KR20130106432A - 중간엽 줄기세포로 췌장염을 치료하는 방법 - Google Patents

중간엽 줄기세포로 췌장염을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 다중계통 줄기세포, 전구세포, 다른 골수 간질 세포를 포함하는 세포의 생체 샘플을 조작하는 단계; 상기 세포의 샘플을 용기 내에 침전시키는 단계; 상기 용기로부터의 상청액을 다른 용기에 전달하는 단계; 및 상기 상청액으로부터, 그 안에 상대적으로 낮은 밀도를 갖는 세포를 격리시키는 단계,에 의해 수득되는 중간엽 줄기세포를 환자에게 투여함으로써 췌장염을 치료하는 방법을 개시한다.

Description

중간엽 줄기세포로 췌장염을 치료하는 방법{METHOD FOR TREATING PANCREATITIS WITH MESENCHYMAL STEM CELLS}
본 발명은 세포 격리의 분야에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 다양한 유형의 줄기세포 또는 전구세포를 격리하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 췌장염을 앓는 환자에게 격리된 줄기세포 또는 전구세포를 투여함으로써 상기 췌장염을 치료 또는 완화하는 방법에 관한 것이다.
뼈 골수는 조혈 및 중간엽 줄기세포 및 전구세포를 포함하는 것으로 알려져 있다. 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)(HSC)는 다양한 유형의 혈액 세포를 생성할 수 있고[1], 골수 간질세포(marrow stromal cell)(MSC) 또는 중간엽 줄기세포는 연골, 뼈 및 지방조직를 포함하는 일부 다른 조직으로 분화될 수 있다[2,3,4]. MSC는 프리덴스타인(Friedenstein) 및 그의 동료들에 의해 [5] 세포 배양 접시에 대한 그의 접착에 따라 처음 보고되었다. 미분화의 MSC는 섬유아세포와 같은 형태가 있고 자기-재생 능력을 갖고 있으며, 주로 중배엽 기원의 결합 조직, 즉 연골, 뼈 및 지방조직으로 분화할 수 있다. 특이적이고 고유하게 MSC를 식별할 수 있는 특정 세포 표면 단백질은 아직 존재하지 않는다. MSC와 관련된 특성의 다양성은 연구실들 사이의 조직 유래, 격리 방법과 배양 방법에서의 차이에 의해 설명될 수 있다[2,6,7,8]. 일관성은 없지만 확장된 MSC는 시험관 내에서 CD29, CD44, CD73, CD105, CD106 및 CD166을 발현하지만[9], CD11b, CD14, CD31, CD34 또는 CD45와 같은 조혈 표면 마커가 부족하거나, 또는 약간 포지티브하다(positive).
주로 뼈 골수, 제대혈 및 지방조직을 포함하는 다른 공급원으로부터 얻을 수 있는, MSC와 유사한 특성을 갖는 세포 집단들이 알려져 있다. 특징적인 마커의 부족 때문에 이러한 세포가 고유한 세포 유형인지 아닌지를 확인하는 것은 곤란하지만, 이들은 아마도 별도의 격리 및 배양 방법에 의한 여러가지 수준의 표면 마커 발현 기능 및 다양한 분화능을 갖는다. MSC가 분화할 가능성이 있는 범위는 중배엽 계통뿐만 아니라, 내배엽 및/또는 외배엽 계통에 이른다. 따라서, "다중계통 줄기세포 또는 전구세포(MLS/PC)"라는 용어는 중배엽, 외배엽 및/또는 내배엽 계통으로 분화할 수 있는 이런 유형의 줄기세포 또는 전구세포를 제안하고 있다.
성체의 뼈 골수로부터 유래하는 MSC는, 격리 및 배양이 용이하고, 시험관 내에서 이러한 표현형이 안정적이고, 동종이계 거절이 낮거나 또는 일어나지 않기 때문에 의료의 새로운 전략의 가능성을 열어 것이다. 사실, 인간과 동물에서 MSC의 낮은 면역 속성에 관한 실험적 증거가 축적되고 있다[10]. 최근, 다양한 질환의 치료를 위해 성체의 자기 또는 동종이계 MSC 임상 적용이 실시되고, 매우 유망한 결과가 얻어지고 있다[11].
Shizuru JA, Negrin RS, Weissman IL. Hematopoietic stem and progenitor cells: Clinical and Preclinical Regeneration of the Hematolymphoid System. Annu Rev Med 2005;56:509-538. Barry FP, Murphy JM. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. Int J Biochem Cell Biol 2004;36:568-584. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999;284: 143-147. Friedenstein AJP, Petrokova KV. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Journal of Embyological Experimental Morphology 1966; 16:381-390. Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol 1976;4:267-274. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002;418:41-49. Reyes M, Verfaillie CM. Characterization of multipotent adult progenitor cells, a subpopulation of mesenchymal stem cells. Ann N Y Acad Sci 2001;938:231-233. Jorgensen C, Gordeladze J, Noel D. Tissue engineering through autologous mesenchymal stem cells. Curr Opin Biotechnol 2004; 15:406-410. Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy. Gene Ther 2003;10:928-931. Le Blanc K, Tammik C, Rosendahl K, Zetterberg E, Ringden O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol 2003;31:890-896. Kassem M, Kristiansen M, Abdallah BM. Mesenchymal stem cells: cell biology and potential use in therapy. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 2004;95:209-214.
배양액 중의 MSC의 격리와 확장에 대해 현재까지 여러 유형의 프로토콜이 개발되고 있다. 이들 방법은 밀도-구배 원심분리[12], FACS 분류[13,14], 특이적 세포 표면 항체[12,15,17,18], 라미닌(laminin)-코팅된 플레이트에 대해 선택적인 접착[19], 훽스트(Hoechest) 염료 제거, 및 크기-체질된 배지[24]를 사용하는 것을 기반으로 한다. 임상 적용의 관점에서 이러한 방법의 가능한 단점은, 배양 세포의 불균질성, 높은 오염의 위험 및/또는 높은 제조 비용이다. 따라서, 오염 가능성과 비용이 더 낮은 매우 균질한 세포 집단을 격리하는 신규 프로토콜을 임상 상황에서 사용하는 것이 바람직하다.
본원은 임상 적용을 위해 오염의 가능성이 거의 없고 더 낮은 비용으로 매우 균질한 MLSC의 집단을 제조하기 위하여 개발한 신규 격리 방법을 개시한다. 이 방법은 반드시 밀도-구배 원심분리, 항체 선택 또는 FACS 분류를 반드시 이용할 필요는 없지만, 바람직하게는 그들의 세포 밀도에 의해 접착성 뼈 골수 세포를 분리하기 위해 비코팅되거나, 콜라겐 또는 폴리리신-코팅된 배양 접시에서 주로 자연 중력과 하위-분획(subfractionation) 세포 배양을 이용한다. 단일 세포-유도된 콜로니로부터 유도된 MLSC 라인의 매우 균질한 일부 집단을 이 프로토콜을 사용하여 인간 뼈 골수로부터 격리 및 확장하였다. 이러한 줄기세포주는 자기-재생 가능하고, 연골발생(chondrogenic), 뼈발생(osteogenic), 지방생성(adipogenic), 신경발생(neurogenic) 및 간원성(hepatogenic) 계통과 같은 일부 다중계통으로 분화할 수 있다.
급성 췌장염(AP)은 연간 100,000명의 성체마다 약 40 경우의 발병률을 갖는다. 전반적으로, 급성 췌장염 환자의 약 20 %는 심한 과정을 가지며, 10 내지 30 %는 중증 급성 췌장염으로 사망한다[30]. 지난 몇년 동안 집중적인 치료의 개선에도 불구하고, AP에 대한 사망률은 크게 감소되지 않았다[31]. 이러한 트립시노겐(trypsinogen)과 같은 소화 효소의 세엽세포내(intra-acinar cell) 활성화는 간질성 부종, 공포화(vacuolization), 염증, 및 세엽세포(acinar cell) 죽음의 결과로 이어지는 질환의 개시 상황(triggering event)이 되는 것으로 생각된다[32]. 이러한 병리학적 변화는 또한 인터류킨(IL)-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, 인터페론 감마(IFN-γ), 및 대식세포와 림프구로부터의 종양 괴사 인자(TNF-α)와 같은 염증성 사이토카인의 생산을 자극할 책임이 있다. 마지막으로, 이러한 사이토카인은 염증 유발 단계를 개시하며, 이는 전신계 염증 반응 증후군, 다기관(multiorgan) 부전, 또는 사망으로 이어진다[33]. 잠재적 약물의 다양한 실험과 임상 시험에도 불구하고, AP를 치료하기 위한 몇 가지 가능한 약물 선택사양이 사용되어 왔다[34].
이를 위해, AP 복구를 개선시키는 가능성으로서 새로운 줄기세포 치료들이 제기되었다. 중간엽 줄기세포(MSC) 다능성이고, 광범위한 세포 유형으로 분화되며, 그의 재생 가능성에 대해 시험되고 있다[35]. MSC의 또 다른 기본 속성은, 조직 복구와 면역조절에 대한 새로운 치료 전략의 맥락에서 많은 관심을 받고 있는 그의 강력한 면역 활성이다. MSC는 성체의 지방조직, 태아 및 신생아 조직으로부터 격리될 수 있지만, 대부분의 임상 적용에서는 그들은 뼈 골수(BM)로부터 격리된다[36]. 최근의 연구에서는, 허혈/재관류 손상, 콜라겐 유도 관절염, 급성 신부전에서의 신장 질환과 같은 다양한 염증 기반의 질환에서 BM-유도된 MSC에 대한 강력한 조직 재생, 복구 및 항염증성 효과를 관찰하였다[37-39].
지금까지, 대부분의 임상전(preclinical) 및 임상 연구는 단핵세포들의 혼합된 집단을 사용하였다. 이전 연구에서는, 빠르게 자기 갱신하는 세포는 작지만, 반면 성숙한 MSC는 큰 것으로 보고되고 있다[40]. 따라서, 높은 효율을 갖는 MSC의 격리와 확장을 위해 여러 프로토콜이 개발되었다. 기존의 구배 원심분리 방법을 사용하는 MSC의 격리는 이종 집단을 생성시키며, 이는 임상 시도의 결과에서 혼란스러운 결과로 이어졌다[41]. 임의의 경우에는, 적어도 표준화된 격리 절차는 인간의 임상 시도에 대한 MSC의 균질한 집단를 확보할 필요가 있다. 우리는 최근 분획 배양 방법(subfraction culturing method)(SCM)으로 지칭되고 인간 클론성 MSC(hcMSC) 라인의 라이브러리(library)를 구축하는 MSC의 균질한 집단의 격리를 위한 새로운 프로토콜을 개발하였다[42].
다양한 다른 질환을 위한 MSC의 생리적 및 예방적 효과[37-39]가 보고되고 있지만, AP에 대한 MSC의 효과는 아직 보고되지 않는다. 현재의 연구에서는, 우리는 hcMSC가 상처난 췌장으로 이동함으로써 손상된 췌장을 복구하며, 등급 위중도에 따라 모두 경증 및 중증 AP의 포유류의 항염증성 효과를 가질 수 있는 지를, SCM을 통해 얻고 조사된 hcMSC를 사용하였다.
하위-분획 배양 방법을 통해 수득된 hcMSC는, 상처난 췌장으로 이동함으로써 손상된 췌장을 복구하며, 등급 위중도에 따라 모두 경증 및 중증 AP의 랫의 항염증성 효과를 가질 수 있는 지를 결정하는 데 사용된다.
발명의 요약
본 발명은 췌장염을 치료하는 데 사용될 수 있는 성체 줄기 또는 전구세포를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은, 췌장염을 치료하거나, 췌장 부종를 감소시키거나, 췌장의 상대 중량을 감소시키거나, 세엽세포(acinar cell)의 집단을 증가시키거나, 췌장염을 앓는 대상의 세엽세포의 괴사를 예방하는 방법으로서, (i) 뼈 골수, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 또는 사이토카인-활성화된 말초 혈액의 생체 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 뼈 골수, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 또는 사이토카인-활성화된 말초 혈액의 생체 샘플을, 용기 내에 침전시키는 단계; (iii) 상기 용기로부터 다른 세포에 비해 비교적 덜 밀집된 세포를 함유하는 상청액을 2회 이상 연속적인 방식으로 다른 용기에 전달하는 단계; (iv) 상기 상청액으로부터의 덜 밀집된 세포를 격리시키는 단계; (v) 단계(iv)에서 수득된 세포를 췌장염을 앓는 대상에게 투여하되, 여기서 상기 뼈 골수, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 또는 사이토카인-활성화된 말초 혈액은 단계 (i) 내지 (iii)에서 1,000 rpm 초과의 원심분리를 겪지 않은 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
상기 세포의 샘플은 조직으로부터의 세포를 해리시키는 임의의 효소, 예컨대 프로테아제(protease)를 함유하지 않은 성장 배지와 혼합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단계 (ii) 및 (iii)는 3회 이상 실시될 수 있다. 상기 상청액으로부터의 격리된 세포는 용기 내에서 확장될 수 있다. 상기 용기가 평탄한 바닥을 가질 수 있다. 상기 용기는 세포 접착제로 코팅되어 있다. 상기 세포 접착제는 임의의 하전된 아미노산의 중합체를 포함할 수 있다. 상기 세포 접착제는 콜라겐, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 세포의 샘플은 뼈 골수로부터 수득될 수 있다. 다중계통 줄기세포 또는 전구세포의 단일 콜로니가 격리될 수 있다. 상기 세포의 생체 샘플은 임의의 원심분리를 겪기 전에 수득될 수 있다. 상기 세포의 생체 샘플은 임의의 원심분리를 겪은 후에 수득될 수 있다. 상기 방법은 상기 세포의 생체 샘플의 원심분리를 배제할 수 있다. 상기 방법은 세포의 특이적 항체 검출을 사용하지 않을 수 있다. 상기 췌장염은 보통 급성 췌장염일 수 있다. 상기 췌장염은 중증 급성 췌장염일 수 있다. 상기 대상은 전신계 면역억제 없이 치료될 수 있다.
하나의 양태에서, 췌장염을 앓는 대상은 췌장염의 기준을 만족하는 조건들을 갖는 대상으로서 확인 또는 진단될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법을 사용하여 격리된 다중계통 줄기세포로 대상을 치료함에 따라, 대상은 췌장염이 당해 분야의 공지된 방법 또는 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료 또는 완화되었는 지 여부를 결정하기 위해 시험될 수 있다.
대상은, 치료하기 전과 치료한 후, 또는 건강한 대조 췌장을 포함할 수 있는 건강한 대조군과 비교하여, 상기 대상에서 췌장 부종의 감소, 췌장의 상대 중량의 감소, 세엽세포(acinar cell)의 집단에서의 증가, 또는 세엽세포의 괴사의 감소를 비교함으로써, 치료의 효과에 대해 시험될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 다중계통 줄기세포의 격리에 관한 것이다. 상기 세포는 전구세포일 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포의 생체 샘플은 원심분리 후에 수득될 수 있으며, 바람직하게는 단핵세포는 MSC 격리에 통상적으로 사용되는 통상적인 밀도-구배 원심분리 방법에 의해 격리 또는 분획될 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포 격리 방법은 세포들 사이의 밀도에서의 차이에 의해 세포의 분리가 초래되도록 격리 배지 중의 임의의 효소를 배제시킬 수 있다.
1. 대안적 양태에서, 본 발명은, 췌장염을 치료하거나, 췌장 부종를 감소시키거나, 췌장염을 앓는 대상의 췌장의 상대 중량을 감소시키는 방법으로서,
(A) 생체 샘플로부터의 세포 밀도에 기반하는 단일 세포-유도된 클론성 다능성 뼈 골수 세포의 균질한 집단을 수득하는 단계로서,
(i) 저밀도 세포의 제 1 상청액을 생성시키는 제 1 용기 내의 중력에 의해 상기 생체 샘플을 침전시키고;
(ii) 상기 제 1 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 제 2 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 제 2 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(iii) 상기 제 2 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 제 3 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 제 3 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(iv) 상기 제 3 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 또다른 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 또다른 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(v) 상청액이 전달되는 성장 배지의 임의의 용기의 바닥 위에 단일 세포-유도된 콜로니를 생성시키고;
(vi) 상기 단일 세포-유도된 콜로니를 격리시키고;
(vii) 상기 단일 세포-유도된 콜로니로부터 성장 배지의 추가의 다른 용기 내에서 확장시켜서 단일 세포-유도된 클론성 다능성 뼈 골수 세포의 균질한 집단을 수득하는 것을 포함하는 단계; 및
(B) 단계(A)에서 수득된 세포를 췌장염을 앓는 대상에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
2. 상기 1에 따른 방법으로서, 상기 세포는 단계(iv)에서 1일 동안 침전된다.
3. 상기 1에 따른 방법으로서, 상기 상청액으로부터의 격리된 세포를 용기 내에서 확장시킨다.
4. 상기 1에 따른 방법으로서, 상기 용기가 평탄한 바닥을 갖는다.
5. 상기 1에 따른 방법으로서, 상기 용기가 세포 접착제로 코팅되어 있다.
6. 상기 5에 따른 방법으로서, 상기 세포 접착제가 임의의 하전된 아미노산의 중합체를 포함한다.
7. 상기 6에 따른 방법으로서, 상기 세포 접착제가 콜라겐, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트 또는 이들의 조합이다.
8. 상기 1에 따른 방법으로서, 세포의 특이적 항체 검출을 사용하지 않는다.
9. 또다른 양태에서, 본 발명은, 췌장염을 치료하거나, 췌장 부종를 감소시키거나, 췌장염을 앓는 대상의 췌장의 상대 중량을 감소시키는 방법으로서,
(A) 생체 샘플로부터의 세포 밀도에 기반하는 단일 세포-유도된 클론성 다능성 뼈 골수 세포의 균질한 집단을 수득하는 단계로서,
(i) 저밀도 세포의 제 1 상청액을 생성시키는 제 1 용기 내의 중력에 의해 상기 생체 샘플을 침전시키고;
(ii) 상기 제 1 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 제 2 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 제 2 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(iii) 상기 제 2 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 제 3 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 제 3 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(iv) 상기 제 3 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 제 4 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 제 4 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(v) 상기 제 4 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 또다른 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 또다른 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(vi) 상청액이 전달되는 성장 배지의 임의의 용기의 바닥 위에 단일 세포-유도된 콜로니를 생성시키고;
(vii) 상기 단일 세포-유도된 콜로니를 격리시키고;
(viii) 상기 단일 세포-유도된 콜로니로부터 성장 배지의 추가의 다른 용기 내에서 확장시켜서 단일 세포-유도된 클론성 다능성 뼈 골수 세포의 균질한 집단을 수득하는 것을 포함하는 단계; 및
(B) 단계(A)에서 수득된 세포를 췌장염을 앓는 대상에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
10. 상기 9에 따른 방법으로서, 상기 세포는 단계(v)에서 1일 동안 침전된다.
11. 상기 9에 따른 방법으로서, 상기 상청액으로부터의 격리된 세포를 용기 내에서 확장시킨다.
12. 상기 9에 따른 방법으로서, 상기 용기가 평탄한 바닥을 갖는다.
13. 상기 9에 따른 방법으로서, 상기 용기가 세포 접착제로 코팅되어 있다.
14. 상기 13에 따른 방법으로서, 상기 세포 접착제가 임의의 하전된 아미노산의 중합체를 포함한다.
15. 상기 14에 따른 방법으로서, 상기 세포 접착제가 콜라겐, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트 또는 이들의 조합이다.
16. 상기 9에 따른 방법으로서, 세포의 특이적 항체 검출을 사용하지 않는다.
17. 또다른 양태에서, 본 발명은, 췌장염을 치료하거나, 췌장 부종를 감소시키거나, 췌장염을 앓는 대상의 췌장의 상대 중량을 감소시키는 방법으로서,
(A) 생체 샘플로부터의 세포 밀도에 기반하는 단일 세포-유도된 클론성 다능성 뼈 골수 세포의 균질한 집단을 수득하는 단계로서,
(i) 저밀도 세포의 제 1 상청액을 생성시키는 제 1 용기 내의 중력에 의해 상기 생체 샘플을 침전시키고;
(ii) 상기 제 1 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 제 2 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 제 2 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(iii) 상기 제 2 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 제 3 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 제 3 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(iv) 상기 제 3 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 제 4 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 제 4 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(v) 상기 제 4 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 제 5 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 제 5 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(vi) 상기 제 5 상청액을 원심분리 없이 성장 배지의 또다른 용기에 직접 전달하고, 세포를 저밀도 세포의 또다른 상청액을 생성시키는 바닥에 침전시키고;
(vii) 상청액이 전달되는 성장 배지의 임의의 용기의 바닥 위에 단일 세포-유도된 콜로니를 생성시키고;
(viii) 상기 단일 세포-유도된 콜로니를 격리시키고;
(ix) 상기 단일 세포-유도된 콜로니로부터 성장 배지의 추가의 다른 용기 내에서 확장시켜서 단일 세포-유도된 클론성 다능성 뼈 골수 세포의 균질한 집단을 수득하는 것을 포함하는 단계; 및
(B) 단계(A)에서 수득된 세포를 췌장염을 앓는 대상에게 투여하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
18. 상기 17에 따른 방법으로서, 상기 세포는 단계(vi)에서 1일 동안 침전된다.
19. 상기 17에 따른 방법으로서, 상기 상청액으로부터의 격리된 세포를 용기 내에서 확장시킨다.
20. 상기 17에 따른 방법으로서, 상기 용기가 평탄한 바닥을 갖는다.
21. 상기 17에 따른 방법으로서, 상기 용기가 세포 접착제로 코팅되어 있다.
22. 상기 21에 따른 방법으로서, 상기 세포 접착제가 임의의 하전된 아미노산의 중합체를 포함한다.
본 발명의 이러한 목적과 다른 목적은, 본 발명의 하기 설명, 이에 첨부된 도면 및 이에 첨부된 특허청구범위로부터 더 충분하게 이해될 것이다.
본 발명은, 이후 본원에 제시된 상세한 설명, 및 단지 예시로 제시되는 첨부 도면으로부터 더욱 잘 이해될 것이며, 따라서 본 발명을 한정하는 것은 아니되, 다음과 같다.
도 1은 하위-분획 배양 방법을 이용한 인간 뼈 골수에서 다중계통 줄기세포의 격리의 전체 흐름도를 나타내는 도면이다.
도 2는 뼈 골수로부터 격리된 다중계통 줄기세포의 형태적 특징을 나타내는 도면이다.
도 3은 뼈 골수에서 4개의 확립된 다중계통 줄기세포주의 형태를 나타내는 도면이다.
도 4은 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC의 세포 표면 단백질을 나타내는 도면이다.
도 5는 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC에서 조혈 줄기세포의 세포 표면 단백질이 관찰되지 않는 것을 나타내는 도면이다.
도 6은 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC 라인에서 관찰된 세포 표면 단백질 CD31(PECAM)의 발현을 비교한 도면이다.
도 7은 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC 라인에서 관찰된 세포 표면 단백질 CD105(SH2) 발현을 비교한 도면이다.
도 8은 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC 라인에서 관찰된 세포 표면 단백질 CD73(SH3, SH4) 발현을 비교한 도면이다.
도 9는 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC 라인에서 관찰된 세포 표면 단백질 CD34의 발현 비교를 나타내는 도면이다.
도 10은 격리된 MLSC의 연골발생 분화를 나타내는 도면이다.
도 11은 격리된 MLSC 뼈발생 분화를 나타내는 도면이다.
도 12는 격리된 MLSC의 지방조직으로의 분화를 나타내는 도면이다.
도 13은 격리된 MLSC의 신경발생 분화를 나타내는 도면이다.
도 14는 격리된 MLSC의 FGF에 의한 신경발생 분화를 나타내는 도면이다.
도 15는 간원성 유도 배지에서 성장한 격리된 MLSC의 형태 변화를 나타내는 도면이다.
도 16은 RT-PCR 분석에 의한 연골세포, 뼈세포, 지방세포, 간세포 및 신경세포에 특이적인 유전자의 발현의 관찰 결과를 나타내는 도면이다.
도 17은 격리된 MLSC 라인에서의 사이토카인의 분비를 나타내는 도면이다.
도 18A 내지 18C는, 경증-AP를 앓는 랫에서 여러 농도(× 105 및 × 106)에 대한 hcMSC의 효과를 제시한다.
도 19A 내지 19C는, 인간 뼈 골수로부터 격리된 hcMSC의 특성을 제시한다.
도 20A 내지 20C는, 경증- 및 중증-AP를 앓는 랫에서의 hcMSC의 효과를 제시한다.
도 21A 내지 21C는 주입된 hcMSC의 추적을 제시한다.
도 22는 인간의 염색체 및 면역형광 염색을 위한 조합된 FISH를 제시한다.
도 23A 및 23B는 hcMSC의 주입 후 염증 사이토카인 및 중재자(mediator)를 제시한다.
도 24A 내지 24E는 hcMSC에 의한 T 세포의 억제를 제시한다.
도 25는, hcMSC를 주입한 후 랫 췌장에서 hcMSC의 FISH 분석의 테이블을 제시한다.
도 1은 하위-분획 배양 방법을 사용하여 인간 뼈 골수로부터의 다중계통 줄기세포의 격리에 대한 전체 흐름도를 제시한다. 간단히 말하면, 1 ml 인간 뼈 골수를 15 ml DMEM-HG, DMEM-LG, 또는 MEM(20 % FBS)과 혼합하고, 10 cm2 세포 배양 접시에 도말하였다(plate). 2 시간 배양한 후, 상청액만을 새로운 접시로 전달하였다. 이것을 다시 반복하였다. 이어서, 코팅이 없거나, 콜라겐 또는 폴리리신-코팅된 접시에 전달하였다. 이 단계에서, 세포를 1일 2회 및 2일 1회 배양하였다. 최종 상청액을 세포의 단일 클론이 나타날 때까지 배양하였다. 세포의 단일 클론이 6-웰(well) 플레이트에 전달하기에 충분한 크기로 되었을 때, 추가 연구를 위해 세포를 더 큰 접시로 확장하였다.
도 2A 내지 2D는, 뼈 골수로부터 격리된 다중계통 줄기세포의 형태적 특징을 제시한다. (A 및 B) 뼈 골수 세포의 최종 하위-분획 후 3일째 MLSC. 세포는 섬유아세포-유사 형태를 갖고 있다. 배율 :(A) 40X, (B) 200X. (C) 세포는 7일째에 일관적이고 균질한 형상을 갖는 집합체(confluence)가 되었다. (D) 격리된 MLSC를 6회 계대한 후(passage), MLSC의 작은 일부(2 내지 3 % 미만)의 형태가 초기의 계대에 비해 더 넓고 큰 형상으로 변화하였다. 격리되고 확장된 MLSC의 형태는 알려진 뼈 골수 간질성 줄기세포와 유사한 방추상이다.
도 3A 내지 3D는 뼈 골수로부터 4개의 확립된 다중계통 줄기세포주의 형태를 제시한다. 4개의 확립된 다중계통 줄기세포주의 사진에서, A는 D4(#1), B는 D4(#3), C는 D5(#1), D는 D5(#2)라고 지칭하며, 70 내지 80 %의 집합체가 될 때까지 성장된다. 확립된 다중계통 줄기세포주의 형태는 방추상이며, 이러한 줄기세포는 다른 섬유아세포에서와 같은 정도의 속도로 성장한다.
도 4는 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC의 세포 표면 단백질을 제시한다. 유동 세포 계측법에서는, MLSC이 정상적인 MSC의 인테그린 단백질(CD29) 및 매트릭스 수용기(CD44와 CD105)에 대하여 일관적으로 포지티브임을 제시하였다. HMSC8292(캠브렉스 바이오 사이언스(Cambrex Bio Science), 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재) 세포를 대조군으로서 사용하였다. 통상적인 MSC에 대해 발현되는 것으로 알려져 있는 세포 표면 단백질은 또한 MLSC에서도 발현되며, 이는 MLSC가 MSC 특징을 갖고 있음을 시사하는 것이다.
도 5는 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC에서 조혈 줄기세포 표면 단백질이 관찰되지 않는 것을 나타낸다. 유동 세포 계측법에서는, MLSC가 초기 조혈 줄기세포의 HLA-DR 및 CD34 마커 단백질에 대해 네거티브임을 제시하였다. HMSC8292(캠브렉스 바이오 사이언스, 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재) 세포를 대조군으로서 사용하였다. 이러한 결과는 격리된 MLSC가 조혈 줄기세포의 표현형을 갖고 있지 않다는 것을 보여주고 있다.
도 6은 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC 라인에서 관찰된 세포 표면 단백질 CD31(PECAM) 발현의 비교를 제시한다. FGF를 사용하는 D4(#1), D4(#3), D5(#1), D5(#2) 및 D5(#2)의 CD31의 발현은 FACS 분석에 의해 측정하였다. 확립된 MLSC 라인 D4(#3)는 CD31에 대한 약간 포지티브이지만, 다른 MLSC 라인은 네거티브이다. 성장 배지 중의 FGF는 D5(#2)의 CD31의 발현을 증가시킨다. 이러한 결과는 D4(#3)가 분화능 및/또는 세포 기능에서의 여러 세포 특성을 갖는 것을 보여주고 있다.
도 7은 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC 라인에서 관찰된 세포 표면 단백질 CD105(SH2) 발현의 비교를 제시한다. FGF를 사용하는 D4(#1), D4(#3), D5(#1), D5(#2) 및 D5(#2)의 CD105의 발현은 FACS 분석에 의해 측정하였다. 확립된 MLSC 라인 D5(#1)은 중간 수준의 CD105 발현을 보여 주지만, 다른 줄기세포주는 높은 수준의 CD105를 나타낸다. 이러한 결과는 D5(#1)가 분화능 및/또는 세포 기능에서의 여러 세포 특성을 갖는 것을 보여주고 있다.
도 8은 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC 라인에서 관찰된 세포 표면 단백질 CD73(SH3, SH4) 발현의 비교를 제시한다. FGF를 사용하는 D4(#1), D4(#3), D5(#1), D5(#2) 및 D5(#2)의 CD73의 발현은 FACS 분석에 의해 측정하였다. 확립된 MLSC 라인 D4(#1)은 매우 낮은 수준의 CD73 발현을 제시하고, D4(#3) 및 D5(#2)는 중간 수준의 발현을 나타내지만, D5(#1)는 발현을 전혀 보이지 않았다. 이러한 결과는 각 줄기세포주가 분화능 및/또는 세포 기능에서 독특한 세포 특성을 갖는 것을 보여주고 있다.
도 9는 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC 라인에서 관찰된 세포 표면 단백질 CD34의 발현의 비교를 제시한다. FGF를 사용하는 D4(#1), D4(#3), D5(#1), D5(#2) 및 D5(#2)의 CD34의 발현은 FACS 분석에 의해 측정하였다. 확립된 MLSC 라인 D4(#3), D4(#3) 및 D5(#2)는 낮은 수준의 CD34 발현을 나타내지만, D5(#1)은 CD34 발현을 제시하지 않는다. 이러한 결과는 각 줄기세포주가 분화능 및/또는 세포 기능에서 독특한 세포 특성을 갖는 것을 보여주고 있다.
도 10A 내지 10D는 격리된 MLSC의 연골발생 분화를 제시한다. 톨루이딘-블루(Toluidine-blue)에 의한 조직학적 염색에서는, 연골발생 분화된 MLSC가 연골발생 유도 후 21일째에 시험된 염색에 대해 매우 포지티브인 것으로 나타난다. (A 및 B) 보통 배지에서 성장한 세포 펠렛. (C 및 D) 연골발생 유도 배지에서 성장한 세포 펠렛. 결과에서는, 연골발생 유도 배지에서 성장한 MLSC는 높은 수준의 프로테오글리칸을 분비하고 연골세포로 분화할 수 있는 것을 나타내고 있다.
도 11A 내지 11D는 격리된 MLSC 뼈발생 분화를 제시한다. 본 코사(von Kossa) 염료에 의한 조직학적 염색에서는, 뼈발생 유도 후 21일째에, 뼈발생 분화된 MLSC의 매트릭스에 결합된 무기질이 있는 지가 나타난다. (A 및 B) 보통 배지에서 성장한 세포 펠렛. (C 및 D) 뼈발생 유도 배지에서 성장한 세포 펠렛. 결과에서는, 뼈발생 유도 배지에서 성장한 MLSC는 높은 수준의 칼슘을 만들고, 뼈세포로 분화할 수 있다는 것을 보여주고 있다.
도 12A 내지 12D는 격리된 MLSC의 지방조직으로의 분화를 제시한다. 오일 레드-O(Oil red-O)에 의한 조직학적 염색에서는, 지방생성 유도 후 21일째에, 지방생성 분화된 MLSC은 염색에 대해 매우 포지티브인 것으로 나타난다. (A 및 B) 보통 배지에서 성장한 세포 펠렛. (C 및 D) 지방생성 유도 배지에서 성장한 세포 펠렛. 결과는 지방생성 유도 배지에서 성장한 MLSC는 중성 지질 액포를 형성하고, 지방세포로 분화할 수 있다는 것을 보여주고 있다.
도 13A 내지 13I는 격리된 MLSC의 신경발생 분화를 제시한다. GFAP, 네스틴 및 NeuN 항체를 사용하는 면역조직학적 염색에서는, 신경발생 분화된 MLSC가 신경발성 유도 후 7 및 14일째에, 염색에 대해 매우 포지티브인 것으로 나타났다. (A, D 및 G) 보통 배양 배지에서 성장되고 항체와 함께 배양된 MLSC. (B, E 및 H) 신경발성 유도 후 7일째에 각각의 항체로 염색된 MLSC. (C, F 및 I) 신경발성 유도 후 14일째에 각각의 항체로 염색된 MLSC. 결과에서는, 신경발성 유도 배지에서 성장한 MLSC가 아교세포(glial cell) 특이적 단백질, 아교세포 섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein)(GFAP), 초기 및 후기 신경세포 마커 단백질, 네스틴 및 NeuN을 각각 합성할 수 있으며, 신경세포로 분화할 수 있다는 것을 보여주고 있다.
도 14A 내지 14I는 FGF와 함께 성장한 격리된 MLSC의 신경발생 분화를 제시한다. GFAP, 네스틴 및 NeuN 항체에 의한 면역조직학적 염색은, 신경발생 분화된 MLSC가, 신경발성 유도 후 7 및 14일째에, 염색에 대해 매우 포지티브인 것으로 나타났다. (A, D 및 G) 보통 배양 배지에서 성장되고 항체와 함께 배양된 MLSC. (B, E 및 H) 신경발성 유도 후 7일째에 각각의 항체로 염색된 MLSC. (C, F 및 I) 신경발성 유도 후 14일째에 각각의 항체로 염색된 MLSC. 결과에서는, 신경발성 유도 배지에서 FGF와 함께 배양한 MLSC가 또한 아교세포 특이적 단백질, 아교세포 섬유 산성 단백질(GFAP), 초기 및 후기 신경세포 마커 단백질, 네스틴 및 NeuN을 각각 합성할 수도 있으며, 신경세포로 분화할 수 있다는 것을 보여주고 있다.
도 15A 내지 15D는 간원성 유도 배지에서 성장한 격리된 MLSC의 형태 변화를 제시한다. 형태 변화는 간원성 유도 배지에서 배양 후 14일째에 관찰되었다. (A) 일반 배양 배지에서 성장한 MLSC 형태. (B, C 및 D) 14일째에 간원성 유도 배지에서 성장한 MLSC의 간세포의 형태 변화. 결과에서는, 간원성 유도 배지에서 성장한 MLSC은 간세포로 분화할 수 있다는 것을 보여주고 있다.
도 16A 내지 16E는 RT-PCR 분석에 의한 연골세포, 뼈세포, 지방세포, 간세포 및 신경세포 특이적 유전자 발현의 관찰 결과를 나타낸다. (A) 콜라겐 유형 II(연골원성, 500bp),(B) 오스테오폰틴(골원성, 330bp),(C) 퍼옥시좀 성장 인자 활성화 수용기 γ2(PPARγ2)(지방세포원성, 352bp),(D) 뉴로필라멘트 분자(NF-M)(신경근원성, 430bp) 및(E) α 페토(alpha feto) 단백질(αFP)(간세포원성, 216bp)의 발현에 대해 RT-PCR 분석에 의해 전체 RNA를 분석하였다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(GAPDH)의 발현을 내부 대조군으로서 사용하였다. M: DNA 분자 크기 마커, N: 유도되지 않는 것, C: 연골발생, O: 뼈발생, A: 지방생성, Ne: 신경발생, 및 H: 간원성. 이러한 결과는 격리된 MLSC가 각각의 특정 분화 조건에서 세포-특이적 유전자를 발현시킬 수 있으며, 다중계통으로 분화할 수 있는 것을 강력히 보여주고 있다.
도 17은 격리된 MLSC 라인에서의 사이토카인의 분비를 제시한다. MLSC 배양 상청액의 분획(50 내지 100 μl)를 Quntikine(등록상표) 인간 TGF-β1, b-NGF, LIF, IL10, HGF, IL2, TGF-α 및 IL12를 이용하여 ELISA에 의해 분석하였다. TGF-β1, LIF, TGF-α 및 IL10은 높은 수준의 분비를 나타냈지만, 다른 것은 분비가 낮거나 분비를 보이지 않았다. 격리된 MLSC에 의한 TGF-β1의 높은 분비량은 이 줄기세포가 T 세포의 활성화를 억제에 관여하는 것을 보여주고 있다. 또한, LIF, TGF-α 및 IL10과 같은 상대적으로 높은 수준의 다른 사이토카인은 이러한 세포가 면역조절 활성을 가질 수 있는 것을 시사하고 있다.
도 18A 내지 18C는, 경증-AP를 앓는 랫에서 여러 농도(× 105 및 × 106)에 대한 hcMSC의 효과를 제시한다. (A) 경증-AP를 앓는 랫 내에 주입된 1 × 105 및 1 × 106에서 CM-DiI-표지된 hcMSC의 췌장 섹션. (B) AP의 조직학적 분석. (C) 아밀라아제(U/L), 리파아제(U/L) 및 미엘로퍼옥시다아제(미엘로퍼옥시다아제)(U/mL)의 췌장/체중 비율과 활성. con, 대조군; con + hcMSC, hcMSC 단독-주입 군; AP, 경증-AP 군; AP + hcMSC, 경증-AP 군 중의 hcMSC 주입. 원래 배율 × 200.
도 19A 내지 19C는, 인간 뼈 골수로부터 격리된 hcMSC의 특성을 제시한다. (A) 플라스틱 배양 접시 상의 hcMSC의 섬유아세포 형상, 및 hcMSC의 명확한 시각화를 위한 크리스탈 바이올렛 염색. (B) 유동 세포 계측법을 사용하는 일부 줄기세포 마커의 발현. (C) hcMSC, 지방생성, 뼈발생 및 연골발생 분화의 다중계통 가능성 및 각 분화 도중 RT-PCR에 의한 유전자 발현의 분자 마커. 원래 배율 × 40 및 100.
도 20A 내지 20C는, 경증- 및 중증-AP를 앓는 랫에서의 hcMSC의 효과를 제시한다. (A) AP의 조직학적 분석. (B) 경증- 및 중증-AP에서의 hcMSC에 의한 감소된 사멸 세포. (C) 아밀라아제(U/L), 리파아제(U/L) 및 미엘로퍼옥시다아제(U/mL)의 췌장/체중 비율과 활성. 각 값은 4개의 개별 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. * P < .05 및 ** P <.01, 경증- 및 중증-AP 군과 비교됨. con, 대조군; con + hcMSC, hcMSC 단독-주입 군; AP, 경증- 및 중증-AP 군; AP + hcMSC, 경증- 및 중증-AP 군 중의 hcMSC 주입. 원래 배율 × 200.
도 21A 내지 21C는 주입된 hcMSC의 추적을 제시한다. (A) 경증- 또는 중증-AP를 앓거나 앓지 않은 랫 내에 주입된, l×lO6에서 CM-DiI-표지된 hcMSC의 췌장 섹션. (B) 췌장 조직으로부터의 인간의 게놈 AlUI PCR. 샘플 1, Con; 샘플 2 및 3, Con + hcMSC; 샘플 4 및 5, 경증-AP + hcMSC; 샘플 6 및 7, 중증-AP + hcMSC, 샘플 8, 인간 DNA. (C) 다양한 조직에서 hcMSC의 분포. 분포는 경증- 또는 중증-AP를 앓거나 앓지 않은 랫 내에 CM-DiI-표지된 hcMSC(l×lO6) 주입 후의 췌장, 폐, 간, 비장 및 또는 신장 섹션으로부터 평가되었다. CM-DiI-표지된 hcMSC의 수는 적어도 10개의 필드에서 평균 + SD로서 나타낸다. Con + hcMSC, hcMSC 단독-주입 군; 경증- 및 중증-AP + hcMSC, 경증- 및 중증-AP 군에서의 hcMSC 주입. 원래 배율 × 200.
도 22는 인간의 염색체 및 면역형광 염색을 위한 조합된 FISH를 제시한다. 경증- 및 중증-AP를 앓는 랫에서 CM-DiI 표지된 hcMSC 후의 인간-특이적 염색체에 대한 조합된 FISH의 대표 이미지. 경증- 및 중증-AP + hcMSC, 경증- 및 중증-AP에서의 hcMSC 주입; hCEN, 인간의 염색체 동원체(centromere). 원래 배율 × 200.
도 23A 및 23B는 hcMSC의 주입 후 염증 사이토카인 및 중재자(mediator)를 제시한다. (A) mRNA 발현 수준. (B) 효소 결합 면역 분석에 의해 hcMSC 주입 후의 TGF-β, TNF-α 및 IFN-γ 혈중 수준. 데이터는 적어도 3개의 개별 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. * P < .05 및 ** P <.01, 경증- 및 중증-AP 군과 비교됨. Con, 대조군; Con + hcMSC, hcMSC 단독-주입 군; AP, 경증- 및 중증-AP 군; AP + hcMSC, 경증- 및 중증-AP 군 중의 hcMSC 주입.
도 24A 내지 24E는 hcMSC에 의한 T 세포의 억제를 제시한다. (A) PBMC 및 림프절 세포는 각각 2개의 다른 랫 및 인간의 혈액으로부터 격리되었다. S: SD, W: Wistar, A, B: PBMC 공여자, M: hcMSC, L: 림프구. (B) 랫으로부터의 림프절 세포를 지정된 자극 및 Foxp3+로 자극하고, 아넥신 V (C) 발현은 CD4+ T 세포에서 측정하였다. T-세포 침윤의 억제(D) 및 췌장 조직에서 hcMSC에 의한 Foxp3+의 발현(E). 데이터는 적어도 5개의 필드를 위한 평균 + SD로서 나타낸다. * P < .05 및 ** P <.01, 경증- 및 중증-AP 군과 비교됨. Con, 대조군; Con + hcMSC, hcMSC 단독-주입 군; AP, 경증- 및 중증-AP 군; AP + hcMSC, 경증- 및 중증-AP 군 중의 hcMSC 주입. 원래 배율 × 200.
도 25는, hcMSC를 주입한 후 랫 췌장에서 hcMSC의 FISH 분석의 테이블을 제시한다.
본원에서, 부정관사 "a"와 "an"는 객체의 단수와 복수 모두를 지칭하는 데 사용된다.
때때로, 약어가 본 발명을 설명하는 데 사용된다. 본 발명에서 사용되는 다음과 같은 약어의 의미는 다음과 같다: hcMSC, 인간의 클론 골수 유래 중간엽 줄기세포를; CM-DiI, CM-1,1'-디옥타데실-3,3,3'-테트라메틸인도-카보시아닌 퍼클로라이드; AP, 급성 췌장염; IFN, 인터페론; IL, 인터류킨; MPO, 미엘로퍼옥시다아제; TGF, 변형 성장 인자; iNOS, 유도 가능한 산화질소 합성효소; TNF, 종양 괴사 인자.
본원에서 사용된 바와 같이, "신체 샘플"은 단일 유형의 세포를 격리하고자 하는 포유류로부터 수득된 임의의 샘플을 의미한다. 이러한 신체 샘플로는 뼈 골수 샘플, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 및 사이토카인-활성화된 말초 혈액을들 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포의 소스 및 치료를 논의하기 위한 "포유류" 또는 "대상"은 인간, 국내 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 랫, 마우스, 토끼 등을 포함하는 포유류 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "세포 샘플"는 뼈 골수 샘플, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 및 사이토카인-활성화된 말초 혈액을 포함하는 여러 유형의 세포 혼합물을 포함하는 임의의 샘플을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "균질한" 집단은 일반적으로 동일한 유형의 세포가 집단 내에 존재하는 것을 제시한다. "실질적으로 균질한"이라는 것은 약 80 %의 균질성. 또는 약 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.1 %, 99.2 %, 99.3 %, 99.4 %, 99.5 %, 99.6 %, 99.7 %, 99.8 % 또는 99.9 %의 균질성을 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "저밀도 세포"는 샘플에서 다른 것들보다 밀도가 낮은 세포 및 격리의 대상이 되는 세포를 의미한다. 저밀도 세포는 비제한적으로 다중계통 줄기세포, 전구세포 및 다른 골수 간질세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "MLSC"는 다중계통 줄기세포를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "MLSC/PC"는 다중계통 줄기세포 또는 전구세포를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "MSC"는 골수 간질세포 또는 중간엽 줄기세포를 의미하며, 이러한 용어는 교환할 수 있 사용된다.
하위-분획 방법
본원은, 하위-분획 배양 방법라고 명명되는 방법으로서 신체 샘플 또는 인간 뼈 골수와 같은 공급원에서 다중계통 줄기세포(MLSC)의 매우 균질한 집단을 격리하는 방법을 설명한다. 1ml 뼈 골수 흡입액(aspirate)에서 총 16개의 뼈 골수 세포주가 확립되었다. 16개 중에서, FACS 분석에 의해 별도의 표현형을 나타내는 4개의 세포주에 대해 특성화하였다. 이들 세포주 모두는 자기-재생 기능 및 중배엽, 외배엽, 내배엽 계통 세포로의 분화능과 같은 다중계통 줄기세포의 특징을 제시하였다.
뼈 골수 MSC는 조혈 세포에 의한 오염 없이 격리하기 어려운 것으로 알려져 있다[20,21]. 임상 설정에 적용하기 위해서는, 면역근원의 문제를 해결하고 임상적 효과를 정확하게 평가하기 위해 MSC의 균질한 집단을 갖는 것이 중요하다. 전통적으로, MSC의 균질한 집단의 격리는 MSC-특이적 항체 칼럼 정제에 의해 실행되었다. 그러나, 이러한 완전한 MSC-특이적 항체가 아직도 허용 가능하지 않기 때문에 이 방법은 충분하지 않다.
뼈 골수 샘플과 같은 생체 샘플로부터 MLSC를 격리하기 위한 본 발명의 원리는, 다중계통 줄기세포 또는 전구세포가 낮은 세포 밀도를 갖고, 따라서 이들이 이에 따라 샘플에서 다른 세포과 분리될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 성숙한 MSC는 신속하게 자기-재생(RS) 세포보다 크다[22,23]. RS 세포는 다중계통의 분화를 위한 더 큰 능력을 갖는 것으로 알려져 있다.
다른 양태에서, 더 접착력이 높은 줄기세포를 얻기 위해 콜라겐 또는 폴리리신-코팅된 배양 접시가 사용되었다. 본 출원인은, 양(+) 또는 음(-)으로 임의 하전된 배양 표면은 코팅하지 않은 접시 표면에 비해 줄기세포의 표면에 접착을 촉진하는 것을 밝혀냈다. 코팅하지 않은 접시보다 각각 약 2 내지 3배 많은 세포가 콜라겐 또는 폴리리신-코팅된 배양 접시에 부착되었다(데이터가 표시되지 않음). 단일 세포-유도된 뼈 골수 세포 콜로니의 수득과 관련하여, 다른 인간 골수 흡입물 및 3개의 상이한 혈통의 마우스 뼈 골수 샘플에서 유사한 결과가 수득되었으며(데이터가 제시되지 않음), 이는 이 프로토콜이 다른 뼈 골수 흡입물과 일관적이며 또한 다른 종에서의 MLSC의 격리에 적용될 수 있음을 보여주고 있다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 배양 접시의 바닥은 양(+)으로 하전된 아미노산, 예컨대 폴리리신, 폴리아르기닌, 또는 음(-)으로 하전된 아미노산, 예컨대 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트, 또는 이들의 조합에 의해 코팅되어서, 줄기세포 또는 전구세포가 접시의 바닥에 접착하는 것을 도와줄 수 있다.
더 무겁거나 더 밀집된 세포의 대부분이 최초 2개의 2시간의 배양 단계에서 제거될 수 있기 때문에, 본 발명의 하위-분획 배양 방법을 실시하기 위해서는, 적혈구 또는 백혈구와 같은 임의의 유형의 세포 샘플로부터 미리 제거하도록 임의의 유형의 원심분리도 사용할 필요가 없다. 이 점에서, 이는 세포들 사이의 임의의 물질을 소화시키는 임의의 효소로 세포를 미리 처리할 필요가 없다. 따라서, 본 발명의 시스템의 장점들 중 하나는, 세포 배양액 중에 피콜(Picoll), 휘콜(Ficoll) 또는 휘콜-히파크(Ficoll-hypaque)와 같은 오염을 도일할 수 있는 통상적으로 사용되는 밀도-구배 원심분리 및 단핵세포 분획 단계들을 회피할 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명의 하위-분획 배양 방법은, 신체 샘플, 바람직하게는 뼈 골수 샘플로부터 매우 균질한 MLSC를 격리하기 위한 단순하고 효과적이고 경제적인 프로토콜이다.
대안적으로, MSC 격리의 종래 밀도-구배 원심분리에 의한 격리/분획된 단핵세포는, 단일 세포-유도된 콜로니를 수득하고 줄기세포 또는 전구세포의 균질한 집단를 격리하기 위해서 접시 D1 내에 가할 수 있다. 따라서, 분획 배양 방법에서는 종래 밀도-구배 원심분리법에 의해 분획된 단핵세포가 이용될 수 있다.
본원은, 생체 샘플, 특히 예시되어 있는 뼈 골수 샘플에 존재하는 줄기세포 또는 전구세포에는 여러 유형이 존재한다는 것을 나타내는, 단일 세포 유도된 줄기세포주의 세포 표면 단백질 발현에서의 특징의 다양성에 대해 설명한다. 격리된 MLSC는 일반적으로 CD34, HLA-DR, CD73, CD31, CD166, HLA 클래스 I에 대해서는 네거티브이거나, 또는 약간 포지티브이며, CD44, CD29, CD105에 대해서는 매우 포지티브있었다. 그러나, D4 및 D5의 접시로부터의 일부 세포주는 분명한 수준의 표면 단백질을 보여 주지만, 이는 뼈 골수에서 일부 다른 다중계통 줄기세포 또는 전구세포가 존재할 수 있는 것을 보여주고 있다. 훙(Hung) 등은, 뼈 골수가 표면 마커 분석에서 다른 많은 군의 MSC를 포함할 수 있다고 가정하였다[24]. 다양한 표면 마커를 갖는 이러한 MSC는 세포의 여러 분화 능력을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 하위-분획 배양 방법에 의해 단일 세포 유도된 균질한 줄기세포의 격리로 인해, 이러한 군의 세포가 뼈 골수 또는 다른 특이적으로 격리된 신체 샘플 중에 존재하고 배양 조건이 세포 확장 동안 그의 능력이 변화시키지 않는 한, 조직 특이적 줄기세포 또는 관계된 전구세포의 격리가 가능하게 된다. MSC 치료 및 세포 이식 처리의 안전성과 유효성은, 본원에 제시된 바와 같이, 특정 성질을 갖는 세포 하위-집단을 특징지을 수 있음으로써 향상된다.
본원은, 재생 기능 및 외배엽, 중배엽 및 내배엽 계통 세포로의 다중계통 분화능을 갖는, 단일 세포로부터 유래하는 MLSC 라인의 매우 균질한 집단을 임의의 다른 신체 샘플, 특히 뼈 골수로부터 격리하는 새로운 방법을 제시한다. 줄기세포를 분리하기 위해 항체를 이용할 필요없이 밀도-구배 원심분리 및 단핵세포 분획 단계를 제거함으로써, 본 발명의 하위-분획 배양 방법은 단순하고 효율적이고 경제적 절차로 및 치료 상황에 대해 더욱 안전하게 더 균질한 MLSC의 집단을 생성시킨다.
내배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/형질전환제
내배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/형질전환제는, 간, 폐, 췌장, 갑상선 및 장 세포와 같은 유형의 세포를 위해, 간세포 성장 인자, 온코스타틴-M(oncostatin-M), 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자-4, 베이직 섬유아세포 성장 인자, 인슐린, 트랜스페린(transferrin), 셀렌산(selenius acid), BSA, 리놀렌산, 아스코베이트 2-포스페이트, VEGF 및 덱사메타손과 같은 제제를 포함한다.
중배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/형질전환제
중배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/형질전환제는, 연골세포, 뼈세포, 지방세포, 근육 세포 및 혈액 세포와 같은 유형의 세포를 위해, 인슐린, 트랜스페린, 셀렌산, BSA, 리놀렌산, TGF-β1, TGF-β3, 아스코베이트 2-포스페이트, 덱사메타손, β-글리세로포스페이트, 아스코베이트 2-포스페이트, BMP 및 인도메타신과 같은 제제를 포함한다.
외배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/형질전환제
외배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/형질전환제는, 신경세포, 피부 세포, 뇌 세포 및 눈 세포와 같은 유형의 세포를 위해, 디부티릴 사이클린 AMP, 이소부틸 메틸잔틴, 인간 상피 성장 인자, 베이직 섬유아세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자-8, 뇌-유도된 신경영양(neurotrophic) 인자 및/또는 다른 신경영양 인자와 같은 제제를 포함한다.
경증 및 중증 급성 췌장염
급성 췌장염(AP)은 국소적 및 별도의 췌장 조직으로 연장할 수 있는 췌장의 급성 염증 상태이다. AP는 크게 경증 또는 중증으로 분류된다.
간질성 또는 부종 췌장염이라고 지칭되는 경증 AP는 최소 또는 전혀 기관의 기능상실 및 적절한 단순한 복구를 그 특징으로 한다. 전반적으로, AP 환자의 약 80 %는 경증 질환을 갖는다[89]. 주된 거시적 특징은 간질성 부종이다. 내부 및 췌장 주위의 지방조직의 지방분해가 통상적으로 관찰될 수 있다[90].
중증 AP는 기관 기능상실, 국소적 합병증, 또는 췌장 괴사의 존재를 의미한다. AP의 중요한 조직병리학적 발견은 간질성 부종, 괴사, 염증 및 출혈이다. 이러한 변경은 선 실질(glandular parenchyma), 혈관, 및 지방조직의 췌장 간질 및 손상으로의 용해성 췌장 효소 유리의 결과로 발생한다[91].
부종, 염증, 괴사 및 출혈의 위중도에 따른 AP는 부종성 췌장염(경증-AP)과 출혈/괴사성 췌장염(중증-AP)으로 확인될 수 있다.
이러한 췌장염 유형의 병인은 동일하지만, 병리학 및 임상적 발견은 손상의 정도에 따라 달라집니다. 또한, 임상적으로, AP 환자들은 하기 기준들 중 하나 이상으로 고생하는 경우 중증 AP를 갖는 것으로서 분류된다: (1) 기관 기능상실(90 mmHg 미만의 수축기 동맥 압력(=쇼크), pa02 = 60 mmHg 이하(=호흡 부족), 혈청 크레아티닌(creatinin) > 2 ㎎/dL(재수화 후)(=신장 장애), 500 mL/일 초과 속도에서 소화기 출혈의 증거); (2) 국소 합병증의 증거(괴사, 감염, 농양의 존재, 또는 가성(pseudocyst)); (3) 3 이상의 랜슨 점수(Ranson score), 및/또는 (4) 8 이상의 APACHE II 점수[92-95]. 랜슨 점수는 허용(admission) 후 48 시간 전에 완료할 수 없으며, APACHE II는 24 시간 이후에 계산될 수 있다.
췌장염의 치료
췌장염은 2개의 매우 다른 형태로 발생할 수 있는 췌장의 염증이다. 급성 췌장염은 급작스러운 것인 반면, 만성 췌장염은 지방변(steatorrhea) 또는 당뇨병의 유무에 관계없이 반복 또는 지속적인 복부 통증을 특징으로 한다.
췌장염의 유형은 급성 췌장염, 만성 췌장염 및 췌장 농양을 포함한다. 급성 췌장염은 췌장을 팽창시킨다(염증). 급성 췌장염의 가장 흔한 원인은 그들이 통상의 담관을 통과하면서 췌장에서 염증을 초래하는 담석-경화된 담즙으로 만들어진 작은 조약돌과 같은 물질-의 존재이다. 과도한 알코올 사용은 만성 췌장염의 가장 흔한 원인이며, 또한 급성 췌장염의 기여 요인이 될 수 있다.
덜 흔한 원인은 고중성지방혈증(하지만 고콜레스테롤혈증은 아님)을 포함하고, 오직 트리글리세라이드(triglyceride) 값이 1500 ㎎/dl(16 mmol/L)을 초과하는 경우에만, 고칼슘혈증; 바이러스 감염(예를 들면, 이하선염); (복부 또는 다른 신체 내의 곳에 대한) 외상, 예컨대 포스트-ERCP(즉, 내시경 역행 담췌관 조영술(Endoscopic Retrograde Cholangiopancreatography)); 혈관염(즉, 췌장 내의 작은 혈관의 염증), 및 자가면역 췌장염을 포함한다. 또한, 분리췌장(pancreas divisum), 췌장의 공통 선천성 기형은 재발 췌장염의 일부 경우의 기초가 될 수 있다.
만성 췌장염은 흉터와 기능 상실에 이르게 하는 췌장의 염증이다. 이는, 췌장으로 하여금 지방을 소화시키는 데 필요한 효소의 정확한 양을 생산할 수 없게 한다. 또한, 당뇨병으로 이어질 수 있는 인슐린 생산을 방해한다. 상기 상태는 가장 흔하게는 알코올 중독 및 알코올 남용으로 인해 발생한다.
췌장 농양은 췌장 내의 고름의 공동(cavity)이다. 췌장 농양은 감염될 췌장 가성낭종 환자로 전개될 수 있다. 췌장 농양 환자는 일반적으로 췌장염이 있었다.
지금까지, 의료 치료를 통해 완전히 AP를 예방하거나 질환 과정을 정지시키는 것은 불가능하였다. 이 연구에서, 우리는 세포-기반 치료 전략으로서 AP의 개선을 위한 hcMSC의 가치를 평가하였다. 우리의 연구의 주요 발견은 다음과 같다: (1) 우리의 새로운 프로토콜로부터 수득된 hcMSC는 시험관 내에서 다능(multipotential) 및 면역억제 속성을 갖고 있다. (2) hcMSC의 투여는, 췌장의 부종, 염증 세포의 침윤 및 세엽세포의 괴사를 보여주는, 중증-AP뿐만 아니라 경증-AP를 완화시켰다. (3) 랫에 대해 CM-DiI 표지된 hcMSC의 주입 후, hcMSC는 정상 췌장보다 심하게 상처난 췌장에서 더 많이 발견되었다. 흥미롭게도, 더 많은 hcMSC가 경증-AP보다 중증-AP에서 관찰되었고, 주입된 hcMSC은 랫 췌장에서 FISH 분석에 의해 인간의 염색체와 재결합하는 것이 관찰되었다. (4) hcMSC는 췌장 염증 중재자/사이토카인의 발현을 감소시켜 T-세포의 침윤를 억제시킬 뿐만 아니라 Foxp3+ 규제 T 세포의 상향조절(up-regulating)에 의해 췌장 기능을 복구하였다. 이는, AP를 앓는 동물 모델에서 염증 반응을 억제하는, 세룰레인(cerulein) 및 TCA에 의해 유도된 경증 및 중증 췌장 상처를 hcMSC이 개선시킨 다는 것을 보여주는 첫번째 보고서라고 생각된다.
AP는 아직 만족할만한 치료가 없는 예측 불가능한 임상 과정을 갖는 빈번한 위장 질환이다[48]. MSC 주입은 조직 손상의 복구에 유리할 뿐만 아니라, MSC는 동종 또는 이종 조건에서 사용하도록 허용하는 면역억제 성질을 갖는다[49]. 이 연구에서는, 우리는 인간 BM으로부터 MSC의 새로운 집단을 격리시키고 이를 특성화하였으며, 이를 hcMSC라고 부른다. 우리는, hcMSC가 지방생성, 뼈발생 및 연골발생 세포를 포함하는 다양한 세포 계통으로의 시험관 내 다능성 분화, 및 MSC 표면 마커의 발현을 나타냄을 입증하였다. 또한, hcMSC는 랫와 인간 T 세포 증식을 모두 억제하는 것으로 보인다. 이러한 발견은, 새로운 프로토콜, SCM을 통해 수득된 hcMSC가 자가 재생, 분화 능력 및 이종 T 세포 억제 능력을 갖고 있음을 제시한다.
MSC 치료를 실행하기 위해, MSC는 부상의 부위에 도달하는 것이 중요하다. 일부 연구에서는, 전신계적으로 전달된 MSC가 사실상 신장, 폐, 간, 및 손상 후의 뒷다리에 이동될 수 있음을 지적하였다[50-53]. 췌장 조직에 대한 hcMSC의 기여를 평가하기 위해, 우리는 2개의 hcMSC 세포 트랙 마커를 사용하였다: FISH에 의한 CM-DiI 및 인간-특이적 염색체의 동원체. 사전-표지화 후 이식된 줄기세포를 추적하기 위해 여러 연구에서 형광 염료 CM-DiI가 사용되었다[54, 55]. 그러나, 드문 경우이지만, 산란된 자가형광(autofluorescent) 세포의 존재는 마커의 특이성을 제한하며, 따라서 그것은 더욱 특이적 기법인 동일반응계 하이브리드화(in situ hybridization)를 사용하여 우리의 발견을 확인하는 것이 중요하다. 우리의 연구에서는, 우리는, 상당수의 CM-DiI-표지된 hcMSC가 췌장의 염증 부위로 이동하고 경증- 및 중증-AP 랫의 췌장에 있는 인간-특이적 염색체 동원체와 재결합한다는 것을 관찰하였으며, 이는 주입된 hcMSC가 손상된 췌장 내에 잘 혼입된다는 것을 제시한다. 놀랍게도, 경증-AP보다 중증-AP에서 더 많은 hcMSC가 검출되었다. 이는, 조직 손상은 손상의 정도, hcMSC 주입의 기간, 및 hcMSC의 세포 수에 따라 다르게 쉽게 조정되는, 췌장에 대한 hcMSC 이동 및 hcMSC의 활성에 있어서 중요한 역할을 담당할 수 있는 것으로 나타낸다(도 18A 내지 18C). 다른 조직에서의 hcMSC의 분포 데이터는, 손상된 췌장과 비교하여, 매우 적은 수의 hcMSC가 폐, 간, 비장 및 신장에서 관찰된 것으로 나타났다. 우리의 결과에서는, hcMSC이 우선적으로 전신계 면역억제에 대한 필요없이 손상된 췌장으로 이동하고, 기관 내에 유지하고, 그곳에서 콜로니를 형성하고, AP의 치유에 기여하는 것에 대해 시사하는 것이다.
조직 손상의 부위로 이동할 수 있는 능력 때문에, MSC는 급성 질환의 조직 복구를 위한 유망한 치료 방식으로서 사용되었다. MSC 주입은 급성 폐 손상, 심근 경색, 이식편 대 숙주 질환 및 신장 손상 등의 심각한 부상의 여러 모델에 유익한 효과를 보이고 있다[56-58]. 그러나, 지금까지 연구들에서는, 췌장염에 대한 세포 치료의 잠재적인 역할을 조사한 적이 거의 없다. 이전 연구는 췌장소도(pancreatic islet)에 초점을 맞추고 있다[59, 60]. 따라서, 우리는 경증- 및 중증-AP에 대한 hcMSC의 효과를 조사하였다. 우리의 2가지 AP 모델에서, hcMSC는 췌장 부종 및 상대 췌장 무게의 감소, 및 모든 조직학적 변화의 완화에 의해 검툴된 바와 같이 췌장 기능을 상당히 완화시켰다. 우리는 또한 hcMSC가 아밀라아제, 리파아제 및 MPO의 증가를 감소시킴을 확인하였다. 이러한 결과는, hcMSC가 세엽세포의 미세 구조를 복원함으로써 AP 도중 생성된 췌장 손상을 제한하는 잠재적 능력이 있다는 것을 제시한다. 최근 마라체(Marrache) 등[61]은, BM-유도된 전구세포가 실험실 상의 만성 췌장염에서 췌장 조직 복구에 기여한다고 보고하였다[61]. 그러나, 마라체 등과 본 발명 사이에는 세포 및 모델 유형의 측면에서 적어도 2가지 주요 차이점이 있다. 마라체 등은 만성 췌장염의 마우스 BM으로부터 수득된 전구세포를 사용하는 공통유전자 투여(syngeneic administration)를 실시한 반면, 본원은 AP에서 인간 BM의 클론성 MSC와 함께 이종 투여를 개시하였다. 이러한 결과를 바탕으로, hcMSC는 임상적 사용의 더 큰 가능성이 있다.
염증은 AP의 병리에 있어서 중요한 역할을 한다. 질환의 증상은 췌장염의 과정에서 방출된 프로- 및 항염증성 사이토카인에 의해 중재된다[62]. 프로-염증성 사이토카인으로서의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6은 주로 AP 동안 생성된다[63, 64]. 마사무네(Masamune) 등[65] 및 쿠조크레아(Cuzzocrea) 등[66]의 연구에서는, TNF-α, IL-1β 및 IL-6에 대항하는 안티-사이토카인 요법은 AP의 실험 동물 모델에서 보호 효과를 나타냈음을 보고하였다[65, 66]. 또한, 이시바시(Ishibashi) 등의 연구[67]에서는, 중증-AP가 TNF-a와 IL-6의 수준을 증가시켰다고 보고하였다[67]. 또한, IFN-γ는 다양한 종류의 염증성 질환에 관여할 것으로 추정된다[68, 69]. 사실상, 하야시(Hayashi) 등은, 경증-AP가 췌장 조직 손상 및 대규모 호중구 침윤과 함께, IFN-γ mRNA 및 단백질 모두의 췌장내(intrapancreatic) 발현을 증강시키는 것으로 관찰하였다[88]. 또한, TGF-β와 iNOS의 보강된 생성은 인간 및 실험 췌장염의 병인과 관련되어 있다[70-72]. 프로-염증성 사이토카인에 대비하여, 주요 항염증성 사이토카인으로서 IL-4 및 IL-10 블록 염증이 있다[73, 74]. AP에서 IL-4, IL-10에 대한 입수 가능한 정보는, 논쟁 중이며, 다른 연구에서는 수득된 결과들에서 큰 변동을 나타낸다[75-79]. 높은 수준의 IL-4와 IL-10은 췌장염을 앓는 인간 및 동물 모델에서 문서화된 반면[75, 80, 81], 라베다(Laveda) 등 및 장(Zhang) 등은, AP에서 IL-4 및 IL-10이 낮은 수준으로 존재하고, 외인성 IL-4 및 IL-10의 투여는 급성 손상에 대항하여 췌장을 보호하는 것으로 보고하고 있다[76, 77]. 이 연구에서는, 우리는, hcMSC가 경증- 및 중증-AP에서 항염증성 사이토카인을 감소시킴과 동시에, 프로-염증성 사이토카인, 예컨대 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 기타 염증성 사이토카인, 및 중재자의 발현을 감소시키는 것을 관찰하였다. 장 등 및 구오(Guo) 등은, 인간 잇몸(gingiva)-유도된 MSC가 심근 경색 및 대장염에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ와 IL-17의 수준을 감쇠시키는 사실에 의해 입증되는 바와 같이, 유사한 결과를 보고하였다[82, 83]. 또한, 우리의 결과에서는, MSC가 급성 신장 손상 후 IL-4 및 IL-10의 수준을 증가시킨다고 보고한 세메도(Semedo) 등의 것과 일치하는 것이다[84].
이 점에서, 염증성 사이토카인과 중재자의 감소, 및 hcMSC에 의한 항염증성 사이토카인의 증가는 AP에서 병리학적 및 기능적 개선과의 관계를 설명할 수 있다. 최근 연구에서는, 다양한 염증 중재를 조절하는 MSC의 용량이 Foxp3+ 조절 T 세포에 의해 면역 반응을 억제할 수 있는 것에 집중하였다[45, 85]. 또한, Foxp3+ 조절 T 세포는 호중구와 CD4+ T 세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 보고하였다[86, 87]. 그러므로, 우리는, hcMSC가 Foxp3+ 조절 T 세포의 발현과 T 세포의 세포사멸의 유도를 야기하는 지를 확인하였다. 우리는, hcMSC가 조절 T 세포 생성을 유도하고 세포사멸을 통해 T 세포 증식을 억제할 수 있음을 확인하였으며, 이는 hcMSC-처리된 췌장 조직에서 감소된 T 세포 침윤를 초래한다.
결론적으로, 우리는, hcMSC가 랫에서 이종 T 세포 억제에 대한 능력을 갖고 것으로 나타났다. 가장 중요한 것은, hcMSC는 췌장의 손상을 개선할 수 있으며, 적어도 경증- 및 중증-AP를 앓는 랫에서 Foxp3+ 조절 T 세포 생성과 T 세포 증식의 억제의 유도를 통해 항염증성 효과를 발휘한다.
본 발명은 본원에서 설명된 특정 실시양태들에 의해 범위가 제한되지 않는다. 사실상, 이러한 본원의 설명에 덧붙여, 당업자에게는 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 본 발명의 다양한 변형이 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위에 속하는 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이를 제한하고자 하여 제공되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1-MLSC의 격리 및 세포 배양
인하대학교 의과대학(Inha University Medical School) IRB의 통지된 동의 및 양해를 얻은 후, 뼈 골수 검사를 받은 환자의 장골능선에서 채취된 폐기된 1ml 인간 뼈 골수 흡입물 1 ml를 완전한 성장 배지: 20 % 소 태아 혈청(FBS) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신과 함께 높은 또는 낮은 글루코스를 함유하는 둘베코의 개질된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium)(DMEM)(GIBCO-BRL, 라이프-테크놀로지스(Life-technologies), 미국 메릴랜드주) 15 ml와 혼합한 후, 100mm 배양 접시에서 배양하였다. 도 1에 제시된 바와 같이, 37 ℃, 5 % CO2에서 2 시간 배양한 후, 오직 세포 배양 상청액만을 새로운 접시로 전달하였다. 새로운 접시 안에서 2 시간 더 배양한 후, 상청액을 비코팅된, 콜라겐 또는 폴리리신-코팅된 접시에 전달되고, 2 시간 배양하였다(D1). 새로운 접시에 1회 더 전달한 후(D2), 상기 상청액을 새로운 접시에 전달한 후, 1일 동안 배양하였다(D3). 1일 및 2일 배양으로 2회 더 반복 실시하였다(각각 D4 및 D5). D4와 D5에서 성장한 단일 콜로니를 먼저 100mm 접시에 전달하고, 이어서 더 큰 배양 플라스크에서 확장된 상태로 유지시켰다. 일반적으로 100mm 플레이트 중 10 내지 14일 후, 0.25 % 트립신 및 1 mM EDTA(GIBCO-BRL)를 사용하여 세포를 수확하고, 10 % 디메틸 설폭 사이드(DMSO) 및 40 % FBS 중에 1 × 106 세포/ml에서 현탁시키고, 액체 질소 중의 1 ml 분취물에서 냉동시킨다(제 1 계대). 단일 콜로니의 박리 및 격리를 위해, 트립신/EDTA를 멸균 한 실린더를 사용하여 1 내지 2 분간 사용하였다. 세포가 일단 80 내지 90 % 혼합물에 도달하면, 트립신/EDTA를 사용하여 이를 회수하고 50 내지 100 세포/cm2에서 다시 도말하였다.
실시예 2-유동 세포 계측법 분석
단일 세포-유도된 콜로니로부터 격리되고 확장된 세포를, 세포 표면 단백질의 패널을 위해 제 3 또는 제 4 계대에 대해 유동 세포 계측법 분석에 의해 평가를 실시하였다. 세포는 트립신/EDTA의 처리로 75cm2 플라스크로부터 수확하고, PBS로 2회 세척하였다. 차단(blocking)을 위해 세포를 0.1 % 염소(goat) 혈청과 함께 PBS에서 배양하고, 세척 완충액(0.4 % BSA를 갖는 PBS)으로 2회 세척하였다. 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)(FITC) 또는 피 코에리트린(phycoerythrin)(PE)-공액결합된 항체와 4 ℃에서 40 분간 배양하였다. 시험된 항원은 매트릭스 수용기(CD13, CD44, CD105), 인테그린(CD29), PECAM(CD31), ALCAM(CD166), SH3 및 SH4(CD73), Thy-1(CD90) 및 조혈 계통 마커(CD34, HLA-DR, HLA 클래스 I)(BD 바이오사이언스즈 파민겐(BD Biosciences Pharmingen), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 포함하였다. 이어서, 세포 혼합물을 세척 완충액으로 2회 세척하고, 녹색 FITC 형광에 대해서는 525nm 필터를 적색 PE의 형광에 대해서는 575nm 필터를 장착한 형광-활성화된 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorter)(FACS)를 사용하여 분석하였다. 대조군으로서, 인간 중간엽 줄기세포(HMSC 8292, 캠브렉스 바이오 사이언스, 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)을 사용하였다.
실시예 3-다중계통 분화의 유도
연골발생, 뼈발생, 또는 지방생성 분화 실험을 위해 제 3 또는 제 4 계대의 세포를 이용한 펠렛 배양 검정을 사용하였다. 0.5 ml 배양액의 2 × 105 세포를 원심 침전시켜 펠렛을 제조하였다. 높은 글루코스와 20 % FBS를 포함한 DMEM 내의 하기 첨가제를, 각 계통에 대하여 연골발생 분화 배지: 6.25 μg/ml 인슐린(시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co), 미국 미주리주 세인트루이스 소재), 트랜스페린(시그마(Sigma)), 6.25 ng/ml 셀렌산(selenous acid)(시그마), 1.25 mg/ml BSA(시그마), 5.35 μg/ml 리놀렌산(시그마), TGF-β1 10 ng/ml(알앤디 시스템즈(R & D Systems), 미국 미네소타주 소재) 및 TGF-β3 10ng/ml(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재); 뼈발생 분화 배지: 50 μg/ml 아스코르베이트 2-포스페이트(시그마), 10-8 M 덱사메타손(dexamethasone)(시그마) 및 10 mM β-글리세로포스페이트(시그마); 지방생성 분화 배지: 50 μg/ml 아스코르베이트 2-포스페이트(시그마), 10-7 M 덱사메타손(시그마) 및 50 μg/ml 인도메타신(indomethacine)(시그마)을 사용하였다. 펠렛 배양물을 37 ℃, 5 % CO2에서 배양한 후, 배지를 3일 간격으로 교체하였다.
신경발생 분화를 위해, 격리하고 확장한 제 3 계대의 세포를, 기본 배지를 이용하여 농도 1 × 104 세포에서 6웰 배양 접시에 씨딩하였다. 24 시간 후, 기본 배지를 폐기하고, 신경발생 배지로 대체하였다. 세포를 1 mM 디부티릴 사이클린 AMP(dbcAMP, 시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재), 0.5 mM 이소부틸 메틸 산틴(IBMX, 시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재), 20 ng/ml 인간 상피 성장 인자(hEGF, 시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재), 40 ng/ml 베이직 섬유아세포 성장 인자(bFGF, 시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재), 10 ng/ml 섬유아세포 성장 인자-8(FGF-8, PEPROTECH INC, 미국 뉴저지주 로키힐 소재), 10 ng/ml 뇌-유도된 신경 인자(BDNF, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재) 에서 배양하였다. 1 × B27 보충제(GIBCO BRL, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)를 갖는 NEUROBASAL(상품명) 배지(GIBCO BRL, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)는 중추 신경계의 해마 및 기타 신경의 장기 생존을 위한 무혈청 기초 배지이다.
간원성 분화를 위해, 격리되고 확장한 제 4 계대의 세포를 농도 1 × 104 세포에서 60 mm 접시에 도말하였다. 24 시간 후, 20 mg/ml 간세포 성장 인자(알앤디), 10 ng/ml 온코스타틴-M(알앤디), 10 ng/ml 상피 성장 인자(시그마), 20 ng/ml 섬유아세포 성장 인자-4(알앤디), 10 ng/ml 베이직 섬유아세포 성장 인자(시그마), 50 mg/ml ITS + 프리믹스(premix)(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 6.25 μg/ml 인슐린, 6.25 μg/ml 트랜스페린, 1.25 mg/ml BSA, 5.35 mg/ml 리놀렌산), 0.1 μM 아스코르베이트 2-포스페이트(시그마), 10-8 M 덱사메타손(시그마)를 함유하는 분화 배지로 처리하였다. 배지를 3일 간격으로 교체하였다.
실시예 4-조직화학 및 면역조직화학 염색
조직화학 염색 및 면역조직화학 시험을 분화 배양의 시작 후 14일째 또는 21일째에 실시하였다. 분화 배지를 제거한 후, 펠렛을 PBS로 2회 세척하였다. 펠렛을 OCT 화합물(사쿠라 파인텍(Sakura Finetek), 미국 캘리포니아주 토런스 소재)과 함께 매립시키고, 6 μm 절편을 염색하였다. 조직을 톨루이딘 블루, 본 코사(von Kossa) 및 오일 레드-O로 각각 염색하여서 연골발생, 뼈발생 및 지방생성 분화를 제시하였다. 인간 콜라겐 유형 II에 대한 면역조직화학 염색을 실시하여 조직의 연골발생 분화를 제시하였다.
이어서, 신경세포의 면역조직화학 염색을 위해, 모든 웰을 99.9 % 에탄올로 고정하고, 마우스 항신경 핵 항원(NeuN, 10μg/ml) IgG 단클론 항체(케미콘(Chemicon), 미국 캘리포니아주 테메큘라 소재), 마우스 안티-네스틴(5 μg/ml) IgG 단클론 항체(케미콘, 미국 캘리포니아주 테메큘라 소재) 및 단클론 항아교세포 섬유 산성 단백질(anti-Glial Fibrillary Acidic Protein)(GFAP, 1:400, 시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)를 사용하여 실온에서 1 시간 표지화하였다. 그 다음, 세포를 PBS로 헹구고, 히스토스테인-플러스 키트(Histostain-Plus Kit)(지메드 레보레토리즈 인코포레이티드(Zymed Laboratories Inc.), 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)를 이용하여 면역 염색을 검출하였다. DAB는 색소원(chromogen)으로 작용하였다. 세포를 디지털 카메라로 촬영하여 신경 특이적 마커의 포지티브 발현을 평가하였다.
실시예 5-RNA 추출 및 RT-PCR 분석
TRIZOL(등록상표)(인비트로젠 캄파니(Invitrogen Co), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 시약을 이용하여 미분화 세포와 분화된 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA(1μg)는 역전사 시스템 키트(Reverse Transcription System Kit)(프로메가(Promega))를 이용하여 상보성 DNA를 합성하였다. 다음과 같은 각각의 계통을 위해 설계된 특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다: col-2(500 bp), 센스(sense): 5'-AAGATGGTCCCAAAGGTGCTCG-3'(SS101-F 서열번호 1) 및 안티센스(antisense): 5'-AGCTTCTCCTCTGTCTCCTTGC-3'(SS101-R 서열번호 2); 오스테오폰틴(330 bp), 센스: 5'-CTAGGCATCACCTGTGCCATACC-3'(SS102-F 서열번호 3 ) 및 안티센스: 5'-CGTGACCAGTTCATCAGATTCATC-3'(SS102-R 서열번호 4), PPAR-γ2(352 bp), 센스: 5'-GCTGTTATGGGTGAAACTCTG-3'(SS103-F 서열번호 5) 및 안티센스: 5'-ATAAGGTGGAGATGCAGGCTC-3'(SS103-R 서열번호 6), GAPDH(350 bp) : 센스: 5'-AACTCCCTCAAGATTGTCAGCA-3'(SS104-F 서열번호 7) 및 안티센스: 5'-TCCACCACCCTGTTGCTTGTA-3'(SS104-R 서열번호 8), NF-M(430 bp), 센스: 5'-GAGCGCAAAGACTACCTGAAGA-3'(SS105-F 서열번호 9) 및 안티센스: 5'- CAGCGATTTCTATATCCAGAGCC-3'(SS105-R 서열번호 10) 및 αFP(216 bp), 센스: 5'-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3'(SS106-F 서열번호 11) 및 안티센스: 5'-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3'(SS106-R 서열번호 12). PCR은, 95 ℃에서 1 분간 변성시키고, 56 ℃에서 1 분간 어닐링시키고, 72 ℃에서 1 분간 신장시키는 각각의 사이클을 갖는 35회 사이클로 실시하였다. 확장된 DNA 생성물을 1 % 아가로스 겔에서 진행하였다.
실시예 6-결과
실시예 6.1-뼈 골수 세포 콜로니의 격리 및 확장
도 1에 기재된 바와 같이, 하위-분획 배양 방법에 의해 인간 뼈 골수 줄기세포 또는 전구세포를 격리할 수 있는지를 검토하기 위해, 뼈 골수를 배지와 혼합하고, 오직 세포 배양 상청액만을 새로운 접시에 전달함으로써 분획된 상태를 유지하였다. 이 분획의 원리는 뼈 골수 줄기세포 또는 전구세포가 낮은 세포 밀도를 갖는다는 가설에 근거한 것이다. 일반적으로 D1과 D2의 접시에서 잘 격리된 단일 콜로니를 얻는 것은 불가능하였다. D1과 D2의 접시에서 분명한 형상과 크기로 관찰되는 적어도 몇 가지 다른 유형의 세포가 존재하며, 이는 골수-유도된 부착성 단층 배양액 중에서 세포의 불균질성이 나타난다. D1 또는 D2 배양 접시에서의 부착성 세포는, 이전 접시로부터의 세포 배양 상청액을 전달한 후 각각 7 내지 10일, 또는 14 내지 21일에서 집합체(confluence)에 이르렀다. D3, D4 및 D5 접시에서 잘 격리된 단일 세포-유도된 콜로니를 얻는 것이 가능하게 되었다. 초기 부착성 방추상 세포는, 이전 접시로부터의 배양 상청액을 전달한 후 14 내지 21일째에 단일 콜로니들로서 나타났다. D3, D4와 D5의 접시에서 각각 10개, 3개 및 3개의 단일 세포-유도된 콜로니들이 나타났다.
도 2는, 뼈 골수 세포의 최종 하위-분획 후 3일째 뼈 골수로부터의 격리된 다중계통 줄기세포의 형태적인 특성을 제시한다. 세포는 섬유아세포-유사 형태를 갖는다. 세포는 7일째에 일관적이고 균질한 형태를 갖는 집합체가 되었다. 격리된 MLSC의 6 계대 후, 일부(2 내지 3 % 미만) MLSC의 형태가 초기 계대들 중 하나와 비교하여 더 넓고 큰 형상으로 변화하였다. 격리되고 확장된 MLSC의 형태는 알려진 골수 간질 줄기세포와 유사한 방추상이다. 일단 약 200 내지 300개의 세포의 콜로니가 형성되면, 세포는 정상적인 섬유아세포와 같은 정도의 속도로 신속하게 증식하였다. D4와 D5의 접시의 개별 콜로니로부터 발생된 6개의 세포주 중에서, 4개의 세포주는 FACS 분석에 의해 분명한 표현형을 나타냈으며, 추가로 특성화하였다. 배양 접시 내의 70 내지 80 % 집합체에서 이들 세포주를 도 3에 나타낸다.
실시예 6.2-뼈 골수 세포주의 표현형의 특성화
단일 세포-유도된 뼈 골수 세포주의 표현형을 평가하기 위해, 표 1에 요약한 바와 같이, 세포 표면 단백질의 패널을 FACS 분석에 의해 분석하였다.
FACS 분석에 의해 검정된 격리된 MLSC 라인의 표면 단백질 발현의 요약
세포 표면 단백질 D4(#1) D4(#3) D5(#1) D5(#2) D5(#2,FGF)
CD 13 L L N L L
CD 29 H H I H H
CD 31 L L N N I
CD 34 L L N L L
CD 44 H H H H H
CD 73 L L N L I
CD 90 H H H H I
CD 105 H H I H H
CD 166 H H I H H
HLA-DR N L N N L
HLA-클래스 H H I H H
N-네거티브, L-낮음, I-중간, H-높음
결과에서는, 표면 발현의 전체 프로필들이 유사하였는 데, 예를 들어 모든 격리된 세포주들은 CD29, CD44, CD73(SH3, SH4), CD90, CD105(SH2), CD166, 및 HLA 클래스 I에 대해 강한 포지티브를 보였다. 그러나, 시험된 11개의 세포 표면 단백질 중에서, 각각의 세포주는 9개의 세포 표면 단백질의 발현에서 상대적으로 독특한 발현 프로파일 및 CD44 및 CD90에서 유사한 수준의 발현을 갖는다. 또한, D5(#1) 세포주는 CD31, CD34 및 HLA-DR에 대하여 네거티브이며, D5(#2)는 CD31, HLA-DR에 대하여 네거티브이지만, CD34에 대해서는 약간 포지티브인 반면, D5(#3)은 CD31, CD34 및 HLA-DR에 대해 포지티브이었다(도 4). 이러한 결과는 인간 뼈 골수 중에 몇 가지 다른 유형의 줄기세포가 존재함을 보여주고 있다.
도 5는, 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터 격리된 MLSC에 대해 어떠한 조혈 줄기세포의 세포 표면 단백질이 관찰되지 않는 것을 나타낸다. 유동 세포 계측법에서는, MLSC가 초기 조혈 줄기세포의 HLA-DR 및 CD34 마커 단백질에 대해 네거티브임을 제시하였다. HMSC8292(캠브렉스 바이오 사이언스, 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재) 세포를 대조군으로서 사용하였다. 이러한 결과는 격리된 MLSC가 조혈 줄기세포 표현형을 갖고 있지 않다는 것을 보여주고 있다.
격리된 세포주에서 몇 가지 대표적인 표면 단백질 마커인 CD31, CD105, CD73 및 CD34의 발현과 관련하여, 도 6 내지 9은 이들의 비교를 제시한다. 도 6은 본 발명의 하위-분획 배양 방법에 의해 뼈 골수로부터의 격리된 MLSC 라인에 대해 관찰된 세포 표면 단백질 CD31(PECAM)의 발현의 비교를 제시한다. FGF를 사용하는 D4(#1), D4(#3), D5(#1), D5(#2) 및 D5(#2)의 CD31의 발현은 FACS 분석에 의해 측정하였다. 확립된 MLSC 라인 D4(#3)는 CD31에 대해 약간 포지티브이지만, 다른 MLSC 라인들은 네거티브이다. 성장 배지의 FGF는 D5(#2)의 CD31의 발현을 증가시킨다. 이러한 결과는 D4(#3)가 분화능 및/또는 세포 기능에서의 여러 세포 특성을 갖는 것을 보여주고 있다.
도 7은 세포 표면 단백질 CD105(SH2)의 발현의 비교를 제시한다. 확립된 MLSC 라인 D5(#1)은 중간 수준의 CD105 발현을 보여 주지만, 다른 줄기세포 라인은 높은 CD105의 수준을 나타낸다.
도 8은 세포 표면 단백질 CD73(SH3, SH4) 발현의 비교를 제시한다. 확립된 MLSC 라인 D4(#1)은 매우 낮은 CD73의 발현 수준을 보이고, D4(#3) 및 D5(#2)는 중간의 발현 수준을 나타내지만, D5(#1)는 전혀 발현을 보여주고 있지 않다.
도 9는 세포 표면 단백질 CD34의 발현의 비교를 제시한다. 확립된 MLSC 라인 D4(#3), D4(#3) 및 D5(#2)는 낮은 CD73의 발현 수준을 나타내지만, D5(#1)는 전혀 CD34의 발현을 보여주고 있지 않다. 상기 결과는 각각의 줄기세포주가 분화능 및/또는 세포 기능에서 독특한 세포 특성을 갖는 것을 보여주고 있다.
실시예 6.3-뼈 골수 세포주의 다중계통 분화
단일 세포-유도된 뼈 골수 세포주의 분화능을 결정하기 위해, 각각의 세포-특이적 유도 배지에서, 연골발생, 뼈발생 및 지방생성 분화를 펠렛 배양 시스템에 의해 시험하고, 신경발생 및 간원성 분화를 통상의 세포 배양에 의해 시험하였다. 격리된 세포주 모두는 연골발생, 뼈발생, 지방생성, 신경발생 및 간원성 계통으로 분화하는 능력을 갖고 있었다(표 2). 4개의 격리된 MLSC 라인은 다양한 수준의 분화능을 제시하였다. 예를 들어, D5(#2) 줄기세포주는 연골세포, 뼈세포, 지방세포, 간세포 및 신경세포로 분화하는 능력을 갖고 있지만, 다른 것은 연골발생, 신경발생, 또는 간원성 계통에서 다양한 수준의 분화능을 갖고 있다.
격리된 MLSC 라인의 분화능의 요약
D4(#1) D4(#3) D5(#1) D5(#2) D5(#2, FGF)
연골발생 H H H H I
뼈발생 N L I H H
지방생성 H H H H H
신경발생 I H L H H
간원성 L L N H H
N-네거티브, L-낮음, I-중간, H-높음
실시예 6.4-뼈 골수 세포주의 연골발생 분화
제 3 또는 제 4 계대에서 4개의 단일 세포-유도된 뼈 골수 세포주를 연골형성 분화 배지(6.25 μg/ml 인슐린, 트랜스페린, 6.25 ng/ml 셀렌산(selenous acid) 1.25 mg/ml BSA, 5.35 μg/ml의 리놀렌산, 10 ng/ml TGF-β1 및 10 ng/ml TGF-β3)에서 펠렛 배양하였다. 처리 후 14 내지 21일째 연골발생 분화가 일어났다. 포지티브 톨루이딘 블루 조직화학 염색 및 면역조직화학 염색에 의한 콜라겐 유형 II-풍부 세포 외 기질이 분명하다(도 10). 일반 배양 배지에서 배양된 세포주는 네거티브 염색을 나타냈다.
실시예 6.5-뼈 골수 세포주의 뼈발생 분화
제 3 또는 제 4 계대에서 4개의 단일 세포-유도된 뼈 골수 세포주를 뼈발생 분화 배지(50 μg/ml 아스코르베이트 2-포스페이트, 10-8 M의 덱사메타손 및 10 mM β-글리세로포스페이트)에서 펠렛 배양하였다. 처리 후 14 내지 21일째 뼈발생 분화가 일어났다. 포지티브 본 코사 염색에 대해서는 뼈발생 분화 배지에서 성장한 세포에서 분명하였지만, 일반 배양 배지에서 성장한 대조 세포에서는 없었다(도 11).
실시예 6.6-뼈 골수 세포주의 지방생성 분화
제 3 또는 제 4 계대에서 4개의 단일 세포-유도된 뼈 골수 세포주를 지방생성 분화 배지(50 μg/ml 아스코르베이트 2-포스페이트, 10-7 M 덱사메타손 및 50 μg/ml 인도메타신)에서 펠렛 배양하였다. 처리 후 14 내지 21일째 지방생성 분화가 일어났다. 포지티브 오일 레드 O 염색에 대해서는 지방생성 분화 배지에서 성장한 세포에서 분명하였지만, 일반 배양 배지에서 성장한 대조 세포에서 염색이 검출되지 않았다(도 12).
실시예 6.7-뼈 골수 세포주의 신경발생 분화
제 3 또는 제 4 계대에서 4개의 단일 세포-유도된 뼈 골수 세포주를 신경발생 분화 배지(1 mM 디부티릴 사이클린 AMP, 0.5 mM 이소부틸 메틸잔틴, 20 ng/ml 인간 상피 성장 인자, 40 ng/ml 베이직 섬유아세포 성장 인자-8, 10 ng/ml 섬유아세포 성장 인자-8, 10 ng/ml 뇌-유도된 신경영양 인자)에서 배양하였다. 처리 후 14 내지 21일째 신경발생 분화가 일어났다. 포지티브 GAFP, NeuN 및 네스틴 염색에 대해서는 신경발생 분화 배지에서 성장한 세포에서 분명하였지만, 일반 배양 배지에서 성장한 대조 세포에서 염색이 검출되지 않았다(도 13).
또한, FGF와 함께 성장한 격리된 MLSC의 신경발생 분화를 제시한다. GFAP, 네스틴 및 NeuN 항체에 의한 면역조직학적 염색은, 신경발생 분화된 MLSC가 신경발성 유도 후 7 및 14일째에, 염색에 대해 매우 포지티브인 것으로 나타났다. 신경발성 유도 배지에서 FGF와 함께 성장한 MLSC도 아교세포 특이적 단백질(GFAP), 초기 및 후기 신경세포 마커 단백질, 네스틴 및 NeuN을 각각 합성할 수 있고, 신경세포로 분화될 수 있다. 이는 격리된 세포를 FGF와 함께 배양하면 신경발생 분화능이 변화하지 않은 것을 나타내고 있다.
실시예 6.8-뼈 골수 세포주의 간원성 분화
제 3 또는 제 4 계대에서 4개의 단일 세포-유도된 뼈 골수 세포주를 20 mg/ml 간세포 성장 인자(알앤디), 10 ng/ml 온코스타틴-M(알앤디), 10 ng/ml 상피 성장 인자(시그마), 20 ng/ml 섬유아세포 성장 인자-4(알앤디), 10 ng/ml 베이직 섬유아세포 성장 인자(시그마), 50 mg/ml ITS + 프리믹스(벡톤 디킨슨, 6.25 μg/ml 인슐린, 6.25 μg/ml 트랜스페린, 1.25 mg/ml BSA, 5.35 mg/ml 리놀렌산), 0.1 μM 아스코르베이트 2-포스페이트(시그마), 10-8 M 덱사메타손(시그마)를 포함하는 간원성 분화 배지에서 배양하였다. 배지를 3일마다 교환하였다(도 15).
실시예 6.9-뼈 골수 세포주의 연골, 뼈, 지방, 신경 및 간세포-특이적 유전자 발현
단일 세포-유도된 뼈 골수 세포주의 연골, 뼈, 지방, 신경 및 간세포-특이적 유전자의 발현을 측정하기 위해, 제 4 또는 5 계대의 세포를 사용하여 RT-PCR 분석을 실시하였다. 분화된 세포에서 연골(콜라겐 유형 II), 뼈(오스테오폰틴), 지방(PPARγ2), 신경(NF-M) 및 간세포(αFP)의 계통 특이적 유전자 발현을 검출하였다(도 16). 반면, 이 유전자는 미분화된 대조 세포 중에서는 발현하지 않았다. GAPDH의 발현을 내부 대조군으로서 사용하였다. 이러한 결과에서는, 격리된 MLSC가 각각의 특이적 분화 조건에서 세포 특이적 유전자를 발현시킬 수 있으며, 다중계통으로 분화될 수 있다는 것을 강하게 시사하고 있다.
실시예 6.10-뼈 골수 세포 계열의 사이토카인의 발현
도 17은 격리된 MLSC 라인에서의 사이토카인 분비를 제시한다. MLSC 배양 상청액의 분취물(50 내지 100μl)을 Quntikine(등록상표) 인간 TGF-β1, b-NGF, LIF, IL10, HGF, IL2, TGF-α 및 IL12을 이용하여 ELISA로 분석하였다. TGF-β1, LIF, TGF-α와 IL10은 높은 수준의 분비를 나타냈지만, 다른 것은 분비가 낮거나 분비를 보이지 않았다. 격리된 MLSC에 의한 높은 수준의 TGF-β1 분비는, 이 줄기세포가 T 세포의 활성화를 억제에 관여할 수 있는 것을 보여주고 있다. 또한, LIF, TGF-α 및 IL10과 같은 상대적으로 높은 수준의 다른 사이토카인은 이러한 세포가 면역조절 활성을 가질 수 있음을 시사하고 있다.
실시예 7-췌장염의 치료 방법
실시예 7.1-세포 준비 및 특성화
BM 흡인물이 (인하대학교 의과대학 IRB(Institutional Review Board)에 의해 승인된) 통지된 동의를 얻은 후에 건강한 여성 공여자의 장골능선에서 촬영하였다. 앞서 기재된 바와 같이, hcMSC의 분리가 이루어졌다[43]. 확립된 hcMSC 라인, KYJ-D2-# 1은 유동 세포 계측법에 의해 일부 줄기세포 마커에 대해 특성화되었다. 분석에 사용되는 항체, 안티-CD14, 안티-CD29, 안티-CD31, 안티-CD34, 안티-CD44, 안티-CD73, 안티-CD90, 안티 CD105, 안티 CD106, 안티 CD119, 안티-CD133, 안티-CD166, 안티-CXCR-4, 안티-HLA 클래스 I, 안티-HLA-DR, 안티-인테그린-α6, 안티-PODXL, 안티-Oct-4, 안티-SSEA-4, 및 안티-Strol 항체(BD 바이오사이언스즈 파민겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재). 세포 FACSCalibur 흐름 cytometer에 (BD Biosciences의)에서 분석하였다. 이소 유형-대조군 항체는 대조군으로 사용 하였다.
실시예 7.2-시험관 내 지방생성, 연골발생, 간원성 및 뼈발생 분화
hcMSC를 6xl04 세포/웰의 밀도로 4-웰 플레이트에 도말하였다. 다음날, 하위-집합(subconfluent) 세포는 50 μg/mL 아스코르브산(시그마, 미국 미저리주 세인트루이스 소재), 10-7 M 덱사메타손(DEX; 시그마), 10 μg/mL 인슐린, 0.5 mM 1-메틸-3-이소부틸크산틴(IBMX; 시그마), 및 50 μg/mL 인도메타신(시그마)을 포함하는 지방생성 배지에서 배양하였다. 세포를 4 내지 5일간 지방세포로 분화시켰다. 세포를 4 % 포름알데히드로 고정한 후, 30분간 오일 레드 O로 염색하며, 이어서 10분간 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin)으로 카운터-염색하였다(counterstain). 연골발생 분화를 위해 펠릿 배양 시스템을 사용하였다. 2.0xl05 hcMSC를 15 mL 원뿔 튜브에 넣고, 스핀다운(spindown)에 의해 펠릿화하였다. 펠렛은 500 μL 혈청-부재 연골발생 배지(10 ng/mL TGF-β1(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재), 10 ng/mL TGF-β3(알앤디 시스템즈), 및 1 % 인슐린-트랜스페린-셀렌산 프리믹스(BD 바이오사이언스즈(BD Biosciences))로 보충된 α-MEM)에서 배양하였다. 연골발생 배지는 3주 동안 2일마다 변경하였다. 세포 펠렛은 OST 화합물(사쿠라 파인텍, 미국 캘리포니아주 토런스 소재)과 함께 매립시키고, 동결시키고, 8 mm 조각으로 절개한 후, 톨루이딘 블루로 염색하였다. 뼈발생 유도를 위해, 6xl04 세포/웰의 밀도로 4-웰 플레이트에서 씨딩된 hcMSC를 뼈발생 배지(10 % FBS, 50 μg/mL 아스코르브산, 10-8 M DEX, 10 mM β-글리세로포스페이트를 포함하는 α-MEM)에서 배양하였다. 뼈발생 배지를 3주 동안 3일마다 변경하였다. 세포를 4 % 파라포름알데히드를 사용하여 고정하고, 알리자린 레드(Alizarin Red) S 염색을 실시하였다.
실시예 7.3-hcMSC에 의한 면역억제
림프절 세포를 2개의 상이한 랫 스트레인(strain)으로부터 격리시키고, 각 스트레인의 1 x 105 세포를 96-웰 플레이트에서 동시 배양하였다. T-세포 증식에 대한 hcMSC의 효과를 조사하기 위해, 지정된 세포 수의 hcMSC를 5일간 림프절 세포와 함께 동시 배양하고, [3H] 티미딘(1 μCi/웰)을 배양액의 최종 16시간에 첨가하였다. T-세포 증식에 대한 hcMSC의 효과는, [3H] 티미딘의 혼입에 의해 결정되었다. 랫으로부터의 격리된 림프절 세포를 상이한 자극으로 자극하고, hcMSC와 함께 동시 배양하였다. CD4+ T 세포를 게이트화하고, Foxp3, CD25 및 아넥신 V 발현을 유동 세포 계측법에 의해 분석하였다.
실시예 7.4-AP의 유도
경증-AP, 부종 췌장염을 2시간 간격으로 세룰레인(세룰레인)(시그마-알드리치, 미국 미저리주 세인트루이스 소재)의 3회 복강 주사에 의해 100 μg/kg 체중의 총 용량으로 유도하였으며, 각각의 주사에는 용량의 50 %를 포함한다. 중증-AP 모델을 위해, 중증 출혈성 췌장염을 앞서 기재된 바와 같이[44] 담즙 췌장관 내로의 소듐 타우로콜레이트(sodium taurocholate)(TCA)의 투여에 의해 유도하였다. 요약하면, 랫을 마취시킨 후 정중선에서 개복하고, 무딘 미세한 카테터를 담즙 췌장관 내에 도입하고, 통상의 담즙관을 결찰하였다(clip). 3 % TCA의 1 ml/kg 용액을 60초 동안 통상의 담즙-췌장관 내에 주입하였다. 그 다음, 카테터 및 결찰실을 제거하고, 십이지장 절개를 폐쇄하였다.
hcMSC의 농도는 우리의 예비 연구에 근거하며(도 18), hcMSC(1 × 106)를 CM-1,1'-디옥타데실-3,3,3'-테트라메틸인도-카보시아닌 퍼클로라이드(CM-DiI)로 표지하고, 각각 꼬리 정맥에 의해 세룰레인의 최종 주입과 수술 후 24 시간에 주입하였다. 조직학적 평가는 맹검 실험에서 췌장 조직 표본에서 수행되었다. 간질 부종은 다음과 같이 등급을 매겼다: 0 = 부재; 1 = 확장된 소엽사이막(interlobular septum); 2 = 확장된 소염내막(intralobular septum); 3 = 분리된 개별 소포(acini). 실질 괴사는 검사 영역의 병발(involvement) 비율로 등급화하였다: 0 = 부재; 1 = 1 내지 10 %; 2 = 1 내지 25 %; 3 = 25 % 초과. 염증 세포의 침윤은 다음과 같이 등급화하였다. 0 = 부재; 1 = 영역(field)당 20개 초과의 염증 세포(1OO× 배율); 2 = 20 내지 50개의 염증 세포/영역; 3 = 50개 초과의 염증 세포/영역.
실시예 7.5-역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의한 hcMSC 분화의 분석
hcMSC 분화는 지방생성(aP2, 퍼옥시좀 증식-활성화된 수용기 γ2, 및 지단백질 리파아제(LPL)), 연골발생(유형 II 콜라겐 α1 체인(Col2Al), 유형 X 콜라겐 α1 체인(CollOAl), 및 어그리칸(aggrecan)) 및 뼈발생(runx2 및 오스테오칼신(OCN)) 마커의 유전자 발현을 분석함으로써 확인되었다. 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)를 로딩 대조군으로서 사용하였다. RT-PCR 분석에 사용되는 PCR 프라이머 서열은 다음과 같다(F 및 R은 각각 정방향 및 역방향 프라이머를 나타내고, 어닐링 온도 및 증폭된 생성물 크기는 괄호 안에 기재되어 있다): aP2 (56 ℃, 252 bp) (F) 5'-CATCAGTGTGAATGGGGATG-3'(서열번호 13), (R) 5'-GTGGAAGTGACGCCTTTCAT-3'(서열번호 14); PPARγ2(60 ℃, 257 bp) (F) 5'-GACCACTCCCACTCCTTTGA-3'(서열번호 15), (R) 5'-CGACATTCAATTGCCATGAG-3'(서열번호 16), LPL(60 ℃, 717 bp) (F) 5'-TACAGGGCGGCCACAAGTTTT-3'(서열번호 17), (R) 5'-ATGGAGAGCAAAGCCCTGCTC-3'(서열번호 18); runx2(58 ℃, 336bp) (F) 5'- TATGAAAAACCAAGTAGCAAGGTTC-3'(서열번호 19), (R) 5'-GTAATCTGACTCTGTCCTTGTGGAT-3'(서열번호 20), OCN(56 ℃, 175 bp) (F) 5'-GTGCAGAGTCCAGCAAAGGT-3'(서열번호 21), (R) 5'-CTAGCCAACTCGTCACAGTC-3'(서열번호 22); Col2Al (56 ℃, 498bp) (F) 5'-TTTCCCAGGTCAAGATGGTC-3'(서열번호 23), (R) 5'-TCACCTGGTTTTCCACCTTC-3'(서열번호 24); CollOAl(57 ℃, 703 bp) (F) 5'-GCCCAAGAGGTGCCCCTGGAATAC-3'(서열번호 25), (R) 5'-CCTGAGAAAGAGGAGTGGACATAC-3'(서열번호 26); 어그리칸(aggrecan)(60 ℃, 350 bp) (F) 5'-GCTACACCCTAAAGCCACTGCT-3'(서열번호 27), (R) 5'- CGTAGTGCTCCTCATGGTCATC-3'(서열번호 28) 및 GAPDH (56 ℃ , 507bp) (F) 5'- AACGGATTTGGTCGTATTGG-3'(서열번호 29), (R) 5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'(서열번호 30)(56 ℃, 507 bp).
염증 중재자와 사이토카인에 대한 hcMSC의 효과를 시험하기 위해, 총 RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 TRIZOL 시약(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로 췌장 샘플로부터 추출하였다. 총 RNA의 분취물은 역전사시키고, 역전사 효소와 Taq DNA 중합효소(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 각각 사용하여 증폭하였다. PCR 생성물은 1.5 % 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 결과는 이미징 시스템(코닥 몰레큘라 이미징 시스템즈(Kodak Molecular Imaging Systems), 미국 코넥티컷주 뉴헤이븐 소재)에 의해 기록하였고, 밴드(band)는 농도계를 사용하여 정량화하였다.
실시예 7.6-효소결합면역흡착측정(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)(ELISA)
AP 혈청에서 TGF-β, TNF-α 및 IFN-γ의 분석을 위해, 우리는 랫 ELISA 키트(알앤디 시스템즈)를 사용하였다. 플레이트는 2 또는 4 ㎍/L 안티-TGF-β, TNF-α 및 IFN-γ 포획(capture) 단일 클론 항체(0.1 M Na2HP04 pH 9 완충액 중)로 밤새도록 코팅하고, 포스페이트 완충된 염수(PBS)-트윈(Tween) 20으로 세척하였다. 바이오틴-표지된 1 또는 2 ㎍/mL 안티-TGF-β, 안티-TNF-α, 및 안티-IFN-γ 검출 항체를 사용하였다. 플레이트는 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다아제(streptavidin-horseradish peroxidase)(벡터(Vector), 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재) 및 2,2-아지노-비스 기재(2,2-azino-bis substrate)(시그마)를 사용하여 현상시켰다.
실시예 7.7-조직병리학
췌장 샘플은 10 % 완충된 포름알데히드 중에 고정시키고, 파라핀 중에 매립시키고, 절개하였다. 8 μm-두께 섹션은 일상적인 조직학에 대한 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색하였다. H & E 염색을 위해, 섹션은 3 분 동안 헤마톡실린으로 염색하고, 세척하고, 추가로 3 분간 0.5 % 에오신으로 염색하였다. 물을 사용하는 세척 단계 후, 슬라이드는 70 %, 96 % 및 100 % 에탄올 중에서 탈수시킨 후, 크실렌 중에서 탈수시켰다. 앞서 기재된 바와 같이, 세엽세포 손상을 정량화하기 위해, 20개의 무작위로 선택된 현미경 영역을 등급화하였다[44]. 간단하게는, 부종은 0 내지 3로 채점하고(0: 부재; 1: 소엽 사이에서 집중적인 증가, 2: 소엽 사이에서의 확산적인 증가; 3: 소포 붕괴 및 분리), 염증 세포 침윤은 0 내지 3로 채점하였으며(0: 부재; 1: (관 주변) 관 내; 2: 소엽의 50% 미만으로 실질 내; 3: 소엽의 50% 초과로 실질 내), 소포 괴사는 0 내지 3로 채점하였다(0: 부재; 1: 5 % 미만의 관주변(periductal) 괴사; 2: 5 내지 20 %의 집중적인 괴사; 3: 20 내지 50 %의 확산 실질 괴사). TUNEL 염색은, 제조업자의 프로토콜에 따라 아폽태그 퍼옥시다아제 동일반응계 세포사멸 검출 키트(ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit)(케미콘/밀리포어(Chemicon/Millipore), 매사추세츠주 빌레리카 소재)를 수행하였다.
실시예 7.8-아밀라아제, 리파아제 및 미엘로퍼옥시다아제의 활성의 결정(MPO)
아밀라아제 활성은 발색 기질로서 시바크론 블루-아밀로스(cibachron blue-amylose)의 사용을 기반으로 하는 상용 키트(바이오어쎄이(Bioassay), 미국 캘리포니아주 헤이워드 소재)로 평가하였다. 혈청 0.1 mL 중의 가용성 발색단(chromogen)은 580 nm에서 분광 광도 측정하였다. 흡광도는 효소 활성에 대해 선형적 관계를 갖는다. 플라즈마 리파아제의 활성은, 제조업자의 지침에 따라, 상용 키트(바이오어쎄이)를 사용하여 측정하였다. 적정 방법은 리파아제에 의한 트라이올레인(triolein)의 분해, 및 그 결과로서 과산화수소(H2O2)의 형성에 이르게 하는 다이아세틸글리세롤(diacetylglycerol)의 방출를 기반으로 한다. 후자의 경우는 412 nm에서 비색법으로 측정할 수 있는 발색단의 형성으로 이어지는 류코 염료와 반응한다. 그 다음, 췌장 내 호중구의 격리는 조직 MPO 활성을 측정함으로써 평가하였다[45]. 조직 샘플을 50 mM의 포스페이트 완충액(pH 6.0) 중의 0.5 % 헥사데실트라이메틸-암모늄 브로마이드로 균질화하였다. 현탁액을 4회 사이클의 동결과 해동에 가하고, 추가로 초음파에 의해 붕괴시켰다(40 초). 샘플은 원심분리시키고(10,000 × g, 5 분, 4 ℃), 상청액 중의 MPO 활성은 기질로서 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)을 사용하여 630 nm에서 분광 광도 측정하였다. 결과는 단백질의 단백질 농도의 관점에서 수정하고, 조직의 단백질당 활성으로서 표현하였다(U/mg).
실시예 7.9-형광 동일반응계 하이브리드화(FISH) 분석
CM-DiI-표지된 hcMSC가 주입된 췌장의 슬라이드를 세척하고, 예열된 2 ℃ 표준 염수 시트레이트(standard saline citrate)(SSC) 완충액(pH 7.0)에서 30 분 동안 37 ℃에서 전처리하였다. 일련의(serial) 에탄올 탈수를 실시하고(1.5 분마다), 슬라이드를 실온에서 공기 건조시켰다. 조직을 3:1 에탄올:아세트산 중에 고정하고, 단백질분해효소 K(10 μg/mL; 시그마, 미국 미저리주 세인트 루이스 소재)로 37 ℃ 5 분 동안 소화시켰다. 조직을 물로 세척한 후, 3 분간 2 × SSC 중에서 세척하고, 공기 건조시키고, 빙냉의 70 %, 90 %, 100 % 에탄올을 통해 전달하고, 다시 공기 건조시켰다. 섹션을 70 % 포름아미드와 2 × SSC 완충액(pH 7.0)에서 2 분 동안 70 ℃에서 변성시키고(denature), 이어서 1.5 분 동안 빙냉의 70 % 에탄올로 켄칭시켰다(quench). 일련의 에탄올 탈수를 다시 시행하였다. 그 다음, FITC(STAR*FISH; 영국 케임브리지 캠비오 소재)로 표지된 인간 동원체 프로브의 혼합물을 10 분 동안 85 ℃로 가열한 후, 상기 섹션에 가하였다. 커버슬립(coverslip)을 첨가하고, 37 ℃에서 수화 슬라이드 박스 내에서 밤새 배양을 위해 고무 시멘트(rubber cement)로 밀봉하였다, 다음날, 커버슬립을 37 ℃에서 예열된 2 × SSC 버퍼(pH 7.0) 중에서 제거하였다. 섹션을 37 ℃에서 5 분 동안 2 × SSC 완충액 중의 예열된 50 % 포름아미드에서 2회 세척하고, 5 분 동안 예열된 2 × SSC 완충액에서 2회 세척하였다. 세척 후, 슬라이드를 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 및 안티-페이드(anti-fade) 용액 중에 장착하였다. 조직의 형광 염색은 공촛점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscopy)(칼 자이스 마이크로이미징(Carl Zeiss Microimaging), 뉴욕주 손우드 소재)에 의해 분석하였다. FISH 신호-포지티브 핵의 계수는 × 630 또는 × 1000 배율 하에서 FISH-염색된 조직을 영역-영역으로 체계적으로 검사함으로써 달성하였다.
실시예 7.10-면역조직화학
면역염색은 탈파라핀화(deparaffinization) 후 8 μm-두께 섹션 위에서 수행하였다. 마이크로파 항원 검색은 10 분 동안 시트레이트 완충액(pH 6.0)에서 수행한 후, 10 분 동안 PBS 중의 3 % H2O2로 퍼옥시다아제를 켄칭시켰다. 그 다음, 섹션을 물에 씻고, 10 분 동안 정상 염소 또는 토끼 혈청으로 예비 블로킹하였다(preblock). 1차 항체 반응에서, 슬라이드를 항체의 1:100 희석으로 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 섹션을 1 시간 동안 바이오틴화된(biotinylated) 2차 항체(1:500)와 함께 배양하였다. PBS를 사용하는 세척 단계 후, 스트렙타비딘-HRP를 적용하였다. 최종적으로, 섹션을 10 분 동안 다이아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 기재로 현상시킨 후, 헤마톡실린으로 카운터-염색하였다. 각 섹션의 5개 이상의 무작위 영역을 × 200의 배율로 검사하고, 컴퓨터 이미지 분석 시스템(미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics), 미국 매릴랜드주 실버 스프링 소재)으로 분석하였다.
실시예 7.11-세포 증식 및 유동 세포 계측법
인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 2명의 건강한 공여자로부터 격리시키고, 각 공여자의 1 × 105 PBMC를, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 위한 편평한 바닥의 96-웰 플레이트에서 동시 배양하였다. 림프절(LN) 세포를 SD 및 위스타(Wistar) 랫으로부터 격리시키고, 각 랫으로부터의 1 × 105 LN 세포는 MLR을 위해 동시 배양하였다. T-세포 증식에 대한 hcMSC의 효과를 조사하기 위하여, 지정된 세포 수의 hcMSC를 5 일 동안 PBMC 또는 LN 세포로 동시 배양하였다. 세포 증식은 배양 12 내지 16 시간 후 [3H] 티미딘(1 μCi/웰)의 혼입에 의해 결정되었다. 비장 세포는 SD 및 위스타 랫으로부터 격리시키고, 각 랫으로부터의 1 × 105 비장 세포를 MLR을 위해 동시 배양하였다. 그 다음, 2 × 105 비장 세포를 3 일 동안 편평한 바닥의 96-웰 플레이트에서 1 ㎍/mL 안티-CD3(2C11) 항체로 자극하였다. 세포 증식에 대한 hcMSC의 효과는 [3H] 티미딘의 혼입에 의해 결정되었다.
실시예 7.12-동물 실험
180 내지 200g 무게의 스프라그-돌리 랫(Sprague-Dawley rat)을 실험에 사용하였다. 동물 보호 및 모든 실험 절차는 의료 과학의 한국 아카데미(Korea Academy of Medical Science)에 의해 발표된 동물 실험 가이드(Guide for Animal Experiments)에 따라 수행하였다. 보충 방법(Supplementary Methods)에 기재된 바와 같이[43], 2개의 분리된 실험 AP 모델(경증- 및 중증-AP)을 사용하였다. 경증-AP의 유도 후, 40마리 랫을 무작위로 10마리 랫으로 4개의 군으로 나누었다; 대조군(n = 10), 대조군 + hcMSC(n = 10), 경증-AP(n = 10), 및 경증-AP + hcMSC (n = 10). 중증-AP 연구를 위해, 32마리 랫들은 4개의 군으로 나누었다; 대조군(n = 8), 대조군 + hcMSC(n = 8), 중증-AP(n = 8), 중증-AP + hcMSC(n = 8). 랫은 CM-DiI-표지된 hcMSC 주입한지 3 일 후에 머리제거(decapitation)에 의해 희생시키고, 혈액을 수거하고 원심분리하였다(500 × g, 25 분, 4 ℃). 보충 방법에 기재된 바와 같이, 혈청을 사이토카인 검출에 사용하였다[44]. 병리학적 손상의 평가를 위해, 췌장 섹션을 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)(H & E) 염색으로 염색 하고, 보충 방법에서 기재된 바와 같이 등급화하였다[44]. 또한, 췌장 조직을 보충 방법에 기재된 바와 같이 아밀라아제, 리파아제 및 미엘로퍼옥시다아제(MPO)와 같은 효소의 활성을 측정하기 위해 준비하였다[45]. 주입된 세포를 생체 내에서 추적하기 위해, 우리는 보충 방법에서 기재된 바와 같이 FITC로 표지된 인간 동원체 프로브를 위한 형광 동일반응계 하이브리드화(FISH)를 사용하였다.
데이터를 평균 + SD로서 표현한다. 통계 분석은 ANOVA를 사용하여 수행하였다. <0.05의 P-값이 통계적으로 유의적임을 나타내는 것으로 한다. 통계적 계산은 SPSS 소프트웨어 윈도우즈(버전 10.0; SPSS, 일리노이즈주 시카고 소재)를 사용하였다.
실시예 8-결과
실시예 8.1-hcMSC의 특성화
균질한 성체 줄기세포를 수득하기 위해, 우리는 앞서 기재된 바와 같이 SCM을 통해 건강한 여성 공여자로부터 다수의 hcMSC 라인을 격리시키고 확립하였다[32]. 이들 중에서, KYJ D2-#1라고 지칭되는 클론을 이 연구에서 선택하여 사용하였다. 플라스틱 배양 접시에서 배양하는 경우, 세포는 섬유아세포-유사 형상을 보였다(도 19A). 이들은 알려진 MSC 마커의 발현에 의해 확인되었다(도 19B). 또한, 이들은 배아 줄기세포 마커 Oct-4 및 SSEA4를 발현하였다(도 19B). hcMSC는 우수한 다중계통 가소성을 갖는 것으로 나타났다. 세포 유형-특이적 염색에서는, 그들이 지방생성, 뼈발생 및 연골발생 매질에 의해 시험관 내에서 유도되었을 때, hcMSC가 성공적으로 각각 지방세포, 뼈세포 및 연골세포로 각각 분화된 것으로 나타났다. 또한 RT-PCR 분석에서도, 분화 도중에 세포 유형-특이적 마커 유전자 발현의 상향조절을 검출하였다(도 191). 이러한 결과는 인간의 골수로부터 분리된 클론 세포는 MSC의 표현형을 갖고 있다는 것을 입증하였다.
실시예 8.2-hcMSC 주입 후 췌장의 조직학적 분석
세룰레인에 의해 유도된 경증-AP 군으로부터의 췌장 조직은 대조군 및 hcMSC 단독 주입된 군에 비해 유의적인 양으로 괴사와 함께 부종과 염증을 제시하였다(P < .05). 부종이 경증-AP에 비해 유의적인 차이를 보이지 않았던 반면, 소듐 타우로콜레이트 용액(sodium taurocholate solution)(TCA)에 의해 유도된 중증-AP 군은 더 깊은 괴사, 염증 및 출혈을 가졌다(데이터가 제시되지 않음). hcMSC은 경증- 및 중증-AP를 앓는 랫에 주입하였을 때, 부종 형성, 염증 세포 침윤 및 괴사는 모두 경증- 및 중증-AP + hcMSC에서 유의적으로 감소되었다(도 20A, P < .05 또는 P < .01). 사멸 세엽세포는 경증- 및 중증-AP 모두에서 증가하였다. 특히, 사멸 세포의 수는 경증-AP보다 중증-AP에서 현저하게 높았다. 그러나, hcMSC 주입 후, TUNEL-포지티브 세포사멸 세엽세포의 수는 경증- 및 중증-AP + hcMSC에 비해 각각 경증- 및 중증-AP에서 1.9 및 2.5 배 감소하였다(도 20B, P < .05 또는 P < .01).
실시예 8.3-췌장 마커에 대한 hcMSC의 효과
췌장염은 췌장 부종 및 높은 수준의 아밀라아제와 리파아제 모두와 같은 현저한 표시자를 갖는다. 이 연구에서는, 혈청 아밀라아제, 리파아제 및 췌장 부종은 정량화하여 췌장염의 위중도를 평가하였다. 도 20C에 제시된 바와 같이, hcMSC 주입 후의 혈청 아밀라아제와 리파아제 수치는 각각 경증- 및 중증-AP 군에서 40 % 및 50 % 감소하였다. 또한, 췌장 부종을 반영하는 췌장-체중 비율은 대조군에 비해 경증- 및 중증-AP 군에서 유의적으로 증가되었다(각각 2.1배 및 3.2배, P < .01). hcMSC가 경증- 및 중증-AP 랫에 주입하였을 때, 췌장 부종은 유의적으로 감소하였다(각각 1.5배 및 1.7배, P < .05). 호중구 분홍-보라색의 과립에 및 단핵세포 리소좀에 위치한 MPO는, 이러한 세포의 조직 침윤의 정도를 측정하는 데 사용할 수 있다. 예상된 바와 같이, hcMSC-주입된 랫의 MPO 활성도 또한 경증- 및 중증-AP 랫에서 유의적으로 억제되었다(P < .01).
실시예 8.4-hcMSC의 생체 내 추적
공촛점 현미경과 PCR 분석을 사용하여, 우리는 hcMSC가 hcMSC 주입 후 손상된 췌장으로 이동하는 지를 조사하였다. CM-1,1'-다이옥타데실-3,3,3'-테트라메틸인도-카보시아닌 퍼클로라이드(CM-DiI)는 hcMSC의 생체 내 세포 추적에 대한 표지화 시스템으로서 선택되었다. hcMSC는 균등하게 CM-DiI로 표지되고, 세포 표지는 염료 농도를 1 ㎍/L까지 최적화하여 달성되었다(도 21A). hcMSC-주입된 군에서 CM-DiI 표지된 세포는 경증- 및 중증-AP 군 모두에서 적색 형광을 나타냈다. 흥미롭게도, 경증-AP에 비해 중증-AP에서 더 많은 수의 CM-DiI 표지된-hcMSC가 발견되었다. 반면에, 췌장 손상없이 hcMSC 단독-주입된 군은 췌장 손상의 hcMSC-주입된 군에 비해 더 적은 수의 CM-DiI 표지된 세포를 보였다. 또한, 췌장 내에 있는 인간 세포의 존재는, 인간-특이적 AluI 서열을 위한 PCR에 의해 확인되고; AluI는 대조군에서 관찰되지 않는 반면, hcMSC 단독-주입된 군 및 경증- 및 중증-AP + hcMSC 군에서 검출되었으며(도 2 IB), 이는 CM-DiI-표지된 세포를 사용하는 공촛점 현미경 분석의 결과를 지지하는 것이다. 또한, 췌장에서의 것과 비교하여, 매우 더 적은 수의 CM-DiI 표지된-hcMSC가 폐, 간, 비장, 신장에 제시되었다(도 21C).
실시예 8.5-FISH 분석에 의한 hcMSC의 검출
인간 세포의 정체성(identification)을 더 입증하려면, 우리는 먼저 CM-DiI로 hcMSC을 표지한 후, 이들을 SD 랫 내에 주입하였다. 주입한 지 3일 후, 우리는 hcMSC로 주입된 경증- 및 중증-AP 랫으로부터의 췌장 표본에서 인간 염색체 동원체(녹색: FITC)를 사용하는, FISH에 의해 인간-특이적 염색체 DNA의 존재를 분석하였다. 경증- 및 중증-AP를 앓는 랫에 hcMSC 주입 후, hcMSC가 포지티브하게 CM-DiI(적색)로 염색한 영역에서, 오직 인간 염색체 동원체(hCEN)를 위한 녹색 형광 도트(dot)는 DAPI 염색의 청색 형광에 의해 식별되는 핵 내에서 검출되었다(도 22). 흥미롭게도, 경증-AP + hcMSC 군에 비해 더 많은 인간의 염색체가 중증-AP + hcMSC 군 내의 CM-DiI로 염색된 hcMSC에서 관찰되었다. 10개의 표본의 분석으로부터의 결과, 및 각 췌장으로부터의 10개의 다른 영역이 표 3(도 25)에 제시된다. 인간의 염색체 프로브를 위한 총 938 및 1282 하이브리드화 신호는 각각 경증- 및 중증-AP 군의 3353 및 3823 핵에서 확인하였으며, 절개 도중 핵의 절단, 촛점 평면 제한, 또는 불완전한 하이브리드화를 시사하는 것이다. 중증-AP + hcMSC 군에서의 CM-DiI-표지된 hcMSC의 인간 염색체 하이브리드화는 전체 핵의 30 %였으며; 이는 경증-AP + hcMSC 군보다 높았다(전체 핵의 20 %).
실시예 8.6-염증 반응에 대한 hcMSC 효과
그 다음, 우리는 AP와 연결되어 있는 염증 중재자의 발현 및 생성에 대한 hcMSC의 주입의 효과를 조사하였다. TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-15, IL-17, iNOS 및 TGF-β의 mRNA는 RT-PCR에 의해 증폭되었다. 도 23A에 제시된 바와 같이, hcMSC는 TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-15, IL-17, iNOS 및 TGF-β를 포함하는 염증 사이토카인 및 중재자의 발현 수준을 현저하게 감소시킨 반면, 이들은 경증- 및 중증-AP를 앓는 랫에서 IL-4 및 IL-10과 같은 항염증성 사이토카인의 발현을 증가시켰다(P < .05 및 P < .01). 또한, AP에서의 hcMSC의 광범위한 항염증성 활성이 전신계 염증 반응의 하향조절에 의해 달성되었으며, 이는 ELISA에 의한 TNF-α, IFN-γ, TGF-β의 감소된 생산을 보여준다( P < .05 및 P < .01)(도 23B).
실시예 8.7-hcMSC에 의한 T 세포 억제
AP를 앓는 랫에서의 hcMSC 효과를 조사하기 위해, 우리는 hcMSC가 랫 T 세포 증식을 억제할 수 있었는 지를 조사하였다. 랫의 각 스트레인의 1 × 105 림프절 세포를 MLR를 위해 배양하였다. 다양한 수의 hcMSC(5 × 103, 2 × 103, 1 × 103, 5 × 102, 2.5 × 102, 2 × 102)를 MLR에 첨가하고, 5일 동안 배양하였다. 도 24A에 제시된 바와 같이, MLR은 hcMSC에 의해 크게 억제되었다. hcMSC가 인간 PBMC와 함께 동시 배양하였을 때 유사한 결과를 얻었다. 우리는 12 내지 15 계대의 hcMSC가 심지어 1:1000 비율(hcMSC:LN 세포)에서도 효과적으로도 T 세포 증식을 억제할 수 있다는 것을 발견하였다. 최근의 증거에서는, MSC가 염증 관련 질환을 억제하는 조절 T 세포를 생성할 수 있을을 제시하였다[44-47]. 그러므로, 우리는 hcMSC와 동시 배양한 후에 랫 CD4+ T 세포에서의 Foxp3+ 발현을 측정하였다. 우리는 림프절 세포가 hcMSC와 동시 배양하는 경우 증가된 Foxp3+ 발현을 밝혀냈다(도 24B). 또한, 우리는 hcMSC와 동시 배양된 증가된 아넥신 V-포지티브 CD4+ T 세포를 관찰하였다(도 24C). 이러한 결과에서는, hcMSC-주입된 랫이 크게 감소된 CD3+ T 세포 침윤을 크게 감소시키고, 및 경증 또는 중증-AP를 앓는 랫의 췌장 조직에서 Foxp3+ 조절 T 세포의 발현을 증가시킴을 확인하였다(P < .05 및 P < .01, 도 24D 및 24E).
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당업계의 숙련자에게는, 통상의 실험을 사용하면 본원에 특별히 기재된 발명의 특정 실시양태들에 대한 많은 등가 형태를 인식할 것이며 또는 확인할 수 있다. 이러한 등가형태는 특허청구범위의 범위 내에 포함되는 것이다.
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Claims (20)

  1. 췌장염을 치료하거나, 췌장 부종를 감소시키거나, 췌장의 상대 중량을 감소시키거나, 세엽세포(acinar cell)의 집단을 증가시키거나, 췌장염을 앓는 대상의 세엽세포의 괴사를 예방하는 방법으로서,
    (i) 뼈 골수, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 또는 사이토카인-활성화된 말초 혈액의 생체 샘플을 수득하는 단계;
    (ii) 상기 뼈 골수, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 또는 사이토카인-활성화된 말초 혈액의 생체 샘플을, 용기 내에 침전시키는 단계;
    (iii) 상기 용기로부터 다른 세포에 비해 비교적 덜 밀집된 세포를 함유하는 상청액을 2회 이상 연속적인 방식으로 다른 용기에 전달하는 단계;
    (iv) 상기 상청액으로부터의 덜 밀집된 세포를 격리시키는 단계;
    (v) 단계(iv)에서 수득된 세포를 췌장염을 앓는 대상에게 투여하되, 여기서 상기 뼈 골수, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 또는 사이토카인-활성화된 말초 혈액은 단계 (i) 내지 (iii)에서 1,000 rpm 초과의 원심분리를 겪지 않은 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포의 샘플은 조직으로부터의 세포를 해리시키는 임의의 효소를 함유하지 않은 성장 배지와 혼합시키는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (ii) 및 (iii)를 3회 이상 실시하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 상청액으로부터의 격리된 세포를 용기 내에서 확장시키는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 용기가 평탄한 바닥을 갖는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 용기가 세포 접착제로 코팅되어 있는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 세포 접착제가 임의의 하전된 아미노산의 중합체를 포함하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 세포 접착제가 콜라겐, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트 또는 이들의 조합인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포의 샘플을 뼈 골수로부터 수득하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    다중계통 줄기세포 또는 전구세포의 단일 콜로니를 격리시키는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포의 생체 샘플을 임의의 원심분리를 겪기 전에 수득하는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포의 생체 샘플을 임의의 원심분리를 겪은 후에 수득하는 방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포의 생체 샘플의 원심분리를 배제하는 방법.
  14. 청구항 1에 있어서,
    세포의 특이적 항체 검출을 사용하지 않는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 췌장염이 보통 급성 췌장염인 방법.
  16. 청구항 1에 있어서,
    상기 췌장염이 중증 급성 췌장염인 방법.
  17. 청구항 1에 있어서,
    상기 대상을 전신계 면역억제 없이 치료하는 방법.
  18. 청구항 2에 있어서,
    상기 효소가 프로테아제인 방법.
  19. 청구항 1에 있어서,
    상기 대상을 치료의 효과에 대해 시험하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서,
    치료하기 전과 치료한 후, 또는 건강한 대조 조직과 비교하여, 상기 대상에서 췌장 부종의 감소, 췌장의 상대 중량의 감소, 세엽세포(acinar cell)의 집단에서의 증가, 또는 세엽세포의 괴사의 감소를 비교함으로써,
    상기 대상을 치료의 효과에 대해 시험하는 방법.
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