KR20130117549A - 프로플라빈을 이용한 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법 및 이를 이용하는 인공광합성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로플라빈을 이용한 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (i) 산화형 옥시도리덕타제 보조인자, (ii) 프로플라빈, (iii) 희생전자 주개 및 (iv) 전자 매개체를 함유하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용액에 빛을 조사하는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 프로플라빈을 이용하여 옥시도리덕타제 보조인자를 재생하면, 빠른 속도로 옥시도리덕타제 보조인자를 재생시킬 수 있어, 옥시도리덕타제 효소를 이용하는 다양한 생촉매 반응의 효율을 높이는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

프로플라빈을 이용한 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법 및 이를 이용하는 인공광합성 방법 {Method for Regenerating Cofactors Using Proflavine and Method of Biocatalyzed Artificial Photosynthesis Using the Same}

본 발명은 프로플라빈을 이용한 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법 및 이를 이용하는 인공광합성에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 프로플라빈을 이용하여 보조인자를 재생하고, 상기 재생된 보조인자를 산화환원효소 반응에 사용하여 유용물질을 제조하는 인공광합성 방법에 관한 것이다.

효소는 단백질로 이루어진 주효소(apoenzyme)와 조효소(coenzyme)로 이루어지며, 상기 조효소는 금속이온 여부에 따라 보조인자(cofactor) 또는 보결족(prosthetic group)으로 구분된다. 우리가 통상적으로 말하는 조효소는 엄밀하게는 보조인자(cofactor)를 말하는 것으로서, 상기 보조인자는 기질로부터 이탈된 원자나 원자단을 일시적으로 수용하여 다른 물질에 전달하는 역할을 하며 대표적으로 니코틴아미드 보조인자인 NAD, NADP와 플라빈 보조인자인 FAD, FMN 등이 있다. 상기 니코틴아미드 보조인자와 플라빈 보조인자 또는 그들의 산화된 형태는 많은 종류의 옥시도리덕타제가 수행하는 산화환원 생촉매반응에 있어서 필수적인 보조인자로 이용된다 (E. Siu et al., Biotechnol . Prog ., 23:293, 2007; W.A. van der Donk and H. Zhao, Curr , Opin . Biotechnol . 14:421, 2003).

상기 생촉매반응은 실험실 내 유기합성 및 다양한 공업 분야에 있어서 점점 더 중요해지고 있다. 생촉매 반응의 효율을 높이기 위해서는, 효소의 지속적인 반응 수행을 위한 보조인자가 지속적으로 재생되어야 할 필요가 있지만, 다양한 방식으로 널리 이용되고 있는 가수분해 효소와는 달리, 산화환원효소의 사용에 있어서 만족할만한 보조인자 재생방법이 확립되지 않아 그다지 널리 상용화되고 있지 않은 현실이다. 이에 전기화학적 재생(electrochemical regeneration)은 기존의 제2효소/기질 재생방법을 대체할 수 있는 하나의 매력적인 방법으로 여겨져 왔다 (F. Hollmann and A. Schmid, Biocatal . Biotransform ., 22:63, 2004). 하지만 전기화학적 재생방법에서도 NAD(P)⁺의 NAD(P)H로의 환원이 열역학적으로 선호되는 전압조건에서도 전극과 NAD(P)⁺사이의 느린 전자전달 속도로 인하여 재생 효율이 떨어지는 단점이 있었다.

이를 해결하기 위하여 균등질의 산화환원 매개체(mediator)를 사용하여 전극과 NAD(P)⁺ 사이에 전자를 전달하는 방법이 개발된 바 있다 (H. Jaegfeldt et al., Anal. Chem ., 53:1979, 1981; J. Wang and J, Liu Anal , Chim. Acta , 284:385, 1993; J. Wang et al., Anal . Chim . Acta , 360:171, 1998).

구체적으로, 메틸비올로겐(methyl viologen)이 NAD(P)H에 대한 전자전달 매개체로써 플라보효소(Ferredoxin Reductase(FDR) 혹은 Lipoamide Dehydrogenase(LipDH))와 함께 간접적인 전기화학적 재생에 사용된 바 있으며 (Dicosimo et al. J Org Chem, 46:4622, 1981), 루테늄(II) 복합체인 (헥사메틸벤젠-2,2'-비피리딘클로로)루테늄(II)을 케톤류의 알콜로의 환원에 전자전달을 위한 매개체로 사용된 바 있고 (Ogo S, Abura T, Watanabe Y, Organometallics 21:2964, 2002; Yaw Kai Wan et al. J Biol Inorg Chem , 11;483, 2006), 로듐(III) 복합체인 (펜타메틸사이클로펜타디에넬-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III):(Cp*Rh(bpy)H₂0]⁺(이하 M)을 NAD(P)+로의 전자전달을 위한 매개체로 사용한 바 있으며 (R. Ruppert et al.,, Tetrahedron Lett., 28:6583, 1987; F. Hollmann et al., Angew . Chem., 113:190, 2001; Angew . Chem . Int . Ed ., 40:169, 2001; K. Vuorilehto et al., Bioelectrochemistry , 65:1, 2004), 상기 로듐 III 복합체를 FADH2의 재생에 사용한 바 있다 (F. Hollmann et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 19-20:167, 2003).

그러나 전기화학적인 재생방법은 본질적으로 전극의 표면적에 절대적으로 의존적인 수득률을 보여 생산력에 한계를 보이는 단점이 있다. 넓은 표면적의 전극을 사용하면 그만큼 높은 반응 속도와 생산력을 얻을 수 있으나 그에 따르는 기반설비 비용이 증가하게 된다.

한편, 빛을 이용한 광화학적 보조인자 재생은 자연계에서 광합성이라는 이름으로 이미 사용되고 있는 방법으로, 최근 들어 보조인자 공급 문제의 해결책으로 각광받고 있다. 자연계의 광합성을 모사하는 것은 외부 전력의 공급 없이 무한한 태양에너지를 이용하여 저가이면서 환경 친화적인 광화학적 보조인자 재생을 가능하게 한다 (D.Gust, T.A. Moore, A.L. Moore, Acc . Chem . Res. 2009, 42, 1890-1898., D.Gust, T.A. Moore, A.L. Moore, Acc . Chem . Res.2001, 34, 40-48). 자연계의 광합성은 클로로필(Chlorophyll)같은 유기 색소(Organic dye)로 이루어진 광계(Photosystem)에서 빛을 흡수해 높은 에너지의 전자를 얻어 ATP(Adenosine Triphosphate) 보조인자와 NAD(Nicotinamide Adenosine Dinucleotide) 보조인자를 환원적으로 재생한 후 이를 포도당 합성의 원료로 사용한다.

이에 반해, in vitro에서는 클로로필로 이루어진 광계 대신에 인공 광감응제(man-made photosensitizer)를 이용하여 태양광을 흡수하고 높은 에너지의 전자(photo-excited electron)을 발생시켜, 산화환원 효소반응에 사용될 보조인자를 광화학적으로 재생한다 (D.H. Nam, S.H. Lee, C.B. Park, Small . 2010, 6, 922-926., J. Ryu, S.H. Lee, D.H. Nam, C.B. Park, Adv . Mater. 2011,23, 1883-1888). 효과적인 광화학적 보조인자 재생을 위해서는 광감응제가 전자를 효과적으로 NAD(P)⁺에 전달하는 것이 중요하다.

한편, 프로플라빈(Proflavine)은 전도유망한 광감응제로서 높은 광안정성을 지닌다 (K. Kalyanasundaram, D. Dung, J. Phys . Chem. 1980, 84, 2551-2556). 이러한 장점으로 인해 프로플라빈은 빛에너지를 이용해 물로부터 수소를 발생시키는 수소 방출(Hydrogen evolution)에서 광감응제로 사용되어 왔다 (M.-P. Pileni, M. Grazel, J. Phys . Chem . 1980, 84, 2402-2406). 이처럼 프로플라빈은 효과적으로 빛에너지를 다른 에너지로 전환할 수 있는 능력을 가졌음에도 불구하고, 광화학적 보조인자 재생에는 아직 사용된 적이 없다.

이에, 본 발명자들은 자연광합성의 광계를 통해 일어나는 보조인자 재생을 모방하여 고효율의 광화학적 옥시도리덕타제 보조인자 재생방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 산화형 옥시도리덕타제 보조인자, 희생전자 주개 및 전자 매개체를 함유하는 재생용액에 프로플라빈을 추가하는 경우, 프로플라빈이 광감응제로 작용하여 빛에 의한 보조인자 재생이 일어나며, 재생된 보조인자를 산화환원효소 반응에 이용하여 유용물질을 생성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 자연광합성의 광계를 통해 일어나는 보조인자 재생을 모방한, 고효율의 광화학적 옥시도리덕타제 보조인자 재생방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 옥시도리덕타제 보조인자 재생용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 프로플라빈을 이용한 인공광합성 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ 및 FMN⁺으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 옥시도리덕타제 보조인자; (ii) 프로플라빈; (iii) 희생전자 주개; 및 (iv) 전자 매개체를 함유하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용액에 빛을 조사하는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (i) NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ 및 FMN⁺으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 옥시도리덕타제 보조인자; (ii) 프로플라빈; (iii) 희생전자 주개; 및 (iv) 전자 매개체를 함유하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (i) NAD⁺; (ii) 프로플라빈; (iii) 트리에탄올아민 및 (iv) 로듐 (III) 복합체를 함유하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) (i) NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ 및 FMN⁺으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 옥시도리덕타제 보조인자; (ii) 프로플라빈; (iii) 희생전자 주개; 및 (iv) 전자 매개체를 함유하는 재생용액에 빛을 조사하여 보조인자를 광학적으로 재생하는 단계; 및 (b) 상기 재생된 보조인자를 산화환원효소 반응에 사용하여 상기 산화환원효소반응에 의해 생성되는 유용물질을 제조하는 단계를 포함하는 프로플라빈을 이용한 인공광합성 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 프로플라빈을 이용하여 옥시도리덕타제 보조인자를 재생하면, 빠른 속도로 옥시도리덕타제 보조인자를 재생시킬 수 있어 옥시도리덕타제 효소를 이용하는 다양한 생촉매반응의 효율을 높이는데 유용하다. 또한, 프로플라빈을 이용한 인공광합성 방법에 따르면 신약원료물질, 광학이성질체와 같은 고부가가치의 정밀화학물질을 친환경적으로 생산하기에 유용하다.

도 1은 프로플라빈을 이용한 광화학적 보조인자 재생의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 프로플라빈의 농도를 변수로 실험한 광화학적 NADH 재생의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 프로플라빈의 흡수 스펙트럼과 LED 광원의 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 프로플라빈과 복합체 M의 농도를 변수로 실험한 L-글루타메이트(L-glutamate) 생성과 광감응제의 턴오버수를 나타낸 것이다.
도 5는 플라빈 유도체들의 화학구조와 플라빈 유도체들을 이용한 광화학적 NADH 재생의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 프로플라빈과 플라빈 유도체들의 순환 전압-전류도를 나타낸 것이다.
도 7은 로듐 (III) 복합체 M의 전기화학적 변환을 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 (i) NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ 및 FMN⁺으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 옥시도리덕타제 보조인자; (ii) 프로플라빈; (iii) 희생전자 주개; 및 (iv) 전자 매개체를 함유하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용액에 빛을 조사하는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법 및 상기 보조인자 재생용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서는 프로플라빈이 효소 반응에 활성을 가진 NAD(P)H를 광화학적으로 재생하는데 있어, 광감응제로써 충분히 사용될 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.

본 발명의 광화학적 환원의 대상이 되는 옥시도리덕타제 보조인자는 니코틴아미드 보조인자인 NAD⁺(nicotinamide adenine dinucleotide), NADP⁺(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 또는 플라빈 보조인자인 FAD⁺(flavin adenine dinucleotide), FMN⁺(flavin monoucleotide) 일 수 있으며, 바람직하게는 NAD⁺일 수 있다.

본 발명에서 상기 희생전자 주개(sacrificial electron donor)는 염료에서 여기된 전자가 전자 매개체(electron mediator)에 전달되어 생기는 전자공극을 채우기 위한 전자를 제공해주는 물질로서, 당업자의 관점에서 트리에탄올아민(Triethanolamine, TEOA), 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 시트르산(Citric acid), 개미산(Formic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 옥살산(Oxalic acid), 알코올류 또는 물 등을 이용할 수 있으나 바람직하게는 TEOA일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 프로플라빈은 상기 전자 매개체와 희생전자 주개가 존재하는 시스템에서 1) 전자 매개체에 대해 높은 에너지 상태의 전자를 전달하기(donor) 위한 매개체와 2) 상기 전자 매개체에 전달하기 위한 전자를 희생전자 주개로부터 얻기(acceptor) 위한 매개체로서의 기능을 수행함으로써 2중적인 매개체 역할을 한다.

상기 염료의 첨가량은 크게 제한되지는 않으나, 1μM이상의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 전자 매개체는, 메틸비올로겐, 루테늄 (II) 복합체 및 로듐 (III) 복합체로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 전자 매개체는 산화형의 옥시도리덕타제 보조인자에 전자 전달(electron transfer)을 위한 1차 매개체의 용도로 사용된다. 일반적으로 전자 매개체를 거치지 않고 바로 산화형 옥시도리덕타제 보조인자로 전자가 전달되는 직접전자전달(direct electron transfer)은 보조인자의 아이소머와 다이머의 형성을 초래한다. 이는 효소의 활성이 없어(enzymatically inactive) 산화환원효소반응에서 최종 생성물을 얻을 수 없다.

상기 루테늄 (II) 복합체는 바람직하게는 (헥사메틸벤젠-2,2'-비피리딘클로로)루테늄(II)일 수 있고, 상기 로듐 (III) 복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III)을 사용하는 것이 바람직하다. 로듐 (III) 복합체는 pH 및 온도 변화에도 높은 위치 선택성(>99%)을 유지하기 때문에 효소 반응에 활성을 가진 NAD(P)H를 간접적으로 재생(indirect regeneration)하는데 있어서 널리 사용된다.

상기 시스템에서 사용되는 광원은 바람직하게는 자연적인 햇빛일 수 있고, 인공적인 텅스텐-할로겐 램프, 제논 램프, LED 혹은 단파장 레이저 장치 일 수 있다.

본 발명의 방법에서는 산화형 옥시도리덕타제 보조인자, 프로플라빈, 희생전자 주개 및 전자 매개체를 함유하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용액에 광원으로 빛을 조사하고 교반하여 환원형의 옥시도리덕타제 보조인자를 생성시킨다. 상기 광원의 출력은 5 W ~ 2000 W인 것이 바람직하다. 상기 출력 범위보다 낮은 경우 빛의 세기가 약해 촉매기능이 나타나지 않을 수 있으며, 너무 높은 출력에서는 빛과 열에 의한 효소 및 기타 물질의 변성으로 인해 생체촉매 반응이 일어나지 않거나 원치 않는 반응이 일어날 수 있다.

본 발명의 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법은, 도 1에 나타난 바와 같이, 광감응제가 빛을 흡수하여 여기시킨 전자를 전자 매개체에 전달하는 단계(단계 a); 상기 단계 a의 광감응제가 상기 희생전자 주개로부터 전자를 보충받아 단계 a가 반복되는 단계(단계 b); 전자를 받은 전자 매개체가 산화형 옥시도리덕타제 보조인자에게 전자를 전달하여 환원형 옥시도리덕타제 보조인자를 형성하게 된다(단계 c). 즉 본 발명에서 사용한 광감응제는 전자 매개체의 존재 하에 빛에 대해 활성을 갖는 촉매로 작용하여 전자의 전달에 관여하게 된다.

구체적으로, 본 발명의 일양태에서 전자 매개체로 로듐 (III) 복합체를 사용하였고, 광감응제로 프로플라빈을 사용한 경우, 도 1에 나타낸 바와 같이, 프로플라빈이 빛을 흡수하여 여기시킨 전자를 복합체 M에 전달하는 단계(단계 a); 상기 단계 a의 프로플라빈이 상기 희생전자 주개로부터 전자를 보충받아 단계 a가 반복되는 단계(단계 b); 전자를 받아 환원된 복합체 M이 산화형 옥시도리덕타제 보조인자에게 전자와 양성자를 전달하여 환원형 옥시도리덕타제 보조인자를 형성하게 된다(단계 c).

본 발명의 효과를 확인하기 위하여, 프로플라빈의 비존재 또는 존재시 NAD⁺에서 NADH로의 변환 속도(conversion rate)를 살펴본 결과, 프로플라빈의 비존재시에는 NADH가 전혀 생성되지 않았으나 프로플라빈이 존재할 때에는 빠른 속도로 NADH가 생성됨을 확인하였다. 또한, 프로플라빈의 양이 증가할수록 NADH의 생성량이 많아지며, 생성속도가 증가함을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

반면에, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD), 플라빈 모노뉴클레오티드(flavin mononucleotide, FMN), 루미크롬(lumichrome), 리보플라빈(riboflavin)의 플라빈 유도체들은 광감응제의 역할을 충분히 할 수 있음에도(도 2b), 광화학적 보조인자 재생실험에서 광감응제로 사용한 결과 NADH가 전혀 재생되지 않았다. 순환 전압전류법을 통해 분석한 결과, 플라빈과 복합체 M의 환원 피크 전류(reduction peak current)는 NAD⁺를 첨가함에 따라 증가하였으나, 플라빈 유도체와 복합체 M의 환원 피크 전류는 NAD⁺를 첨가함에 따라 감소하였다.

이는 NADH에서 M으로 전자가 전달되는 역전자 전달(back-electron transfer)이 발생하였음을 의미한다. NAD⁺는 복합체 M이 산화하면서 내놓은 수소를 받고 NADH로 환원되며 산화된 M(M_ox)은 광감응제로부터 2개의 전자를 받고 M_red로 환원된다. 환원된 M(M_red)는 반응 용액상에 있는 광자 하나를 받고 원래 상태인 M으로 되돌아간다(도 7). 여기서, 처음 단계인 M의 산화로 인한 NAD⁺의 환원반응이 가역적이기 때문에, 본 연구에서 원하는 전자 전달 방향과 반대인 역전자 전달(back-electron transfer)이 발생할 수도 있으며, Hollmann은 이를 실험적으로 확인하였다 (F.Hollmann et al., J. Mol . Catal . B Enzym. 19-20, 167-176, 2003). 따라서 프로플라빈과 복합체 M은 NAD⁺의 환원반응을 촉진시키는 것에 반해, 플라빈 유도체들의 경우에는 NADH 산화 반응이 우세하여 NADH 재생이 발생하지 않는다는 것을 알 수 있다.

이로부터, 본 발명에서 사용한 프로플라빈은 희생전자 주개 및 전자 매개체 존재하에 빛에 의해 활성을 갖는 촉매로 작용하여 전자의 전달에 관여함으로써, 옥시도리덕타제 보조인자의 재생속도를 상승시키는데 기여하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 방법은 옥시도리덕타제 효소를 이용하는 다양한 산화환원 촉매반응의 효율을 높일 수 있으며, 특히 pH와 온도 변화에도 효율적일 것으로 판단된다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) (i) NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ 및 FMN⁺으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 옥시도리덕타제 보조인자; (ii) 프로플라빈; (iii) 희생전자 주개; 및 (iv) 전자 매개체를 함유하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용액에 빛을 조사하여 보조인자를 광화학적으로 재생하는 단계; 및 (b) 상기 재생된 보조인자를 산화환원효소 반응에 사용하여 상기 산화환원효소반응에 의해 생성되는 유용물질을 제조하는 단계를 포함하는 프로플라빈을 이용한 인공광합성 방법에 관한 것이다.

본 발명의 인공광합성은 자연광합성의 명반응을 모방하여 프로플라빈을 이용하여 보조인자를 재생하고, 암반응을 모방하여 모든 산화환원효소를 이용한 효소반응으로 유용물질을 제조하는 과정을 의미한다. 본 발명에 있어서 인공광합성에 의해 생산되는 유용물질은 글루타메이트(glutamate), 아스파테이트(aspartate), 이부프로펜(Ibuprofen), 2-클로로-1-페닐에탄올, 프라바스타틴(Pravastatin) 또는 택솔(Taxol) 등을 포함하는 신약원료물질, 광학이성질체와 같은 고부가가치의 정밀화학물질을 예시할 수 있으나, 산화환원효소 반응에 의해 생성되는 물질을 모두 포함한다.

본 발명의 인공광합성은 프로플라빈을 집광재(light harvesting component)로 이용하는 것을 특징으로 하며, 상기 희생전자 주개는 트리에탄올아민(Triethanolamine, TEOA), 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 시트르산(Citric acid), 개미산(Formic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 옥살산(Oxalic acid), 알코올류 또는 물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

상기 전자 매개체는 메틸비올로겐, 루테늄 (II) 복합체 및 로듐 (III) 복합체로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하며, 상기 로듐 (III) 복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'비피리딘클로로)로듐(III):[Cp*Rh(bpy)H₂0]⁺인 것을 특징으로 한다.

상기 산화환원효소는 산화환원반응을 촉매하는 효소이면 어느 것이나 가능하며, GDH(glutamate dehydrogenase), ADH(alcohol dehydrogenase), G6PDH(glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH(lactic dehydrogenase), MDH(malate dehydrogenase) 및 SDH(succinic dehydrogenase) 등일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 프로플라빈을 이용한 광화학적 NADH 재생

광화학적 방법에 의하여 NADH를 재생하기 위하여, 인공 광원과 이로부터 빛을 조사받을 수 있는 석영 반응기를 제작하였다. 인공 광원으로는 450W의 출력을 갖는 제논 램프를 사용하였고, 특히 가시광 영역의 빛을 조사하기 위해 420nm 이하의 파장을 갖는 빛을 걸러내는 필터(모델 66924, Oriel USA)를 장착하였다. NADH 생성의 전자 매개체인 로듐 (III) 복합체 M(M=Cp*Rh(bpy)H₂0]⁺)은 250μM의 농도로 사용하였고, 빛을 흡수해 산화환원반응에 활성을 갖는 촉매로 사용된 프로플라빈은 10μM의 농도로 사용하였으며, NAD⁺는 1mM의 농도로 사용하였다. 전해질로는 인산염 버퍼 용액(100mM, pH 7.0)을 사용하였고, 상기 버퍼에 15% w/v의 TEOA, M, 프로플라빈 및 NAD⁺를 첨가하고 교반하여 용해시킨 후 빛을 조사하여 NAD⁺와 NADH의 농도를 각각 측정하였다.

그 결과, 1시간 동안 광화학적 NADH 재생 실험을 하였을 때, NADH의 재생 속도는 프로플라빈의 농도에 비례하였고, 초기 턴오버 주파수(initial turnover frequency) 및 최대 수득률(maximum yield)은 각각 127.8h^-1, 63.4%로 나타났다. 이와는 달리 빛이 조사되지 않은 상태에서는 NADH가 전혀 재생되지 않았고, 프로플라빈이 존재하지 않을 때도 NADH가 재생되지 않은 것으로 나타났다(도 2).

이처럼 빛의 존재는 광화학적 NADH 재생에 있어서 중요한 역할을 차지하지만, 지금까지의 연구에서는 입사광이 광화학적 NADH 재생에 미치는 영향에 대한 연구가 거의 없었다. 본 연구에서는 입사광 세기를 0~40mW/cm²로 변화시키면서 입사광이 미치는 영향을 관찰해 보았으며, 표 1에서 보듯이 입사광의 세기가 셀수록, 즉 광자의 개수가 많아질수록, NADH 재생 효율이 증가하는 것으로 나타났다.

입사광의 파장 및 세기가 광화학적 NADH 재생에 미치는 영향

		광감응제의 턴오버 주파수(h-1)	광감응제의 턴오버수
입사광(LEDs)의 파장	Blue LED	31.8	13.8
	Green LED	3.0	1.2
	Red LED	0.0	0.0
입사광(Xe 램프)의 세기	40mW/cm2	127.8	63.4
	20mW/cm2	97.2	43.2
	10mW/cm2	49.2	21.5
	0mW/cm2	0.0	0.0

실시예 2: 입사광의 파장에 따른 광화학적 NADH 재생

입사광의 파장이 광화학적 NADH 재생에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 서로 다른 방출 파장을 가진 3종류의 LED(NSPB346KS/NSPG346KS/NSPR346KS, Nichia, Japan)를 광원으로 사용하였다. 이때 LED 입사광의 세기는 각각 1.0 mW/cm²으로 고정하였다. 10μM의 프로플라빈, 1mM의 NAD⁺, 250mM의 로듐 (III) 복합체M을 15% w/v TEOA를 함유하는 인산염 버퍼(100mM, pH 7.0)에 첨가하여 상기 광원을 조사하였다.

그 결과 Blue LED와 Green LED를 사용하였을 때는 초기 턴오버 주파수가 각각 31.8 h^-1, 3.0 h^-1로 나타난 것에 비하여, Red LED를 광원으로 사용하였을 경우 NADH가 전혀 재생되지 않았다(표 1). 이러한 차이가 나타나게 된 원인은 각각의 LED가 방출하는 광자의 에너지가 다르기 때문인 것으로 추측된다. 프로플라빈은 2.36 eV 이상의 에너지를 가진 광자만을 흡수할 수 있는데, Blue, Green, Red LED에서 방출하는 광자는 각각 2.34~2.95 eV, 2.07~2.70 eV, 1.84~2.16 eV 사이의 에너지를 가진다. 따라서 프로플라빈은 Red나 Green LED에서 나오는 광자보다는 Blue LED에서 나오는 광자를 흡수할 가능성이 상대적으로 높다(도 3). 즉 프로플라빈의 흡수 스펙트럼은 Blue LED의 방출 스펙트럼과 가장 많이 겹친다.

실시예 3: 생촉매 광합성

프로플라빈을 사용하여 광화학적으로 재생된 효소 활성이 있는(enzymatically active) NADH를 산화환원반응에 사용하기 위하여, L-글루타메이트 디하이드로게네이즈(L-glutamate dehydrogenase, GDH)에 대한 광효소 반응을 프로플라빈, 0.2 mM의 NAD⁺, 500 μM의 복합체 M(Cp*Rh(bpy)H₂0]⁺), 10mM의 α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate), 100 mM의 황산 암모늄, 40 U의 GDH 및 15% w/v의 TEOA를 함유하고 있는 인산염 버퍼에서 실행하였다.

그 결과, 프로플라빈과 M이 함께 있을 때에는 α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)에서 L-글루타메이트(L-glutamate)로 전환이 이루어졌으며, 프로플라빈이 2μM일 때 12.5%, 10μM일 때는 65.3%로 증가하였다(도 4). 이에 반해 프로플라빈이나 M 둘 중 하나라도 없으면, L-글루타메이트는 생성되지 않았다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

1. (i) NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ 및 FMN⁺으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 옥시도리덕타제 보조인자; (ii) 프로플라빈; (iii) 희생전자 주개; 및 (iv) 전자 매개체를 함유하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용액에 빛을 조사하는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 희생전자주개는 트리에탄올아민(Triethanolamine, TEOA), 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 시트르산(Citric acid), 개미산(Formic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 옥살산(Oxalic acid), 알코올 류 및 물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 빛은 텅스텐-할로겐 램프광, 제논 램프광, LED, 단파장 레이저광 및 태양광으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 전자 매개체는 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 루테늄 II 복합체는 (헥사메틸벤젠-2,2'-비피리딘클로로)루테늄(II)인 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 로듐 III 복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III)인 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 광화학적 재생방법.
7. (i) NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ 및 FMN⁺으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 옥시도리덕타제 보조인자; (ii) 프로플라빈; (iii) 희생전자 주개; 및 (iv) 전자 매개체를 함유하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 희생전자주개는 트리에탄올아민(Triethanolamine, TEOA), 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 시트르산(Citric acid), 개미산(Formic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 옥살산(Oxalic acid), 알코올 및 물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 전자 매개체는 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용 조성물.
10. 제 8항에 있어서, 상기 루테늄 II 복합체는 (헥사메틸벤젠-2,2'-비피리딘클로로)루테늄(II)인 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용 조성물.
11. 제 8항에 있어서, 상기 로듐 III 복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III)인 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용 조성물.
12. (i) NAD⁺; (ii) 프로플라빈; (iii) 트리에탄올아민 및 (iv) 로듐 (III) 복합체를 함유하는 옥시도리덕타제 보조인자 재생용 조성물.
13. 다음 단계를 포함하는 프로플라빈을 이용한 인공광합성 방법:
    (a) (i) NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ 및 FMN⁺으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 보조인자, (ii) 프로플라빈 (iii) 희생전자 주개 및 (iv) 전자 매개체를 함유하는 재생용액에 빛을 조사하여 보조인자를 광학적으로 재생하는 단계; 및
    (b) 상기 재생된 보조인자를 산화환원효소 반응에 사용하여 상기 산화환원효소반응에 의해 생성되는 유용물질을 제조하는 단계.
14. 제 13항에 있어서, 상기 희생전자 주개는 트리에탄올아민(Triethanolamine, TEOA), 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 시트르산(Citric acid), 개미산(Formic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 옥살산(Oxalic acid), 알코올 및 물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인공광합성 방법.
15. 제 13항에 있어서, 상기 전자 매개체는 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인공광합성 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 루테늄 II 복합체는 (헥사메틸벤젠-2,2'-비피리딘클로로)루테늄(II)인 것을 특징으로 하는 인공광합성 방법.
17. 제 15항에 있어서, 상기 로듐 III 복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III)인 것을 특징으로 하는 인공광합성 방법.
18. 제 13항에 있어서, 상기 산화환원효소는 GDH(glutamate dehydrogenase), ADH(Alcohol dehydrogenase), G6PDH(glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH(lactic dehydrogenase), MDH(malate dehydrogenase), SDH(succinic dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인공광합성 방법.

Images