KR20130121559A

KR20130121559A - 개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균 및 그를 이용한 개미산 합성방법

Info

Publication number: KR20130121559A
Application number: KR1020120044872A
Authority: KR
Inventors: 김용환; 전찬하; 정광덕
Original assignee: 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2013-11-06

Abstract

본 발명은 개미산(formate)의 합성에 사용되는 변이 대장균 및 그를 이용한 개미산 합성방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 수소화효소(hydrogenase)-3를 암호화하는 유전자 및 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 중에서 어느 하나 이상을 결실하여 개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균과, 상기 변이 대장균, 전자공급원 및 전자전달체를 사용하여 이산화탄소를 전기화학적으로 환원시키는 것을 특징으로 하는 개미산의 합성방법에 관한 것이다.

Description

개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균 및 그를 이용한 개미산 합성방법{E. coli mutant for producing formic acid and producing method of formic acid by using thereof}

본 발명은 개미산(formate)의 합성에 사용되는 변이 대장균 및 그를 이용한 개미산 합성방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균을 제공하고, 상기 변이 대장균, 전자공급원 및 전자전달체를 사용하여 이산화탄소를 전기화학적으로 환원시키는 것을 특징으로 하는 개미산의 합성방법에 관한 것이다.

현재 석유화학공업의 발달로 인하여 대부분의 화학물질들이 석유 및 천연가스로부터 생산되고 있으나, 최근 지구온난화현상 등 환경문제의 대두로 전세계적으로 환경규제가 강화되어, 화학물질의 생산을 위한 대체공정의 개발에 대한 요구가 증가되고 있다. 에너지원의 고갈과 환경오염 문제가 심각하게 대두되면서 대체에너지 및 환경오염문제의 해결책이 시급함에 따라 석유자원의 대체와 온실가스의 저감효과를 동시에 창출할 수 있는 바이오산업에 대한 관심이 커지고 있다. 그 중 심각한 기후변화를 야기시키는 이산화탄소 때문에 전 세계의 이목이 집중되고 있으며, 이러한 이산화탄소 감축문제를 놓고 단순히 산업분야뿐만이 아닌 에너지와 경제 분야 등 사회 여러 분야에서 관심이 커져가고 있다.

현재 선진국들이 이산화탄소 배출량에 대해 탄소세를 부과하려는 움직임을 보이고 있는 실정에서 에너지를 많이 사용하는 산업기반을 가진 우리나라는 큰 부담일 수 밖에 없으며, 이를 해결할 이산화탄소 저감 기술의 개발이 절실한 상황이다.

이에 따라, 미생물 배양기술과 유전공학적 기술의 획기적인 발달에 힘입어 생물공정에 의한 생물학적 물질(biochemical)의 생산이 점차 석유화학공정에 대하여 경쟁력을 갖게 되었다. 생물학적인 방법은 값싼 재생자원(renewable resource)을 원료로서 이용하고, 이산화탄소 등 지구온난화가스의 발생을 공정상에서 억제할 수 있기 때문에 환경문제를 근본적으로 해결할 수 있는 환경친화적 공정으로 알려져 있으므로, 균주개발 및 공정개선 등 원가절감을 위한 연구가 확대되고 있는 추세이다. 아울러, 생물학적 물질의 시장성이 매우 높아지고 있어, 미생물을 이용하여 생물자원(biomass)으로부터 생물학적 물질의 생산에 대한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다.

이러한 배출규제에 대비하기 위해서 이산화탄소를 개미산(포르메이트, Formate, formic acid)으로 제조하는 기술은 이산화탄소의 저감 방법의 유용한 하나가 될 것이며, C1 계열의 석유화학 기초 물질인 개미산은 다른 석유화학제품의 원료로서 비교적 고부가화물질로 C1 화학의 중요한 중간체로 가치가 크다.

개미산 탈수소효소(Formate dehydrogenase, FDH) 효소를 활용하여 개미산을 합성하는 방법 (US 20070042479)에서는 NAD⁺를 생물학적인 방법으로 재생하여 FDH 효소를 촉매로 개미산 및 메탄올을 합성하는 방법에 개발하였고, FDH효소로부터 이산화탄소를 개미산이나 메탄올로 전환하기 위한 생물학적 NADH 재생방법 (JP 2002233395, US 7087418) 및 전기화학적 NADH 재생방법 (JP 06153904)이 발표되었다. 이러한 FDH 효소를 촉매로 NADH를 매개체로 사용하여 이산화탄소를 개미산으로 제조하는 기술은 FDH 효소가 개미산으로부터 이산화탄소로 전환하는 반응이 정반응인 효소촉매시스템에서 NADH의 농도 및 pH의 조절에 의해 역반응으로 수행해야하는 매우 어려운 반응일 뿐 아니라, NADH 및 FDH의 가격이 매우 높아 현실적으로 상용화단계까지 가기 어려운 반응시스템이 된다.

1. 미국공개특허 US 20070042479 2. 일본공개특허 JP 2002233395 3. 미국등록특허 US 7087418 4. 일본등록특허 JP 06153904

본 발명은 보다 효율적이고 경제적인 이산화탄소 저감 기술로서, 이산화탄소를 환원하여 개미산을 합성하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 이산화탄소를 환원하여 개미산을 합성하는 방법을 보다 효율적이고 대량으로 수행하는 변이된 대장균을 개발하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 대장균에서 수소화효소(hydrogenase)-3를 암호화하는 유전자 및 개미산 탈수소효소(formate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 중에서 어느 하나 이상을 결실하여 개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 개미산 합성 변이 대장균은 수소화효소(hydrogenase)-3를 암호화하는 유전자는 hycB이고, 개미산 탈수소효소(formate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자는 fdhF, fdnG 및 fdoG 중에서 선택된 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균, 전자공급원 및 전자전달체를 사용하여 이산화탄소를 전기화학적으로 환원시키는 것을 특징으로 하는 개미산 합성방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 개미산 합성방법의 전자공급원은 물 분해에 의해 얻어지며, 그 전위차는 1.4 내지 4.0 eV의 범위인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 개미산 합성방법의 전자전달체는 pH 7에서 -0.43 V 이하의 표준환원전위를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 대장균에서 수소화효소(hydrogenase)-3를 암호화하는 유전자 및 개미산 탈수소효소(formate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 중에서 어느 하나 이상을 결실하여 개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균을 제공하고, 상기 변이 대장균, 전자공급원 및 전자전달체를 사용하여 이산화탄소로부터 개미산을 대량 합성할 수 있게 된다.

상기 개미산 합성방법에 사용되는 전자공급원으로 광활성 태양전지를 직접사용할 수 있어 에너지사용은 최소화함으로써 현실적으로 인공광합성 시스템의 구현을 가능하게 하는 방법이 된다.

본 발명에 따른 개미산 합성방법에 의하여 환경오염물질의 배출이 적고, 에너지 효율이 높으며, 친환경적인 생체모방기술을 이용한 에너지 및 자원생산시스템을 개발할 수 있다.

도 1은 유전자 결실에 따른 개미산 합성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 전자전달체 종류에 따른 개미산 합성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 pH 종류에 따른 개미산 합성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 전위에 따른 개미산 합성 정도를 나타낸 그래프이다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 대장균에서 수소화효소(hydrogenase)-3를 암호화하는 유전자 및 개미산 탈수소효소(formate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 중에서 어느 하나 이상을 결실하여 개미산(formate)의 합성에 사용되는 변이 대장균을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

상기 대장균은 Escherichia coli (E. coli)로서, 사람을 포함해서 포유류의 장관을 기생장소로 하고 있는 장내세균으로, 통성혐기성 그람음성의 간균이며 글루코오스를 분해하여 산을 생산한다.

본 발명에 있어서, ‘결실’이란 용어는 상기 유전자에 의해 코딩되는 효소가 생성되지 못하도록 해당 유전자를 변형시킨 것을 모두 포괄한다.

한편, 순수한 대장균의 경우 이산화탄소로부터 개미산을 합성할 수 없다. 그러나 본 발명에 따른 변이 대장균은, FDH-H와 전자전달계가 이어져 있는 수소화효소(hydrogenase)-3과 FDH-H를 발현해주는 유전자 hycB 및 fdhF를 각각 결실시켜준 변이체로, 이를 사용하여 전자와 수소이온으로부터 이산화탄소를 환원시켜 개미산을 합성할 수 있었다. 여기서 두 유전자 hycB 및 fdhF를 모두 동시에 결실시켜도 이산화탄소를 환원시켜 개미산을 합성하는 것이 가능하였다.

본 발명에 있어서, 상기 변이 대장균의 수소화효소(hydrogenase)-3를 암호화하는 유전자는 hycB이고, 개미산 탈수소효소(formate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자는 fdhF, fdnG 및 fdoG 중에서 선택된 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균, 전자공급원 및 전자전달체를 사용하여 이산화탄소를 전기화학적으로 환원시키는 것을 특징으로 하는 개미산 합성방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 전자공급원은 물 분해에 의해 얻어지며, 그 전위차는 1.4 내지 4.0 eV의 범위인 것을 특징으로 한다. 또한 상기 물분해는 태양광을 이용한 태양전시스템 등에 의해 제공될 수 있으며, 그때 전위차는 1.6~4.0 eV의 범위에서 가능하며 실제로는 1.8~3.0 eV의 범위에서 가능하게 된다. 전위차가 1.8 eV보다 작게 되면 물이 분해해서 수소이온과 전자가 발생하지 않으며, 전위차가 4.0 eV보다 크게 되면 전해질 및 전자전달체가 과도하게 환원되어 이산화탄소의 전환수율이 매우 떨어지게 된다.

상기 태양전지는 실리콘 태양전지, 염료감응형 태양전지, 유기태양전지등을 사용할 수 있으며 필요한 전위차를 갖는 반도체형 광활성 물질등이 사용될 수 있으며 이러한 광활 성물질은 Strontium titanate(SrTiO₃), GaP, (산화)나이트리드((Oxy)nitride) 계열의 물질 등이 있다.

본 발명은 상기 전자전달체는 pH 7에서 -0.43 V 이하의 표준환원전위를 갖는 것을 특징으로 하는 개미산의 합성방법을 제공한다. 상기 생산된 전기는 전자전달체를 환원시키므로, 상기 전자전달체는 이산화탄소의 표준환원전위보다 낮은 값을 가져서 이산화탄소를 환원시킬 수 있어야 한다. 이산화탄소를 개미산으로 환원시키는 반응의 경우 pH 7에서 표준환원전위는 -0.43 V이며, 상기 보다 낮은 표준환원전위를 갖는 물질은 바이올로겐 계열의 화합물이 있다. 상기 바이올로겐 계열 화합물에는 보다 구체적으로 알킬 바이올로겐, 에틸 바이올로겐, 메틸 바이올로겐, 벤질 바이올로겐 등이 있으나 이에 국한되지 않고 -0.43 V 이하의 표준환원전위를 갖는 전자전달체는 모두 사용이 가능하다. 상기 보다 pH가 낮은 경우 보다 높은 표준환원전위를 갖는 전자전달체의 사용이 가능하다.

이산화탄소의 환원반응은 pH의 영향을 크게 받으며 pH의 값이 작을수록 유전자 조작된 대장균의 반응활성은 높게된다. 이러한 반응을 위해서 버퍼용액을 사용하는 것이 바람직하며 아세테이트 버퍼(acetate buffer), 인산 버퍼(phosphate buffer), 시트레이트 버퍼(citrate buffer), MES-NaOH buffer등이 있으며, pH 1~8까지 pH를 조절할 수 있는 버퍼용액을 사용하며 실제로는 pH2~7까지 조절할 수 있는 버퍼용액의 사용이 가능하다. 상기 범위보다 pH가 너무 낮으면 유전자조작된 대장균의 활성이 저해되며, 반대로 pH가 너무 높으면 열역학적으로 이산화탄소의 전환이 제한된다.

본 발명에서는 다루기 쉽고 대량생산이 용이한 대장균을 변형하여 NADH 없이 다양한 전자전달시스템으로 이산화탄소를 개미산으로 전환할 수 있는 유전자 조작된 대장균을 개발하여 대량의 이산화탄소를 경제적으로 전환할 수 있는 시스템의 구현을 가능하게 하였다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

1. 실시예의 제조

1) 유전자 결실 변이체의 제작

대장균 균주로 BW25133을 사용하였으며 fdh 를 결실시킨 변이체를 제작하였으며, 상기 결실시킨 자리에는 카나마이신(kanamycin) 항생제에 저항성을 가지는 selection marker(선택 표지)의 서열을 넣어주어 선택적 배양이 가능하게 하였다.

2) 균주의 배양 및 유도

상기에서 제조한 미생물 배양을 위해 Luria-Bertani (LB) 액체배지 (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 10 g/L)를 사용하였다. 125 ml serum bottle에 조제된 LB 액체배지 50 ml을 옮겨 넣고, 아르곤(Ar) 가스로 15분 동안 purging 해준 뒤, 밀봉하고 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 멸균 뒤 혐기 배양을 위해 주사기를 이용하여, 멸균된 glucose 5 g/L를 넣어주었으며 deletion mutants를 배양할 경우 선택적 배양을 위하여 kanamycin 1 mM 을 투입하였다.

FDH의 유도를 위해 sodium selenite와 sodium formate를 각각 10μM, 10mM의 농도로 넣어주었다. 멸균, 밀봉된 배지에 미리 배양한 3 ml의 균주를 접종시킨 뒤 37℃, 150 rpm에서 OD₆₀₀ 1.0이 될 때까지 배양하였다. 배양이 끝난 균주는 4000 rpm에서 20분 동안 원심분리 하였으며, 배양한 액체배지와 분리시켜 회수하였다.

실시예 1에서 결실시킨 염기서열이 fdnG인 점을 제외하고는 동일하게 제조하고 배양하였다.

실시예 1에서 결실시킨 염기서열이 fdoG인 점을 제외하고는 동일하게 제조하고 배양하였다.

실시예 1에서 결실시킨 염기서열이 hycB인 점을 제외하고는 동일하게 제조하고 배양하였다.

상기에서 제조한 실시예 및 대조군을 정리하면 하기 표 1과 같다.

	결실부위	Genotype
대조군	-	from NBRP (NIG, Japan)
실시예1	fdhFKm^R ^*	Defective in selenopolypeptide subunit of formate dehydrogenase-H
실시예2	fdnGKm^R	Defective in alpha subunit of formate dehydrogenase-N
실시예3	fdoGKm^R	Defective in large subunit of formate dehydrogenase-O
실시예4	hycBKm^R	Defective in Fe-S subunit of hydrogenase 3

2. 개미산 생성 반응

개미산 생성 반응은 다음과 같은 방법을 토대로 진행되었다. 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.0), 10 mM sodium bicarbonate, 1 mM methyl viologen 및 10 mM zinc powder를 포함하는 반응용액 4 ml에, 상기에서 회수하여 혼탁시킨 균주를 1 ml 넣어 반응을 진행하였다.

pH 실험을 위하여 sodium acetate buffer의 pH를 4.0~7.0으로 변화시켜 실험해 주었고, 전자전달체의 친화도를 비교하기 위해 methyl viologen, ethyl viologen 그리고 benzyl viologen을 이용하여 실험을 진행하였다.

생성된 개미산의 농도를 측정하기 위해 High-performance liquid chromatography (HPLC, Agilent 1200 series)를 이용하였다. 정량분석의 컬럼은 HPX-87H (Bio-Rad, 300 mm×7.8 mm)를 사용하였으며, 검출은 ultraviolet diode-array(UV) detector를 사용하여 210 nm 파장에서 이루어졌다. 분석은 30℃, 0.6 ml/min의 조건에서 수행되었고, 용매로는 8 mM H₂SO₄를 이용하였으며 Injection volume은 20㎕였다.

3. 유전자 결실에 따른 개미산 합성 확인

유전자 결실 여부에 따른 개미산 합성 결과는 도 1에 나타내었다. 실험 결과, 유전자 결실을 하지 않은 대조군은 개미산이 합성되지 않았으나, 실시예 1 및 실시예 4에서 개미산이 합성된 것을 확인하였다.

4. 전자전달체의 선택

본 연구에서는 개미산 생성 반응에서 전자전달체의 최적화를 위하여 실험을 진행하였다. 실시예 4를 사용하였고, 전자전달체의 종류로는 에틸렌바이올로겐(ethyl viologen), 메칠 바이올로겐(methyl viologen) 그리고 벤질 바이올로겐(benzyl viologen)을 사용하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실험 결과, ethyl viologen를 전자전달체로 이용했을 경우 10분에 1.15 mM의 개미산을 생산해 가장 많은 양의 개미산을 생산해냈다. 이는 각각의 전자전달체와 CO₂/formate의 redox potential energy를 비교해 보았을 때, ethyl viologen이 산화될 때 가장 많은 에너지를 만들어내어 개미산 생성을 용이하게 한 것으로 해석된다.

5. pH 의 영향

pH가 개미산 합성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 반응 용액 100 mM sodium acetate buffer의 pH를 4.0~7.0로 변화시켜주며 실험을 진행하였다.

실시예 4를 사용하였고, 전자전달체로 methyl viologen을 사용하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 실험 결과, pH 4.0에서 개미산의 합성이 최대로 증가하였다. 이는 pH가 낮을수록 수소이온의 농도가 높아 이산화탄소가 환원되기 쉬운 환경을 만들어 주기 때문이다.

6. 전기화학적 시스템에 의한 이산화탄소로부터 개미산의 제조

2전극시스템의 전기화학시스템을 사용하여 이산화탄소로부터 개미산을 제조하는 반응실험을 수행하였다.

물을 분해하기 위한 전극으로는 백금전극을 사용하였고, 환원전극으로는 GC(glassy carbon)을 사용하였다. 실시예 1을 사용하였고, 버퍼용액으로는 MES buffer를 사용하였고, 1mM의 methyl viologen을 전자전달체로 사용하였고, 전위를 2V 및 3V를 각각 제공하고, CO₂를 가스로 주입하여 반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 실험 결과 2 V에서 보다 3 V에서 더욱 많은 양의 개미산이 합성되는 것은 물론, 더 빨리 최대 합성에 도달하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

대장균에서 수소화효소(hydrogenase)-3를 암호화하는 유전자 및 개미산 탈수소효소(formate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 중에서 어느 하나 이상을 결실하여 개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균.
제1항에 있어서,
상기 수소화효소-3를 암호화하는 유전자는 hycB이고, 상기 개미산 탈수소효소를 암호화하는 유전자는 fdhF, fdnG 및 fdoG 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균.
제1항 또는 제2항에 따른 개미산의 합성에 사용되는 변이 대장균, 전자공급원 및 전자전달체를 사용하여 이산화탄소를 전기화학적으로 환원시키는 것을 특징으로 하는 개미산의 합성방법.
제3항에 있어서,
상기 전자공급원은 물 분해에 의해 얻어지며, 그 전위차는 1.4 내지 4.0 eV의 범위인 것을 특징으로 하는 개미산의 합성방법.
제3항에 있어서,
상기 전자전달체는 pH 7에서 -0.43 V 이하의 표준환원전위를 갖는 것을 특징으로 하는 개미산의 합성방법.