KR20130107060A - Changeable color two-photon fluorescent probes for hydrogen peroxide in mitochondria and biological imaging methode of hydrogen peroxide using the same and synthesis methode of the same - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A variable color two-proton fluorescent probe is provided to have variable color two-proton fluorescent performance from blue to yellow and to be easily loaded by cells due to low molecular weight and solubility to water. CONSTITUTION: A variable color two-proton fluorescent probe is selected from compounds represented by chemical formula 1 and chemical formula 2. In chemical formula 1 and 2, X is independently O or S. An imaging method of hydrogen peroxide in mitochondria comprises a step of injecting the two-proton fluorescent probe into a cell; a step of obtaining fluorescent light by the reaction of the two-proton fluorescent probe with the hydrogen peroxide in the mitochondria; and a step of observing the fluorescent light through a two-proton microscope.

Description

미토콘드리아 내 과산화수소 활성 감지를 위한 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법과 이를 이용한 미토콘드리아 내 과산화수소 활성의 영상화 방법{Changeable Color Two-photon Fluorescent Probes for Hydrogen Peroxide in Mitochondria and Biological Imaging Methode of Hydrogen Peroxide using the same and synthesis methode of the same}Changeable Color Two-photon Fluorescent Probes for Hydrogen Peroxide in Mitochondria and Biological Imaging Methode of Hydrogen Peroxide using the same and synthesis methode of the same}

본 발명은 미토콘드리아 내에 존재하는 과산화수소와 선택적으로 감응하여 이광자 형광의 색이 변하는 가변색 형광 프로브에 관한 것으로서 보다 구체적으로는 높은 감도와 선택성으로 과산화수소의 활동성을 낮은 에너지 여기원의 이광자 현미경을 통해 실시간으로 영상화 할 수 있는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a variable color fluorescent probe that changes color of two-photon fluorescence by selectively reacting with hydrogen peroxide present in the mitochondria. More specifically, the activity of hydrogen peroxide with high sensitivity and selectivity in real time through a two-photon microscope of low energy excitation source. It is about a method which can image.

세포 내에 존재하는 활성산소종(superoxide anion radical (O2 ·), hydroxyl radical (HO·), peroxy radical (RO2 ·), singlet oxygen (1O2), hypochlorous acid (HOCl))은 호흡과정에서 몸속으로 들어간 산소가 산화과정에 이용되면서 여러 대사과정에서 생성되어 생체조직을 공격하고 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소이다.Superoxide anion radicals (O 2 · ), hydroxyl radicals (HO · ), peroxy radicals (RO 2 · ), singlet oxygen ( 1 O 2 ), hypochlorous acid (HOCl) in the cells Oxygen that enters the body is used in the oxidation process is produced by various metabolic processes to attack the biological tissues and damage the cells are strong oxygen.

특히 미토콘드리아 내의 활성산소에 의해 미토콘드리아의 막이 손상을 받게 되면 세포 기능을 저하, 혹은 상실하게 된다. 이렇게 손상된 미토콘드리아는 더 많은 활성산소를 배출해 세포의 손상을 가속화하게 된다. 활성 산소는 탄수화물이 세포 속의 미토콘드리아에서 산소와 반응해 에너지로 전환될 때 에너지 생성과 더불어 필수 불가결하게 발생한다. 이렇게 대사과정에서 끊임없이 생성된 활성 산소는 생체 조직을 공격하여 세포를 산화, 손상시키는 주된 성분이며 유해산소라고도 한다. In particular, if the mitochondrial membrane is damaged by free radicals in the mitochondria, cellular function is reduced or lost. The damaged mitochondria release more free radicals and accelerate cell damage. Free radicals are indispensable in addition to energy production when carbohydrates react with oxygen in mitochondria in cells to be converted into energy. Active oxygen, which is constantly generated during metabolism, attacks the tissues and oxidizes and damages cells, and is also called harmful oxygen.

활성산소 종의 대표적인 예는 과산화수소인데 최근 들어 과산화수소는 우리 몸에 없어서는 안 될 중요한 역할을 하고 있는 것으로 밝혀져 그 관심의 대상이 되고 있다. 그 주된 역할은 생체 내 신호전달에 관여하고 또한 병원체의 방어 물질, 독성 물질에 대한 해독작용 등을 하는 생체 방어 기능이다.  A representative example of reactive oxygen species is hydrogen peroxide, which has recently been found to play an important role in our bodies and has been of interest. Its main role is biological defense, which is involved in signaling in vivo and also acts as a protective agent for pathogens and detoxification of toxic substances.

이러한 기능을 이해하기 위하여, 단일광자 형광 프로브가 개발되어 왔으나 대부분의 단일광자 프로브의 공통적인 문제점은 그들의 짧은 여기 파장(<500 ㎚)이다. 이러한 요구는 얕은 투과 깊이(<100 ㎛), 광표백(photobleaching) 및 세포 자가 형광으로 인하여 조직 이미징에 대한 적용을 제한한다. 이러한 문제에 대한 이상적인 해결은 여기를 위하여 낮은 에너지의 2개의 근적외선 광자를 이용하는 이광자 현미경(TPM)이 된다. 이광자 현미경을 사용하면, 온전한 조직이 70 ㎛보다 더 큰 조직 조각 내부로 연장될 수 있는 조직 준비 성형물로부터 최소한의 간섭을 만들면서 오랜 기간 동안 이미지로 만들어질 수 있다. 또한 세포 내부의 대표적인 활성 소기관인 미토콘드리아 내부에 존재하는 과산화수소를 선택적으로 감지할 수 있는 이광자 형광 표지자는 전무한 상태이다.
To understand this function, single photon fluorescent probes have been developed but a common problem with most single photon probes is their short excitation wavelength (<500 nm). This requirement limits the application to tissue imaging due to shallow penetration depth (<100 μm), photobleaching and cell autofluorescence. The ideal solution to this problem is a two-photon microscope (TPM) that uses two near-infrared photons of low energy for excitation. Using two-photon microscopy, intact tissue can be imaged for long periods of time with minimal interference from tissue preparation moldings that can extend into tissue pieces larger than 70 μm. In addition, there are no two-photon fluorescent markers capable of selectively detecting hydrogen peroxide present in the mitochondria, a representative organelle within the cell.

이에 본 발명자는 기존의 단일광자 형광 프로브가 가지는 짧은 여기 파장에 따른 문제점을 해결하고, 미토콘드리아 내부에 존재하는 과산화수소를 선택적으로 감지할 수 있는 형광 표지자를 개발하고자 연구, 노력한 결과, 미토콘드리아 내부에 존재하는 과산화수소를 선택적으로 감지할 수 있는 가변색 이광자 형광 프로브를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have solved the problem according to the short excitation wavelength of the conventional single photon fluorescent probe and researched and tried to develop a fluorescent marker capable of selectively detecting hydrogen peroxide present in the mitochondria. The present invention has been completed by developing a variable color two-photon fluorescent probe capable of selectively detecting hydrogen peroxide.

이에 본 발명의 목적은 생체 조직 내부에 효율적이고 선택적으로 염색되고 미토콘드리아 내부에 존재하는 과산화수소에 대한 선택성과 활동성을 영상화시키기에 적합한 가변색의 형광 프로브를 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a variable color fluorescent probe suitable for imaging the selectivity and activity of hydrogen peroxide efficiently and selectively stained in living tissue and present in the mitochondria.

본 발명의 다른 목적은 상기 이광자 형광 프로브를 이용하여 미토콘드리아 내부에 존재하는 과산화수소의 분포 및 활동성을 선택적으로 이미징하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for selectively imaging the distribution and activity of hydrogen peroxide present inside the mitochondria using the two-photon fluorescent probe.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이광자 형광 프로브의 제조방법을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a method of manufacturing the two-photon fluorescent probe.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 과산화수소 이미징용 가변색 이광자 형광 프로브를 제공한다.According to one aspect of the invention, the present invention provides a variable color two-photon fluorescent probe for hydrogen peroxide imaging selected from the compounds represented by the formula (1) to formula (2).

[화학식 1] [Formula 1]

Figure pat00001
Figure pat00001

[화학식 2](2)

Figure pat00002
Figure pat00002

상기 화학식 1 및 2에서 X는 각각 독립적으로 O 또는 S이다.
In Formulas 1 and 2, X is each independently O or S.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,According to another aspect of the present invention, the present invention,

(i) 하기 화학식 3 로 표시되는 화합물 및 화학식 4 표시되는 반응 혼합물을 반응시켜 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계(i) reacting the compound represented by the following formula (3) and the reaction mixture represented by the formula (4) to stir under a nitrogen atmosphere to produce an amide compound

를 포함하는 화학식 1로 표시되는 가변색 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.It provides a method for producing a variable color two-photon fluorescent probe represented by the formula (1) comprising a.

[화학식 3](3)

Figure pat00003
Figure pat00003

[화학식 4][Formula 4]

Figure pat00004
Figure pat00004

상기 화학식 3에서 Y는 Cl 또는 OCOCH3이며, 상기 화학식 4에서 X는 S 또는 O이다.
In Formula 3, Y is Cl or OCOCH 3 , and in Formula 4, X is S or O.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은,According to another aspect of the invention, the present invention,

(i) 하기 화학식 3 로 표시되는 화합물 및 화학식 5 표시되는 반응 혼합물을 반응시켜 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계(i) reacting the compound represented by the following formula (3) and the reaction mixture represented by the formula (5) to stir under a nitrogen atmosphere to produce an amide compound

를 포함하는 화학식 2로 표시되는 가변색 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.It provides a method for manufacturing a variable color two-photon fluorescent probe represented by the formula (2) comprising a.

[화학식 3](3)

Figure pat00005
Figure pat00005

[화학식 5][Chemical Formula 5]

Figure pat00006
Figure pat00006

상기 화학식 3에서 Y는 Cl 또는 OCOCH3이며, 상기 화학식 5에서 X는 S 또는 O이다.
In Formula 3, Y is Cl or OCOCH 3 , and in Formula 5, X is S or O.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은According to another aspect of the present invention,

(a) 청구항 1의 화학식 1 내지 화학식 2중 어느 하나의 이광자 형광 프로브를 세포에 주입하는 단계;(a) injecting a two-photon fluorescent probe of any one of Formulas 1 to 2 into a cell;

(b) 상기 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아 내 과산화수소와 반응하여 가변색 형광을 나타내는 단계; 및(b) reacting the two-photon fluorescent probe with hydrogen peroxide in the mitochondria to produce variable color fluorescence; And

(c) 상기 가변색 형광을 이광자 현미경으로 통해 관측하는 단계(c) observing the variable color fluorescence through a two-photon microscope

를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 내 과산화수소의 이미징(imaging) 방법을 제공한다.
It provides a method for imaging hydrogen peroxide in the mitochondria characterized in that it comprises a.

본원 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.The features and advantages of the present invention are summarized as follows.

(i) 본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 미토콘드리아 내에 선택적으로 염색됨과 동시에 과산화수소와 반응하여 청색에서 황색으로의 가변 이광자 형광을 나타낸다. 또한 물에 대한 용해도와 적은 분자량으로 인하여 세포에 쉽게 로딩될 수 있다. (i) The two-photon fluorescence probe according to the present invention exhibits variable two-photon fluorescence from blue to yellow in response to hydrogen peroxide while being selectively stained in the mitochondria. It can also be easily loaded into cells due to its solubility in water and low molecular weight.

(ii) 60분 이상의 시간에 걸쳐 생체 세포 및 90~180 μm 깊이의 생체 조직에서 선택적으로 과산화수소를 탐지할 수 있으므로 생체 세포 또는 온건한 생체 조직에서 과산화수소의 분포 및 활성을 고해상도로 이미징할 수 있다.
(ii) Hydrogen peroxide can be selectively detected in living cells and 90-180 μm deep tissues over a time period of 60 minutes or more, enabling high-resolution imaging and distribution of hydrogen peroxide in living cells or moderate biological tissues.

도 1은 (a) 과산화수소와 반응하는 SHP-Mito의 시간대별 단광자 형광 변화이다. 과산화수소 첨가 0 - 60 분 동안의 스펙트라이다. (b) 1 uM의 SHP-Mito에 다양한 종류의 산소와 질소 종(200 uM)과의 반응에 의한 형광 반응이다. 그래프에 나타낸 막대 바는 0 - 120 분 동안 F yellow/F blue의 형광 비율을 나타내었다. 30 mM의 MOPS, pH 7.4, 여기 파장 λ= 370 nm 조건에서의 데이터이다.
도 2는 (a) 이광자 형광 프로브(SHP-Mito)로 염색된 Raw 264.7 세포의 이광자 현미경 (TPM) 이미지이다. (b) 37℃에서 30분 동안 Mitotracker Red FM(1 uM)에서의 이광자 현미경 (TPM) 이미지이다. (c) 400-550 nm와 640-700 nm에서의 각각 방출된 형광의 합성 이미지이다. 단광자 및 이광자 여기 파장은 각각 514와 750 nm이다. 스케일 바, 15 μm.
도 3은 (a-d) Raw 267.4 세포의 TPM 이미지로 (a)는 SHP-Mito 이미지, (b) PMA(1 ug/mL)를 30분 동안 처리한 이미지 (c) 과산화수소 200 uM를 30분 간 처리하고 난 후의 이미지 (d) 반응식 1의 화합물 1의 이미지 (e) (a-d)에서의 평균 F yellow/F blue의 형광 비율을 표시한 그래프이다.
여기 파장은 750 nm. 청색 : 400 - 470 nm, 황색 : 530 - 600 nm, 스케일 바 15 um
도 4는 도 4에서 패널 (a)는 래트 해마 슬라이스 CA1 - CA3 구역의 90-180μm 깊이에서 20 uM SHP-Mito로 염색된 이미지(10x 배율)이고, 패널 (b)는 약 90-180 μm 깊이에서 과산화수소 1 mM을 처리한 래트 해마 슬라이스의 z축 방향에 따른 영상이며, 패널 (c)은 반응식 1의 화합물 1이 염색된 슬라이스의 영상 이미지이며, 패널 (d)-(f)는 깊이 120 um에서 40X로 확대한 (a)-(c)의 각각의 이미지이다. (g)는 CA3와 CA1에서의 형광 방출을 알아보기 위해 점선으로 표시한 영상이고, (h)는 CA3와 CA1에서 750 nm의 여기 광자를 이용하여 청색 채널(400-470 nm)과 황색 채널(530-600 nm)에서의 평균 F yellow/F blue 값을 도표화 한 그래프이다.1 is (a) time-dependent monofluorescence change of SHP-Mito reacting with hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is spectra for 0-60 minutes. (b) Fluorescence reaction by reaction of various kinds of oxygen and nitrogen species (200 uM) to 1 uM SHP-Mito. The bar bars in the graph show the fluorescence ratio of F yellow / F blue for 0-120 minutes. Data at 30 mM MOPS, pH 7.4, excitation wavelength λ = 370 nm.
Figure 2 is (a) two-photon microscopy (TPM) image of Raw 264.7 cells stained with two-photon fluorescence probe (SHP-Mito). (b) Two-photon microscopy (TPM) images in Mitotracker Red FM (1 uM) for 30 minutes at 37 ° C. (c) Composite images of emitted fluorescence at 400-550 nm and 640-700 nm, respectively. The mono and two photon excitation wavelengths are 514 and 750 nm, respectively. Scale bar, 15 μιη.
3 is (ad) TPM image of Raw 267.4 cells (a) SHP-Mito image, (b) Image of PMA (1 ug / mL) for 30 minutes (c) 200 uM hydrogen peroxide for 30 minutes (D) It is a graph which shows the fluorescence ratio of average F yellow / F blue in image (e) (ad) of compound 1 of reaction formula (1).
The excitation wavelength is 750 nm. Blue: 400-470 nm, yellow: 530-600 nm, scale bar 15 um
4 shows panel (a) in FIG. 4 is an image (10 × magnification) stained with 20 uM SHP-Mito at 90-180 μm depth of the rat hippocampal slice CA1-CA3 zone, panel (b) is about 90-180 μm deep Is a z-axis image of a rat hippocampus slice treated with 1 mM hydrogen peroxide at, panel (c) is an image image of a slice stained with compound 1 of Scheme 1, and panels (d)-(f) are 120 μm deep. Each image of (a)-(c) is magnified at 40X. (g) is a dotted image for fluorescence emission from CA3 and CA1, and (h) is a blue channel (400-470 nm) and a yellow channel (400-470 nm) using excitation photons of 750 nm in CA3 and CA1. 530-600 nm) is a graph plotting the average F yellow / F blue values.

본 발명은 생체 조직 내부에 효율적이고 선택적으로 염색되고 과산화수소에 대한 선택성과 활동성을 영상화시키기에 적합한 가변색 이광자 형광 프로브를 제공하는 것이다. The present invention provides a variable color two-photon fluorescent probe that is efficiently and selectively stained inside biological tissues and is suitable for imaging selectivity and activity for hydrogen peroxide.

본 발명의 가변색 이광자 형광 프로브는 생체 새포 내부에서 선택적으로 염색되며, 과산화수소와 반응하여 약 70 배 이상의 형광세기의 증가를 나타낸다. 또한 청색 형광인 400 - 470에서 형광을 띠는 이광자 형광 프로브는 과산화수소와 반응 후에는 황색 파장인 530 ~ 600 nm 범위로 파장 영역이 가변되도록 이광자 형광을 나타낸다. 따라서, 과산화수소에 대한 선택성과 활동성을 영상화시키기에 적합한 형광 프로브로써 이용될 수 있다.
The variable color two-photon fluorescent probe of the present invention is selectively stained inside a living cell, and exhibits an increase in fluorescence intensity of about 70 times or more in response to hydrogen peroxide. In addition, the two-photon fluorescence probe fluorescing at 400-470, which is blue fluorescence, shows two-photon fluorescence such that the wavelength range is changed to a yellow wavelength range of 530-600 nm after reaction with hydrogen peroxide. Thus, it can be used as a fluorescent probe suitable for imaging the selectivity and activity for hydrogen peroxide.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 과산화수소 이미징용 가변색 이광자 형광 프로브를 제공한다.According to one aspect of the invention, the present invention provides a variable color two-photon fluorescent probe for hydrogen peroxide imaging selected from the compounds represented by the formula (1) to formula (2).

[화학식 1] [Formula 1]

Figure pat00007
Figure pat00007

[화학식 2](2)

Figure pat00008
Figure pat00008

상기 화학식 1 및 2에서 X는 각각 독립적으로 O 또는 S이다.
In Formulas 1 and 2, X is each independently O or S.

본 발명은 이광자 형광 프로브에 관한 것으로서, 이광자 형광체로 6-(benzo[d]thiazol-2’-yl)-2-(N,N-dimethylamino)naphthalene (BTDAN) 을 포함한다. 또한 triphenylphosphonium salt (TPP) 를 미토콘드리아 탐침으로 수용체로, boronate를 기반으로 carbamate를 결합한 과산화수소 수용체로 각각 형광체(BTDAN)에 도입시킨 형태인 상기의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 이광자 형광 프로브에 관한 것이다.
The present invention relates to a two-photon fluorescent probe, which includes 6- (benzo [ d ] thiazol-2'-yl) -2- ( N, N- dimethylamino) naphthalene (BTDAN) as a two-photon phosphor. The present invention also relates to a two-photon fluorescent probe represented by Chemical Formula 1 or Chemical Formula 2, wherein triphenylphosphonium salt (TPP) is introduced into a phosphor (BTDAN) as a mitochondrial probe as a receptor and a boronate-based hydrogen peroxide receptor to which carbamate is bound.

본 발명의 이광자 형광 프로브는 기존 사용되던 단일 광자 형광 프로브와는 달리 90 ~ 180 ㎛ 범위의 깊은 투과 깊이를 가져, 생체 세포 및 100 ~ 200 ㎛ 깊이의 생체 조직에서 과산화수소를 탐지할 수 있다. 또한 본 발명의 이광자 형광 프로브는 세포 내부에서 광안정성의 특징으로 인해 60 분 이상 지속적인 과산화수소 탐지가 가능하며, 보다 바람직하게는 30 분 ~ 90 분 동안 탐지가 가능한 것을 특징으로 한다.
Unlike the conventional single photon fluorescent probe, the two-photon fluorescent probe of the present invention has a deep penetration depth in the range of 90 to 180 μm, and can detect hydrogen peroxide in living cells and biological tissues having a depth of 100 to 200 μm. In addition, the two-photon fluorescent probe of the present invention is capable of detecting hydrogen peroxide continuously for 60 minutes or more, and more preferably 30 minutes to 90 minutes due to the light stability characteristics inside the cell.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,According to another aspect of the present invention, the present invention,

하기 화학식 3 로 표시되는 화합물 및 화학식 4 표시되는 반응 혼합물을 반응시켜 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계To react the compound represented by the formula (3) and the reaction mixture represented by the formula (4) and stirred in a nitrogen atmosphere to produce an amide compound

를 포함하는 화학식 1로 표시되는 가변색 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.It provides a method for producing a variable color two-photon fluorescent probe represented by the formula (1) comprising a.

[화학식 3](3)

Figure pat00009
Figure pat00009

[화학식 4][Formula 4]

Figure pat00010
Figure pat00010

상기 화학식 3에서 Y는 Cl 또는 OCOCH3이며, 상기 화학식 4에서 X는 S 또는 O이다.
In Formula 3, Y is Cl or OCOCH 3 , and in Formula 4, X is S or O.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은,According to another aspect of the invention, the present invention,

하기 화학식 3 로 표시되는 화합물 및 화학식 5 표시되는 반응 혼합물을 반응시켜 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계To react the compound represented by the formula (3) and the reaction mixture represented by the formula (5) to stir under a nitrogen atmosphere to produce an amide compound

를 포함하는 화학식 2로 표시되는 가변색 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.It provides a method for manufacturing a variable color two-photon fluorescent probe represented by the formula (2) comprising a.

[화학식 3](3)

Figure pat00011
Figure pat00011

[화학식 5][Chemical Formula 5]

Figure pat00012
Figure pat00012

상기 화학식 3에서 Y는 Cl 또는 OCOCH3이며, 상기 화학식 5에서 X는 S 또는 O이다.In Formula 3, Y is Cl or OCOCH 3 , and in Formula 5, X is S or O.

예를 들어, 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조는 질소 분위기 하에서 화학식 3과 화학식 4로 표시되는 화합물을 반응시킨다. 카복시산 유도체 중에서 아실 클로라이드 또는 산 무수물 작용기를 아민과의 반응시켜 아마이드를 합성하는 과정이다. 아실 클로라이드 또는 산 무수물과 아민과 반응시 아민 대비 2 당량 이상을 반응시킨다. 카복시산 유도체 중에서 아민과 반응을 잘 일으킬 수 있는 작용기인 아실 클로라이드와 산 무수물을 본 발명에서 하나의 예로 들었지만, 반드시 상기 기재된 작용기에 한정하는 것은 아니며, 아마이드 화합물을 변화시킬 수 있는 화학종 모두 본 발명의 범위에 포함된다. For example, the preparation of the two-photon fluorescent probe represented by Chemical Formula 1 reacts the compound represented by Chemical Formula 3 and Chemical Formula 4 under a nitrogen atmosphere. In the carboxylic acid derivatives, acyl chloride or acid anhydride functional groups are reacted with amines to synthesize amides. When acyl chloride or acid anhydride is reacted with amine, at least 2 equivalents of amine is reacted. Among the carboxylic acid derivatives, acyl chloride and acid anhydride, which are functional groups capable of reacting well with amines, are exemplified in the present invention, but the present invention is not necessarily limited to the functional groups described above. It is included in the range of.

상기 아실 클로라이드 화학종 이외에도 산 무수물, 에스터, 카복시산 등의 작용기가 이에 포함된다.
In addition to the acyl chloride species, functional groups such as acid anhydride, ester, carboxylic acid, and the like are included therein.

반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 3일 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 증발시키고, 생성물을 CH3CN에 용해시킨 후 부산물인 요소는 필터링으로 제거하였고, 감압 조건에서 걸러진 생성물을 농축시킨다. 조 생성물을 CHCl3에서 5% 메탄올을 이동상으로 하여 컬럼 크로마토그래피에서 분리한다.
The reaction mixture was stirred for 3 days at room temperature under a nitrogen atmosphere. The solution is evaporated and the product is dissolved in CH 3 CN and the byproduct urea is removed by filtration and the filtered product is concentrated under reduced pressure. The crude product is separated by column chromatography in CHCl 3 with 5% methanol as mobile phase.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은According to another aspect of the present invention,

(a) 청구항 1의 화학식 1 내지 화학식 2중 어느 하나의 이광자 형광 프로브를 세포에 주입하는 단계;(a) injecting a two-photon fluorescent probe of any one of Formulas 1 to 2 into a cell;

(b) 상기 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아 내 과산화수소와 반응하여 가변색 형광을 나타내는 단계; 및(b) reacting the two-photon fluorescent probe with hydrogen peroxide in the mitochondria to produce variable color fluorescence; And

(c) 상기 가변색 형광을 이광자 현미경으로 통해 관측하는 단계(c) observing the variable color fluorescence through a two-photon microscope

를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 내 과산화수소의 이미징(imaging) 방법을 제공한다.It provides a method for imaging hydrogen peroxide in the mitochondria characterized in that it comprises a.

본 발명은 상기 (a)단계에서 3 x 10-6 M의 매우 낮은 이광자 형광 프로브의 농도로 세포에 30 분 동안 주입시킴으로써 생체 조직 세포에 선택적으로 위치시킬 수 있다. 세포에 주입 후 이광자 현미경의 여기원은 750 nm에 해당하는 근적외선 빛을 사용하고, 형광의 범위는 과산화수소와 반응하긴 전의 파장인 400 ~ 470 nm 범위인 것을 특징으로 한다. 가변색 이광자 프로브가 과산화수소와 반응하면 황색 파장 범위인 530 - 600 nm으로 발색 범위가 달라지며, 이 때, 이광자 여기 형광의 세기가 70 배 정도 증가되어 고해상도의 이광자 현미경 영상을 얻는 효과를 나타낸다.The present invention can be selectively positioned in living tissue cells by injecting the cells for 30 minutes at a concentration of a very low two-photon fluorescent probe of 3 x 10 -6 M in step (a). The excitation source of the two-photon microscope after injection into the cell uses near-infrared light corresponding to 750 nm, and the fluorescence range is 400 to 470 nm, the wavelength before reacting with hydrogen peroxide. When the variable color two-photon probe reacts with hydrogen peroxide, the color range is changed to a yellow wavelength range of 530-600 nm, whereby the intensity of the two-photon excitation fluorescence is increased by about 70 times, thereby obtaining a high-resolution two-photon microscope image.

낮은 여기 에너지를 갖는 2 개 의 근적외선 광자들을 여기원으로 사용하는 이광자 현미경(TPM)은 일광자 현미경에 비해서 증가된 투과 깊이 및 국소화된 여기를 가지며, 장시간 이미징이 가능하다는 장점이 있다. 본 발명은 상기와 같은 이미징 방법 을 통해 생체 세포 또는 조직에서 미토콘드리아의 과산화수소의 분포 및 활동성을 효과적으로 이미징할 수 있다.
Two-photon microscopy (TPM), which uses two near-infrared photons with low excitation energy as excitation sources, has an increased transmission depth and localized excitation and has the advantage of long-term imaging as compared to one-photon microscopy. The present invention can effectively image the distribution and activity of mitochondrial hydrogen peroxide in living cells or tissues through the above imaging method.

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

실시예Example 1:  One: SHPSHP -- MitoMito 의 합성Synthesis of

하기 반응식 1의 용액 1(0.30 g, 0.42 mmol) 및 용액 2(0.19 g, 0.64 mmol)를 드라이 CH2Cl2에서 피리딘(0.35 mL, 4.32 mmol)을 첨가하고 질소 분위기 하에서 2 시간 동안 실온에서 교반하여 반응 혼합물을 생성시켰다. 용액을 vacuo에서 제거하였고, 조 생성물을 CHCl3에서 8% 메탄올을 이동상으로 하여 컬럼 크로마토그래피에서 흰색 고체인 SHP-Mito을 분리하였다.Solution 1 (0.30 g, 0.42 mmol) and solution 2 (0.19 g, 0.64 mmol) of Scheme 1 were added pyridine (0.35 mL, 4.32 mmol) in dry CH 2 Cl 2 and stirred at room temperature under nitrogen atmosphere for 2 hours. To produce a reaction mixture. The solution was removed in vacuo and the crude product was separated by column chromatography SHP-Mito as a white solid with 8% methanol in CHCl 3 as mobile phase.

수율: 0.11 g (27 %); 녹는점 170172 ℃; Yield: 0.11 g (27%); Melting point 170172 ° C .;

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.49 (br t, 1H, amide-NH), 8.67 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.19-8.16 (m, 2H), 8.06 (d, J = 8.4, 1H), 7.92 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.88-7.66 (m, 19H), 7.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.02-3.99 (m, 4H), 3.44 (s, 3H), 1.33 (s, 12H). 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ 9.49 (br t, 1H, amide-NH), 8.67 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.19-8.16 (m, 2H), 8.06 (d , J = 8.4, 1H), 7.92 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.88-7.66 (m, 19H), 7.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.02-3.99 (m, 4H), 3.44 (s, 3H), 1.33 (s, 12H).

13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.6, 167.0, 156.3, 155.4, 142.4, 139.5, 135.31, 135.1, 135.0, 133.8 (d, J = 9.8 Hz), 131.2, 130.9, 130.7 (d, J = 12.9 Hz), 130.0, 129.7, 128.7, 127.6, 127.1, 126.3, 125.9, 125.1, 122.8, 122.2, 117.6 (d, J = 84.9 Hz), 84.1, 67.7, 38.1, 34.2, 25.2, 23.4 (d, J = 49.3 Hz). 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ): δ 170.6, 167.0, 156.3, 155.4, 142.4, 139.5, 135.31, 135.1, 135.0, 133.8 (d, J = 9.8 Hz), 131.2, 130.9, 130.7 (d, J = 12.9 Hz), 130.0, 129.7, 128.7, 127.6, 127.1, 126.3, 125.9, 125.1, 122.8, 122.2, 117.6 (d, J = 84.9 Hz), 84.1, 67.7, 38.1, 34.2, 25.2, 23.4 (d, J = 49.3 Hz).

31P NMR (162 MHz, CDCl3): δ 21.9 ppm. 31 P NMR (162 MHz, CDCl 3 ): δ 21.9 ppm.

HRMS (FAB+): m/z calcd for [C53H50BN3O5PS]+: 882.3302, found: 882.3302.HRMS (FAB +): m / z calcd for [C 53 H 50 BN 3 O 5 PS] &lt; + &gt;: 882.3302, found: 882.3302.

[반응식 1][Reaction Scheme 1]

Figure pat00013

Figure pat00013

실시예Example 2:  2: SHPSHP -- MitoMito 의 of 광물리학적Photophysical 특성 및 표지자 역할 확인 Identify Attributes and Marker Roles

하기 표 1에서 모든 측정은 MOPS 완충 용액(30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7.4)에서 실시하였다. [b] 몰흡광계수 수치, [c] 단광자 방출 스펙트라 λmax, [d] 형광 양자 수득률(± 15 %), [e] 과산화수소 첨가(1 mM) 전과 첨가 1 시간 후 단광자 방출 전환 비율(F 530-600/F 400-470) [f] 이광자 여기 스펙트라 [g] T10-50 cm4/양자(GM)에서의 이양자 단면 피크.All measurements in Table 1 below were made in MOPS buffer solution (30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7.4). [b] molar extinction coefficient value, [c] monophoton emission spectra λmax, [d] fluorescence quantum yield (± 15%), [e] monophoton emission conversion ratio before and after 1 hour of hydrogen peroxide addition ( F) 530-600 / F 400-470 ) [f] Two photon excitation spectra [g] T10 -50 cm 4 / proton cross section peak at quantum (GM).

[표 1][Table 1]

Figure pat00014

Figure pat00014

SHP-Mito가 이광자 형광 프로브로 형광 검출자로 사용될 수 있는지 여부를 확인하기 위해서 Raw 264.7 매크로파지 세포, Mito Tracker Red를 이용하여 SHP-Mito를 염색시키고, 이를 확인하였다. 염색 결과 SHP-Mito는 세포 내 미토콘드리아에 선택적으로 염색되었음을 확인할 수 있었다.(도 2)
In order to confirm whether SHP-Mito can be used as a fluorescence detector as a two-photon fluorescent probe, SHP-Mito was stained using Raw 264.7 macrophage cells, Mito Tracker Red, and confirmed. As a result of staining, SHP-Mito was confirmed to be selectively stained in the intracellular mitochondria. (FIG. 2)

실시예Example 3: 이광자 형광 현미경 이미지 3: two-photon fluorescence microscope image

SHP-Mito 및 이광자 형광이 레이블된 세포와 조직을 스펙트라 콘포컬 현미경과 멀티 양자 현미경을 이용하여 이광자 형광 이미지를 얻었다.(배율: X10, X40 드라이, X100 오일, 개구율(Numerical Aperture): 0.30, 0.75 및 1.30)Cells and tissues labeled with SHP-Mito and two-photon fluorescence were obtained two-photon fluorescence images using spectra confocal microscopy and multi-quantum microscopy (magnification: X10, X40 dry, X100 oil, Numerical Aperture: 0.30, 0.75). And 1.30)

이광자 형광 현미경 이미지를 DM IRE2 현미경(Leica)로 티타늄-사파이어 레이저 광원(Coherent Chameleon, 90 MHz, 200 fs)으로 프로브를 여기시켜 얻었다.Two-photon fluorescence microscopy images were obtained by exciting the probe with a titanium-sapphire laser light source (Coherent Chameleon, 90 MHz, 200 fs) with a DM IRE2 microscope (Leica).

750 nm 파장 및 1345 mW의 파워로 세팅시키고, 티타늄-사파이어 레이저 광원(Coherent Chameleon, 90 MHz, 200 fs)으로 프로브를 여기시켜 이광자 형광 현미경 이미지를 얻었다. 데이터를 소프트웨어 ImageJ S8(NIH)와 Ratio Plus 플러그인(Paulo Magalhes)를 사용하여 분석하였다. Set to 750 nm wavelength and power of 1345 mW, the probe was excited with a titanium-sapphire laser light source (Coherent Chameleon, 90 MHz, 200 fs) to obtain a two photon fluorescence microscope image. Data was analyzed using software ImageJ S8 (NIH) and Ratio Plus plug-in (Paulo Magalhes).

도 3에 따르면, SHP-Mito를 이용하여 과산화수소 표지자로 사용하는 경우, 과산화수소가 존재하는 상황 또는 과산화수소 발생을 유도시키는 PMA(phorbol myristate acetate)가 존재하는 경우에 평균 F yellow/F blue 값이 증가함을 관찰할 수 있었다.According to Figure 3, when used as a hydrogen peroxide marker using SHP-Mito, the average F yellow / F blue value increases in the presence of hydrogen peroxide or in the presence of PMA (phorbol myristate acetate) to induce the generation of hydrogen peroxide Could be observed.

이를 통하여 SHP-Mito가 과산화수소에 선택적으로 반응하여 생체 세포 내 미토콘드리아에 존재하는 과산화수소를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
It was confirmed that SHP-Mito can selectively detect hydrogen peroxide present in mitochondria in living cells by selectively reacting with hydrogen peroxide.

실시예Example 4: 이광자 형광  4: two-photon fluorescence 프로브를The probe 이용한 미토콘드리아 내 과산화수소  Hydrogen Peroxide in Mitochondria 이미징Imaging 분석 analysis

조직 내 세포의 영상화를 위해, 본 발명의 이광자 형광 프로브가 갖는 유용성을 증명하기 위해, 생후 2일의 마우스 해마상 돌기의 미세박편을 모니터링하였다.For imaging of cells in tissues, to demonstrate the usefulness of the two-photon fluorescent probe of the present invention, microflakes of mouse hippocampal dendritic cells at 2 days of age were monitored.

인공 뇌척수액(ACSF; 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM D-glucose, 2.4 mM CaCl2, and 1.3 mM MgSO4)에서 진공 블레이드 마이크로톰을 이용하여 400 μm 두께의 관상면(coronal slice)으로 잘랐다. 인공 95% 산소와 5% 이산화탄소로 버블링한 뇌척수액에서 20 μM의 SHP-Mito와 함께 슬라이스를 37℃에서 2 시간 동안 배양시켰다. 이후 슬라이스를 인공 뇌척수액과 함께 세 번 세척하였고, 유리바닥접시(MatTek)으로 옮겼다. 20 μM의 SSH-Mito가 레이블된 래트의 해마 슬라이스의 TPM 영상을 얻었다. 400 using a vacuum blade microtome in artificial cerebrospinal fluid (ACSF; 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO 3 , 1.25 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM D-glucose, 2.4 mM CaCl 2 , and 1.3 mM MgSO 4 ) Cut into μm thick coronal slices. Slices were incubated at 37 ° C. for 2 hours with 20 μM of SHP-Mito in bubbling cerebrospinal fluid with artificial 95% oxygen and 5% carbon dioxide. The slices were then washed three times with artificial cerebrospinal fluid and transferred to a glass bottom plate (MatTek). TPM images of hippocampus slices of rats labeled with 20 μM SSH-Mito were obtained.

도 4에서 패널 (a)는 래트 해마 슬라이스 CA1 - CA3 구역의 90-180μm 깊이에서 20 uM SHP-Mito로 염색된 이미지(10x 배율)이고, 패널 (b)는 약 90-180 μm 깊이에서 과산화수소 1 mM을 처리한 래트 해마 슬라이스의 z축 방향에 따른 영상이며, 패널 (c)은 반응식 1의 화합물 1이 염색된 슬라이스의 영상 이미지이며, 패널 (d)-(f)는 깊이 120 um에서 40X로 확대한 (a)-(c)의 각각의 이미지이다. (g)는 CA3와 CA1에서의 형광 방출을 알아보기 위해 점선으로 표시한 영상이고, (h)는 CA3와 CA1에서 750 nm의 여기 광자를 이용하여 청색 채널(400-470 nm)과 황색 채널(530-600 nm)에서의 평균 F yellow/F blue 값을 도표화 한 그래프이다.In FIG. 4, panel (a) is an image (10 × magnification) stained with 20 uM SHP-Mito at 90-180 μm depth of the rat hippocampal slice CA1-CA3 zone, and panel (b) is hydrogen peroxide 1 at about 90-180 μm depth. z-axis image of rat hippocampus slice treated with mM, panel (c) is an image of slice stained with compound 1 of Scheme 1, and panels (d)-(f) are 40X at 120 um depth. It is each image of enlarged (a)-(c). (g) is a dotted image for fluorescence emission from CA3 and CA1, and (h) is a blue channel (400-470 nm) and a yellow channel (400-470 nm) using excitation photons of 750 nm in CA3 and CA1. 530-600 nm) is a graph plotting the average F yellow / F blue values.

생체 내에 투여된 이광자 형광 프로브는 CA1와 CA3 구역에서 강한 형광을 나타내었다.(도 4) 90 - 180 nm 깊이에서 과산화수소의 분포를 알아보는 TPM 이미지로 실험 결과, CA1(F green/F blue = 0.81) 및 CA3(F green/F blue = 0.72)로 관찰되었으며, 조직에 과산화수소의 양을 증가시켰을 때 CA1과 CA3에서의 강도가 1.57(CA3), 1.75(CA1)으로 각각 증가하였다.The two-photon fluorescence probe administered in vivo showed strong fluorescence in the CA1 and CA3 regions. (FIG. 4) As a result of the TPM image examining the distribution of hydrogen peroxide at a depth of 90-180 nm, CA1 ( F green / F blue = 0.81). ) And CA3 ( F green / F blue = 0.72), the strength of CA1 and CA3 increased to 1.57 (CA3) and 1.75 (CA1), respectively, when the amount of hydrogen peroxide in the tissue was increased.

이는 본 발명의 이광자 형광 프로브가 TPM을 이용하여 미토콘드리아 내부에 특히 미토콘드리아에서 90 내지 180 μm의 두께까지 존재하는 과산화수소를 매우 효과적으로 검출할 수 있음을 보여주는 것이다.
This shows that the two-photon fluorescent probe of the present invention can very effectively detect hydrogen peroxide present in the mitochondria, especially in the mitochondria, up to a thickness of 90 to 180 μm.

Claims (8)

하기 화학식 1 내지 화학식 2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 과산화수소 이미징용 가변색 이광자 형광 프로브:
[화학식 1]
Figure pat00015

[화학식 2]
Figure pat00016

상기 화학식 1 및 2에서 X는 각각 독립적으로 O 또는 S이다.
A variable color two-photon fluorescent probe for hydrogen peroxide imaging selected from compounds represented by the following Chemical Formulas 1 to 2:
[Formula 1]
Figure pat00015

(2)
Figure pat00016

In Formulas 1 and 2, X is each independently O or S.
청구항 1에 있어서, 과산화수소 이미징용 가변색 이광자 형광 프로브는 미토콘드리아에 선택적으로 염색되는 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
The two-photon fluorescent probe of claim 1, wherein the variable color two-photon fluorescent probe for hydrogen peroxide imaging is selectively stained with mitochondria.
청구항 1에 있어서, 과산화수소 이미징용 가변색 이광자 형광 프로브는 과산화수소와 반응하여 400-470 nm에서 530 ~ 600 nm 범위의 형광으로 가변하는 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
The two-photon fluorescent probe of claim 1, wherein the variable color two-photon fluorescent probe for imaging hydrogen peroxide varies from 400-470 nm to fluorescence in the range of 530-600 nm in response to hydrogen peroxide.
제 1 항에 있어서, 과산화수소 이미징용 가변색 이광자 형광 프로브는 생체 세포 및 90 ~ 180 ㎛ 깊이의 생체 조직에서 미토콘드리아 내 과산화수소 탐지가 가능한 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
The two-photon fluorescent probe of claim 1, wherein the variable color two-photon fluorescent probe for imaging hydrogen peroxide is capable of detecting hydrogen peroxide in the mitochondria in living cells and biological tissues having a depth of 90 to 180 µm.
하기 화학식 3 로 표시되는 화합물 및 화학식 4 표시되는 반응 혼합물을 반응시켜 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계
를 포함하는 화학식 1로 표시되는 가변색 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법:
[화학식 3]
Figure pat00017

[화학식 4]
Figure pat00018

상기 화학식 3에서 Y는 Cl 또는 OCOCH3이며, 상기 화학식 4에서 X는 S 또는 O이다.
To react the compound represented by the formula (3) and the reaction mixture represented by the formula (4) and stirred in a nitrogen atmosphere to produce an amide compound
Method for preparing a variable color two-photon fluorescent probe represented by Formula 1 comprising:
(3)
Figure pat00017

[Chemical Formula 4]
Figure pat00018

In Formula 3, Y is Cl or OCOCH 3 , and in Formula 4, X is S or O.
하기 화학식 3 로 표시되는 화합물 및 화학식 5 표시되는 반응 혼합물을 반응시켜 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계
를 포함하는 화학식 2로 표시되는 가변색 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법:
[화학식 3]
Figure pat00019

[화학식 5]
Figure pat00020

상기 화학식 3에서 Y는 Cl 또는 OCOCH3이며, 상기 화학식 5에서 X는 S 또는 O이다.
To react the compound represented by the formula (3) and the reaction mixture represented by the formula (5) to stir under a nitrogen atmosphere to produce an amide compound
Method for preparing a variable color two-photon fluorescent probe represented by the formula (2) comprising:
(3)
Figure pat00019

[Chemical Formula 5]
Figure pat00020

In Formula 3, Y is Cl or OCOCH 3 , and in Formula 5, X is S or O.
(a) 청구항 1의 화학식 1 내지 화학식 2중 어느 하나의 이광자 형광 프로브를 세포에 주입하는 단계;
(b) 상기 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아 내 과산화수소와 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및
(c) 상기 형광을 이광자 현미경으로 통해 관측하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 내 과산화수소의 이미징(imaging) 방법.
(a) injecting a two-photon fluorescent probe of any one of Formulas 1 to 2 into a cell;
(b) reacting the two-photon fluorescent probe with hydrogen peroxide in the mitochondria to fluoresce; And
(c) observing the fluorescence through a two-photon microscope
Imaging method of hydrogen peroxide in the mitochondria comprising a.
제 7 항에 있어서, 상기 (b)단계에서 나타내는 형광은 400-470 nm에서 530 ~ 600 범위의 형광으로 가변하는 것을 특징으로 하는 생체조직세포 내 일산화질소의 이미징(imaging) 방법.The method of claim 7, wherein the fluorescence shown in step (b) is varied to fluorescence in the range of 530 to 600 at 400-470 nm. 9.
KR1020120028854A 2012-03-21 2012-03-21 Changeable Color Two-photon Fluorescent Probes for Hydrogen Peroxide in Mitochondria and Biological Imaging Methode of Hydrogen Peroxide using the same and synthesis methode of the same KR101364592B1 (en)

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CN104165876A (en) * 2014-08-22 2014-11-26 江南大学 Method for rapidly fluorescently detecting hydrogen peroxide on basis of etched nano silver triangle

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101653581B1 (en) * 2014-09-18 2016-09-05 아주대학교산학협력단 - - ratiometric two-photon fluorescent probes for -galactosidase synthesis method of the same and quantitative imaging method of senescence-associated -galactosidase in vivo using the same
CN106565596B (en) * 2016-10-28 2018-12-07 山西大学 A kind of application of naphthyl derivatives as Mitochondrially targeted type pH fluorescence probe
CN110894201B (en) * 2019-12-13 2023-02-03 安徽大学 Single-molecule fluorescent probe for simultaneous super-resolution imaging of mitochondrial hydrogen peroxide, protein and nucleic acid and preparation and application thereof
CN112881355B (en) * 2021-01-17 2022-03-18 复旦大学 Double-parameter fluorescent nano sensor for simultaneously measuring pH and oxygen concentration in cells and preparation method thereof
CN116024296A (en) * 2022-11-25 2023-04-28 中国科学院深圳先进技术研究院 Application method for evaluating mitochondrial state of living germ cells and early embryo thereof based on organic fluorescent probe

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101130536B1 (en) * 2009-11-05 2012-04-12 경기대학교 산학협력단 A targetable fluorescent probe for natural ROS of living cells , preparation of the same, detection probe and detection method of ROS using the same
KR101233679B1 (en) * 2010-08-05 2013-02-15 아주대학교산학협력단 Dual-color imaging method of sodium/calcium activities using two-photon fluorescent probes and preparation method of two-photon fluorescent probes

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104165876A (en) * 2014-08-22 2014-11-26 江南大学 Method for rapidly fluorescently detecting hydrogen peroxide on basis of etched nano silver triangle
CN104165876B (en) * 2014-08-22 2016-08-24 江南大学 The method of rapid fluorescence detection hydrogen peroxide based on etching nanometer silver triangle

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