생분해는 전자 수용체로 보정된 모든 고 농도 마이크로코즘에서 관측되었다 (도 7). 알코올 없이 인큐베이션된 경우에, 각각 질산염 환원, 철 환원 및 황산염 환원 조건 하에 80일 이내에 약 38 μM의 톨루엔이 검출 한계 미만으로 분해되었다. 아이소부탄올의 존재는 질산염 환원 및 황산염 환원 조건 하에 톨루엔 분해에 대하여 약간의 영향을 나타내었으나, 철로 보정된 마이크로코즘에서는 톨루엔 분해가 감속되었다. 그러나, 미보정된 고 농도 마이크로코즘 (처리군 2)에서, 대조군에 비해, 측정가능한 톨루엔 농도 감소 경향이 관측되지 않았다. 처리군 2의 백그라운드 황산염은 아마도 아이소부탄올 생분해으로 인해 최초 30일 내에 고갈되며, 전자 수용체 부족은 미보정 처리군에 톨루엔이 잔류하기 때문인 것으로 예상되었다. 충분한 전자 수용체가 존재하는 저 농도 마이크로코즘에서, 아이소부탄올은 미보정 (황산염 제한) 및 전자 수용체로 보정된 임의의 마이크로코즘에서의 톨루엔 생분해에 대하여 거의 영향을 나타내지 않았다 (도 8). 에틸벤젠 및 총 자일렌에 대한 결과 (도 10)는 에틸벤젠 및 총 자일렌의 생분해가 톨루엔과 비교하여 약간 느리게 일어나더라도, 톨루엔에 대한 결과와 유사하였다.
아이소부탄올이 존재하지 않는 고 BTEX 농도 처리군에서는, 162일 동안의 인큐베이션을 통해 임의의 혐기성 조건 하에서 실질적인 벤젠 생분해가 관측되지 않았다 (도 7). 그러나, 처리군 9 및 12에서 벤젠 농도가 실험의 종료 시점에 감소되기 시작했기 때문에, 아이소부탄올의 존재는 철 환원 및 황산염 환원 조건 하에 벤젠 생분해를 촉진시키는 것으로 보여졌다. 황산염 환원 조건 하에서의 저 농도 처리군에서, 벤젠 농도는 약 300일 동안의 인큐베이션 후에 아이소부탄올이 존재하는 마이크로코즘 (처리군 13)에서는 분석적 검출 한계 (0.50 μM) 미만으로 감소되며, 에탄올이 존재하는 마이크로코즘 (처리군 14)에서는 약 0.85 μM로 감소되었다. 벤젠 생분해는 처리군 14에서 120일 이전에 시작되며, 처리군 13에서 160 내지 300일 사이에 일어났다.
미생물 분석
표 6에 나타낸 미생물 분석 결과는 일반적으로 인큐베이션 동안에 미생물 농도 증가를 나타내었다. (값은 세포 mL-1로 나타내며; ± 값은 95% 신뢰 구간을 나타낸다.)
[표 6]
Figure pct00007
제이철 이온 (처리군 9) 또는 황산염 (처리군 2 및 12)을 포함하는 마이크로코즘에서, 대응하는 철 환원 및 황산염 환원 세균의 개체군은 각각, 1000배 증가되었다. 질산염이 처리군 6의 혐기성 인큐베이션의 종료 시점에 고갈됨에 따라, 메탄 생성 세균 개체군은 100배 증가되었다. 약간 더 낮은 레벨의 메탄 생성 세균 바이오매스 증가가 다른 처리군에서 관측되었다.
탈질소 세균 증식 증가가 질산염으로 보정된 처리군에서 관측되지 않았다. 이러한 관측에 대한 한 가지 설명은 2개의 상이한 질산염 환원효소 유전자가 모니터링되었지만, 본 발명자의 시스템 내의 탈질소 세균에 대한 기능 유전자는 정량화되지 않았다는 것이다. 아니면, 탈질소 세균의 활성이 상당할 수도 있지만, 탈질소 세균 증식은 두벨 (Dubbels) 등 (2009, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 1576-1578)에 의한 탈질소 조건 하에서의 n-부탄올 연구에서 관측된 바와 같이 낮을 수도 있다. 마찬가지로, 증식을 위한 질산염 환원에 의존하지 않는 발효성 세균은 또한 탈질소 조건 하에서의 아이소부탄올 분해에 관여할 수 있다 (Laanbroek et al., 1982, Arch. Microbiol. 133: 178-184).
실시예 3 - 에탄올에 대한 공용매로서의 아이소부탄올
스코핑 워터 (scoping water) 내성 및 상분리 시험을 18℃ (65℉)에서 아이소부탄올 - 에탄올 - 가솔린 블렌드 상에서 행하였다. 증가량의 아이소부탄올을 E10 가솔린과 혼합한 다음에, 1.3% 또는 2.6% 물을 모든 블렌드에 첨가하였다. 에탄올을 포함하는 가솔린 블렌드가 다량의 물을 흡수하기 때문에, 일부 블렌드에 대해서는 물을 2.6 vol%로 증가시킬 필요가 있으며, 1.3% 물은 분석을 위해 분리된 수상 및 탄화수소 상의 형성을 유도하기에 반드시 충분한 것은 아니었다 (즉, 1.3 vol% 물은 고 아이소부탄올 블렌드에 의해 완전히 흡수되었다). 이는 도 11에서 알 수 있으며, E10 중의 아이소부탄올의 양이 5 vol%에 이를 때까지 2개의 상을 유도하는데 1.3 vol%가 충분하지만, E10 중의 10 vol% 아이소부탄올의 경우에는, 상분리를 유도하는데 레벨을 2.6 vol% 물로 증가시킬 필요가 있었다.
도 12의 데이터는 아이소부탄올 농도 증가에 따라 수상으로 추출되는 에탄올의 양이 감소되는데, 이는 아이소부탄올이 에탄올에 대한 공용매로서 작용하는 것을 나타낸다는 것을 보여준다. 탄화수소 및 수상 중의 농도는 GC로 측정되었다.
특정 실시형태에 대한 위의 설명은 본 발명의 일반적인 특성을 충분히 나타내며, 다른 사람들은 과도한 실험 없이, 본 발명의 일반 개념으로부터 벗어나지 않고, 이 분야의 기술 내의 지식을 적용하여, 다양한 응용을 위해 그러한 특정 실시형태를 쉽게 변경 및/또는 개량할 수 있다. 따라서, 이러한 개량 및 변경은 본 명세서에서 제시되는 교시 및 지침에 기초하여, 개시된 실시형태의 등가의 의미 및 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 명세서의 표현이나 용어는 설명의 목적을 위한 것이며 제한하기 위한 것이 아니며, 본 명세서에서 사용되는 표현이나 용어는 그 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되는 것으로 이해하여야 한다.

Claims (28)

  1. 탄화수소 연료 조성물의 생분해성을 증가시키기 위해 탄화수소 연료 조성물에 적당량의 아이소부탄올을 첨가하는 단계를 포함하는, 탄화수소 연료 조성물의 재생가능성을 증가시키고 탄화수소 연료 조성물에 의한 오염 시에 환경 구획 (environmental compartment)에 대한 영향을 제한하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 탄화수소 연료 조성물은 에탄올을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 에탄올은 아이소부탄올의 첨가 전에 연료 조성물의 약 10% 이하로 포함되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 아이소부탄올은 탄화수소 연료 조성물의 적어도 하나의 BTEX 성분의 생분해를 향상시키는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 아이소부탄올은 벤젠의 생분해를 향상시키는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 환경 구획은 토양 매트릭스를 포함하고, 아이소부탄올의 첨가는 토양 매트릭스 내의 에탄올의 수송을 감소시키는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 아이소부탄올의 첨가는 탄화수소 연료 조성물로부터의 BTEX 플룸 (plume)의 팽창을 저해하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 아이소부탄올의 첨가는 탄화수소 연료 조성물의 다양한 성분의 생분해성을 향상시키는 방법.
  9. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 생분해 향상은 호기성 조건 하에 일어나는 방법.
  10. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 생분해 향상은 질산염 환원 또는 황산염 환원 조건 하에 일어나는 방법.
  11. 하나 이상의 BTEX 성분의 생분해 속도를 증가시키기에 충분한 양으로 환경 구획에 전자 수용체를 첨가하는 단계를 포함하는, 혐기성 조건 하에서의 환경 구획에서 아이소부탄올을 포함하는 탄화수소 연료 조성물의 환경 거동 (environmental fate)을 향상시키는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 철, 황산염 또는 질산염, 또는 이들의 조합인 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 Fe(OH)3인 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 NaNO3인 방법.
  15. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 MgSO4인 방법.
  16. 제 11 항에 있어서, 하나 이상의 BTEX 성분은 톨루엔을 포함하는 방법.
  17. 제 11 항에 있어서, 하나 이상의 BTEX 성분은 자일렌을 포함하는 방법.
  18. 제 11 항에 있어서, 하나 이상의 BTEX 성분은 벤젠을 포함하는 방법.
  19. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 질산염이고, 질산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 첨가되는 방법.
  20. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 황산염이고, 황산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하는 방법.
  21. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 질산염이고, 질산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 톨루엔은 아이소부탄올과 거의 동일한 일수로 생분해하는 방법.
  22. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 황산염이고, 황산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 톨루엔은 아이소부탄올과 거의 동일한 일수로 생분해하는 방법.
  23. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 질산염이고, 질산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 벤젠은 아이소부탄올과 거의 동일한 일수로 생분해하는 방법.
  24. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 황산염이고, 황산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 벤젠 생분해는 황산염 환원 조건을 포함하지 않는 이의 생분해와 비교하여 향상되는 방법.
  25. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 황산염이고, 황산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 벤젠 생분해는 아이소부탄올의 부재 하에서의 이의 생분해와 비교하여 향상되는 방법.
  26. 제 11 항에 있어서, 전자 수용체는 황산염이고, 황산염 환원 조건을 형성하기에 충분한 양으로 존재하며, 벤젠 생분해는 에탄올의 존재 하에서의 이의 생분해와 비교하여 향상되는 방법.
  27. 가솔린, 아이소부탄올, 및 Fe(OH)3, NaNO3 또는 MgSO4 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
  28. 가솔린, 아이소부탄올, 및 Fe(OH)3, NaNO3, KNO3 , NHNO3 , Na2SO4 , CaSO4 , MgSO4, 킬레이트 철, 영가 (zero-valent) 철 및 나노 영가 철 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
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