KR20130101689A - 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기 및 락툴로오스 생산 방법 - Google Patents

락툴로오스 합성용 마이크로 반응기 및 락툴로오스 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기 및 락툴로오스 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로 마이크로 반응기에 고정화된 베타-갈락토시다제에 의하여 유청 및 과당을 포함하는 기질과 반응시켜 경제적으로 프리바이오틱스의 하나인 락툴로오스의 생산이 가능하며, 생물학적인 연속 생산이 가능한 마이크로 반응기 및 락툴로오스 생산 방법에 관한 것이다.

Description

락툴로오스 합성용 마이크로 반응기 및 락툴로오스 생산 방법{MICRO REACTOR FOR SYNTHESIZING LACTULOSE AND METHOD OF SYNTHESIZING LACTULOSE}
본 발명은 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기 및 락툴로오스 생산 방법에 관한 것이다.
프리바이오틱스(prebiotics)란 대장에 존재하는 유익한 미생물의 성장이나 활성을 선택적으로 촉진하여 인간의 건강을 개선시키는 난소화성 물질이다. 상기 프리바이오틱스의 기능을 나타내는 물질은 대부분 당류이며, 이당류, 올리고당 및 다당류에 속하는 일부의 물질들이 이 부류에 포함된다. 상기 이당류 중 유당의 유도체인 락툴로오스가 대표적인 프리바이오틱스의 기능을 나타낸다.
상기 락툴로오스는 소장에서 분해되거나 흡수되지 않고, 대장에 존재하는 비피더스균 및 유산균과 같은 유익균에 의해 이용되며, 변비치료, 만성문맥계뇌증에 있어서 간성혼수의 치료 및 예방에 유용하게 사용되고 있다. 특히 영유아의 변비 및 임신 중 또는 분만 후 변비에도 장기간 안전하게 사용할 수 있는 물질이다.
현재, 락툴로오스의 생산은 화학적 합성방법이며, 알칼리 처리에 의한 에피머반응(epimerization)을 이용한다. 상기 화학적 합성방법은 반응산물인 락툴로오스 이외에 다양한 부산물의 생성으로 인하여 의약품 및 특별한 목적의 식품으로 적용 시, 고가의 다단계 정제공정이 수반되어야 하고, 고온고압의 반응 조건 때문에 위험성이 높고, 화학촉매와 유기용매의 사용으로 인한 공해가 발생할 수 있다.
이에 반해, 효소를 이용한 생물전환 합성방법은 반응에 있어 고도의 정밀성, 특이성, 선택성을 지니고, 소규모의 장치로도 생산이 가능하며, 환경 친화적이라는 장점을 가진다. 따라서 화학적 합성방법의 단점을 극복하기 위하여 생촉매인 효소가 알칼리촉매를 대체할 수 있다.
그러나, 생물전환 합성방법에서는 기질(substrate)로써 고가의 정제된 유당을 사용하고 있어 경제성이 낮고, 연속공정의 부재 등의 문제점을 가지고 있다.
대한민국 공개특허 제1989-0009958호 대한민국 공개특허 제1992-0000779호
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 기질로 유청 및 과당을 사용하여 락툴로오스를 연속적으로 합성하는 베타-갈락토시다제가 고정화된 마이크로 반응기를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 고정화된 베타-갈락토시다제에 의한 가수분해반응 및 당전이반응에 의하여 연속적으로 락툴로오스를 합성하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 유청 및 과당을 포함하는 기질이 반응하는 베타-갈락토시다제가 다중벽 탄소 나노튜브를 연결기로 하여 고정화된 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기를 제공한다.
본 발명은 베타-갈락토시다제, 완충용액 및 유당을 포함하는 반응 수용액을 제조하는 단계; 상기 반응 수용액 및 다중벽 탄소 나노튜브를 포함하는 용액을 마이크로 반응기에 주입하여 상기 베타-갈락토시다제를 상기 마이크로 반응기에 고정시키는 단계; 및 유청 및 과당을 포함하는 기질을 상기 마이크로 반응기에 주입하여 반응시키는 단계를 포함하는 락툴로오스 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기는 기존의 락툴로오스 생산에 사용되었던 기질인 고가의 정제된 유당 대신에, 유청을 사용하여 경제적이며, 락툴로오스의 연속적인 생산이 가능하다.
또한, 본 발명의 락툴로오스 생산 방법은 락툴로오스의 연속 합성방법으로, 공정의 경제성을 향상시킬 수 있으며, 유당함유 폐액 등을 적극적으로 활용함으로써 자원을 재활용 할 수 있고, 프리바이오틱스 생산 산업 전반에 이용될 수 있다.
또한, 기질로서 유청을 사용함으로써, 폐기되는 유청의 이용가치를 높이고, 폐기 및 환경정화의 비용을 감소시킬 수 있으며, 락툴로오스의 생산 비용을 절감시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 마이크로 반응기를 나타내는 평면도이다.
도 2는 본 발명의 마이크로 반응기를 포함하는 마이크로 반응 시스템을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 마이크로 반응기의 표면에 베타-갈락토시다제의 고정화 전을 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 마이크로 반응기의 표면에 베타-갈락토시다제의 고정화 후를 나타내는 사진이다.
도 5는 마이크로 반응기 내에 주입되는 기질의 유속에 따른 락툴로오스의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 6은 시간에 따른 기질 및 반응 생성물의 농도를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 유청 및 과당을 포함하는 기질이 반응하는 베타-갈락토시다제가 다중벽 탄소 나노튜브를 연결기로 하여 고정화된 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기를 제공한다.
유청(乳淸)은 우유가 엉겨서 응고된 뒤 남은 액체이며, 훼이(Whey) 또는 유장(乳漿)이라고도 한다. 보통 치즈나 카세인 제조 과정에서 부산물로 생성되며, 몇몇 상업적인 용도로 이용된다. 유당은 락토오스(lactose), 젖당이라고도 하며, 우유의 대표적인 탄수화물로 1 분자의 글루코오스와 1 분자의 칼락토오스로 구성되어 있는 이당류이다.
갈락토시다제(galactosidase)는 알릴 및 알킬-D-갈락토시드를 가수분해하여 갈락토오스를 생성하는 효소이다. 또한, 가수분해와 함께 갈락토오스 잔기를 다른 당, 알코올 및 페놀로 전이하는 갈락토시드 전달효소 작용도 한다. 상기 갈락토시다제는 알파형 및 베타형으로 구분되며, 상기 베타-갈락토시다제는 락타아제라고도 하고, 베타-D-갈락토시드 외에 유당에도 작용한다.
대장에 존재하는 유익한 미생물의 성장이나 활성을 선택적으로 촉진하여 인간의 건강을 개선시키는 난소화성 물질인 프리바이오틱스(prebiotics) 중 하나인 락툴로오스는 소장에서 분해되거나 흡수되지 않고, 대장에 존재하는 유익균, 주로 비피더스균과 일부 유산균에 의해 이용되며, 변비치료, 만성문맥계뇌증에 있어서 간성혼수의 치료 및 예방에 유용하게 사용되고 있고, 특히 영유아의 변비 및 임신 중 또는 분만 후 변비에도 장기간 안전하게 사용할 수 있는 물질이다.
상기 베타-갈락토시다제가 탄소 나노튜브 중 하나인 다중벽 탄소나노튜브가 흡착된 마이크로 반응기의 표면에 고정화되고, 상기 다중벽 탄소나노튜브는 상기 베타-갈락토시다제의 연결기(linker)역할을 한다. 베타-갈락토시다제가 고정화된 마이크로 반응기는 유청을 기질로 하여 프리바이오틱스 중 하나인 락툴로오스를 생산할 수 있다.
구체적으로 상기 유청 및 과당을 포함하는 기질을 고정화된 베타-갈락토시다제는, 유청에 포함된 유당을 글루코오스 및 갈락토오스로의 가수분해반응시키고, 상기 갈락토오스와 과당 사이의 당전이반응에 의하여 락툴로오스를 합성할 수 있다.
상기 베타-갈락토시다제의 고정화를 통하여, 락툴로오스의 연속적인 생산이 가능하다. 또한, 종래에 락툴로오스의 합성에 이용되었던 기질로 고가의 정제된 유당을 유청으로 대체함으로써 경제성을 향상시킬 수 있다.
기질에 포함되는 상기 유청은 유당, 즉 락토오스를 10 내지 30%(w/v)으로 포함하는 것이 바람직하며, 상술한 범위를 만족할 경우, 락툴로오스의 생산성을 향상시킬 수 있고, 고온의 조건에서 유당의 농도로 30%(w/v)를 초과할 경우, 부가 반응에 의하여 부산물이 생성되어 락툴로오스의 생산성이 저하되는 문제점이 있다.
본 발명은 베타-갈락토시다제, 완충용액 및 유당을 포함하는 반응 수용액을 제조하는 단계; 상기 반응 수용액 및 다중벽 탄소 나노튜브를 포함하는 용액을 마이크로 반응기에 주입하여 상기 베타-갈락토시다제를 상기 마이크로 반응기에 고정시키는 단계; 및 유청 및 과당을 포함하는 기질을 상기 마이크로 반응기에 주입하여 반응시키는 단계를 포함하는 락툴로오스 생산 방법을 제공한다.
구체적으로, 베타-갈락토시다제를 마이크로 반응기에 고정화시키기 위하여 상기 베타-갈락토시다제를 전처리하는 단계로, 베타-갈락토시다제, 완충용액 및 유당을 포함하는 반응 수용액을 제조한다. 상기 완충용액은 인산 완충용액인 것이 바람직하며, 전처리 물질로 유당을 사용한다. 상기 유당은 베타-갈락토시다제와 반응을 통하여 효소의 활성부위(active site)를 보호하는 역할을 한다. 즉, 유당에 의한 전처리 과정을 거치지 않는 경우, 상기 베타-갈락토시다제의 활성부위에서 다중벽 탄소 나노튜브와 공유결합이 형성되어 효소의 활성이 낮아지는 문제점이 있다. 따라서, 이를 극복하기 위하여 베타-갈락토시다제와 유당을 전처리에 의하여, 활성부위에서의 결합과 해리를 거쳐, 다중벽 탄소 나노튜브가 활성부위 이외의 부위에서 공유결합을 형성시킬 수 있다.
다음 단계로, 상기 베타-갈락토시다제를 전처리하여 제조된 반응 수용액은 다중벽 탄소 나노튜브를 혼합하여 마이크로 반응기에 주입하여 마이크로 반응기 표면에 베타-갈락토시다제를 고정화시키는 단계를 포함한다. 이때, 상기 베타-갈락토시다제 및 다중벽 탄소 나노튜브를 혼합하고, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC·HCl)를 첨가하여 반응시키는 것이 바람직하다.
상기 베타-갈락토시다제가 포함된 용액을 마이크로 반응기에 10 내지 30℃ 온도 조건에서 1 내지 10㎕/분의 유속으로 주입하여 마이크로 반응기에 고정화 시키는 것이 바람직하다.
기질에 포함되는 상기 유청은 유당, 즉 락토오스를 10 내지 30%(w/v)으로 포함하는 것이 바람직하며, 상술한 범위를 만족할 경우, 락툴로오스의 생산성을 향상시킬 수 있고, 고온의 조건에서 유당의 농도로 30%(w/v)를 초과할 경우, 부가 반응에 의하여 부산물이 생성되어 락툴로오스의 생산성이 저하되는 문제점이 있다.
상기 기질을 마이크로 반응기에 주입하여 반응시키는 단계는 37 내지 57℃ 온도조건에서 반응되는 것이 바람직하며, 상술한 범위를 만족할 경우, 마이크로 반응기 내에 고정화된 베타-갈락토시다제가 활성 상태로 기질인 유청이 락툴로오스로로 전환되는 효율이 우수하다.
상기 기질을 마이크로 반응기에 0.1 내지 20㎕/분 속도로 주입하는 것이 바람직하다. 상술한 범위를 만족할 경우, 마이크로 반응기 내에서 기질의 체류시간이 증가되어 효소인 베타-갈락토시다제와 충분히 반응할 수 있어 락툴로오스의 생산성이 증가된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
1. 마이크로 반응기 제조
도 1은 마이크로 반응기의 평면도로, 마이크로 채널(microchannel)은 유리의 식각을 통하여 형성하였다. 즉, 도 1에서 나타낸 바와 같이, 너비 390㎛, 깊이 150㎛, 길이 13mm의 12개의 마이크로 채널을 식각하였고, 상기 마이크로 반응기의 양단에 지름 1mm의 주입부와 배출부를 구비하였다.
상기 마이크로 채널을 보호하는 덮개로, 산소 플라즈마(oxygen plasma)에 노출된 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)조각을 사용하였고, 마이크로 채널과 상기 폴리디메틸실록산 조각을 밀착시켜 80℃에서 15분간 가열하여 마이크로 반응기를 제작하였다.
2. 기능화된 다중벽 탄소 나노튜브( functionalized multi - walled carbon nanotubes)의 제조
200mg의 다중벽 탄소 나노튜브(시그마사, 미국)를 황산 및 질산이 부피비 3:1로 혼합된 용액에 첨가하여 10시간 동안 40℃에서 초음파 처리하였다. 이후, 상기 용액을 초순수(deionized water)에 의한 수 차례의 세척하여 카르복시기(carboxyl group)로 기능화된 다중벽 탄소 나노튜브 용액을 제조하였다.
3. 유당을 이용한 베타- 갈락토시다제의 전처리
100mM 인산 완충용액(pH 7.2)에 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)로부터 유래한 10%(v/v)의 베타-갈락토시다제(시그마사, 미국) 및 전처리 물질로 30mM의 유당을 첨가하여 20mL의 반응 수용액(reaction mixture)을 제조하였다. 상기 반응 수용액을 37℃, 150rpm에서 1시간 동안 반응시켜 베타-갈락토시다제를 전처리하였다.
4. 마이크로 반응기에 베타- 갈락토시다제의 고정화
상기 마이크로 반응기에 베타-갈락토시다아제의 고정화를 위하여, 마이크로 반응기 내부에 15%(v/v) 3-아미노프로필트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane)의 아세톤(acetone) 용액을 50℃에서 2시간 동안 분당 50㎕의 유속으로 주입시키고, 이후 증류수를 25℃에서 1시간 동안 분당 50㎕의 유속으로 주입하여 세척하였다.
기능화된 다중벽 탄소나노튜브 용액 10mL 및 상기 전처리된 베타-갈락토시다제 용액 10mL를 혼합한 용액에 0.05M의 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC·HCl)를 첨가하여 4℃에서 8시간 동안 반응시켰다.
상기 마이크로 반응기 내부로 상기 혼합된 용액을 20℃에서 12시간 동안 분당 5㎕의 유속으로 주입시켰고, 이후 100mM 인산완충용액(pH 7.2)을 25℃에서 1시간 동안 분당 50㎕의 유속으로 주입하여 마이크로 반응기 내부를 세척하여, 마이크로 반응기에 베타-갈락토시다제를 고정시켰다.
5. 유청 내 함유된 유당용액의 제조
건조된 유청(시그마사, 미국) 200g을 50mM 인산 완충용액(pH 7.5) 100mL에 혼합하고, 혼합된 용액을 10,000rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 상등액을 새로운 비이커에 옮기고, pH 7.5로 조절하였다. 산도를 조절한 용액을 다시 10,000rpm에서 20분간 원심분리 하여 상등액, 즉 락툴로오스 합성을 위한 유당용액(20%, w/v)을 제조하였다.
6. 마이크로 반응기를 포함하는 마이크로 반응 시스템
도 2는 마이크로 반응기를 포함하는 마이크로 반응 시스템에 관한 모식도이다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 마이크로 반응 시스템은 주사기 펌프(syringe pump), 마이크로 반응기 및 항온수조(water bath)를 포함하고, 상기 마이크로 반응기 내로 유입되는 모든 유체의 흐름은 주사기 펌프에 의하여 일정하게 유지될 수 있으며, 마이크로 반응기의 온도 조절은 항온수조에 의하여 조절할 수 있다.
< 실험예 1: 마이크로 반응기의 표면분석>
상기 실시예 1의 마이크로 반응기 표면에 베타-갈락토시다제의 고정화 전후의 모습을 전계방사형주사전자현미경(Field emission scanning electron microscope, FE-SEM)을 사용하여 관찰하였다. 관찰 결과 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 기능화된 다중벽 탄소 나노튜브가 베타-갈락토시다제에 의하여 덮임으로써 마이크로 채널 표면의 거칠기(roughness)가 현저히 감소하였고, 이를 통하여, 마이크로 반응기의 표면에 베타-갈락토시다제가 고정화되었음을 확인하였다.
< 실험예 2: 유속의 변화가 락툴로오스 합성에 미치는 영향>
마이크로 반응기에서 연속적인 락툴로오스의 합성을 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 20%(w/v) 유당용액에 20%(w/v) 과당을 첨가하여 기질용액을 제조하였다.
상기 기질용액은 47℃에서 각각 분당 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 및 10.0㎕의 유속으로 마이크로반응기 내부로 주입되어 락툴로오스 합성반응을 수행하였다.
이때, 반응기질인 유당 및 과당과 산물인 글루코오스, 갈락토오스 및 락툴로오스의 농도는 고성능액체크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC)를 이용하여 측정하였다. 고성능 탄수화물 컬럼(High performance carbohydrate column, 4.6 mm×250 mm, Waters Co., 미국)과 굴절율 검출기(RI detector)를 사용하였고, 컬럼오븐(column oven)의 온도와 이동상의 유속은 각각 35℃, 분당 1.4mL이었으며, 이동상은 아세토니트릴(acetonitrile) 대비 초순수(deionized water)의 비율이 8:2(v/v)인 용액을 제조하여 사용하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 합성된 락툴로오스는 유속의 증가에 따라 점차 감소되었다. 이를 통해 마이크로 반응기 내에 기질의 체류시간이 길어질수록 수율이 우수함을 알 수 있었다.
< 실험예 3: 효소 마이크로반응기의 장기 조업이 기질소모 및 산물생성에 미치는 영향>
상기 실시예 1의 마이크로반응기에서 연속적인 락툴로오스의 합성을 위하여 20%(w/v) 유당용액 및 20%(w/v) 과당을 혼합한 기질용액을 제조하였고, 상기 기질을 분당 1.0 ㎕ 유속으로 47℃ 온도에서 48시간 동안 락툴로오스 합성반응을 수행하였으며, 유당, 과당, 글루코오스, 갈락토오스 그리고 락툴로오스의 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, 반응기질인 유당 및 과당은 가수분해반응 및 당전이반응에 의하여 농도가 감소한 반면, 가수분해반응물 및 최종반응산물인 글루코오스, 갈락토오스 및 락툴로오스는 농도가 증가하였다.
따라서, 마이크로 반응기는 48시간 동안 매우 안정적으로 운전되었음을 확인할 수 있었고, 평균 1.29 g/L의 락툴로오스 합성을 나타내었다.
이를 통하여 베타-갈락토시다제가 고정화된 효소 마이크로반응기를 이용하여 유청 내 함유된 유당으로부터 연속적으로 락툴로오스가 합성될 수 있음을 확인할 수 있었다.
11: 마이크로 반응기 111: 주입부
112: 배출부 113: 마이크로 채널
114: 월(wall) 12: 주사기 펌프
13: 항온수조 14: 반응 생성물

Claims (6)

  1. 유청 및 과당을 포함하는 기질이 반응하는 베타-갈락토시다제가 다중벽 탄소 나노튜브를 연결기로 하여 고정화된 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 유청은 유당을 10 내지 30%(w/v)으로 포함하는 것을 특징으로 하는 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기.
  3. 베타-갈락토시다제, 완충용액 및 유당을 포함하는 반응 수용액을 제조하는 단계;
    상기 반응 수용액 및 다중벽 탄소 나노튜브를 포함하는 용액을 마이크로 반응기에 주입하여 상기 베타-갈락토시다제를 상기 마이크로 반응기에 고정시키는 단계; 및
    유청 및 과당을 포함하는 기질을 상기 마이크로 반응기에 주입하여 반응시키는 단계를 포함하는 락툴로오스 생산 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 유청은 유당을 10 내지 30%(w/v)으로 포함하는 것을 특징으로 하는 락룰로오스 생산 방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 기질을 마이크로 반응기에 주입하여 반응시키는 단계는 37 내지 57℃ 온도조건에서 반응되는 것을 특징으로 하는 락툴로오스 생산 방법.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 기질을 마이크로 반응기에 0.1 내지 20㎕/분 속도로 주입하는 것을 특징으로 하는 락툴로오스 생산 방법.
KR1020120022609A 2012-03-06 2012-03-06 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기 및 락툴로오스 생산 방법 KR101363293B1 (ko)

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