KR20130096993A - Method for preparing conditioned medium powder - Google Patents

Method for preparing conditioned medium powder Download PDF

Info

Publication number
KR20130096993A
KR20130096993A KR1020120018657A KR20120018657A KR20130096993A KR 20130096993 A KR20130096993 A KR 20130096993A KR 1020120018657 A KR1020120018657 A KR 1020120018657A KR 20120018657 A KR20120018657 A KR 20120018657A KR 20130096993 A KR20130096993 A KR 20130096993A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
conditioned medium
medium powder
stem cells
powder
cells
Prior art date
Application number
KR1020120018657A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR102126331B1 (en
Inventor
국일
이정우
한충성
Original Assignee
(주)치아줄기세포뱅크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)치아줄기세포뱅크 filed Critical (주)치아줄기세포뱅크
Priority to KR1020120018657A priority Critical patent/KR102126331B1/en
Priority to PCT/KR2013/001496 priority patent/WO2013125927A1/en
Publication of KR20130096993A publication Critical patent/KR20130096993A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102126331B1 publication Critical patent/KR102126331B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/21—Chemokines, e.g. MIP-1, MIP-2, RANTES, MCP, PF-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Abstract

PURPOSE: A method for manufacturing conditioned medium powder is provided to obtain highly concentrated conditioned medium powder using an alcoholic polar solvent and to cheaply produce a large amount of the conditioned medium powder. CONSTITUTION: A method for manufacturing conditioned medium powder comprises the steps of: culturing cells in a serum-free medium and preparing a conditioned medium; and reacting the conditioned medium with a polar solvent selected among alcohols, an alcohol solution, and acetone. The cells are stem cells.

Description

컨디션드 배지 분말의 제조방법{Method for preparing conditioned medium powder}Method for preparing conditioned medium powder {Method for preparing conditioned medium powder}

본 발명은 세포 배양액의 유효성분을 효과적으로 분리 농축시켜 저비용으로 고효율의 효과를 얻을 수 있는 컨디션드 배지 분말의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing a conditioned medium powder which can effectively separate and concentrate an active ingredient of a cell culture solution to obtain a high efficiency effect at low cost.

단백질의 특성들, 즉 크기, 아미노산 조성, 아미노산 서열, 극성, 키랄성, 아미노산 변형 등을 파악하고 원하는 단백질을 분리할 경우 다양한 방법을 분리 및 정제를 진행한다. 기존의 단백질 침전 및 농축 방법으로는 암모늄 설페이트 침전법, PEG 침전법, 초미세여과법, 투석법, 크기별 용출(Size-exclusion) 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등이 정제비용 및 시간이 많이 소모된다는 단점이 있다.The characteristics of the protein, ie size, amino acid composition, amino acid sequence, polarity, chirality, amino acid modifications, etc. are identified and various methods are isolated and purified when separating the desired protein. Conventional protein precipitation and concentration methods include ammonium sulfate precipitation, PEG precipitation, ultrafiltration, dialysis, size-exclusion chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. It has the disadvantage of being consumed a lot.

예를 들어, 암모늄 설페이트 침전법의 경우 고농도의 염 용액 속에서는 단백질이 뭉쳐서 침전하는 경향이 있다. 염(salt)의 이온 강도는 각 이온의 농도에 비례하므로 염(salt)을 많이 넣으면 용액의 이온력(ionic strength)가 증가한다. 염(salt)의 양이 많아질수록 단백질이 침전되는 것이다. 각각의 단백질이 염(salt)에 의해 다르게 침전하는 특성을 이용해 단백질 정제에 이용되곤 한다. 하지만 침전된 단백질은 염(salt)을 용출하기 위하여 투석(Dialysis)이라는 방법을 사용하기 때문에 대량화 하기 위해서는 일정한 온도 조건과 대규모의 시설, 그리고 많은 노동력이 필요로 하여 적당하지 않다.For example, in the case of the ammonium sulphate precipitation method, proteins tend to aggregate and precipitate in a high concentration of salt solution. Since the ionic strength of the salt is proportional to the concentration of each ion, a large amount of salt increases the ionic strength of the solution. The greater the amount of salt, the more precipitated the protein. Each protein is used for protein purification using the property of different precipitation by salt. Precipitated proteins, however, use a method called dialysis to elute salts, which is not suitable due to the constant temperature conditions, large-scale facilities, and labor.

크로마토그래피 공정은 이동상(분리하고자 하는 물질)과 고정상(분리할 수 있는 지지체)으로 이루어진다. 고정상은 흡착제, 이온교환수지, 다공성 물질 또는 겔 등이 사용되며, 이들은 원통형 관에 충진되어 있다. 이동상에는 분리하려는 용질이 포함된 용액과 용액을 고정상으로 운반하는 용출액이 있다. 시료성분은 고정상과 이동상으로 분배를 반복하면서 고정상 내를 이동하는데 각 성분에 따라 그 분배의 비율이 다르고, 고정상 내의 이동속도에 차이가 생겨 각 성분이 분리된다. 따라서 고정상의 가격이 매우 고가이며 공정이 매우 까다로운 단점이 있다. 이온 교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)는 이온 또는 하전된 화합물이 정전기적인 힘(electrostatic force)에 의해 이온교환수지에 결합되어 있는 단백질을 용출하는 방법이다. 이온 교환 크로마토그래피의 고정상(분리할 수 있는 지지체)은 다양한 종류의 기능기가 부착된 지지체인 이온교환수지(ion exchange resin)을 사용한다. 단백질을 분리하기 위해서 역시 고정상의 가격이 매우 고가이며 공정이 매우 까다로운 단점이 있다.The chromatography process consists of a mobile phase (material to be separated) and a stationary phase (separable support). As the stationary phase, an adsorbent, an ion exchange resin, a porous material or a gel is used, which are filled in a cylindrical tube. The mobile phase includes a solution containing the solute to be separated and an eluate which carries the solution to the fixed phase. The sample components move in the stationary phase while repeating the distribution into the stationary phase and the mobile phase, and the ratio of the distribution is different according to each component, and there is a difference in the moving speed in the stationary phase to separate each component. Therefore, the stationary phase is very expensive and the process is very difficult. Ion-exchange chromatography is a method of eluting proteins in which ions or charged compounds are bound to the ion exchange resin by electrostatic forces. The stationary phase (separable support) of ion exchange chromatography uses ion exchange resin, which is a support to which various kinds of functional groups are attached. In order to separate proteins, the fixed bed is also very expensive and the process is very difficult.

또한, 단백질의 농축을 위해서는 시료를 대량화하여 생산해야 하는 단점이 있다.
In addition, there is a disadvantage in that the mass production of the sample in order to concentrate the protein.

1. 미국 공개특허 제2003-0161818호, 2003.08.281. US Patent Publication No. 2003-0161818, 2003.08.28

1. Developmental Brain Research, vol.152, pp. 189-197, 2004Developmental Brain Research, vol. 152, pp. 189-197, 2004

이에, 본 발명자들은 알코올류 극성용매를 사용하여 컨디션드 배지에 있는 유효성분을 분리 및 농축하여 세포의 분열 및 분화에 대한 효과를 확인하고, 유효성분을 대량생산화는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors separated and concentrated the active ingredient in the conditioned medium using an alcohol polar solvent to confirm the effect on cell division and differentiation, and to establish a method for mass production of the active ingredient. Completed.

따라서, 본 발명의 목적은 컨디션드 배지 내 유효성분을 효과적으로 분리 농축하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for effectively separating and concentrating an active ingredient in conditioned medium.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 통해 유효성분이 고농축된 컨디션드 배지 분말 및 이의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a conditioned medium powder having a high concentration of the active ingredient through the above method and a pharmaceutical use thereof.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포를 무혈청 배지에서 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of culturing the cells in serum-free medium to prepare a conditioned medium; And

알코올, 알코올 수용액 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 극성용매와 상기 컨디션드 배지를 반응시키는 단계를 포함하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법을 제공한다.
It provides a method of producing a conditioned medium powder comprising the step of reacting the conditioned medium with at least one polar solvent selected from the group consisting of alcohol, aqueous alcohol solution and acetone.

본 발명은 또한 상기 컨디션드 배지 분말의 제조방법에 따라 제조되고, 유효성분으로 Decorin, MCP-1, DKK-3 및 TIMP-2를 포함하는 컨디션드 배지 분말을 제공한다.
The present invention also provides a conditioned medium powder prepared according to the method for producing the conditioned medium powder, and containing Decorin, MCP-1, DKK-3 and TIMP-2 as active ingredients.

본 발명은 또한 상기 컨디션드 배지 분말을 포함하는 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물을 제공한다.
The present invention also provides a composition for promoting stem cell division and differentiation comprising the conditioned medium powder.

본 발명은 세포 배양액 내 유효성분을 알코올류 극성용매를 이용하여 분말화함으로써 제조공정이 단축되고 저비용으로 고효율의 유효성분을 획득할 수 있다.The present invention can shorten the manufacturing process and obtain high-efficiency active ingredients at low cost by pulverizing the active ingredients in cell culture using an alcohol-like polar solvent.

본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말은 성장인자, 사이토카인 등의 유효성분이 고농축되어 있어 줄기세포의 분열 및 분화에 뛰어난 효과를 나타낼 수 있다.
Stem cell conditioned medium powder of the present invention is highly concentrated growth factors, cytokines and the like active ingredients can exhibit an excellent effect on the division and differentiation of stem cells.

도 1은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 컨디션드 배지 분말을 골수 유래 중간엽 줄기세포에 처리하여 세포분열 능력을 조사한 결과이다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 컨디션드 배지 분말을 골수 유래 중간엽 줄기세포에 처리하여 세포증식율을 조사한 결과이다.
도 3은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 컨디션드 배지 분말을 골수 또는 치수 유래 줄기세포에 처리하여 줄기세포의 골아세포로의 분화 능력을 조사한 결과이다.
도 4는 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 컨디션드 배지 분말의 구성 성분을 분석한 그래프이다.1 is a result of examining the cell division capacity by treating the conditioned medium powder prepared according to the production method of the bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
Figure 2 is a result of examining the cell growth rate by treating the conditioned medium powder prepared according to the production method of the bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
Figure 3 is a result of examining the differentiation capacity of stem cells into osteoblasts by treating the conditioned medium powder prepared according to the production method of the present invention to bone marrow or pulp-derived stem cells.
Figure 4 is a graph analyzing the components of the conditioned medium powder prepared according to the production method of the present invention.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, the structure of this invention is demonstrated concretely.

본 발명은 세포를 무혈청 배지에서 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및The present invention comprises the steps of culturing the cells in serum-free medium to prepare a conditioned medium; And

알코올, 알코올 수용액 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 극성용매와 상기 컨디션드 배지를 반응시키는 단계를 포함하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법을 제공한다.It provides a method of producing a conditioned medium powder comprising the step of reacting the conditioned medium with at least one polar solvent selected from the group consisting of alcohol, aqueous alcohol solution and acetone.

본 발명은 세포를 적정한 배지 및 조건에서 배양한 후 유효성분을 포함한 컨디션드 배지(무혈청 배지 배양액)를 알코올류 극성용매를 이용하여 상기 유효성분을 고농축시키는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized by high concentration of the active ingredient using an alcohol-type polar solvent in a conditioned medium (serum-free medium culture solution) containing the active ingredient after culturing the cells in a suitable medium and conditions.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법은 줄기세포의 무혈청 배지 배양액인 컨디션드 배지 분말 내에 유효성분을 다량 함유함으로써 상기 분말이 줄기세포의 분열과 분화에 뛰어난 효과를 갖도록 할 수 있다.According to one embodiment, the method for producing a conditioned medium powder of the present invention by containing a large amount of the active ingredient in conditioned medium powder, a serum-free medium culture medium of the stem cells so that the powder has an excellent effect on the division and differentiation of stem cells can do.

본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법은 컨디션드 배지 내에 유효성분을 저비용 고효율로 농축함으로써 경제성을 갖는 것을 특징으로 한다.The method for producing the conditioned medium powder of the present invention is characterized by having economical efficiency by concentrating the active ingredient in the conditioned medium at low cost and high efficiency.

본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.Referring to the production method of the conditioned medium powder of the present invention step by step.

제1단계는 세포를 무혈청 배지에서 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계이다. The first step is to prepare a conditioned medium by culturing the cells in serum-free medium.

본 명세서에서, "컨디션드 배지(conditioned medium)" 란 세포를 세포분열 최성기인 대수성장기에 도달했을 때 무혈청 배지로 교환한 후 배양액만 수거한 배지를 말한다. 이는 분열중인 세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 미지의 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine)을 이용하는 것을 말한다. 일 구체예에 따르면 상기 컨디션드 배지는 골수 또는 치수 유래 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 후 골수 또는 치수 유래 중간엽 줄기세포를 제거한 용액을 포함하는 것으로서, 골수 또는 치수 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 성장인자, 사이토카인 등의 물질이 풍부하게 함유되어 있을 수 있다. As used herein, the term "conditioned medium" refers to a medium in which only culture medium is collected after exchanging cells with a serum-free medium when the cells reach an apoptotic growth stage. This refers to using an unknown growth factor, cytokine, which is extracted from the dividing cells in the medium. According to one embodiment, the conditioned medium comprises a solution in which bone marrow or pulp-derived mesenchymal stem cells are removed from the bone marrow or pulp-derived mesenchymal stem cells after culturing in a serum-free medium. It may contain abundant substances such as growth factor, cytokine derived from.

상기 세포는 통상의 세포배양에 사용할 수 있는 세포라면 특별히 제한하는 것은 아니며, 예컨대 줄기세포일 수 있다.The cell is not particularly limited as long as it can be used for normal cell culture, and may be, for example, stem cells.

상기 줄기세포는 다음의 특성을 나타내는 골수 또는 치수 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다:The stem cells may be mesenchymal stem cells derived from bone marrow or pulp that exhibit the following properties:

(a) CD90, CD105, CD44 및 CD73 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고, (b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내며, (c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 것을 특징으로 한다. (a) all show positive immunological characteristics for CD90, CD105, CD44, and CD73, (b) adhere to and grow in cell culture dishes, and exhibit morphological properties of the spine-shape; (c) It is characterized by having the ability to differentiate into mesodermal derived cells.

본 명세서에서, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)"라 함은 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 골수 또는 치수 유래의 중간엽 줄기세포를 의미한다.In the present specification, "mesenchymal stem cells (MSCs)" are cells that assist in making cartilage, bone, fat, myeloid epilepsy, muscle, nerves, etc., in adults, although they generally stay in the bone marrow, the cord blood It also exists in the peripheral blood, other tissues, etc., means a cell that can be obtained from them. For the purposes of the present invention, mesenchymal stem cells of the present invention refers to mesenchymal stem cells derived from bone marrow or pulp.

본 발명에서 "분화(differentiation)"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 중간엽 줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 중배엽성 세포)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예컨대, 골모세포 등), 그 뒤 특정 조직(예컨대, 뼈 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 지방세포, 골세포, 연골세포 등)로 분화될 수 있다.In the present invention, "differentiation" refers to a phenomenon in which a cell's structure or function is specialized during cell division and proliferation. Pluripotent mesenchymal stem cells can differentiate into lineage-defining progenitors (eg, mesodermal cells), and then further differentiate into other forms of progenitors (eg, osteoblasts, etc.), followed by specific tissues (eg, May be differentiated into terminal differentiated cells (eg, adipocytes, bone cells, chondrocytes, etc.) that play a characteristic role in bones, etc.).

또한, 상기 무혈청 배지는 혈청을 포함하지 않는 초기단계 세포배양을 위한 배지로서 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium) 등을 사용할 수 있다.In addition, the serum-free medium may be used without limitation as long as it is a medium for the purpose of maintaining and storing the cell type as a medium for initial cell culture without serum. For example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM (alpha Minimal essential Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) and the like can be used.

상기 무혈청 배지는 상기 배지에 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함할 수 있다.The serum-free medium may further comprise growth factors or cytokines in the medium.

상기 성장인자로 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 또는 PDGF 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.As the growth factors, IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF or PDGF may be used singly or in combination of two or more.

상기 사이토카인으로 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-r, IL-10 또는 IL-17 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.As the cytokine, IL-1, IL-4, IL-6, IFN-r, IL-10 or IL-17 may be used alone or two or more, but is not particularly limited thereto.

상기 컨디션드 배지는 세포를 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 무혈청 배지에서 배양하여 제조할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. The conditioned medium can be prepared by culturing the cells in serum-free medium for 1 to 3 days at 25 to 40 ℃, but is not particularly limited thereto.

일 구체예에 따르면, 줄기세포를 이용하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계는 According to one embodiment, the step of preparing a conditioned medium using stem cells

분리된 골수, 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 유래의 세포를 혈청 함유 배지에서 계대배양하여 골수 또는 치수 유래의 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계; 및Subcultured the cells derived from the bone marrow, pulp, periodontal ligament, alveolar bone, alveolar tip or gum in serum-containing medium to obtain mesenchymal stem cells derived from bone marrow or pulp; And

상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.The mesenchymal stem cells may comprise the step of culturing in serum-free medium.

상기 중간엽 줄기세포는 골수, 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 내에 존재하는 세포 중에서 정제과정을 거쳐 수득할 수 있으며, 각 조직의 특성에 따라 줄기세포를 추출하는 과정은 공지의 방법을 사용할 수 있는 당업자의 주지의 사실이며, 현재는 인간 유래의 중간엽 줄기세포를 연구용 목적으로 사용 가능한 세포주를 판매하고 있어 쉽고 용이하게 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다. The mesenchymal stem cells can be obtained through the purification process among the cells present in bone marrow, pulp, periodontal ligament, alveolar bone, root tooth or gum, and the process of extracting stem cells according to the characteristics of each tissue can be used by a known method. It is well known to those skilled in the art, and currently sells cell lines that can use human-derived mesenchymal stem cells for research purposes, so that mesenchymal stem cells can be easily and easily obtained.

중간엽 줄기세포의 배양 과정과 관련하여 필수적으로 포함되는 과정들은 문헌들을 통해 공개되어 있으며, 세포배양에 앞서 공지의 방법을 통해 공급원으로부터 추출한 생검 즉, 골수, 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 등은 일반적인 항생제를 포함한 세척배지를 이용한 반복적인 세척과정을 통해 후속배양에서의 오염 가능성을 최소한으로 감소시킬 수 있다. Processes essential for the culturing of mesenchymal stem cells have been disclosed in the literature, and biopsies extracted from sources through known methods prior to cell culture, ie bone marrow, pulp, periodontal ligament, alveolar bone, root apex or gum It is possible to minimize the likelihood of contamination in subsequent cultures by repeated washing with a common wash medium containing antibiotics.

혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 중간엽 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 좋다. 본 발명에서는 일반적으로 세포배양에 사용하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium)을 사용하고, 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함한다. The medium for initial cell culture, including serum, is preferably a medium for the purpose of maintaining and storing cell types such as mesenchymal stem cells. In the present invention, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) and aMEM (alpha Minimal Essential Medium), which are generally used for cell culture, are used and include serum commonly used in cell culture.

혈청은 0.1 내지 20％의 소 태아 혈청(FBS)을 첨가하는 것이 좋고, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다. Serum should preferably contain 0.1-20% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics, antifungals and reagents to prevent the growth of mycoplasma causing contamination.

항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 폰지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다. As the antibiotic, antibiotics commonly used for cell culture such as penicillin, streptomycin or fungizone can be used. Amphotericin B is preferred as an antifungal agent, tylosin as a mycoplasma inhibitor, and gentamicin, ciprofloxacin, and azithromycin can prevent mycoplasma contamination.

필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.If necessary, oxidants such as glutamine and energy metabolites such as sodium pyruvate can be added.

일 구체예에 따르면, 배지는 1∼2mM 의 글루타민, 0.5∼1mM 소디움 피루베이트, 5∼10％ FBS, 1％ 항생제(100IU/mL)로 보충된 글루코오스 및 DMEM을 함유하는데 이를 완전혈청배지라 한다. 이때 글루코오스의 농도범주는 대략적으로 1g/L∼4.5g/L일 수 있다. 상기 완전혈청배지는 골수 또는 치수 유래 줄기세포의 보관과 유지 및 시험관내 안정된 기본배양조건을 제공해 주며 효과적인 세포의 안정화를 보여준다.According to one embodiment, the medium contains 1-2 mM glutamine, 0.5-1 mM sodium pyruvate, 5-10% FBS, glucose supplemented with 1% antibiotic (100 IU / mL) and is referred to as complete serum medium. . In this case, the concentration range of glucose may be approximately 1 g / L to 4.5 g / L. The complete serum medium provides stable storage and maintenance of bone marrow or pulp-derived stem cells and basic culture conditions in vitro and shows effective cell stabilization.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90∼95％, 온도 35∼39℃, 5∼10％ CO2 배양기에서 배양하고, 5∼10％ CO2 배양 시에는 최종농도가 0.17∼0.22 중량％가 되게 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다. In general culture conditions, the initial culture is the most appropriate conditions to apply the culture at 90 to 95% humidity, temperature 35~39 ℃, 5~10% CO 2 incubator and, 5~10% CO 2, the final concentration during culture in cell culture Carbon modifiers, such as sodium bicarbonate, can be added so that it may become 0.17 to 0.22 weight%.

초기배양 단계 동안 조직단편은 배양 용기 바닥에 부착된 상태를 유지시키는 게 바람직하며, 세포 배양의 표준 기술에 따른 트립신-EDTA 처리로 인한 짧은 자극으로 성장을 촉진할 수 있다. During the initial culture step, the tissue fragments are preferably attached to the bottom of the culture vessel and can promote growth with short stimulation due to trypsin-EDTA treatment according to standard techniques of cell culture.

누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75∼85％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 80％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대배양을 한다. The cumulative population doubling time is maintained until 75-85% confluence of the cells in culture in the flask is preferably subcultured at 80% confluence.

상기 단계 배양된 골수 또는 치수 유래의 줄기세포를 무혈청 배지에서 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조한다.
Conditioned medium is prepared by culturing stem cells derived from bone marrow or pulp derived from the above step for 1 to 3 days at 25 to 40 ° C. in serum-free medium.

본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법에 있어서, 제2단계는 컨디션드 배지와 알코올류 극성용매를 반응시켜 유효성분을 농축시키는 단계이다.In the method for producing a conditioned medium powder of the present invention, the second step is a step of concentrating the active ingredient by reacting the conditioned medium with an alcohol-like polar solvent.

상기 알코올류 극성용매는 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올, 상기 알코올의 희석용액, 예컨대, 95%, 90% 알코올 수용액, 또는 환원제에 의해 아이소프로필 알코올이 되는 아세톤 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.The alcohol polar solvent may be used alone or two or more of a lower alcohol having 1 to 6 carbon atoms, a dilution solution of the alcohol, for example, 95%, 90% alcohol aqueous solution, or acetone to be isopropyl alcohol by a reducing agent. .

본 명세서에서, 알코올 수용액은 알코올의 희석용액을 의미하는 것으로, 예를 들어, 95% 에탄올, 90% 에탄올 등을 포함할 수 있다.In the present specification, the aqueous alcohol solution refers to a dilute solution of alcohol, for example, may include 95% ethanol, 90% ethanol and the like.

상기 알코올류 극성용매는 컨디션드 배지에 대하여 2 내지 5배의 중량비의 함량으로 혼합될 수 있다. 상기 범위 내일 경우, 컨디션드 배지 내의 유효성분의 효과적인 농축을 얻을 수 있다.The alcohol polar solvent may be mixed in an amount of 2 to 5 times the weight ratio of the conditioned medium. If it is in the said range, the effective concentration of the active ingredient in a conditioned medium can be obtained.

상기 컨디션드 배지와 알코올류 극성용매의 반응은 -30 내지 0 ℃에서 5 내지 500분 동안 수행될 수 있다.The reaction of the conditioned medium and the polar polar solvent may be performed at -30 to 0 ° C for 5 to 500 minutes.

일 구체예에 따르면, 컨디션드 배지를 원심분리 한 후 상층액을 수득하고, 상기 상층액에 100% 알코올을 부가하여 -30 내지 0 ℃에서 5 내지 500분 동안 방치한다. 이를 원심분리 한 후 침전물에 90% 알코올을 부가하여 다시 원심분리 한다. 이로부터 얻은 침전물에 멸균수를 첨가하여 현탁한 후 동결한다.According to one embodiment, the supernatant is obtained after centrifuging the conditioned medium, and 100% alcohol is added to the supernatant and left at -30 to 0 ° C for 5 to 500 minutes. After centrifugation, 90% alcohol is added to the precipitate and centrifuged again. The precipitate obtained therefrom is added with sterile water, suspended and frozen.

상기 단계를 거친 반응물을 6 내지 10 시간 동안 동결 건조하는 단계를 더 거칠 수 있다.The reactant subjected to the above step may be further subjected to lyophilization for 6 to 10 hours.

상기 동결 건조 후 분말 형태의 제제로 얻을 수 있다.
After freeze-drying can be obtained in powder form.

본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법에 따라 제조된 분말 형태의 제제는 유효성분이 고농축으로 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 유효성분으로 Decorin, MCP-1, DKK-3 및 TIMP-2를 포함하는 컨디션드 배지 분말을 제공한다.Powder form preparations prepared according to the method for producing a conditioned medium powder of the present invention may be present in a highly concentrated active ingredient. Accordingly, the present invention provides a conditioned medium powder containing Decorin, MCP-1, DKK-3 and TIMP-2 as an active ingredient.

일 구체예에 따르면, 상기 컨디션드 배지 분말에는 Decorin, MCP-1, DKK-3, TIMP-2, Angiogenin, Follistatin, Osteoprotegerin, betaIG-H3, MMP-10, MMP-7, LYVE-1, XEDAR, IL-22, RANK, IGFBP-6, Axl, FLRG, NRG1-beta1, PAI-1, Ferritin, Galectin-7, Resistin, Bate2 M, TSLP, VEGF-C, CD40, sTNT R1, IL-6, TRAIL R2, Osteopontin, TIMP-1, Growth Hormon, Thromboppoietin, CXCL-16, DPPIV, HVEM, IL-17B, IL-3, bFGF, IFN-r, TGF, HGF 또는 PDGF 등이 포함될 수 있다.
According to one embodiment, the conditioned medium powder is Decorin, MCP-1, DKK-3, TIMP-2, Angiogenin, Follistatin, Osteoprotegerin, betaIG-H3, MMP-10, MMP-7, LYVE-1, XEDAR, IL-22, RANK, IGFBP-6, Axl, FLRG, NRG1-beta1, PAI-1, Ferritin, Galectin-7, Resistin, Bate2 M, TSLP, VEGF-C, CD40, sTNT R1, IL-6, TRAIL R2 , Osteopontin, TIMP-1, Growth Hormon, Thromboppoietin, CXCL-16, DPPIV, HVEM, IL-17B, IL-3, bFGF, IFN-r, TGF, HGF or PDGF.

상기 컨디션드 배지 분말은 유효성분으로 Decorin, MCP-1, DKK-3 및 TIMP-2를 다량 포함하고 있어 줄기세포의 분열 및 분화를 촉진하는 뛰어난 효과를 나타내므로, 본 발명은 또한 상기 컨디션드 배지 분말을 포함하는 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물을 제공한다.Since the conditioned medium powder contains a large amount of Decorin, MCP-1, DKK-3 and TIMP-2 as an active ingredient, and shows an excellent effect of promoting division and differentiation of stem cells, the present invention also provides the conditioned medium It provides a composition for promoting stem cell division and differentiation comprising a powder.

상기 컨디션드 배지 분말은 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 20 중량부로 포함되는 것이 좋다.The conditioned medium powder may be included in 1 to 20 parts by weight based on 100 parts by weight of the composition for promoting stem cell division and differentiation.

본 발명의 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물은 줄기세포가 분비하는 활성 단백질 복합물을 함유함으로써 줄기세포를 사용할 때 나타날 수 있는 면역학적 문제점, 안전성에 대한 문제점, 제제학적 문제점, 개체 편차를 최소화할 수 있다. 또한 인체 내 세포 주입으로 인하여 발생할 수 있는 부작용을 근본적으로 방지할 수 있다.Stem cell division and differentiation promoting composition of the present invention can minimize the immunological problems, safety problems, pharmaceutical problems, individual deviations that may occur when using stem cells by containing the active protein complex secreted by stem cells have. In addition, it can fundamentally prevent side effects that may occur due to cell injection in the human body.

본 발명의 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. Stem cell division and differentiation promoting composition of the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제,향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. When the composition of the present invention is manufactured from a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the formulation and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not. The pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans in various routes such as oral or parenteral routes such as oral, rectal or intravenous, muscular, subcutaneous, intra-uterine, Can be administered by injection. Preferably, it is applied by transdermal administration during parenteral administration, more preferably by topical application by application.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.1∼100 ㎎/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to the patient. Can be. The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be administered once or several times a day in an oral dosage form of 0.1 to 100 mg / kg on an adult basis. It is recommended to apply 1 to 5 times a day in an amount of 3.0 ml to continue for 1 month or more. However, the dosage is not intended to limit the scope of the present invention.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container. The formulation may be used in any form suitable for pharmaceutical preparations, including powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, oral formulations such as aerosols, external preparations such as ointments, creams, suppositories, and sterile injectable solutions. It may further comprise a dispersant or stabilizer.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention more specifically and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments.

<실시예 1> 골수 유래 중간엽 줄기세포의 수득Example 1 Obtaining Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

골수 유래 중간엽 줄기세포 hMSC는, Human Mesenchymal stem cells (Lonza, PT-2501)에서 구매하였고, 22세 건강한 여자의 골수로부터 분리된 세포였다. 골수 유래 중간엽 줄기세포의 초기 계대배양은 4.5g/L의 D-글루코스, 584mg/L의 L-글루타민, 110mg/L의 소디움피루베이트 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90%의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5 % CO2 배양기에서 배양하였다.Bone marrow derived mesenchymal stem cells hMSCs were purchased from Human Mesenchymal stem cells (Lonza, PT-2501) and were isolated from the bone marrow of a 22 year old healthy woman. Initial passage of bone marrow-derived mesenchymal stem cells was 4.5 g / L D-glucose, 584 mg / L L-glutamine, 110 mg / L sodium pyruvate 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin or amphoteric as an antifungal agent It was added to DMEM medium supplemented with SinB and incubated in a 5% CO 2 incubator under about 90% humidity and about 37 ° C. temperature conditions.

계대배양은 배양액을 제거한 플라스크를 인산완충용액으로 세척하고 0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 떨어뜨린 후 세포 부유액을 원심분리 한 다음, 세포수 측정과 생존능을 검사한 뒤 다시 3배로 계대배양 하였다. For subculture, wash the flask from which the culture medium was removed with phosphate buffer solution, drop the cells with 0.25% Trypsin-EDTA (GIBCO), centrifuge the cell suspension, check the cell count and viability, and then subculture again. It was.

계대배양에 사용한 배지는 4.5g/L의 D-글루코스, 584mg/L의 L-글루타민, 110mg/L의 소디움피루베이트, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 DMEM 배지였다.The medium used for passage was DMEM medium supplemented with 4.5 g / L D-glucose, 584 mg / L L-glutamine, 110 mg / L sodium pyruvate, 1% penicillin-streptomycin or amphotericin B with an antifungal agent. .

세포의 컨플루언시가 약 70∼80%가 되었을 때 파이펫을 사용하여 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산완충용액으로 2회 세척한 후, 4.5g/L의 D-글루코스, 584mg/L의 L-글루타민, 110mg/L의 소디움피루베이트, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 폰지존이 보충된 DMEM 배지를 가한 후 약 90%의 습도 및 약 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하였다.
When the cell confluency reached about 70-80%, the culture medium was removed from the culture cultured using a pipette, washed twice with phosphate buffer solution, and then 4.5 g / L of D-glucose, 584 mg. / L of L-glutamine, 110 mg / L of sodium pyruvate, 1% penicillin-streptomycin or DMEM medium supplemented with Ponzizon and then in a 5% CO 2 incubator under about 90% humidity and about 37 ° C. temperature conditions. Incubated for 48 hours.

<실시예 2> 무혈청 배지 분말 제제의 제조Example 2 Preparation of Serum-Free Medium Powder Formulations

상기 실시예 1에서 배양한 배양액 50mL을 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 새로운 튜브로 옮긴 후 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리한 뒤 잔여 부유물을 제거한 뒤, 100% 에탄올을 3배 첨가하여 -20℃에 한 시간 동안 방치하였다. 이후 15분간 4℃에서 15000rpm으로 원심분리 하였다. 이후 침전물에 90% 에탄올을 처리하여 다시 15000rpm으로 7분간 원심분리 하였다. 원심분리 한 침전물에 멸균수 2.5mL을 첨가하여 침전물을 녹인 후에 1.8mL-튜브에 500㎕씩 분주한 후 -80℃ 디프리져에서 3시간 방치하였다. 이후 동결건조를 8시간 진행한 후 분말 형태로 제조하였다.
After centrifuging 50mL of the culture medium in Example 1 for 5 minutes at 1500rpm, the supernatant was transferred to a new tube, centrifuged for 3 minutes at 3000rpm, and after removing the remaining suspended solids, 100% ethanol was added three times. It was left at -20 ℃ for one hour. After 15 minutes centrifuged at 15000rpm at 4 ℃. After treating the precipitate with 90% ethanol was again centrifuged for 7 minutes at 15000rpm. After dissolving the precipitate by adding 2.5mL of sterile water to the centrifuged precipitate, 500μl was dispensed into 1.8mL-tube and left for 3 hours in a -80 ° C defreezer. After lyophilization for 8 hours to prepare a powder form.

<실시예 3> 성인, 유치 치수 줄기세포의 수득 Example 3 Obtaining Adult, Primary Pulp Stem Cells

성인 치아 및 유치(젖니)의 치수 줄기세포는 치아 발치 시 공여 되는 치아에서 분리하였다. 치아에서 치수를 회수한 다음 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신 B가 보충된 a-MEM배지 10mL에 콜라게네이즈(3mg/mL) 및 디스페이즈(4mg/mL)를 첨가하여 치수에 처리하여 약 90%의 습도 및 약 37℃ 온도 조건하에서 5% CO2 배양기에서 한 시간 반응 시켰다. 반응이 끝난 조직을 70㎛의 스트레이너에 통과시켜서 세포를 수득하였다. Pulp stem cells of adult teeth and teeth (ear teeth) were isolated from the donated teeth at tooth extraction. The pulp was recovered from the teeth, and collagenase (3 mg / mL) and disparate (4 mg / mL) were added to 10 mL of a-MEM medium supplemented with 1% penicillin-streptomycin or amphotericin B as an antifungal agent. Treatment was performed for 1 hour in a 5% CO 2 incubator under about 90% humidity and about 37 ° C. temperature conditions. After the reaction, the tissue was passed through a 70 μm strainer to obtain cells.

치수 줄기세포의 초기 계대배양은 a-MEM, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90%의 습도 및 약 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다.Initial passage of pulp stem cells was carried out in a-MEM, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin or DMEM medium supplemented with amphotericin B as an antifungal agent and under conditions of about 90% humidity and about 37 ° C. temperature. Cultured in a% CO 2 incubator.

계대배양은 배양액을 제거한 플라스크를 인산완충용액으로 세척하고 0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 떨어뜨린 후 세포 부유액을 원심분리 한 다음, 세포수 측정과 생존능을 검사한 뒤 다시 3배로 계대배양 하였다. For subculture, wash the flask from which the culture medium was removed with phosphate buffer solution, drop the cells with 0.25% Trypsin-EDTA (GIBCO), centrifuge the cell suspension, check the cell count and viability, and then subculture again. It was.

계대배양에 사용한 배지는 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 a-MEM 배지였다.The medium used for subculture was 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin or a-MEM medium supplemented with amphotericin B with an antifungal agent.

세포의 컨플루언시가 약 70∼80%가 되었을 때 파이펫을 사용하여 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산완충용액으로 2회 세척한 후 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 폰지존이 보충된 DMEM 배지 또는 aMEM을 가한 후 약 90%의 습도 및 약 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하였다.
When the confluency of the cells reached about 70-80%, the culture medium was removed from the culture cultured using the pipette, washed twice with phosphate buffer solution, and supplemented with 1% penicillin-streptomycin or ponzione. DMEM medium or aMEM was added and then incubated for 48 hours in a 5% CO 2 incubator under a humidity of about 90% and a temperature of about 37 ° C.

<실시예 4> 무혈청 배지 분말 제제의 제조Example 4 Preparation of Serum-Free Medium Powder Formulations

상기 실시예 3에서 배양한 배양액 50mL을 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 새로운 튜브로 옮긴 후 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리한 뒤 잔여 부유물을 제거한 뒤, 100% 에탄올을 첨가하여 -20℃에 한 시간 방치하였다. 이후 15분간 4℃에서 15000rpm으로 원심분리 하였다. 이후 침전물에 다시 90% 에탄올을 처리하여 15000rpm으로 7분간 원심분리 하였다. 원심분리 한 침전물에 멸균수 2.5mL을 첨가하여 침전물을 녹인 후에 1.8mL-튜브에 500㎕씩 분주한 후 -80℃ 디프리져에서 3시간 방치하였다. 이후 동결건조를 8시간 진행한 후 분말 형태로 제조하였다.
50 mL of the culture medium in Example 3 was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was transferred to a new tube, followed by centrifugation at 3000 rpm for 3 minutes to remove residual suspension, and then 100% ethanol was added to- It was left at 20 ° C. for one hour. After 15 minutes centrifuged at 15000rpm at 4 ℃. Then, the precipitate was further treated with 90% ethanol and centrifuged at 15000 rpm for 7 minutes. After dissolving the precipitate by adding 2.5mL of sterile water to the centrifuged precipitate, 500μl was dispensed into 1.8mL-tube and left for 3 hours in a -80 ° C defreezer. After lyophilization for 8 hours to prepare a powder form.

<실시예 5> 세포분열 능력 분석Example 5 Cell Division Capability Analysis

골수 유래 중간엽 줄기세포에 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말을 배양배지 100 중량부에 대해 10중량부로 첨가한 다음 세포 증식율을 세포 수 측정(Cell counting) 및 MTT 분석을 실시하여 5일간 평가하였다(각 그룹 당 n=3).To the bone marrow-derived mesenchymal stem cells, the conditioned medium powder prepared in Examples 2 and 4 was added at 10 parts by weight based on 100 parts by weight of the culture medium, and then the cell proliferation rate was measured by cell counting and MTT analysis. Evaluation was made for 5 days (n = 3 in each group).

도 1에 나타난 바와 같이, 컨디션드 배지 분말을 첨가하지 않은 대조군에 비해 세포수가 현저히 증가하여 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말은 세포분열을 촉진함을 알 수 있었다.
As shown in Figure 1, the number of cells significantly increased compared to the control medium did not add the conditioned medium powder, it can be seen that the conditioned medium powder prepared in Examples 2 and 4 promote cell division.

<실시예 6> 콜로니 형성 능력Example 6 Colony Formation Ability

골수 유래 중간엽 줄기세포에 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말을 배양배지 100 중량부에 대해 10중량부로 첨가한 다음 세포 증식율을 콜로니 형성능력을 확인하였다.To the bone marrow-derived mesenchymal stem cells, the conditioned medium powder prepared in Examples 2 and 4 was added at 10 parts by weight based on 100 parts by weight of the culture medium, and then the cell proliferation rate was confirmed by colony formation ability.

도 2에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말 둘 다 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMMSC)의 콜로니 형성 능력을 향상시킴을 알 수 있었다.
As shown in Figure 2, both of the conditioned medium powder prepared in Examples 2 and 4 was found to improve the colony forming ability of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMMSC).

<실시예 7> 골분화 능력 테스트Example 7 Bone Differentiation Ability Test

골수 유래 중간엽 줄기세포 및 치수 유래 줄기세포를 골아세포로 분화시키기 위해, 상기 줄기세포들에 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말을 배양배지 100 중량부에 대해 10중량부로 각각 첨가한 다음 100mM 덱사메타손(dexamethasone), 10mM β- 글리세롤 인산염(β-glycerol phosphate) 및 50nM 아스코르브산-2-인산염(ascorbate-2-phosphate)과 10% 우태아혈청으로 처리하였다. 골아세포로 분화되었는지 여부는 골아세포의 경우 알리잘린 레드(Alizarin red) 염색법을 사용하였다.To differentiate the bone marrow-derived mesenchymal stem cells and pulp-derived stem cells into osteoblasts, the conditioned medium powder prepared in Examples 2 and 4 was added to the stem cells at 10 parts by weight based on 100 parts by weight of the culture medium, respectively. It was then treated with 100 mM dexamethasone, 10 mM β-glycerol phosphate and 50 nM ascorbate-2-phosphate and 10% fetal bovine serum. Whether or not they were differentiated into osteoblasts, Alizarin red staining was used for osteoblasts.

도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말은 각각 골수 유래 줄기세포와 치수 유래 줄기세포의 골아세포로의 분화를 촉진함을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 3, the conditioned medium powder prepared in Examples 2 and 4 promoted differentiation of bone marrow-derived stem cells and pulp-derived stem cells into osteoblasts, respectively.

RSD: 유치로부터 분리한 세포를 DMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
RSa: 유치로부터 분리한 세포를 aMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
RDa: 성인치아로부터 분리한 세포를 aMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
RDD: 성인치아로부터 분리한 세포를 DMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
RBD: 골수 유래 중간엽 줄기세포를 DMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
RBa: 골수 유래 중간엽 줄기세포를 aMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
SHED: Stem cells From Human Exfoliated Deciduous Teeth(인간의 자연 탈락되는 유치 또는 젖니 유래 줄기세포) 컨디션드 배지
DPSC: Dental Pulp Stem Cell(치아 치수 줄기세포) 컨디션드 배지RSD: A sample treated with 10% of conditioned powder prepared after culturing cells isolated from incubated in DMEM
RSa: A sample treated with 10% of the conditioned powder prepared after incubating the cells isolated from the larvae in aMEM
RDa: A sample treated with 10% conditioned powder prepared after culturing cells isolated from adult teeth in aMEM
RDD: A sample treated with 10% conditioned powder prepared after culturing cells isolated from adult teeth in DMEM
RBD: Sample treated with 10% conditioned powder prepared after culturing bone marrow-derived mesenchymal stem cells in DMEM
RBa: Sample treated with 10% conditioned powder prepared after culturing bone marrow-derived mesenchymal stem cells in aMEM
SHED: Stem cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth Conditioned Medium
DPSC: Dental Pulp Stem Cell Conditioned Medium

Claims (13)

세포를 무혈청 배지에서 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및
알코올, 알코올 수용액 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 극성용매와 상기 컨디션드 배지를 반응시키는 단계를 포함하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
Culturing the cells in serum free medium to produce conditioned medium; And
A method of producing a conditioned medium powder comprising the step of reacting the conditioned medium with at least one polar solvent selected from the group consisting of alcohol, aqueous alcohol solution and acetone.
제1항에 있어서,
세포는 줄기세포를 포함하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
The method of claim 1,
Cell is a method of producing a conditioned medium powder comprising a stem cell.
제2항에 있어서,
줄기세포는 다음과 같은 특성을 나타내는 골수 또는 치수 유래의 중간엽 줄기세포인 컨디션드 배지 분말의 제조방법:
(a) CD90, CD105, CD44 및 CD73 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고,
(b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내며,
(c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가진다.
The method of claim 2,
Stem cells are bone marrow or pulp-derived mesenchymal stem cells exhibiting the following characteristics:
(a) exhibits positive immunological characteristics for CD90, CD105, CD44 and CD73,
(b) grows attached to a cell culture dish and exhibits morphological characteristics of spindle-shape,
(c) cells differentiated into mesenchymal stem cells.
제1항에 있어서,
무혈청 배지는 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
The method of claim 1,
Serum-free medium is a method of producing a conditioned medium powder further comprises a growth factor or cytokine.
제4항에 있어서,
성장인자는 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
5. The method of claim 4,
Growth factor is one or more selected from the group consisting of IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF and PDGF.
제4항에 있어서,
사이토카인은 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-r, IL-10 및 IL-17로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
5. The method of claim 4,
And cytokine is at least one selected from the group consisting of IL-1, IL-4, IL-6, IFN-r, IL-10 and IL-17.
제1항에 있어서,
배양은 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 실시하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
The method of claim 1,
Cultivation is a method for producing a conditioned medium powder to be carried out for 1 to 3 days at 25 to 40 ℃.
제1항에 있어서,
컨디션드 배지 및 극성용매는 1: 2 내지 5의 중량비로 혼합하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
The method of claim 1,
The conditioned medium and the polar solvent are mixed in a weight ratio of 1: 2 to 5.
제1항에 있어서,
반응은 -30 내지 0 ℃에서 5 내지 500분 동안 수행하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
The method of claim 1,
Reaction is a method for producing a conditioned medium powder is carried out at -30 to 0 ℃ for 5 to 500 minutes.
제1항에 있어서,
컨디션드 배지 및 극성용매의 반응에서 얻은 반응물을 동결 건조하는 단계를 더 포함하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
The method of claim 1,
A method for producing a conditioned medium powder further comprising the step of lyophilizing a reactant obtained in the reaction of a conditioned medium and a polar solvent.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 제조되고, 유효성분으로 Decorin, MCP-1, DKK-3 및 TIMP-2를 포함하는 컨디션드 배지 분말.
Conditioned medium powder prepared according to the method according to any one of claims 1 to 10, comprising Decorin, MCP-1, DKK-3 and TIMP-2 as an active ingredient.
제11항의 컨디션드 배지 분말을 포함하는 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물.
A composition for promoting stem cell division and differentiation comprising the conditioned medium powder of claim 11.
제12항에 있어서,
컨디션드 배지 분말은 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 20 중량부로 포함되는 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물.The method of claim 12,
Conditioned medium powder is a stem cell division and differentiation promoting composition comprising 1 to 20 parts by weight based on 100 parts by weight of the composition for promoting stem cell division and differentiation.
KR1020120018657A 2012-02-23 2012-02-23 Method for preparing conditioned medium powder KR102126331B1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120018657A KR102126331B1 (en) 2012-02-23 2012-02-23 Method for preparing conditioned medium powder
PCT/KR2013/001496 WO2013125927A1 (en) 2012-02-23 2013-02-25 Production method for conditioned medium powder

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120018657A KR102126331B1 (en) 2012-02-23 2012-02-23 Method for preparing conditioned medium powder

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130096993A true KR20130096993A (en) 2013-09-02
KR102126331B1 KR102126331B1 (en) 2020-06-25

Family

ID=49006021

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120018657A KR102126331B1 (en) 2012-02-23 2012-02-23 Method for preparing conditioned medium powder

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102126331B1 (en)
WO (1) WO2013125927A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150008306A (en) * 2013-07-12 2015-01-22 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) Media composition comprising interferon-γ and method for producing iduced pluripotent stem cell having none-graft rejection

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19980041619A (en) * 1996-11-30 1998-08-17 이해규 Horizontal retaining device of construction equipment

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030161818A1 (en) 2002-02-25 2003-08-28 Kansas State University Research Foundation Cultures, products and methods using stem cells
WO2011118795A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 国立大学法人名古屋大学 Composition for treatment of damaged part

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998008934A1 (en) * 1996-08-30 1998-03-05 Life Technologies, Inc. Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
US6372494B1 (en) * 1999-05-14 2002-04-16 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods of making conditioned cell culture medium compositions
KR100627695B1 (en) * 2004-04-12 2006-09-25 주식회사 바이넥스 Animal serum-free medium composition for culturing human stem cells and method for differentiating from the cultured human stem cells to hematocytes
KR101119225B1 (en) * 2009-03-20 2012-03-20 주식회사 스템메디언스 Large scale production of growth promoting factors using fetus-derived mesenchymal stem cells from amniotic fluids
KR101245562B1 (en) * 2010-05-26 2013-03-21 바이오스펙트럼 주식회사 Serum-free medium for animal cell culture comprising natural extracts or compounds isolated from them

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030161818A1 (en) 2002-02-25 2003-08-28 Kansas State University Research Foundation Cultures, products and methods using stem cells
WO2011118795A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 国立大学法人名古屋大学 Composition for treatment of damaged part

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Developmental Brain Research, vol.152, pp. 189-197, 2004

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150008306A (en) * 2013-07-12 2015-01-22 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) Media composition comprising interferon-γ and method for producing iduced pluripotent stem cell having none-graft rejection

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013125927A1 (en) 2013-08-29
KR102126331B1 (en) 2020-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107254443B (en) Induction medium and induction method for promoting differentiation of mesenchymal stem cells to neurons
KR101542849B1 (en) Method for Differentiating Pluripotency Stem Cell Induced from Mesenchymal Stem Cell into Hepatocyte
KR101980453B1 (en) Composition For Promoting Production of Stem Cell-derived Exosomes
US20180236003A1 (en) Cell Expansion Methods and Therapeutic Compositions
JP7246569B2 (en) Composition for promoting stem cell-derived exosome production and enhancing stem cell potency
WO2023164241A1 (en) Method for enriching muse cells and obtaining exosomes, microvesicles or the secretome therefrom
KR20150050861A (en) Method for Differentiating Pluripotency Stem Cell Induced from Mesenchymal Stem Cell into Chondrocyte
Fanjun et al. Induced differentiation of human cord blood mesenchymal stem/progenitor cells into cardiomyocyte-like cells in vitro
KR101479566B1 (en) Composition for improvement atopy using protein secreted from stem cells
Malerba et al. Selection of multipotent cells and enhanced muscle reconstruction by myogenic macrophage-secreted factors
KR102126331B1 (en) Method for preparing conditioned medium powder
KR102123268B1 (en) Composition For Promoting Production of Stem Cell-derived Exosomes and Increasing Stemness comprising Hyaluronic acid
Yan et al. Maxillofacial-derived mesenchymal stem cells: characteristics and progress in tissue regeneration
CN111973632A (en) Stem cell preparation for treating diabetes and preparation method thereof
JP2023130530A (en) Extracellular vesicle solution
KR101334243B1 (en) Method for manufacturing culture solution of fetus-derived mesenchymal stem cells from amniotic fluids using shear stress
WO2015064803A1 (en) Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into osteoblast
KR20150050865A (en) Method for Differentiating Pluripotency Stem Cell Induced from Mesenchymal Stem Cell into Adipocyte
KR101538969B1 (en) Medium Composition for Culturing Mesenchymal Stem Cells Comprising Extract of Ecklonia cava
KR20210063084A (en) PREPARING METHOD OF POLYDEOXYRIBONUCLEOTIDE FROM HUMAN DERIVED In vitro cultivated STEM CELL, POLYDEOXYRIBONUCLEOTIDE PREPARED BY THE SAME, AND COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME
KR20230005830A (en) Medium for stem cells and method for culturing stem cells
KR101982835B1 (en) Method for Differentiating Pluripotency Stem Cell Induced from Mesenchymal Stem Cell into Pancrease beta-cell
JP6305782B2 (en) Stem cell undifferentiated state maintenance agent and growth promoter
KR101486314B1 (en) Composition for bone regeneration comprising conditioned medium powder of stem cell
KR20130003159A (en) Method for manufacturing fetus-derived mesenchymal stem cells from amniotic fluids using selenium containing medium

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant