KR20130107583A

KR20130107583A - 혈중종양세포 진단용 조성물 및 이를 이용한 혈중종양세포 검출방법

Info

Publication number: KR20130107583A
Application number: KR1020120029486A
Authority: KR
Inventors: 김학성; 민혜근; 조성민
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2013-10-02
Also published as: KR101355176B1

Abstract

본 발명은 빠르고 효율적인 혈중종양세포의 포획 및 검출을 위한 나노입자-자성비드 결합 플랫폼에 관한 것으로, 상세하게 종양세포를 표적화 할 수 있는 일차 항체가 매달려 있는 나노입자를 혈중종양세포의 수용체에 표적화한 후 일차 항체를 표적화하는 이차 항체가 단백질이 달린 자성 비드를 나노입자에 결합 시켜 자석으로 혈중종양세포를 분리하는 특징이 있다.
본 발명에 따른 혈중종양세포의 분리 방법은 수십 나노미터 크기의 작은 나노입자를 이용하여 표적 효율을 높이고 자성비드를 이용하여 혈액 세포에 대한 비 특이적 결합을 획기적으로 줄이면서 종양세포만 빠르게 분리할 수 있는 장점이 있다.

Description

혈중종양세포 진단용 조성물 및 이를 이용한 혈중종양세포 검출방법 {Composition for Diagnosing Circulating Tumor Cells and Method for Detecting Circulating Tumor Cells Using the Same}

본 발명은 혈중종양세포 진단용 조성물 및 이를 이용한 혈중종양세포 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자 및 상기 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 포함하는 혈중종양세포 진단용 조성물 및 이를 이용한 혈중종양세포 검출방법에 관한 것이다.

최근 종양에서 떨어져 나온 상피세포인 혈중종양세포(circulating tumor cell: CTC)를 검출하여 전이성 암을 조기 진단하거나 암 치료의 결과를 모니터링 하는 연구가 증가하고 있다(World J. Surg. Oncol., 3, 18, 2005; Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 42, 155, 2005; Breast Cancer Res. Treat., 86, 237, 2004).

환자의 혈액 내에서 혈중종양세포는 1 CTC / 10⁹ 혈액세포 정도로 극히 적은 농도로 존재하므로, 이를 효율적으로 포획하여 검출하는 데에는 많은 어려움이 있었다. 그러나 혈중종양세포를 이용하여 암의 전이나 치료의 결과를 모니터링 하는 것은 직접 체내에서 암 조직을 떼어내는 것과 같은 생검(biopsy)을 하지 않아도 되는 장점이 있는데, 이러한 방법은 특히 조직검사가 어려운 폐암 환자에게서는 절대적으로 유리한 방법이라 할 수 있다.

현재까지 개발된 혈중종양세포의 분리 방법은 대부분 상피세포에 특이적으로 발현되는 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)을 표적하는 방법이 대표적이다.

첫 번째 플랫폼은 셀서치 테크놀로지(CellSearch Technology)에서 개발된 면역자성 기반 플랫폼으로 자성 나노입자를 이용하여 혈중종양세포를 분리하는 방법으로, 유일하게 FDA에서 승인되어 상용화 된 제품이다(Cancer Res., 13, 920, 2007). 이는 120-200 nm 크기의 자성 나노입자를 다중(multi)으로 세포에 결합시켜 자석으로 분리시키는 방법으로, 혈액 세포에 비 특이적으로 결합하는 나노입자의 수도 함께 증가시키기 때문에 순도가 낮다는 단점이 있다.

두 번째 플랫폼은 Sunitha Nagrath와 Lecia V. Sequist가 제안한 anti-EpCAM이 달려있는 마이크로유체(microfluidic) 장치를 이용한 방법으로 현재 까지는 50%에 이르는 가장 높은 순도를 보여주고 있다(Nature, 450, 1235, 2007). 하지만, 2.5 mL/h의 낮은 혈류량 (blood flow rate)으로 전체 혈액 시료의 검사 시간이 긴 단점이 있다.

세 번째 플랫폼은 Hengyi Xu와 Andrew Wang이 최근에 발표한 anti-HER2 (e.g. herceptin)가 달려있는 30nm 크기의 자성나노입자를 이용하여 혈액내의 300개 정도의 암세포를 평균 효율 73.6 %로 분리해 낸 것이 있다(Biomaterials, 32, 9758, 2011). 크기가 작은 나노입자를 사용하여 포획 효율은 높였지만 반대로 크기가 작은 자성나노입자를 자석으로 분리하는데 1시간 정도의 긴 시간이 필요하며 이 동안 나노입자의 특성상 혈액세포에도 충분한 양이 흡수될 수 있기 때문에 분리 후에는 역시 낮은 순도가 예상된다.

이 외 물리적인 혈중종양세포의 분리 방법으로는 세포 크기 배제(size exclusion) 방법이 있다(Am J Pathol., 156, 57, 2000). 최근에 보고된 마이크로필터를 이용한 플랫폼은 5 ~ 8μm 크기의 필터를 이용하여 비교적 크기가 큰 10 ~ 15μm의 종양세포를 분리하는 것으로 수율은 90%까지 높일 수 있지만 순도가 0.025% 이하로 매우 낮은 단점이 있다(Cancer Res. 70, 6420, 2010).

따라서 혈액 내에 적은 농도로 존재하는 혈중종양세포를 효율적으로 포획하고, 혈액 세포와의 비 특이적 결합을 최소로 하여 높은 순도로 분리해내는 방법을 개발하는 것은 새로운 전이성 암을 조기에 진단하고 치료의 결과를 모니터링 하는 데 있어 정확성을 높일 수 있는 획기적인 방법이 될 것이다. 그러나 현재까지 상용화된 혈중종양세포 진단 제품은 아직 그 수가 많지 않고, 효율과 순도 및 분리 시간에서 상용화되기까지 해결되어야 할 과제가 여전히 남아 있는 상태이다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자를 이용하여 혈중종양세포(CTC)를 표적화한 후, 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 결합시키면 빠르고 효율적이며 비 특이적 결합을 최소화 하여 높은 순도로 혈중종양세포를 포획할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 혈중종양세포를 효율적으로 포획하여 조기에 전이성 암을 진단할 수 있는 혈중종양세포 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 혈중종양세포의 포획 효율을 높이고 혈액 세포에 대한 비 특이적 결합을 최소화하여 순도를 높일 수 있는 혈중종양세포 검출방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자; 및 상기 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 포함하는 혈중종양세포 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 혈중종양세포를 함유하는 시료에 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자를 반응시키는 단계; (b) 상기 혈중종양세포를 함유하는 시료와 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자의 반응액을 원심분리 하여, 미 반응된 나노입자를 제거하는 단계; (c) 완충용액과 상기 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 첨가하는 단계; 및 (d) 자석으로 혈중종양세포 및 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드와 결합된 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자를 분리하는 단계를 포함하는 혈중종양세포의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자; 및 상기 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 포함하는 혈중종양세포 진단용 조성물을 이용할 경우, 기존의 혈중종양세포 포획 방법에 비해 더 빠르고 효율적이며 높은 순도로 혈중종양세포를 포획하여 검출할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 1차 항체가 결합되어 있는 나노입자와 2차 항체가 결합되어 있는 자성비드를 이용하여 혈중종양세포를 포획하는 것에 대한 설명도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 혈중종양세포를 검출하는 순서도이다.
도 3은 SKOV3 세포의 주사전자현미경(SEM)과 공초점현미경의 이미지이다(a: 15nm 크기의 자성나노입자(MNP)를 세포 표면에 1차로 결합시킨 후, 1μm 크기의 자성 비드를 표적한 이미지, b: 나노입자 없이 자성 비드만 표적한 세포 이미지).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 15nm 크기의 자성나노입자가 표면에 결합된 SKOV3 세포의 bio-TEM 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 Anti-HER2-MNP+anti-IgG-MB 플랫폼으로 SKBR3 세포를 포획한 후 측정한 recovery %와 purity %이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 Anti-HER2-QD+Anti-IgG-MB 플랫폼으로 포획한 PC9-GFP 세포를 haemocytometer에 올려놓고 측정한 현미경 이미지이다(a:위상차 이미지, b:형광 이미지).

본 발명에서는 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자를 이용하여 혈중종양세포(CTC)를 표적화한 후, 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 결합시키면 빠르고 효율적이며 높은 순도로 혈중종양세포를 포획할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자를 이용하여 혈중종양세포(CTC)를 표적한 후, 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 결합시킨 다음 자석으로 자성비드를 분리하였다. 그 결과 혈중종양세포를 검출할 수 있음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 (ⅰ) anti-HER2에 해당하는 허셉틴(herceptin) 또는 anti-EpCAM이 결합된 15nm 직경의 아연-산화철 나노입자 또는 4 nm 직경의 CdSe/ZnS 양자점 (QD630) 및 anti-IgG가 결합된 1 μm 또는 300 nm 자성비드를 제조한 다음, (ⅱ) SKBR3(또는 PC9-GFP) 등의 혈중종양세포를 함유하는 시료에 허셉틴이 결합된 아연-산화철 나노입자 또는 anti-EpCAM이 결합된 양자점을 반응시키고, (ⅲ) 반응액을 원심분리하여, 미반응된 나노입자를 제거시킨 다음, (ⅳ) 완충용액과 anti-IgG가 결합된 자성비드를 첨가시킬 경우, (ⅴ) 자석으로 SKBR3, PC9-GFP 등의 혈중종양세포 및 anti-IgG가 결합된 자성비드와 결합된 나노입자를 분리할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명에 따른 1차 항체가 결합되어 있는 나노입자와 2차 항체가 결합되어 있는 자성비드를 이용하여 혈중종양세포를 포획하는 것에 대한 설명도이다.

도 1에 나타난 바와 같이, 혈중종양세포(CTC)에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자가 결합되어 있고, 1차 항체와 결합할 수 있는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드가 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자와 결합되어 있으므로, 결과적으로 자석(magnet)으로 혈중종양세포(CTC)를 분리할 수 있다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자; 및 상기 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 포함하는 혈중종양세포 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 혈중종양세포는 혈중에 존재하는 종양세포로서 그 종류는 특별히 제한되지 않으나, 그에 해당하는 암세포 모델로는 폐암세포주(A549, H1975, H460, PC9, H358), 난소암세포주(SKOV3), 자궁경부암세포주(HeLa), 흑색소 피부암세포주(SKMEL-2, A375), 중추신경계암세포주(XF498), 결장암세포주(HCT15) 유방암세포주(SKBR3, BT474, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-453, HCC827), 전립선암세포주(PC3), 방광암세포주(T24), 간암세포주(HepG2), 위암세포주(NCI-N87), 뇌종양세포주(U87MG) 등을 예시할 수 있다.

상기 1차 항체는 상기 혈중종양세포 에서 발현되는 항원과 특이적으로 결합되는 항체로서, 혈중종양세포와 결합할 수 있는 것이라면 특별한 제한 없이 이용할 수 있으며, anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule (anti-EpCAM), anti-Epidermal Growth Factor Receptor(anti-EGFR), anti-Human Epidermal Recpetor 2(anti-HER2), anti-Vascular Endothelial Growth Factor (anti-VEGFR), anti-folate receptor, anti-CD87, anti-integrin 및 anti-Prostate Specific Membrane Antigen(anti-PSMA) 등을 예시할 수 있다. 혈중종양세포에 발현되는 표적분자의 경우 암의 종류, 환자 개개인, 그리고 혈중종양세포의 종류에 따라 발현의 여부 및 발현량의 차이가 개별적으로 다르므로 각각의 혈중종양세포에 적합한 1차 항체를 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 나노입자는 자성 나노입자, 양자점 나노입자, 금 나노입자, 은 나노입자, 실리카 나노입자, 고분자 나노입자 등을 이용할 수 있으며, 상기 나노입자의 직경은 특별히 제한을 두지 않지만, 효율면에 있어서는 수나노미터에서 수십나노미터로 크기가 작은 나노입자를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 고분자 나노입자로는 polymethyl methacrylate(PMMA), dendrimer, polymer-siRNA 나노입자 등을 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자는 특별한 제한없이 통상적으로 나노입자에 항체를 부착시키는 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 예를들면 1차 항체를 싸이올 기로 수식시키고, 나노입자를 말레이미드로 수식시킨 후, 0~37℃에서 1~48시간 동안 완충용액에서 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

상기 말레이미드로 나노입자를 수식시키는 것은 나노입자 표면에 있는 최초 리간드의 종류에 따라 말레이미드로 나노입자를 직접 수식하거나 연결자를 이용하여 수식할 수 있다. 상기 나노 입자를 말레이미드로 수식하는데 사용될 수 있는 연결자로는 Sulfo-SMCC( sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)), N-숙시니미딜 4-말레마이도부틸레이트(N-succinimidyl 4-maleimidobutyrate), NHS-PEG-maleimide(N-hydroxysuccinimide-PEG-maleimide) 등을 예시 할 수 있다.

또한, 나노입자의 비 특이적 결합을 최소화하기 위해 PEG(폴리에틸렌 글라이콜: polyethylene glycol)을 나노입자 표면에 코팅시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 DSPE-PEG₂₀₀₀-methoxy, DSPE-PEG₃₄₀₀-maleimide, DSPE-PEG₂₀₀₀-amine 등의 화합물을 이용하여 나노입자의 표면 PEG로 코팅시키면서 필요한 작용기들을 수식할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 2차 항체는 상기 혈중종양세포와 특이적으로 결합되는 항체로써, 1차 항체와 결합할 수 있는 것이라면 특별한 제한 없이 이용할 수 있으며, anti-IgG, protein A, protein G, 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidin) 등을 예시할 수 있다. Anti-IgG는 1차 항체의 기원에 따라 선택적으로 인식하여 결합하고, protein A와 protein G는 1차 항체의 특정 부위를 인식하여 결합하며, 스트렙타비딘과 아비딘은 일부 항체에 표식된 비오틴(biotin)을 인식하여 특이적으로 결합한다.

본 발명에 있어서, 상기 자성비드는 자성을 가지고 있는 것이라면 제한 없이 이용할 수 있으나, 비드의 크기가 100nm ~ 1μm인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비드의 크기가 100nm 미만인 경우 분리시간이 길어지는 문제가 있고, 1μm를 초과할 경우 비드의 자기력이 커지므로 비록 적은 수의 비드가 혈액 세포에 비 특이적 결합을 하더라도 혈중암세포에 비해 상대적으로 크기가 작은 혈액 세포는 충분히 자석으로 분리될 수가 있어 순도를 낮추는 효과가 있다.

상기 자성비드는 2차 항체와의 결합을 위해 그 표면에 아민기, 카르복시기, NHS(N-hydroxyl succinimide)기, 스트렙타비딘(streptavidin)기 등의 작용기를 가지고 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드는 특별한 제한없이 통상적으로 자성비드에 항체를 부착시키는 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 예를들면 NHS기-아민기, 또는 스트렙타비딘-비오틴 반응성을 이용하여 0~37℃에서 30분~18시간 동안 완충용액에서 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 즉, NHS기가 코팅된 자성비드는 아민기를 가지는 2차 항체와, 스트렙타비딘이 코팅된 자성비드는 비오틴을 수식한 항체와 반응시킴으로써 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 제작할 수 있다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 혈중종양세포를 검출하는 순서도이다.

도 2에 도시된 바와 같이, 혈중종양세포를 함유하는 시료에 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자(anti-HER2-NP 또는 anti-EpCAM-NP)를 첨가하여 반응시키고, 원심분리를 수행하여 반응하지 않은 나노입자를 제거하고, 다시 완충용액과 함께 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드(anti-IgG-MB)를 첨가하여 반응시키면 자석을 이용하여 혈중종양세포+Anti-HER2-NP+Anti-IgG-MB 또는 혈중종양세포+Anti-EpCAM-NP+Anti-IgG-MB 복합체를 분리할 수 있다. 자석으로 분리된 혈중종양세포 또는 미처 반응이 이루어지지 않아 자석으로 분리되지 않은 혈중종양세포는 면역 형광염색을 한 다음 형광 현미경으로 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 혈중종양세포를 함유하는 시료에 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자를 반응시키는 단계; (b) 상기 혈중종양세포를 함유하는 시료와 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자의 반응액을 원심분리하여, 미반응된 나노입자를 제거하는 단계; (c) 완충용액과 상기 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 첨가하는 단계; 및 (d) 자석으로 혈중종양세포 및 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드와 결합된 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자를 분리하는 단계를 포함하는 혈중종양세포의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 혈중종양세포의 검출방법은 필요에 따라 혈중종양세포를 염색하고, 현미경으로 관찰하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 양자점 나노입자를 이용할 경우 양자점의 형광을 관찰할 수 있으므로 혈중종양세포를 염색하는 단계 없이 관찰이 가능하다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 1차 항체가 결합된 나노입자 제작

실시예 1-1: 허셉틴이 결합된 15nm 직경의 아연-산화철 나노입자의 제작

1.2mg의 허셉틴(Roche, Swiss)을 0.5 mL의 멸균 증류수에 녹인 후, 이 용액을 10mM 농도의 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid; HEPES) 완충용액으로 평형화된 덱스트란 재질의 탈염 칼럼으로 정제하여 허셉틴 제형에 포함된 저분자 이물질을 제거 하였다.

이후, 정제된 허셉틴 용액에 3μg의 N-숙시니미딜 S-아세틸티오아세테이트(N-succinimidyl S-acetylthioacetate; SATA)와 10μL의 디메틸설폭시화물을 넣고 상온에서 45분간 반응시켜 싸이올기를 수식화시켰다. 반응 후, 탈아세틸화(deacetylation) 반응으로 허셉틴의 싸이올기를 자유화시키기 위하여, 0.5M 농도의 수산화아민·염산(hydroxylamineㅇHCl)용액 100μL를 첨가하고, 2시간동안 추가로 반응시켰다. 반응 후, 반응액을 탈염 칼럼으로 정제하여 미 반응된 N-숙시니미딜 S-아세틸티오아세테이트(N-succinimidyl S-acetylthioacetate; SATA)와 수산화아민·염산, 그리고 부산물을 제거시켜 0.5 mL의 허셉틴 용액을 얻었다. 이렇게 싸이올기가 수식된 항체는 말레이미드(maleimide)기와 공유결합을 형성하는 반응을 할 수 있다.

15nm 직경의 아연-산화철 나노입자(연세대학교 화학과 나노화학 연구실로부터 제공받음) 1mg, DSPE-PEG₂₀₀₀-methoxy (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], ammonium salt)(Avanti Polar Lipid, USA) 1.36mg, DSPE-PEG₃₄₀₀-maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-3400])(Nanocs, USA) 0.23mg을 클로로포름 1mL에 녹이고, 25 mL 둥근바닥 플라스크에 넣은 후 진공 오븐에 넣은 후 감압 하에서 2시간동안 건조하여 클로로포름을 제거하였다. 그런 다음, 2mL의 증류수를 첨가하여 분산시키고, 초음파 균질기를 이용하여 10분간 균질화시켰다. 균질화 된 용액을 1시간 동안 아닐링(annealing)시켜 아연-산화철 나노입자 표면을 PEG-말레이미드기와 PEG-메톡시기를 1:4 비율로 수식화하였다. 그 후, 분획분자량 100,000 달톤을 가지는 원심분리필터를 이용하여 3500rpm에서 15분씩 6회간 반복 세척하여 자유 마이셀과 아연-산화철 나노입자 표면에 흡착하지 않은 물질들을 제거한 후 증류수 0.5mL에 재 분산하였다.

획득된 아연-산화철 나노입자 0.5mL 용액과 위에서 정제된 허셉틴 0.5mL 용액을 10mM HEPES 완충용액 2mL에 넣고 4℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응 후 분획분자량 100,000 달톤의 원심분리필터를 이용하여 부피를 0.5mL로 낮춘 후 세파크릴-S300 레진이 충진 된 1.3 × 26cm 의 컬럼을 통과시켜 미 반응된 허셉틴과 부산물을 제거하고, 최종 농도 2mg/mL이 되도록 허셉틴이 결합된 15nm 직경의 아연-산화철 나노입자를 제작하였다.

실시예 1-2: anti-EpCAM이 결합된 4nm 직경의 양자점 제작

0.5mg의 옥타데실아민(octadecylamine)으로 코팅된 CdSe/ZnS 양자점, QD630(Ocean Nanotech, USA)을 DSPE-PEG₂₀₀₀-methoxy(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], ammonium salt) 5mg, DSPE-PEG₂₀₀₀-amine(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000], ammonium salt) 5 mg과 함께 클로로포름 1 mL에 넣고 25mL 둥근바닥 플라스크에 넣은 후 감압 하에서 2시간 동안 건조하여 클로로포름을 제거하였다. 그런 다음, 1mL의 증류수를 첨가하여, 초음파 균질기를 이용하여 10분간 균질화시키고 상온에서 1시간 동안 아닐링(annealing)시켜, 양자점 표면을 PEG-amine과 PEG-methoxy 를 1:1 비율로 수식화하였다. 그 후, 분획분자량 100,000 달톤을 가지는 원심분리필터를 이용하여 3500rpm에서 15분씩 6회 세척하여 자유 마이셀과 양자점 표면에 흡착하지 않은 물질들을 제거하였다. 아민기를 다시 말레이미드기로 수식화 하기 위해 0.1mg의 Sulfo-SMCC( sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)를 양자점 용액에 넣고 1시간동안 상온에서 반응 시킨 후 분획분자량 100,000 달톤을 가지는 원심분리필터를 이용하여 3500rpm에서 15분씩 6회간 반복 세척하여 양자점 표면에 반응하지 않은 연결자를 모두 제거하였다.

상기 방법으로 연결자를 반응시킨 양자점 용액에 실시예 1-1과 동일한 방법으로 제조된 싸이올을 작용기로 가진 anti-EpCAM(R&D systems, Minneapolis, MN) 0.5mg을 넣고, 4℃에서 20시간동안 인산완충 식염수에서 반응시켰다. 이때 최종 반응 부피는 3mL이 되도록 하였다. 반응이 끝난 후 분획분자량 300,000 달톤의 원심분리필터를 이용하여 3500rpm에서 6회간 반복 세척하여 미반응된 anti-EpCAM과 부산물을 제거하고, 양자점의 최종 농도가 1mg/mL인 anti-EpCAM이 결합된 양자점(Anti-EpCAM-QD)을 제작하였다.

실시예 2: anti-IgG가 결합된 자성비드 제작

2-1: anti-IgG가 결합된 1μm의 자성비드 제작

NHS(N-hydroxyl succinimide)가 표면에 활성화된 1μm 직경의 자성 비드(Bioclone Inc, USA) 10mg을 2mL 튜브에 넣고, 1mL의 10mM 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 0.15M 소듐 클로라이드(NaCl)가 들어있는 pH 5.5의 결합 완충용액을 넣고 혼합 후 자석 분리기에 1~2분 놓아 두어 자성비드를 모으고 상청액을 버려 자성비드를 세척하였다. 자성 비드만 남아있는 튜브에 탈염 정제된 200μg/mL의 anti-mouse IgG (Sigma-Aldrich, USA)를 1mL씩 넣고 혼합 후, 4℃에서 18시간동안 교반시켰다. 교반 후, anti-IgG가 결합되어 있는 자성 비드를 자석 분리기로 분리하고, 0.5M NaCl이 들어있는 0.05M Tris-HCl 용액(pH 8.0)으로 3~4회 세척한 후, 1M의 에탄올아민(ethanolamine, pH 9) 용액 1mL에서 1시간 동안 반응시켜 자성 비드 표면에 남아 있는 NHS기를 차단(blocking) 시켰다. 반응 후, 위의 세척 방법과 동일한 방법으로 3~4회 세척한 후, 0.1% BSA가 들어있는 PBS 완충용액 1mL에 분산시켰다.

2-2: anti-IgG가 결합된 300nm의 자성비드 제작

스트렙타비딘(streptavidin)이 코팅된 300nm 자성 비드(Ademtech, France) 5mg/mL을 2mL 튜브에 넣고, 자석분리기에 1~2분 놓아 두어 자성비드를 모으고 상청액을 버려 세척하였다. 남은 자성비드는 PBS (photassium buffered saline) 용액 1mL로 재부유(resuspension) 한 후 자석분리기를 이용하여 2번 세척하였다.

탈염 정제된 200μg/mL의 anti-mouse IgG (Sigma-Aldrich, USA) 1mL에 EZ-link NHS-PEG₄-biotin(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)을 넣고 혼합 후, 상온에서 1시간 동안 교반시켰다. 교반 후, 탈염 정제하여 anti-mouse IgG에 결합하지 않은 자유 EZ-link NHS-PEG₄-biotin을 제거하였다. 비오틴이 부착된 anti-mouse IgG를 스트렙타비딘으로 코팅된 300nm 자성 비드와 1mL PBS 완충용액에 혼합한 후, 상온에서 1시간 동안 교반시켰다. 교반 후, anti-IgG가 최종 결합되어 있는 자성 비드를 자석 분리기로 분리하고, PBS 완충용액으로 4~5회 세척한 후, storage buffer(Thermo Fisher Scientific Inc., USA) 1mL에 분산시켰다.

실험예 1: 혈중종양세포(SKOV3)의 검출

HER2 양성의 SKOV3(ATCC, Manassas, VA) 세포를 RPMI 1640, 10% FBS 배지가 들어 있는 T-플라스크에 넣고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 계대 배양하였다.

실시예 1-2에서 제작된 허셉틴이 결합된 2mg/mL의 15nm 직경의 아연-산화철 나노입자(MNP) 10μL를 상기 혈중종양세포(SKOV3)가 10⁵~10⁶있는 용액 1mL에 넣고 10분간 반응시키고, 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리 시켰다. 원심분리 후, 혈중종양세포(SKOV3)와 결합되지 않은 허셉틴이 결합된 아연-산화철 나노입자가 남아 있는 용액을 제거하고, DPBS 완충용액 1mL를 넣어 세포를 재부유시키고, 실시예 2-1에서 제작된 anti-IgG가 결합된 1μm 직경의 자성비드 10mg/mL을 30μL 넣고 10분간 반응시켰다. 반응 후, 자석분리기에 1~2분 놓아 두어 혈중종양세포(SKOV3)+Anti-HER2(e.g. 허셉틴)-MNP+Anti-IgG-MB 복합체를 분리하였다.

또한, 1um 직경의 자성비드에 실시예 2-1에서 제작한 방법으로 anti-IgG 대신 anti-HER2(e.g. 허셉틴)를 부착시켜 혈중종양세포(SKOV3)가 10⁵~10⁶있는 현탁액 1mL에 10mg/mL을 30μL 넣고 10분간 반응시킨 후, 바로 자석분리기로 혈중종양세포 (SKOV3)+Anti-HER2(e.g. 허셉틴)-MB 복합체를 분리하였다.

혈중종양세포(SKOV3)의 분리 여부를 확인하여 위하여, 혈중종양세포(SKOV3)+Anti-HER2(e.g. 허셉틴)-MNP+Anti-IgG-MB 복합체 및 혈중종양세포 (SKOV3)+Anti-HER2(e.g. 허셉틴)-MB 복합체를 SEM으로 관찰하고 DAPI(4'-6-Diamidino-2-phenylindole, Invitrogen, Co., USA)로 염색시킨 후 공초점현미경으로도 관찰하였다(도 3).

도 3에 나타난 바와 같이, 허셉틴이 결합된 아연-산화철 나노입자를 혈중종양세포(SKOV3) 표면에 일차로 결합시킨 후, anti-IgG가 결합된 자성비드로 표적한 경우에는 세포 하나에 여러 개의 자성비드가 표적된 반면(3a), 허셉틴이 결합된 1um 자성 비드만 표적한 경우는 1~2개의 자성 비드만이 세포에 표적되어 있음을 확인할 수 있었다.(3b)

또한, 혈중종양세포(SKOV3)+Anti-HER2(e.g. 허셉틴)-MNP 복합체를 bio-TEM으로 관찰하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 혈중종양세포(SKOV3) 표면에는 허셉틴이 결합된 15nm 직경의 아연-산화철 나노입자가 수 백 nm의 간격으로 결합되어 있어, 형태학적 특성상 자성비드가 세포 표면에 촘촘히 돋아있는 수용체(HER2)를 직접 표적하는 것보다 높은 효율로 세포를 표적할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2: 혈중종양세포(SKBR3)의 검출

HER2 양성의 SKBR3(Samsung Medical Center, Korea) 세포와 HER2 음성의 PC9-GFP(PC9-녹색 형광 단백질; Samsung Medical Center, Korea)를 RPMI 1640, 10% FBS 배지가 들어 있는 T-플라스크에 넣고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 계대 배양하였다.

먼저 HER2 양성의 혈중종양세포(SKBR3)와 음성의 PC9-GFP 세포를 1:9로 혼합한 후 실시예 1에서 제작된 2mg/mL 농도의 허셉틴이 결합된 아연-산화철 나노입자 5μL를 총 세포의 수가 10⁵~10⁶있는 용액 1mL에 넣고 10분간 반응시키고, 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리 시켰다. 원심분리 후, 혈중종양세포(SKBR3)나 PC9-GFP와 결합되지 않은 아연-산화철 나노입자가 남아 있는 용액을 제거하고, DPBS 완충용액 1 mL를 넣어 세포를 재부유(resuspension)시키고, 실시예 2-2에서 제작된 anti-IgG가 결합된 300nm 자성비드 5mg/mL을 10μL 넣고 10분간 반응시켰다. 반응 후, 자석분리기에 1~2분 놓아 두어 혈중종양세포(SKBR3)+anti-HER2(e.g. 허셉틴)-MNP+Anti-IgG-MB 복합체를 분리하였다. 자석으로 분리된 세포를 DPBS 완충용액 1mL에 재분산 시킨 후 일회용 haemocytometer(Invitrogen Co., USA)에 10μL 넣은 후 위에 현미경으로 세포의 수를 세고 다시 형광현미경으로 녹색 형광 단백질이 들어있는 음성의 PC9-GFP 세포를 센 후 빼 주어 분리된 혈중종양세포(SKBR3)의 수를 계산하고, recovery %와 purity %를 계산하였다.(도 5)

도 5에 나타난 바와 같이, 자성 비드의 양이 늘어나면 recovery %가 99.4 %까지 증가하고, purity %는 36 %로 일정함을 알 수 있었다.

실험예 3: 혈중종양세포(PC9-GFP)의 검출

EpCAM 양성의 PC9-GFP(Samsung Medical Center, Korea) 및 EpCAM 음성의 Jukat(백혈구 세포의 모델세포; ATCC, USA) 세포를 각각 RPMI 1640, 10% FBS 배지가 들어 있는 T-플라스크에 넣고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 계대 배양하였다.

먼저 EpCAM 양성의 PC9-GFP(Samsung Medical Center, Korea)와 음성의 Jukat(백혈구 세포의 모델세포; ATCC, USA) 세포를 1:3으로 혼합한 후 실시예 1-2에서 제작된 2mg/mL 농도의 anti-EpCAM이 결합된 4nm 직경의 양자점 5μL를 총 세포의 수가 10⁵~10⁶있는 용액 1mL에 넣고 10분간 반응시키고, 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리 시켰다. 원심분리 후, PC9-GFP나 Jurkat과 결합되지 않은 anti-EpCAM이 결합된 4nm 직경의 양자점이 남아 있는 용액을 제거하고, DPBS 완충용액 1 mL를 넣어 세포를 재부유시키고, 실시예 2-2에서 제작된 anti-IgG가 결합된 300nm 자성비드 5mg/mL을 10μL 넣고 10분간 반응시켰다. 반응 후, 자석분리기에 1~2분 놓아 두어 혈중종양세포(PC9-GFP)+Anti-EpCAM-QD+Anti-IgG-MB 복합체를 분리하였다.

혈중종양세포(PC9-GFP)의 분리 여부를 확인하여 위하여, 녹색 형광 단백질이 들어있는 혈중종양세포(PC9-GFP)+Anti-EpCAM-QD+Anti-IgG-MB 복합체를 1mL DPBS 완충용액에 재분산시킨 뒤 10μL를 일회용 haemocytometer에 올려놓고 형광현미경으로 관찰하였다(도 6).

도 6에 도시된 바와 같이, 포획된 세포 30개 중 녹색 형광을 보이는 것은 20개로 purity %가 66%임을 확인할 수 있었다.

비교예 1: 혈중종양세포의 검출

실험예 2 및 실험예 3과 동일한 방법으로 실험을 3회 수행하고, purity % 및 yield %를 산출한 다음 그 평균값을 하기 표 1에 나타내었다.

또한, 시중에서 판매하는 Cellsearch^TM system 및 Microchip, Microfilter, IO nanoparticle을 이용하여 혈중종양세포(SKBR3 등)를 검출하고, purity % 및 yield %를 산출한 다음 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

구 분	% Purity	% Yield
Anti-HER2-MNP+Anti-IgG-MB	36%	99.4%
Anti-EpCAM-QD+Anti-IgG-MB	66%	78%
Cellsearch^TM system	-	82%
Microchip	50%	65%
Microfilter	0.025%	90%
IO nanoparticle	-	73.6%

표 1에 나타난 바와 같이, 혈중종양세포의 종류, 항체의 종류 및 나노입자의 종류에 따라 purity %와 recovery %가 달라지는 것을 확인하였다. Anti-HER2-MNP+Anti-IgG-MB를 이용할 경우 % Yield가 매우 우수하였으며, Anti-EpCAM-QD+Anti-IgG-MB를 이용할 경우 % Purity 및 % Yield가 통상적으로 이용되는 방법에 비하여 우수하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자; 및
상기 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 포함하는 혈중종양세포 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혈중종양세포는 폐암세포주(A549, H1975, H460, PC9, H358), 난소암세포주(SKOV3), 자궁경부암세포주(HeLa), 흑색소 피부암세포주(SKMEL-2, A375), 중추신경계 암세포주(XF498), 결장암세포주(HCT15) 유방암세포주(SKBR3, BT474, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-453, HCC827), 전립선암세포주(PC3), 방광암세포주(T24), 간암세포주(HepG2), 위암세포주(NCI-N87) 및 뇌종양세포주(U87MG)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈중종양세포 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 1차 항체는 anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule (anti-EpCAM), anti-Epidermal Growth Factor Receptor(anti-EGFR), anti-Human Epidermal Recpetor 2(anti-HER2), anti-Vascular Endothelial Growth Factor (anti-VEGFR), anti-folate receptor, anti-CD87, anti-integrin 및 anti-Prostate Specific Membrane Antigen(anti-PSMA)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈중종양세포 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 나노입자는 자성 나노입자, 양자점 나노입자, 금 나노입자, 은 나노입자, 실리카 나노입자 및 고분자 나노입자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈중종양세포 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 2차 항체는 anti-IgG, protein A, protein G, 스트렙타비딘(streptavidin) 및 아비딘(avidin)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈중종양세포 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자성비드의 크기는 100nm ~ 1μm인 것을 특징으로 하는 혈중종양세포 진단용 조성물.
다음 단계를 포함하는 혈중종양세포의 검출방법:
(a) 혈중종양세포를 함유하는 시료에 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자를 반응시키는 단계;
(b) 상기 혈중종양세포를 함유하는 시료와 혈중종양세포에 특이적으로 결합하는 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자의 반응액을 원심분리하여, 미반응된 나노입자를 제거하는 단계;
(c) 완충용액과 상기 1차 항체와 결합하는 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드를 첨가하는 단계; 및
(d) 자석으로 혈중종양세포 및 2차 항체가 부착되어 있는 자성비드와 결합된 1차 항체가 부착되어 있는 나노입자를 분리하는 단계.
제7항에 있어서, 상기 혈중종양세포는 폐암세포주(A549, H1975, H460, PC9, H358), 난소암세포주(SKOV3), 자궁경부암세포주(HeLa), 흑색소 피부암세포주(SKMEL-2, A375), 중추신경계 암세포주(XF498), 결장암세포주(HCT15) 유방암세포주(SKBR3, BT474, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-453, HCC827), 전립선암세포주(PC3), 방광암세포주(T24), 간암세포주(HepG2), 위암세포주(NCI-N87) 및 뇌종양세포주(U87MG)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈중종양세포의 검출방법.
제7항에 있어서, 상기 1차 항체는 anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule (anti-EpCAM), anti-Epidermal Growth Factor Receptor(anti-EGFR), anti-Human Epidermal Recpetor 2(anti-HER2), anti-Vascular Endothelial Growth Factor (anti-VEGFR), anti-folate receptor, anti-CD87, anti-integrin 및 anti-Prostate Specific Membrane Antigen(anti-PSMA)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈중종양세포의 검출방법.
제7항에 있어서, 상기 나노입자는 자성 나노입자, 양자점 나노입자, 금 나노입자, 은 나노입자, 실리카 나노입자 및 고분자 나노입자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈중종양세포의 검출방법.
제7항에 있어서, 상기 2차 항체는 anti-IgG, protein A, protein G, 스트렙타비딘(streptavidin) 및 아비딘(avidin)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈중종양세포의 검출방법.
제7항에 있어서, 상기 자성비드의 크기는 100nm ~ 1μm인 것을 특징으로 하는 혈중종양세포의 검출방법.