KR101411410B1 - 락툴로오스 생산 방법 및 락툴로오스 생산 시스템 - Google Patents

락툴로오스 생산 방법 및 락툴로오스 생산 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락툴로오스 생산 방법 및 락툴로오스 생산 시스템에 관한 것으로, 구체적으로는 유청 및 과당을 포함하는 기질을 락툴로오스로 전환시키는 담체에 고정된 베타-갈락토시다제를 포함하는 충진상 반응기를 이용하여 락툴로오스를 생산하는 방법을 통하여, 기질로 고가의 정제된 유당 대신에 저가의 유청을 이용하여 공정 비용을 감소시키고, 유청의 재활용이 가능한 락툴로오스 생산 방법 및 락툴로오스 생산 시스템에 관한 것이다.

Description

락툴로오스 생산 방법 및 락툴로오스 생산 시스템{METHOD OF SYNTHESIZING LACTULOSE AND SYSTEM FOR SYNTHESIZING LACTULOSE}
본 발명은 락툴로오스 생산 방법 및 락툴로오스 생산 시스템에 관한 것이다.
프리바이오틱스(prebiotics)란 대장에 존재하는 유익한 미생물의 성장이나 활성을 선택적으로 촉진하여 인간의 건강을 개선시키는 난소화성 물질이다. 상기 프리바이오틱스의 기능을 나타내는 물질은 대부분 당류이며, 이당류, 올리고당 및 다당류에 속하는 일부의 물질들이 이 부류에 포함된다. 상기 이당류 중 유당의 유도체인 락툴로오스가 대표적인 프리바이오틱스의 기능을 나타낸다.
상기 락툴로오스는 소장에서 분해되거나 흡수되지 않고, 대장에 존재하는 비피더스균 및 유산균과 같은 유익균에 의해 이용되며, 변비치료, 만성문맥계뇌증에 있어서 간성혼수의 치료 및 예방에 유용하게 사용되고 있다. 특히 영유아의 변비 및 임신 중 또는 분만 후 변비에도 장기간 안전하게 사용할 수 있는 물질이다.
현재, 락툴로오스의 생산은 화학적 합성방법이며, 알칼리 처리에 의한 에피머반응(epimerization)을 이용한다. 상기 화학적 합성방법은 반응산물인 락툴로오스 이외에 다양한 부산물의 생성으로 인하여 의약품 및 특별한 목적의 식품으로 적용 시, 고가의 다단계 정제공정이 수반되어야 하고, 고온고압의 반응 조건 때문에 위험성이 높고, 화학촉매와 유기용매의 사용으로 인한 공해가 발생할 수 있다.
이에 반해, 효소를 이용한 생물전환 합성방법은 반응에 있어 고도의 정밀성, 특이성, 선택성을 지니고, 소규모의 장치로도 생산이 가능하며, 환경 친화적이라는 장점을 가진다. 따라서 화학적 합성방법의 단점을 극복하기 위하여 생촉매인 효소가 알칼리촉매를 대체할 수 있다.
그러나, 생물전환 합성방법에서는 기질(substrate)로써 고가의 정제된 유당을 사용하고 있어 경제성이 낮고, 연속공정의 부재 등의 문제점을 가지고 있다.
대한민국 공개특허 제1989-0009958호 대한민국 공개특허 제1992-0000779호
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 기질로 유청 및 과당을 사용하여 담체에 고정된 베타-갈락토시다제를 포함하는 충진상 반응기를 이용하여 락툴로오스를 합성하는 방법 및 이를 이용하는 락툴로오스 생산 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 고정화된 베타-갈락토시다제에 의한 가수분해반응 및 당전이반응에 의하여 연속적으로 락툴로오스를 합성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 베타-갈락토시다제를 담체에 고정화하는 단계; 상기 고정화된 담체를 충진상 반응기에 충진하는 단계; 및 유청 및 과당을 포함하는 기질을 충진상 반응기에 주입하여 반응시키는 단계를 포함하는 락툴로오스 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 담체에 고정된 베타-갈락토시다제가 충진된 충진상 반응기; 유청 및 과당을 포함하는 기질을 충진상 반응기에 주입하는 기질 주입부; 및 상기 충진상 반응기의 반응 온도를 조절하는 온도 조절부;를 포함하는 락툴로오스 생산 시스템을 제공한다.
본 발명의 락툴로오스 합성 촉매는 기존의 락툴로오스 생산에 사용되었던 기질인 고가의 정제된 유당 대신에, 유청을 사용하여 경제적이며, 락툴로오스의 연속적인 생산이 가능하다.
또한, 본 발명의 락툴로오스 생산 방법은 락툴로오스의 연속 합성방법으로, 공정의 경제성을 향상시킬 수 있으며, 유당함유 폐액 등을 적극적으로 활용함으로써 자원을 재활용 할 수 있고, 프리바이오틱스 생산 산업 전반에 이용될 수 있다.
또한, 기질로서 유청을 사용함으로써, 폐기되는 유청의 이용가치를 높이고, 폐기 및 환경정화의 비용을 감소시킬 수 있으며, 락툴로오스의 생산 비용을 절감시킬 수 있다.
도 1은 유리로 제작된 충진상 반응기의 형태를 나타내는 사시도이다.
도 2는 충진상 반응기를 포함하는 락툴로오스 합성 시스템을 나타내는 모식도이다.
도 3은 기질의 유속에 따른 락툴로오스의 농도 변화를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 베타-갈락토시다제를 담체에 고정화하는 단계; 상기 고정화된 담체를 충진상 반응기에 충진하는 단계; 및 유청 및 기질을 포함하는 기질을 충진상 반응기에 주입하여 반응시키는 단계를 포함하는 락툴로오스 생산 방법을 제공한다.
유청(乳淸)은 우유가 엉겨서 응고된 뒤 남은 액체이며, 훼이(Whey) 또는 유장(乳漿)이라고도 한다. 보통 치즈나 카세인 제조 과정에서 부산물로 생성되며, 몇몇 상업적인 용도로 이용된다. 유당은 락토오스(lactose), 젖당이라고도 하며, 우유의 대표적인 탄수화물로 1분자의 D-글루코오스와 1분자의 D-칼락토오스로 구성되어 있는 이당류이다.
갈락토시다제(galactosidase)는 알릴 및 알킬-D-갈락토시드를 가수분해하여 갈락토스를 생성하는 효소이다. 또한, 가수분해와 함께 갈락토스 잔기를 다른 당·알코올 및 페놀로 전이하는 갈락토시드 전달효소 작용도 한다. 상기 갈락토시다제는 알파형 및 베타형으로 구분되며, 상기 베타-갈락토시다제는 락타아제라고도 하고, 베타-D-갈락토시드 외에 유당에도 작용한다.
대장에 존재하는 유익한 미생물의 성장이나 활성을 선택적으로 촉진하여 인간의 건강을 개선시키는 난소화성 물질인 프리바이오틱스(prebiotics) 중 하나인 락툴로오스는 소장에서 분해되거나 흡수되지 않고, 대장에 존재하는 유익균, 주로 비피더스균과 일부 유산균에 의해 이용되며, 변비치료, 만성문맥계뇌증에 있어서 간성혼수의 치료 및 예방에 유용하게 사용되고 있고, 특히 영유아의 변비 및 임신 중 또는 분만 후 변비에도 장기간 안전하게 사용할 수 있는 물질이다.
상기 고정화된 베타-갈락토시다제는 유청에 포함된 유당을 글루코오스 및 갈락토오스로의 가수분해반응시키고, 고정화된 베타-갈락토시다제에 의한 갈락토오스와 과당 사이의 당전이반응에 의하여 락툴로오스를 합성할 수 있다.
상기 락툴로오스 합성 촉매는 종래에 락툴로오스의 합성에 이용되었던 기질로 고가의 정제된 유당을 저가의 유청으로 대체함으로써 경제성을 향상시킬 수 있다.
상기 기질을 충진상 반응기에 0.1 내지 2.0mL/분 속도로 주입하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.25 내지 0.75mL/분 속도로 주입하는 것이 좋다. 상술한 범위를 만족할 경우, 충진상 반응기 내부에 기질이 고정화된 베타-갈락토시다제와 충분히 반응할 수 있으며, 생산된 락툴로오스가 베타-갈락토시다제에 의하여 가수분해 되는 것을 억제할 수 있다.
기질에 포함되는 상기 유청은 유당, 즉 락토오스를 10 내지 30%(w/v)으로 포함하는 것이 바람직하며, 상술한 범위를 만족할 경우, 락툴로오스의 생산성을 향상시킬 수 있으며, 고온의 조건에서 유당의 농도로 30%(w/v)를 초과할 경우, 부가 반응에 의하여 부산물이 생성되어 락툴로오스의 생산성이 저하되는 문제점이 있다.
상기 기질을 반응시키는 단계는 37 내지 57℃ 온도 조건에서 반응되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 42 내지 52℃가 바람직하고, 보다 바람직하게는 47℃ 온도 조건인 것이 좋다. 상술한 범위를 만족할 경우, 담체에 고정화된 효소의 활성이 증가되고, 그에 따라 기질이 락툴로오스로 전환되는 효율이 우수하다.
상기 베타-갈락토시다제는 상기 담체와 공유결합하여 고정된 것이 바람직하며, 이때 상기 담체는 실리카 겔인 것이 바람직하나, 담체에 효소를 공유결합에 의하여 고정화시키고, 기질과 반응시키는데 사용될 수 있는 담체라면 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 담체에 고정된 베타-갈락토시다제가 충진된 충진상 반응기; 유청 및 과당을 포함하는 기질을 충진상 반응기에 주입하는 기질 주입부; 및 상기 충진상 반응기의 반응 온도를 조절하는 온도 조절부;를 포함하는 락툴로오스 생산 시스템을 제공한다.
상기 충진상 반응기에서 담체에 고정된 베타-갈락토시다제를 포함함으로써, 저가의 유청을 포함하는 기질을 사용하여 경제적이며, 락툴로오스의 연속적인 생산이 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
1. 충진상 반응기의 제조
도 1에서 나타낸 바와 같이, 지름 17mm, 높이 130mm인 반응기의 양단에 주입부 및 배출부를 제작하고, 충진상 반응기의 온도를 조절할 수 있도록 워터 재킷으로 둘러싸인 형태로, 유리로 이루어진 충진상 반응기를 제조하였다.
2. 베타- 갈락토시다제의 고정화를 위한 담체의 제조
베타-갈락토시다제를 담체에 고정화시키기 위하여, 건조된 실리카 겔 1g을 15%(v/v) 3-아미노프로필트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane)을 포함하는 아세톤(acetone) 용액 20mL에 첨가한 후, 50℃에서 2시간 동안 일정하게 교반하며 반응시켰다.
상기 반응된 실리카 겔을 증류수로 세척한 후 60℃에서 2시간 동안 건조시켰다. 상기 건조된 실리카 겔 및 2.6M 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액 1.6mL을 100mM 인산완충용액(pH 8.0) 18.4mL에 첨가하였고, 20℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 활성화된 실리카 겔을 증류수로 세척한 다음 60℃에서 2시간 동안 건조시켰다.
3. 유당을 이용한 베타- 갈락토시다제의 전처리
클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)로부터 유래한 10%(v/v)의 베타-갈락토시다제(시그마, 미국) 및 전처리 물질로 30mM의 유당을 100mM 인산완충용액(pH 7.2)에 첨가하여 20mL의 반응 수용액(reaction mixture)을 제조하였다. 상기 반응 수용액을 37℃, 150rpm에서 1시간 동안 반응시켜 베타-갈락토시다제를 전처리하였다.
4. 유당을 이용하여 전처리된 베타- 갈락토시다제의 고정화
상기 활성화된 실리카 겔 1g을 상기 전처리한 베타-갈락토시다제 용액에 첨가하였고, 20℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이후 상기 반응액을 여과하고, 100 mM 인산완충용액(pH 7.2)으로 세척한 후, 실온에서 건조시킴으로써 고정화된 베타-갈락토시다제를 제조하였다.
5. 유청 내 함유된 유당용액의 제조
건조된 유청(시그마, 미국) 200g을 50mM 인산완충용액(pH 7.5) 100mL에 혼합하였다. 이후 상기 혼합액은 10,000rpm에서 20분간 원심분리 되었고, 새로운 비이커에 옮겨진 상등액은 pH 7.5로 조절되었으며, 이 용액을 다시 10,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여, 유청 내 함유된 유당용액의 농도가 20%(w/v)인 유당용액을 제조하였다.
6. 충진상 반응기를 포함하는 연속 반응 시스템의 구축
도 2는 충진상 반응기를 포함하는 연속 반응 시스템(continuous reaction system)을 나타낸다. 상기 연속 반응 시스템은 충진상 반응기 내로 유입되는 기질의 흐름을 주사기 펌프(syringe pump)에 의하여 일정하게 유지시키며, 충진상 반응기의 온도는 워터 재킷(water jacket)을 통한 물의 순환에 의하여 조절하였다.
7. 담체에 고정화된 효소를 충진상 반응기에 충진 및 락툴로오스의 합성
상기 고정화된 베타-갈락토시다제 20g을 상기 충진상 반응기에 충진하고, 20%(w/v) 과당과 상기 20%(w/v) 유당용액을 혼합한 기질을 47℃ 온도 조건에서 분당 0.25mL의 유속으로 충진상 반응기 내부로 주입하여 락툴로오스 합성 반응을 수행하였다.
< 실시예 2>
상기 실시예 1에서, 충진상 반응기 내부로 주입되는 기질의 유속이 분당 0.25mL 인 것 대신에, 0.5mL인 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
< 실시예 3>
상기 실시예 1에서, 충진상 반응기 내부로 주입되는 기질의 유속이 분당 0.25mL 인 것 대신에, 0.75mL인 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
< 실시예 3>
상기 실시예 1에서, 충진상 반응기 내부로 주입되는 기질의 유속이 분당 0.25mL 인 것 대신에, 1.0mL인 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
< 실험예 1: 기질의 유속 변화가 락툴로오스 합성에 미치는 영향>
1. 고정화된 베타- 갈락토시다제의 활성도 측정
고정화된 베타-갈락토시다제의 활성도는 o-니트로페닐-β-D-갈라토피라노사이드(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, o-NPG)의 가수분해(hydrolysis) 측정에 의하여 수행하였다. 20mM 인산완충용액(pH 7.0) 10mL에 5mM o-NPG 및 상기 고정화된 베타-갈락토시다제 100mg을 첨가하여 37℃, 150rpm에서 10분간 반응시켰다. 그 후, 1.0M의 Na2CO3 2mL를 첨가하여 반응을 정지시켰고, 410nm에서 흡광도를 측정하였다.
측정된 흡광도를 기준 곡선(standard curve)에 대입하여 고정화된 베타-갈락토시다제의 활성도를 측정하였고, 1 유닛(unit)의 효소 활성도는 1분간 1 μmol의 o-NPG를 o-니트로페놀(o-nitrophenol)로 가수분해하는 효소의 양으로 계산하였고, 측정 결과 상기 고정화된 베타-갈락토시다제는 활성도는 783 U/g이었다.
2. 락툴로오스의 농도 측정
락툴로오스는 고성능액체크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC)를 이용하여 측정하였다. 고성능 탄수화물 컬럼(High performance carbohydrate column, 4.6 mm×250 mm, Waters Co., 미국)과 굴절율 검출기(RI detector)를 사용하였고, 컬럼오븐(column oven)의 온도와 이동상의 유속은 각각 35℃, 분당 1.4mL이었으며, 이동상은 아세토니트릴(acetonitrile) 대비 초순수(deionized water)의 비율이 8:2(v/v)인 용액을 제조하여 사용하였다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 합성된 락툴로오스는 분당 0.5mL의 유속까지 농도가 증가하였지만, 그 이상의 유속에서는 점차 감소하였다. 분당 0.25mL의 유속이 분당 0.5mL의 유속보다 더 긴 체류시간을 가짐에도 불구하고 락툴로오스 합성이 낮은 것은 초과된 체류시간 때문에 고정화된 베타-갈락토시다제에 의하여 락툴로오스가 가수분해 된 결과이다.
또한, 분당 0.75 및 1.0mL의 유속에서는 기질의 짧은 체류시간으로 인하여 락툴로오스 합성이 감소된 것을 관찰하였다.
따라서, 충진상반응기에서 기질 및 산물의 체류시간이 상당히 중요한 인자임을 관찰하였으며, 분당 0.5mL 유속(체류시간 40분)에서 19.1g/L의 락툴로오스 합성을 나타내었다.
이를 통하여 담체에 고정화된 베타-갈락토시다제가 충진된 충진상반응기를 이용하여 유청 내 함유된 유당으로부터 연속적으로 락툴로오스가 합성될 수 있음을 확인할 수 있었다.
11: 충진상 반응기 111: 워터 재킷
112: 주입부 113: 배출부
12: 주사기 펌프 13: 냉각수 공급부
14: 생산물 저장부

Claims (6)

  1. 베타-갈락토시다제를 담체에 고정화하는 단계;
    상기 고정화된 담체를 충진상 반응기에 충진하는 단계; 및
    유청 및 과당을 포함하는 기질을 충진상 반응기에 0.25 내지 0.75mL/분 속도로 주입하여 반응시키는 단계를 포함하며, 상기 유청은 유당을 10 내지 30%(w/v)으로 포함하는 것을 특징으로 하는 락툴로오스 생산 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 기질을 충진상 반응기에 주입하여 반응시키는 단계는 37 내지 57℃ 온도 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 락툴로오스 생산 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 담체는 실리카 겔인 것을 특징으로 하는 락툴로오스 생산 방법.
  6. 삭제
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Appl Microbiol Biotechnol. 1986, Vol.25, pp.224-228 *
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Enzyme and Microbial Technology. 2006, Vol.39, pp.903-908 *
Enzyme and Microbial Technology. 2006, Vol.39, pp.903-908*

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