KR20130077296A - Clostridium sp. strain, a method for producing butyric acid using the clostridium sp. strain, and a method for isolating the clostridium sp. strain - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 신규한 클로스트리디움 속 균주에 관한 것이다. 다른 한편으로는 갈락토스로부터 부티르산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 한편으로는, 갈락토스로부터 부티르산을 생산하는 신규한 클로스트리디움 속 균주를 분리하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a novel strain of Clostridium sp. On the other hand, a method for producing butyric acid from galactose. On the other hand, it relates to a novel method for isolating Clostridium sp. Strain which produces butyric acid from galactose.
최근 화석 연료 고갈과 지구 온난화 문제로 인해 지속적이고 조화로운 발전과 함께 에너지 보존 및 효율적인 환경 보존을 위한 대체 가능한 새로운 에너지의 개발에 관심이 모아지고 있다. Recently, fossil fuel depletion and global warming have attracted interest in sustainable and harmonious development, as well as the development of alternative energy sources for energy conservation and efficient environmental conservation.
바이오매스는 재생 가능한 식물로부터 생성된 유기물을 말하며 이 중에는 에너지 작물, 나무와 식품, 사료 등이 있고, 최근에는 새로운 바이오매스로서 해조류에 대한 관심이 높아지고 있다. 해양에서 대량 양식을 통해 생산되는 해조류는 육상식물처럼 심각한 식량 공급 문제를 촉발시키거나, 성장 기간이 긴 산림 자원처럼 자원을 고갈시키지 않는 자원이기 때문이다. 더욱이 해조류는 목질계에 비하여 성장 속도가 월등히 빠르며, 구성성분 면에서도 리그닌이 함유되어 있지 않아 전처리가 용이하다.Biomass refers to organic matter generated from renewable plants, including energy crops, trees, food, and feed. In recent years, interest in algae has increased as a new biomass. Algae produced in large scale in the oceans is a resource that does not trigger serious food supply problems like land plants or does not deplete resources like long-lived forest resources. In addition, seaweeds have a much faster growth rate than wood-based ones, and are easy to pretreat because they do not contain lignin.
홍조류는 해조류 중 가장 많은 탄소원을 포함하고(예컨대, 77.2 %, 우뭇가사리), 주요 탄수화물 구성성분은 갈락탄과 셀룰로스이다. 갈락탄 성분은 당화에 의해 갈락토스로 분해되고, 셀룰로스는 글루코오스로 분해된다.Red algae contains the largest number of carbon sources (eg, 77.2%) in seaweeds, and the main carbohydrate constituents are galactan and cellulose. The galactan component is degraded to galactose by glycation, and the cellulose is decomposed into glucose.
부티르산은 화학, 식품 및 의약 산업에 널리 사용되는 물질로 대표적인 생산균주는 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)이다(한국 공개 특허 제10-2009-0103720). 그러나, 한국 공개 특허 제10-2009-0103720호에 개시된 내용은 글루코스로부터 부티르산을 생산하는 것이다. 클로스트리디움 타이로부티리쿰은 홍조류에 포함된 갈락토스를 거의 이용하지 못하는 문제점이 있어 발효 수율이 떨어진다. 이를 극복하기 위해서는 갈락토스를 효과적으로 이용하여 부티르산을 생산하는 새로운 미생물의 개발이 절실히 필요하다.
Butyric acid is widely used in the chemical, food and pharmaceutical industries. Typical production strains include but are not limited to Clostridium tyrobutyricum) (Korea Patent Publication No. 10-2009-0103720). However, what is disclosed in Korean Patent Laid-Open No. 10-2009-0103720 is to produce butyric acid from glucose. Clostridium thyrobutiricum has a problem in that galactose contained in red algae is hardly utilized, and the yield of fermentation is low. To overcome this, it is urgently necessary to develop a new microorganism that produces galactose effectively and produces butyric acid.
본 명세서에 개시된 기술은 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 균주를 제공하는 것이다.The technique disclosed herein is to provide a strain that produces butyric acid using galactose.
또 다른 관점에서, 본 명세서에 개시된 기술은 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.In another aspect, the technique disclosed herein provides a method for producing butyric acid using galactose.
또 다른 관점에서, 본 명세서에 개시된 기술은 해조류 바이오매스로부터 부티르산을 고효율로 생산하는 균주를 제공하는 것이다. In another aspect, the technique disclosed herein provides a strain that produces butyric acid from seaweed biomass with high efficiency.
또 다른 관점에서, 본 명세서에 개시된 기술은 해조류 바이오매스로부터 부티르산을 고효율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다. In another aspect, the technique disclosed herein provides a method for efficiently producing butyric acid from seaweed biomass.
또 다른 관점에서, 본 명세서에 개시된 기술은 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 균주를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.In another aspect, the technique disclosed herein provides a method for isolating strains that produce butyric acid using galactose.
본 발명의 일실시예에 따른 균주는, 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 클로스트리디움 속(Clostridium) 균주이다.The strain according to an embodiment of the present invention is a Clostridium strain producing butyric acid using galactose.
본 발명의 일실시예에 따른 부티르산 생산방법은, 갈락토스로부터 부티르산을 생산하는 방법으로서, 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 클로스트리디움 속 균주를 처리하여 갈락토스를 부티르산으로 전환시키는 것을 포함하는 방법이다.A method for producing butyric acid according to an embodiment of the present invention is a method for producing butyric acid from galactose, comprising treating a strain of Clostridium that produces butyric acid using galactose to convert galactose to butyric acid.
본 발명의 일실시예에 따른 클로스트리디움 속 균주의 분리 방법은, 혐기성 슬러지를 열처리하여 그람 음성균을 제거하는 단계; 상기 열처리된 혐기성 슬러지를 갈락토스를 함유한 배지에 접종하여 배양시키는 단계; 상기 배양으로부터 얻어진 배양액을 부티르산 또는 그 염을 함유한 배지에 도말하여 부티르산에 저항성이 있는 콜로니들을 선발하는 단계; 및 상기 선발된 콜로니들의 부티르산 생산량을 측정하여 부티르산 생산량이 가장 높은 균주를 분리하는 단계를 포함하며, 상기 클로스트리디움 속 균주는, 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 균주인 방법이다. The method of isolating Clostridium spp. According to an embodiment of the present invention comprises the steps of: heat treating anaerobic sludge to remove Gram-negative bacteria; Culturing the heat-treated anaerobic sludge in a culture medium containing galactose; Selecting a colony which is resistant to butyric acid by sprinkling the culture obtained from the culture on a medium containing butyric acid or a salt thereof; And isolating the strain having the highest amount of butyric acid production by measuring the butyric acid production amount of the selected colonies, wherein the Clostridium sp. Strain is a strain producing butyric acid using galactose.
본 발명을 이용하면 갈락토스로부터 부티르산을 효과적으로 생산할 수 있다. 갈락토스로부터 부티르산을 생산할 수 있으므로 주요 탄수화물 성분이 갈락탄인 해조류 바이오매스로부터 부티르산을 효과적으로 생산할 수 있다. 이를 통해 해조류 바이오매스를 이용한 화학 원료 또는 바이오 에너지 생산에 널리 이용될 수 있다. By using the present invention, butyric acid can be effectively produced from galactose. Since butyric acid can be produced from galactose, it is possible to effectively produce butyric acid from seaweed biomass, a major carbohydrate ingredient, galactan. It can be widely used to produce chemical raw materials or bioenergy using seaweed biomass.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 클로스트리디움 타이로부티리쿰 S1의 16S rDNA 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 클로스트리디움 타이로부티리쿰 S1의 16S rDNA 영역 염기서열을 바탕으로 계통학적 관계를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 클로스트리디움 타이로부티리쿰 S1의 의 성장 최적 온도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 클로스트리디움 타이로부티리쿰 S1의 의 성장 최적 pH를 나타내는 그래프이다.
도 5는 mMRS 배지에서의 본 발명의 일실시예에 따른 클로스트리디움 타이로부티리쿰 S1의 성장 특성과 부티르산 생산 특성을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 표준 시료 부티르산의 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometry) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 13C가 레이블된 젖산을 첨가한 본 발명의 일실시예에 따른 클로스트리디움 타이로부티리쿰 S1을 이용하여 수득된 부티르산의 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometry) 분석 결과를 나타낸 것이다.1 is a diagram showing a 16S rDNA nucleotide sequence of Clostridium tyrobutyricum S1 according to an embodiment of the present invention.
2 is a diagram showing a phylogenetic relationship based on the 16S rDNA region nucleotide sequence of Clostridium tyrobutyricum S1 according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a graph showing the optimum growth temperature of Clostridium tyrobutyricum S1 according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a graph showing the growth optimal pH of Clostridium tyrobutyricum S1 according to an embodiment of the present invention.
5 is a graph showing the growth characteristics and butyric acid production characteristics of Clostridium tyrobutyricum S1 according to an embodiment of the present invention in mMRS medium.
6A shows the result of GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) analysis of a standard sample of butyric acid.
Figure 6b shows the results of Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) of butyric acid obtained by using Clostridium tyrobutyricum S1 according to an embodiment of the present invention with lactic acid labeled 13 C .
본 발명의 일실시예에 따른 균주는, 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 클로스트리디움 속(Clostridium) 균주이다. The strain according to an embodiment of the present invention is a Clostridium strain producing butyric acid using galactose.
상기 클로스트리디움 속 균주는, 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 갈락토스, 폴리소르베이트 (Tween 80), 디포타슘 히드로젠 포스페이트, 트리암모늄 시트레이트, 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트 및 망간 설페이트 테트라하이드레이트를 포함한 mMRS 액체배지에서 3일간 37℃에서 배양하는 경우, 갈락토스의 25중량% 이상, 30중량% 이상, 35중량% 이상, 40중량% 이상, 45중량% 이상 또는 50중량% 이상을 부티르산으로 전환시키는 성질을 갖는 클로스트리디움 속 균주일 수 있다. mMRS 배지는, 구체적으로, 0.5-1.5 % 펩톤, 0.5-1.5 % 고기 추출물, 0.2-0.8 % 효모 추출물, 1.5-2.5 % 갈락토스, 0.05-0.15 % 폴리소르베이트 (Tween 80), 0.15-0.25 % 디포타슘 히드로젠 포스페이트, 0.15-0.25 % 트리암모늄 시트레이트, 0.005-0.015 % 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트, 0.002-0.008 % 망간 설페이트 테트라하이드레이트 및 선택적으로 0.2-0.8% 소디움 아세테이트를 포함할 수 있다. 구체적으로, mMRS 배지는 1.0 % 펩톤, 1.0 % 고기 추출물, 0.5 % 효모 추출물, 2.0 % 갈락토스, 0.1 % 폴리소르베이트 (Tween 80), 0.2 % 디포타슘 히드로젠 포스페이트, 0.2 % 트리암모늄 시트레이트, 0.01 % 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트, 0.005 % 망간 설페이트 테트라하이드레이트 및 선택적으로 0.5% 소디움 아세테이트를 포함한 배지일 수 있다. 상기 클로스트리디움 속 균주는 최적 생장 온도가 40℃이고 최적 생장 pH가 5.5인 균주일 수 있다. The Clostridium spp. Strain is an mMRS liquid including peptone, meat extract, yeast extract, galactose, polysorbate (Tween 80), dipotassium hydrogen phosphate, triammonium citrate, magnesium sulfate hepta hydrate and manganese sulfate tetrahydrate When cultured at 37 占 폚 for 3 days in a culture medium, has a property of converting at least 25% by weight, at least 30% by weight, at least 35% by weight, at least 40% by weight, at least 45% by weight or at least 50% by weight of galactose into butyric acid It may be Clostridium sp. The mMRS medium is specifically selected from the group consisting of 0.5-1.5% peptone, 0.5-1.5% meat extract, 0.2-0.8% yeast extract, 1.5-2.5% galactose, 0.05-0.15% polysorbate (Tween 80), 0.15-0.25% di Potassium hydrogen phosphate, 0.15-0.25% triammonium citrate, 0.005-0.015% magnesium sulfate heptahydrate, 0.002-0.008% manganese sulfate tetrahydrate, and optionally 0.2-0.8% sodium acetate. Specifically, the mMRS medium contained 1.0% peptone, 1.0% meat extract, 0.5% yeast extract, 2.0% galactose, 0.1% polysorbate (Tween 80), 0.2% dipotassium hydrogen phosphate, 0.2% triammonium citrate, 0.01 % Magnesium sulfate heptahydrate, 0.005% manganese sulfate tetrahydrate, and optionally 0.5% sodium acetate. The Clostridium spp. Strain may be a strain having an optimal growth temperature of 40 DEG C and an optimum growth pH of 5.5.
상기 클로스트리디움 속 균주는 아세트산 또는 그 염, 및 락틱산 또는 그 염 중 하나 이상을 더 이용하여 부티르산을 생산하는 클로스트리디움 속 균주일 수 있다. 아세트산 또는 그 염이나 락틱산 또는 그 염을 배지에 첨가하면 클로스트리디움 속 균주에 의한 부티르산의 생산량이 더욱 향상된다. 아세트산 또는 그 염이나 락틱산 또는 그 염의 첨가량은 mMRS 액체배지 전체 부피를 기준으로 10 내지 100mM 또는 20 내지 80mM, 30 내지 70mM, 40 내지 60mM일 수 있다. 여기서 염은 산과 이온결합을 통해 염을 형성하는 모든 염기에 의한 염일 수 있다. 예컨대, 1A족 금속에 의한 염일 수 있다. 예컨대, 소디움 염 또는 포타슘 염일 수 있다. 상기 균주는 50mM의 아세트산 또는 그 염의 첨가에 따른 부티르산 생산량 증가가, 1.5배 이상, 1.8배 이상, 2.0배 이상 또는 2.2배 이상인 성질을 가질 수 있다. 한편, 상기 균주는 50mM의 락틱산 또는 그 염의 첨가에 따른 부티르산 생산량 증가가, 1.8배 이상, 2.0배 이상, 2.2배 이상 또는 2.4배 이상인 성질을 가진 균주일 수 있다.The Clostridial sp. Strain may be a Clostridial sp. Strain producing butyric acid using one or more of acetic acid or a salt thereof, and lactic acid or a salt thereof. When acetic acid or a salt thereof or lactic acid or a salt thereof is added to the medium, the production amount of butyric acid by Clostridium spp. Strain is further improved. The amount of acetic acid or its salt or lactic acid or its salt to be added may be 10 to 100 mM or 20 to 80 mM, 30 to 70 mM, 40 to 60 mM based on the total volume of the mMRS liquid medium. Where the salt may be a salt with all bases which form a salt through an ionic bond with the acid. For example, it may be a salt of a Group 1A metal. For example, a sodium salt or a potassium salt. The strain may have an increase in the production of butyric acid by 1.5 times, 1.8 times, 2.0 times, or 2.2 times by the addition of 50 mM acetic acid or a salt thereof. On the other hand, the strain may be a strain having an increase in butyric acid production by 1.8 times, 2.0 times, 2.2 times, or 2.4 times as much as the addition of 50 mM lactic acid or a salt thereof.
한편, 상기 클로스트리디움 속 균주는 2-(N-모르홀리노)에탄설포닉산(2-(N-morholino) ethanesulfonic acid, MES) 버퍼를 처리하는 경우 부티르산 생산을 향상시키는 성질을 갖는 클로스트리디움 속 균주일 수 있다. MES 첨가량은 mMRS 액체배지 전체 부피를 기준으로 50 내지 150mM 또는 70 내지 130mM, 80 내지 120mM, 90 내지 110mM이다. 구체적으로, 상기 균주는 100mM MES 처리시 부티르산 생산량 증가가, 1.5배 이상, 1.8배 이상, 2.0배 이상, 2.2배 이상 또는 2.3배 이상인 성질을 가진 균주일 수 있다.On the other hand, the Clostridium sp is 2- (N- know Holly furnace) when working with ethane sulfonic acid (2- (N- morholino) ethanesulfonic acid, MES) buffer having the property of improving the acid producing Clostridium Lt; / RTI > The amount of MES added is 50 to 150 mM or 70 to 130 mM, 80 to 120 mM, 90 to 110 mM based on the total volume of the mMRS liquid medium. Specifically, the strain may be a strain having an increase in the production of butyric acid by 100 mM MES, 1.5 times, 1.8 times, 2.0 times, 2.2 times, or 2.3 times or more.
또한, 상기 클로스트리디움 속 균주는 아세트산 또는 그 염과 100mM MES를 동시에 처리시 부티르산 생산량 증가가, 2.0배 이상, 2.2배 이상, 2.4배 이상, 2.6배 이상 또는 2.8배 이상인 성질을 가진 균주일 수 있다. In addition, the Clostridial strain can be a strain having an increase in butyric acid production of 2.0 times or more, 2.2 times or more, 2.4 times or more, 2.6 times or 2.8 times or more when the acetic acid or its salt and 100 mM MES are simultaneously treated have.
또한, 상기 클로스트리디움 속 균주는 락틱산 또는 그 염과 100mM MES를 동시에 처리시 부티르산 생산량 증가가, 2.2배 이상, 2.4배 이상, 2.6배 이상 2.8배 이상, 3.0배 이상 또는 3.1배 이상인 성질을 가진 균주일 수 있다. In addition, the Clostridial strain exhibits a property that the increase in butyric acid production is 2.2 times or more, 2.4 times, 2.6 times or more 2.8 times, 3.0 times or more or 3.1 times or more when the lactic acid or its salt and 100 mM MES are simultaneously treated Lt; / RTI > strain.
한편, 상기 클로스트리디움 속 균주는 아세트산 또는 그 염 첨가에 의한 부티르산 생산량 증가가 2.2배 이상이고; 락틱산 또는 그 염 첨가에 의한 부티르산 생산량 증가가 2.4배 이상이며; 100mM MES 첨가시 부티르산 생산량 증가가 2.3배 이상이며; 아세트산 또는 그 염과 100mM MES 첨가시 부티르산 생산량 증가가 2.8배 이상이며, 락틱산 또는 그 염과 100mM MES 첨가시 부티르산 생산량 증가가 3.1배 이상인 성질을 가진 균주일 수 있다. On the other hand, the strain of Clostridium sp. Is 2.2 times or more increased in butyric acid production by addition of acetic acid or its salt; The increase of butyric acid production by addition of lactic acid or its salt is more than 2.4 times; The addition of 100 mM MES increases butyric acid production by more than 2.3 times; The increase of butyric acid production by acetic acid or its salt and the addition of 100 mM MES is 2.8 times or more, and the increase of butyric acid production by lactic acid or its salt and 100 mM MES is 3.1 times or more.
상기 클로스트리디움 속 균주는 해조류 바이오매스로부터 유래된 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 균주일 수 있다. The Clostridium spp. Strain may be a strain producing butyric acid using galactose derived from seaweed biomass.
상기 해조류는 녹조류(green algae), 갈조류(brown algae) 및 홍조류(red algae)를 포함한다. 녹조류는 파래, 청각, 청태 등을 포함한다. 갈조류는 톳, 미역, 다시마, 대황, 등을 포함한다. 홍조류는 , 김, 카라니긴 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 해조류는 홍조류이다. 홍조류는 해조류 중 가장 많은 탄소원을 포함하며, 주요 탄수화물 구성성분이 갈락탄이기 때문이다. 갈락탄은 당화에 의해 갈락토스로 분해된다. The algae include green algae, brown algae and red algae. Green algae include blue, hearing, and blue light. Brown algae include seaweed, seaweed, kelp, rhubarb, and the like. Red algae include Kim, caranigin, and the like. Preferably, the algae are red algae. Red algae contains the most carbon sources of seaweed, and the main carbohydrate component is galactan. Galactan is degraded to galactose by glycation.
상기 클로스트리디움 속 균주는 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 에 속하는 균주일 수 있다. 상기 클로스트리디움 속 균주는 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) S1 균주일 수 있다. 상기 클로스트리디움 속 균주는 미생물 기탁기관인 대한민국 생명공학연구원 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB) 내 생명자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2011년 12월 13일자로 KCTC 12103BP호로 기탁된 클로스트리디움 균주일 수 있다. The strain of the genus Clostridium may be a strain belonging to Clostridium tyrobutyricum. The genus Clostridium strain may be Clostridium tyrobutyricum S1 strain. The Clostridium sp. Strain was deposited at KCTC 12103BP on Dec. 13, 2011 in the Korean Collection for Type Culture (KCTC) of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) Gt; Clostridium < / RTI > strain.
본 발명의 일실시예에 따른 부티르산 생산방법은, 갈락토스 또는 갈락탄이 갈락토스로 분해된 해조류 바이오매스에 상기 언급된 클로스트리디움 속 균주 중 어느 하나를 처리하여 배양함으로써 갈락토스를 부티르산으로 전환시키는 것을 포함할 수 있다. The method of producing butyric acid according to an embodiment of the present invention includes converting a galactose to a butyric acid by culturing and culturing a seaweed biomass in which galactose or galactan is decomposed into galactose by treating any one of the Clostridia sp. can do.
상기 부티르산 생산방법에 있어서, 상기 배양은 pH 5 내지 6의 조건 하에서 수행할 수 있다. 또한, 상기 배양은 pH 5.2 내지 5.8, 또는 pH 5.3 내지 5.7, 또는 pH 5.4 내지 5.6의 조건 하에서 수행할 수 있다. 상기 클로스트리디움 속 균주의 최적 생장 pH는 5.5이므로, pH 범위를 상기 범위 내로 조정하면 부티르산 생산 효율을 높일 수 있다. In the butyric acid production method, the cultivation may be carried out under the condition of
상기 부티르산 생산방법에 있어서, 상기 배양은 38 내지 42℃에서 수행할 수 있다. 또한, 상기 배양은 35 내지 45℃, 또는 39 내지 41℃에서 수행할 수 있다. 상기 클로스트리디움 속 균주의 최적 생장 온도는 40℃이므로, 상기 온도 범위 내에서 배양을 수행하면 부티르산 생산 효율을 높일 수 있다. In the butyric acid production method, the cultivation may be carried out at 38 to 42 ° C. In addition, the cultivation can be carried out at 35 to 45 캜, or 39 to 41 캜. Since the optimum growth temperature of the Clostridial sp. Strain is 40 캜, the production efficiency of butyric acid can be increased by performing the culture within the above temperature range.
상기 부티르산 생산방법은, 갈락토스 또는 갈락탄이 갈락토스로 분해된 해조류 바이오매스에 클로스트리디움 속 균주를 처리하기 전, 또는 후에, 또는 동시에 아세트산 또는 그 염, 및 락틱산 또는 그 염 중 하나 이상을 갈락토스에 첨가할 수 있다. 아세트산 또는 그 염이나 락틱산 또는 그 염을 첨가하면 클로스트리디움 속 균주의 부티르산 생산량을 더욱 높일 수 있다. 아세트산 또는 그 염이나 락틱산 또는 그 염의 첨가량은 mMRS 액체배지 전체 부피를 기준으로 10 내지 100mM 또는 20 내지 80mM, 30 내지 70mM, 40 내지 60mM일 수 있다. 상기 범위 내에서 부티르산 생산량이 효과적으로 높아진다. The butyric acid production method is characterized in that at least one of acetic acid or a salt thereof and lactic acid or a salt thereof is added to a seaweed biomass in which galactose or galactan is degraded to galactose before or after the treatment of Clostridium spp. ≪ / RTI > Acetic acid or a salt thereof or lactic acid or a salt thereof may be added to further increase the amount of butyric acid produced in Clostridium spp. The amount of acetic acid or its salt or lactic acid or its salt to be added may be 10 to 100 mM or 20 to 80 mM, 30 to 70 mM, 40 to 60 mM based on the total volume of the mMRS liquid medium. Within this range, the production of butyric acid is effectively increased.
상기 부티르산 생산방법은, 갈락토스 또는 갈락탄이 갈락토스로 분해된 해조류 바이오매스에 클로스트리디움 속 균주를 처리하기 전, 또는 후에, 또는 동시에 2-(N-모르홀리노)에탄설포닉산(MES) 버퍼를 갈락토스에 첨가할 수 있다. MES를 처리하면 클로스트리디움 속 균주의 부티르산 생산량을 더욱 높일 수 있다. MES 첨가량은 mMRS 액체배지 전체 부피를 기준으로 50 내지 150mM 또는 70 내지 130mM, 80 내지 120mM, 90 내지 110Mm일 수 있다. 이 농도 범위 내에서 부티르산 생산량이 더욱 향상될 수 있다. The butyric acid production method is characterized in that the seaweed biomass in which galactose or galactan has been degraded to galactose is added to the biomass before or after treatment with Clostridium spp. Or simultaneously with 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer May be added to galactose. Treatment of MES can further increase the production of butyric acid by Clostridium spp. The amount of MES added may be 50 to 150 mM or 70 to 130 mM, 80 to 120 mM, 90 to 110 mM based on the total volume of the mMRS liquid medium. Within this concentration range, butyric acid production can be further improved.
상기 부티르산 생산방법에 있어서, 상기 갈락토스는 해조류 바이오매스로부터 유래된 갈락토스일 수 있다. In the butyric acid production method, the galactose may be galactose derived from seaweed biomass.
상기 부티르산 생산방법은, 클로스트리디움 속 균주를 처리하기 전에 해조류 바이오매스를 당화시켜 갈락탄을 갈락토스로 분해하는 것을 더 포함할 수 있다. 해조류 바이오매스를 당화시키는 방법으로는 당업계에서 통상 사용되고 있는 효소를 이용한 당화 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 사이토파지 종(Cytophaga species)으로부터 유래된 효소나 묽은 황산 및 묽은 염산을 이용하여 해조류 바이오매스의 갈락탄을 가수분해시킬 수 있다(J R Turvey, J Christison, "The hydrolysis of algal galactans by enzymes from a Cytophaga species" The Biochemical journal (1967) Volume: 105, Issue: 1, Pages: 311-316; N J Kim et al., "Ethanol production from marine algal hydrolysates using Escherichia coli KO11" Bioresource technology (2011) Volume: 102, Issue: 16, Pages: 7466-7469). The method for producing butyric acid may further include saccharifying the seaweed biomass to decompose galactan into galactose before treating the strain of Clostridium sp. As a method of saccharifying the seaweed biomass, a saccharification method using enzymes commonly used in the art can be used. For example, enzymes derived from Cytophaga species, dilute sulfuric acid and dilute hydrochloric acid can be used to hydrolyze galactan of seaweed biomass (JR Turvey, J Christison, "The hydrolysis of algal galactans by enzymes from "Ethanol production from marine algae hydrolysates using Escherichia coli KO11" Bioresource technology (2011) Volume: 102, Issue: 1, Pages: 311-316 , Issue: 16, Pages: 7466-7469).
본 발명의 일실시예에 따른 클로스트리디움 속(Clostridium) 균주의 분리 방법은, 혐기성 슬러지를 열처리하여 그람 음성균을 제거하는 단계; 상기 열처리된 혐기성 슬러지를 갈락토스를 함유한 배지에 접종하여 배양시키는 단계; 상기 배양으로부터 얻어진 배양액을 부티르산 또는 그 염을 함유한 배지에 도말하여 부티르산에 저항성이 있는 콜로니들을 선발하는 단계; 및 상기 선발된 콜로니들의 부티르산 생산량을 측정하여 부티르산 생산량이 가장 높은 균주를 분리하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 클로스트리디움 속 균주는, 해조류 바이오매스의 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 균주일 수 있다. Clostridium genus (Clostridium) separation method of the strain according to one embodiment of the present invention includes the steps of removing Gram-negative bacteria by heating the anaerobic sludge; Culturing the heat-treated anaerobic sludge in a culture medium containing galactose; Selecting a colony which is resistant to butyric acid by sprinkling the culture obtained from the culture on a medium containing butyric acid or a salt thereof; And isolating the strain having the highest production of butyric acid by measuring the production of butyric acid of the selected colonies. The Clostridium sp. Strain may be a strain producing butyric acid using galactose of seaweed biomass have.
상기 균주 분리 방법에 있어서, 열처리는 80-100℃의 온도에서 10-60분간 열처리하는 것일 수 있다. 상기 온도 및 시간 범위 내에 속하면 그람 음성균을 효과적으로 제거할 수 있다. In the method for isolating strains, the heat treatment may be a heat treatment at a temperature of 80-100 ° C for 10-60 minutes. Gram negative bacteria can be effectively removed if they are within the above temperature and time range.
상기 균주 분리 방법에 있어서, 상기 갈락토스를 함유한 배지는 제한배지인 MP2 액체배지일 수 있다. MP2 배지는 갈락토스, K2HPO4, KH2PO4, 효모 추출물, 암모늄 아세테이트, MgSO4, MnSO4 및 l-시스테인 HCl을 포함하는 배지일 수 있다. 구체적으로, MP2 배지는 갈락토스 15-25 g/L, K2HPO4 0.3-0.7 g/L, KH2PO4 0.3-0.7 g/L, 효모 추출물 0.7-1.3 g/L, 암모늄 아세테이트 1.8-2.7 g/L, MgSO4 0.1-0.3 g/L, MnSO4 0.005-0.015 g/L 및 l-시스테인 HCl 0.3-0.7 g/L 를 함유한 배지일 수 있다. 구체적으로, MP2 배지는 갈락토스 20 g/L, K2HPO4 0.5 g/L, KH2PO4 0.5 g/L, 효모 추출물 1 g/L, 암모늄 아세테이트 2.2 g/L, MgSO4 0.2 g/L, MnSO4 0.01 g/L 및 l-시스테인 HCl 0.5 g/L 를 함유한 배지일 수 있다. In the strain isolation method, the medium containing the galactose may be MP2 liquid medium, which is a restricted medium. MP2 medium may be a medium comprising galactose, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , yeast extract, ammonium acetate, MgSO 4 , MnSO 4 and l-cysteine HCl. Specifically, the MP2 medium contained 15-25 g / L of galactose, 0.3-0.7 g / L of K 2 HPO 4, 0.3-0.7 g / L of KH 2 PO 4 , 0.7-1.3 g / L of yeast extract, g / L, MgSO 4 0.1-0.3 g / L, MnSO 4 0.005-0.015 g / L and 1-cysteine HCl 0.3-0.7 g / L. Specifically,
상기 균주 분리 방법에 있어서, 상기 열처리된 혐기성 슬러지를 갈락토스를 함유한 배지에 접종하여 배양시키는 단계는 37℃에서 2-4일간 배양하는 것일 수 있다. In the method for isolating strains, the step of inoculating and culturing the heat-treated anaerobic sludge in a culture medium containing galactose may be carried out at 37 ° C for 2-4 days.
상기 균주 분리 방법에 있어서, 부티르산 생산량이 가장 높은 균주를 분리하는 단계는 MP2 배지에서 37℃에서 2-4일간 배양 결과 부티르산 생산량이 가장 높은 균주를 선택하는 것을 포함할 수 있다. The step of isolating the strain having the highest amount of butyric acid production in the method for isolating the strain may include selecting a strain having the highest amount of butyric acid production as a result of culturing in MP2 medium at 37 ° C for 2-4 days.
상기 클로스트리디움 속 균주의 분리방법에 있어서 클로스트리디움 속 균주는, 상기 언급한 클로스트리디움 속 균주 중 어느 하나일 수 있다.
In the method for isolating Clostridium spp., Clostridium spp. May be any one of Clostridium spp. Mentioned above.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 이는 예시적인 목적에 불과할 뿐 특허의 권리범위를 한정하는 것이 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, which are for illustrative purposes only and do not limit the scope of the patent.
<실시예 1: 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 균주의 분리><Example 1: Isolation of a strain producing butyric acid using galactose>
갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 미생물을 분리하기 위해 대한민국 서울시 중랑구에 위치한 폐수처리장의 혐기성 슬러지에서 혐기성 슬러지 1 g을 채집하고 이를 90℃에서 30분간 열처리하여 그람 음성균을 제거하였다. 상기 열처리된 혐기성 슬러지를 제한배지인 MP2 액체배지(Galactose 20 g, K2HPO4 0.5 g, KH2PO4 0.5 g, Yeast extract 1 g, Ammonium acetate 2.2 g, MgSO4 0.2 g, MnSO4 0.01 g, l-cysteine HCl 0.5 g)에 접종하여 37℃에서 3일간 증균 배양시켰다.1 g of anaerobic sludge was collected from the anaerobic sludge of the wastewater treatment plant located in Jungnang-gu, Seoul, Korea to isolate butyric acid-producing microorganisms using galactose, and Gram-negative bacteria were removed by heat treatment at 90 ° C for 30 minutes. The heat-treated anaerobic sludge was treated with MP2 liquid medium (Galactose 20 g, K 2 HPO 4 0.5 g, KH 2 PO 4 0.5 g, Yeast extract 1 g, Ammonium acetate 2.2 g, MgSO 4 0.2 g, MnSO 4 0.01 g , l-cysteine HCl 0.5 g) and incubated at 37 ° C for 3 days.
증균 배양한 배양액은 20 g의 소디움 부티레이트(sodium butyrate)가 포함된 MP2 배지에 도말하여 부티르산에 저항성이 있는 콜로니들을 선발하였다. 선발된 각각의 콜로니들을 MP2 액체 배지에 접종하여 37℃에서 3일간 배양 후, 기체 크로마토그래피(Gas chromatography, GC)를 이용하여 부티르산 생산량을 측정하였다. 그 결과, 가장 많은 양의 부티르산을 생산하는 미생물을 분리하였다. 분리된 미생물을 부다페스트 조약에 따른 미생물 기탁기관인 대한민국 생명공학연구원 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB) 내 생명자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2011년 12월 13일자로 기탁번호 제KCTC 12103BP호로 기탁하였다.
The cultures were cultured on MP2 medium containing 20 g of sodium butyrate, and colonies resistant to butyric acid were selected. Each of the selected colonies was inoculated into MP2 liquid medium and cultured at 37 ° C for 3 days, and the amount of butyric acid production was measured by gas chromatography (GC). As a result, microorganisms producing the largest amount of butyric acid were isolated. The isolated microorganism was deposited on December 13, 2011 in the Korean Collection for Type Culture (KCTC) of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), a microorganism depository organization under the Budapest Treaty, KCTC 12103BP.
<실시예 2: 균주의 동정 및 특성>≪ Example 2: Identification and characteristics of strains >
상기 분리된 클로스트리디움 속 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 하여 동정하였다. 즉, 분리된 균주로부터 Genomic DNA Preparation Kit(Promega Co., 미국)을 사용하여 지놈 DNA(genomic DNA)를 추출한 다음, 유니버셜 프라이머(universal primer) 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'; 서열번호: 1)와 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3': 서열번호 2)로 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 실시하여 16S rRNA 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 산물은 PCR Purification kit을 이용하여 정제한 후 마크로젠에 16S rDNA 시퀀싱을 의뢰하였다.The 16S rRNA gene of Clostridium sp. Isolate was identified by sequencing. Genomic DNA was extracted from the isolated strain using a genomic DNA preparation kit (Promega Co., USA), and then a universal primer 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 16S rRNA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ': SEQ ID NO: 2) . The amplified products were purified using a PCR Purification kit, and 16S rDNA sequencing was performed on Macrogen.
신규 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 도 1 및 서열번호: 3에 나타내었다. 이러한 분리 균주의 16S rDNA 유전자 염기서열은 계통학적 관계를 분석하기 위해, 상기 서열을 블라스트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)에서 검색하였고, 네이버-조이닝 분석 (Neighbor-joining analysis) 법으로 계통수 (phylogenetic tree)를 정립하였다. 그 결과, 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) (GenBank accession no.M59113)와 95.7% 상동성을 보이는 것을 확인하였다(도 2). 따라서, 본 발명자는 상기 S1 균주를 "클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) S1"으로 명명하였다.The 16S rRNA gene sequence of the novel strain is shown in Fig. 1 and SEQ ID NO: 3. The 16S rDNA gene sequence of this isolate was searched in the blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) to analyze the phylogenetic relationship, and the Neighbor-Joining analysis The phylogenetic tree was established by -joining analysis method. As a result, it was confirmed that it was 95.7% homologous with Clostridium tyrobutyricum (GenBank accession no. M59113) (Fig. 2). Therefore, the inventor named the S1 strain "Clostridium tyrobutyricum S1".
클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) S1으로 확정된 분리 균주는 API 50 CHL(Bio-marieux, France)을 이용하여 탄수화물 이용 능력을 확인하였다. 분리된 시료를 MRS 액체배지에 2회 계대 배양하여 활력을 높인 후, 10,000 Ⅹg에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 0.85% 염화나트륨 수용액을 이용하여 2회 세척한 후 탁도를 4 Macfarland로 조정하였다. 2 ml의 현탁액을 5 ml의 API 50CHL medium에 첨가 후 각 큐플에 100㎕씩 주입하였다. API 50CHL 배지는 1.0 % 펩톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.1 % 폴리소르베이트 (Tween 80), 0.2 % 디포타슘 히드로젠 포스페이트, 0.2 % 트리암모늄 시트레이트, 0.02 % 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트, 0.005 % 망간 설페이트 테트라하이드레이트 및 0.5% 소디움 아세테이트를 및 0.017 %브로모크레졸 퍼플 인디케이터(bromocresol purple indicator)를 포함한 배지이다. 완성된 kit는 혐기 배양 장치를 이용하여 37℃에서 48시간 배양하며 관찰하였다. 상기 실험 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 분리 균주는 해조류 당화액에 포함되는 D-자일로스와 갈락토스 그리고 만노오스를 이용하여 산을 생산하는 것을 확인하였다.
Isolation strain confirmed as Clostridium tyrobutyricum S1 was confirmed carbohydrate availability using API 50 CHL (Bio-marieux, France). The separated samples were enriched by subculturing twice in MRS liquid medium and centrifuged at 10,000 xg for 10 minutes to collect the cells. The recovered cells were washed twice with 0.85% aqueous sodium chloride solution and the turbidity was adjusted to 4 Macfarland. 2 ml of the suspension was added to 5 ml of API 50CHL medium, and 100 쨉 l of each suspension was injected into each cuplet. The API 50CHL medium contained 1.0% peptone, 0.5% yeast extract, 0.1% polysorbate (Tween 80), 0.2% dipotassium hydrogen phosphate, 0.2% triammonium citrate, 0.02% magnesium sulfate heptahydrate, 0.005% manganese sulfate tetra Hydrate and 0.5% sodium acetate, and 0.017% bromocresol purple indicator. The completed kit was incubated at 37 ° C for 48 hours using an anaerobic incubator. The experimental results are shown in Table 1 below. As shown in the following Table 1, it was confirmed that the isolated strain produced an acid using D-xylose, galactose and mannose contained in the algae saccharification solution.
+1): 양성, -2): 음성+ 1) : positive, - 2) : negative
클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) S1의 최적생장 온도 및 pH를 확인하기 위해 각각의 pH(5.5, 6.0, 6.5)와 온도(34, 37, 40, 43℃)에 따른 균주성장을 관찰하였다.In order to confirm the optimum growth temperature and pH of Clostridium tyrobutyricum S1, the strain growth was observed according to each pH (5.5, 6.0, 6.5) and temperature (34, 37, 40, 43 ℃). It was.
도 3 내지 4에서 나타난 바와 같이, 클로스트리디움 타이로부티리쿰 S1의 생장에 가장 적합한 온도와 pH는 40℃, pH 5.5인 것을 알 수 있다.
As shown in Figures 3 to 4, it can be seen that the most suitable temperature and pH for growth of Clostridium tyrobutyricum S1 is 40 ℃, pH 5.5.
<실시예 3: 클로스트리디움 타이로부티리쿰 균주들과 본 발명 균주의 갈락토스 이용 특성 비교>≪ Example 3: Comparison of galactose utilization characteristics of Clostridium Tyrobuticum strains with the strain of the present invention >
부티르산 생산에 가장 널리 이용되고, 분리 균주와 유사도가 가장 높은 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 균주들을 이용하여 갈락토스가 함유된 MP2 배지에서 37℃에서 3일간 발효하여 부티르산 생산 및 균주 성장에 대해 분리 균주와 비교해보았다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. (Clostridium tyrobutyricum) strain, which is most widely used for butyric acid production and has the highest degree of similarity to the isolated strain, was fermented at 37 ° C for 3 days in MP2 medium containing galactose to produce butyric acid and strain Were compared with the isolates. The results are shown in Table 2 below.
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 분리 균주를 제외한 나머지 클로스트리디움 타이로부티리쿰 균주들은 갈락토스를 거의 이용하지 못했고, 부티르산도 증가하지 않는 결과가 나왔으나, 본 발명의 일실시예에 따른 분리 균주의 경우 갈락토스를 효과적으로 이용하여 부티르산을 생산하는 것을 관찰할 수 있다.As shown in Table 2, the strains of Clostridium Tyrobutilicum except for the isolate according to an embodiment of the present invention showed almost no use of galactose and no increase of butyric acid. However, In the case of the isolated strains according to the examples, it is observed that galactose is effectively used to produce butyric acid.
(g/L)Galactose consumption
(g / L)
(g/L)Butyric acid production
(g / L)
N.D.1): almost not usedND 1) : almost not used
<실시예 4: 분리 균주의 부티르산 생산에 미치는 요소><Example 4: Factors affecting the production of butyric acid by the isolated strain>
클리스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) S1을,Cliprisdium tyrobutyricum S1,
1.0 % 펩톤, 1.0 % 고기 추출물, 0.5 % 효모 추출물, 2.0 % 갈락토스, 0.1 % 폴리소르베이트 (Tween 80), 0.2 % 디포타슘 히드로젠 포스페이트, 0.2 % 트리암모늄 시트레이트, 0.01 % 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트, 0.005 % 망간 설페이트 테트라하이드레이트 및 0.5% 소디움 아세테이트를 포함한 mMRS 액체배지에서 37℃에서 3일간 발효한 결과 14.32 g/L의 갈락토스를 이용하여 6.99 g/L의 부티르산을 생산하였으나, 아세트산은 오히려 4.1 g/L에서 1.85 g/L로 줄어든 것을 확인하였다(도 5). 아세트산 및 락틱산의 첨가에 의한 부티르산 생산 증가를 관찰하기 위해 소디움 아세테이트 또는 소디움 락테이트를 각각 50 mM씩 mMRS 배지에 첨가하여 37℃에서 3일간 발효하였다. 또 유기산 생산에 있어 pH 또한 중요한 요소이므로 100 mM의 MES(2-(N-morholino) ethanesulfonic acid ) buffer를 이용하여 분리균주의 부티르산 생산과 pH에 의한 영향을 관찰하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. Run I은 아세테이트 및 락테이트가 결여된 mMRS 배지에서 배양한 결과이다. Run II는 아세테이트가 첨가된 mMRS 배지에서 배양한 결과이다. Run III는 락테이트가 첨가된 mMRS 배지에서 배양한 결과이다. Run IV는 아세테이트나 락테이트 없이 100mM의 MES만이 첨가된 mMRS 배지에서 배양한 결과이다. Run V는 아세테이트와 100mM의 MES가 첨가된 mMRS 배지에서 배양한 결과이다. Run VI는 락테이트와 100mM의 MES가 첨가된 mMRS 배지에서 배양한 결과이다.1.0% peptone, 1.0% meat extract, 0.5% yeast extract, 2.0% galactose, 0.1% polysorbate (Tween 80), 0.2% dipotassium hydrogen phosphate, 0.2% triammonium citrate, 0.01% magnesium sulfate heptahydrate, The fermentation at 37 ° C for 3 days in the mMRS liquid medium containing 0.005% manganese sulfate tetrahydrate and 0.5% sodium acetate produced 6.99 g / L of butyric acid using 14.32 g / L of galactose, but acetic acid was only 4.1 g / L to 1.85 g / L (Fig. 5). In order to observe the increase of butyric acid production by addition of acetic acid and lactic acid, sodium acetate or sodium lactate was added to mMRS medium at 50 mM each and fermented at 37 ° C for 3 days. Since pH is also an important factor in the production of organic acids, the effect of butyric acid production and pH on the isolated strain was observed using 100 mM MES (2- (N-morholino) ethanesulfonic acid) buffer. The results are shown in Table 3 below. Run I is the result of incubation in mMRS medium lacking acetate and lactate. Run II is the result of culturing in mMRS medium supplemented with acetate. Run III is the result of culturing in mMRS medium supplemented with lactate. Run IV is the result of culturing in mMRS medium supplemented with 100 mM MES without acetate or lactate. Run V is the result of culturing in mMRS medium supplemented with acetate and 100 mM MES. Run VI was the result of incubation in mMRS medium with lactate and 100 mM MES.
표 3에서 보는 바와 같이 부티르산의 생산이 50 mM의 소디움 아세테이트를 첨가했을 때 2.2배, 50 mM의 소디움 락테이트를 첨가했을 때 2.4배 증가하는 것이 관찰하였고, 100 mM MES 첨가했을 때 2.3배 증가하는 것을 확인하였다. 게다가, 50 mM 소디움 락테이트와 100 mM MES를 동시에 첨가했을 때 3.1배 높은 9.52 g/L의 부티르산이 생산되는 것을 관찰하였다(표 3).
As shown in Table 3, the production of butyric acid by the addition of sodium acetate of 50 mM was increased by 2.4-fold when sodium lactate of 2.2-fold and 50-mM was added, and increased 2.3-fold by addition of 100 mM of MES Respectively. In addition, it was observed that a simultaneous addition of 50 mM sodium lactate and 100 mM MES resulted in the production of 9.52 g / L butyric acid, 3.1 times higher (Table 3).
Run I : mMRS without acetate and lactateRun I: mMRS without acetate and lactate
Run II :mMRS with acetateRun II: mMRS with acetate
Run III :mMRS with lactateRun III: mMRS with lactate
Run IV :mMRS without acetate and lactate (100mM MES)Run IV: mMRS without acetate and lactate (100 mM MES)
Run V :mMRS with acetate (100mM MES)Run V: mMRS with acetate (100 mM MES)
Run VI :mMRS with lactate (100mM MES)Run VI: mMRS with lactate (100 mM MES)
표 3에서 보는 바와 같이 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) S1은 락틱산을 효과적으로 이용하며, 락틱산 이용시 부티르산 생산이 증가하므로 락틱산이 부티르산으로 전환되는지 보기 위해 l-[3-13C]락테이트를 이용하여 대사경로를 관찰하였다. 그 결과를 도 6a 내지 6b에 타내었다. By Clostridium tie as shown in Table 3 butynyl rikum (Clostridium tyrobutyricum) is S1, and effective use of lactic acid, lactic acid increase in the drive acid production, so to see if the lactic acid is converted to acid l- [3- 13 C] Metabolic pathways were observed using lactate. The results are shown in Figs. 6A to 6B.
도 6a 내지 도 6b에서 보는 바와 같이, 표준 시료 부티르산의 GC-MS 분석 결과(도 6a)에서 나타나지 않는 13C-락테이트로부터 온 90.1, 91.1 및 92.1 mass/charge 피크가 관찰되는 것으로 보아 락틱산을 이용하여 부티르산으로 전환하는 것을 확인할 수 있다.
As shown in FIGS. 6A and 6B, 90.1, 91.1 and 92.1 mass / charge peaks from 13 C-lactate which are not observed in GC-MS analysis (FIG. 6A) of the standard sample butyric acid are observed, Can be confirmed to be converted to butyric acid.
결론적으로 본 발명의 일실시예에 따른 균주는 기존 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 균주들이 이용하지 못하는 해조류 바이오매스에 존재하는 갈락토스를 효과적으로 이용하여 부티르산을 생산할 수 있으며, 부티르산 생산 선택력(product selectivity)이 거의 100%에 달하므로 해조류 바이오매스를 이용한 부티르산 생산 시 좋은 후보 균주로 사용될 수 있다.
In conclusion, the strain according to an embodiment of the present invention can produce butyric acid by effectively utilizing galactose present in algae biomass that is not available from existing strains of Clostridium tyrobutyricum, product selectivity) is almost 100%, it can be used as a good candidate strain for production of butyric acid by seaweed biomass.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Clostridium sp. strain, a method for producing butyric acid using the Clostridium sp. strain, and a method for isolating the Clostridium sp. strain <130> 11p572/ind <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1392 <212> DNA <213> Clostridium tyrobutyricum <400> 3 ggacgaacgc tggcggcgtg cctaacacat gcaagtcgag cgagagagtc ccttcgggga 60 caatctagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctcaaaga gggggatagc 120 ctcccgaaag ggagattaat accgcataag acctggattc acatggatcc gggatgaaag 180 gagaaatccg ctttgagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgggg taaaggccta 240 ccaaggcagc gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacattgga actgagagac 300 ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat 360 gcagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtc ttctgggaag 420 ataatgacgg taccagagga ggaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480 cgtaggtggc gagcgttgtc cggatttact gggcgtaaag ggtgcgtagg cggatgttta 540 agtgagatgt gaaatacccg ggcttaaccc gggggctgca tttcaaactg gacatctgga 600 gtgcaggaga ggagaatgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagag attaggaaga 660 acaccagtgg cgaaggcgat tctctggact gtaactgacg ctgaggcacg aaagcgtggg 720 tagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagta ctaggtgtag 780 gaggtatcga ccccttctgt gccgcagtta acacattaag tactccgcct gggaagtacg 840 atcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg 900 tttaattcga agcaacgcga agaaccttac ctggacttga catcccctgc atagcctgga 960 gacaggcgaa gcccttcggg gcagggagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1020 cgtgagatgt taggttaagt cctgcaacga gcgcaaccct tgttgttagt tgctaacatg 1080 taaagatgag cactctaacg agactgccgc ggttaacgcg gaggaaggtg gggatgacgt 1140 caaatcatca tgccccttat gtccagggcg acacacgtgc tacaatgggc agaacagaga 1200 gatgcgaaac cgcgaggtgg agccaaacta gaaaactgcc ctcagttcgg attgcaggct 1260 gaaacccgcc tgcatgaagt tggagttgct agtaatcgcg aatcagaatg tcgcggtgaa 1320 tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg agagctggca acacccgaag 1380 tccgcagtct aa 1392 <110> Korea Institute of Science and Technology <120> Clostridium sp. strain, a method for producing butyric acid using the Clostridium sp. strain, and a method for isolating the Clostridium sp. strain <130> 11p572 / ind <160> 3 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1392 <212> DNA <213> Clostridium tyrobutyricum <400> 3 ggacgaacgc tggcggcgtg cctaacacat gcaagtcgag cgagagagtc ccttcgggga 60 caatctagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctcaaaga gggggatagc 120 ctcccgaaag ggagattaat accgcataag acctggattc acatggatcc gggatgaaag 180 gagaaatccg ctttgagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgggg taaaggccta 240 ccaaggcagc gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacattgga actgagagac 300 ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat 360 gcagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtc ttctgggaag 420 ataatgacgg taccagagga ggaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480 cgtaggtggc gagcgttgtc cggatttact gggcgtaaag ggtgcgtagg cggatgttta 540 agtgagatgt gaaatacccg ggcttaaccc gggggctgca tttcaaactg gacatctgga 600 gtgcaggaga ggagaatgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagag attaggaaga 660 acaccagtgg cgaaggcgat tctctggact gtaactgacg ctgaggcacg aaagcgtggg 720 tagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagta ctaggtgtag 780 gaggtatcga ccccttctgt gccgcagtta acacattaag tactccgcct gggaagtacg 840 atcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg 900 tttaattcga agcaacgcga agaaccttac ctggacttga catcccctgc atagcctgga 960 gacaggcgaa gcccttcggg gcagggagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1020 cgtgagatgt taggttaagt cctgcaacga gcgcaaccct tgttgttagt tgctaacatg 1080 taaagatgag cactctaacg agactgccgc ggttaacgcg gaggaaggtg gggatgacgt 1140 caaatcatca tgccccttat gtccagggcg acacacgtgc tacaatgggc agaacagaga 1200 gatgcgaaac cgcgaggtgg agccaaacta gaaaactgcc ctcagttcgg attgcaggct 1260 gaaacccgcc tgcatgaagt tggagttgct agtaatcgcg aatcagaatg tcgcggtgaa 1320 tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg agagctggca acacccgaag 1380 tccgcagtct aa 1392
Claims (22)
펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 갈락토스, 폴리소르베이트 (Tween 80), 디포타슘 히드로젠 포스페이트, 트리암모늄 시트레이트, 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트 및 망간 설페이트 테트라하이드레이트를 포함한 mMRS 액체배지에서 3일간 37℃에서 배양하는 경우, 갈락토스의 25중량% 이상을 부티르산으로 전환시키는 성질을 갖는 클로스트리디움 속 균주.The method according to claim 1, wherein the Clostridia spp.
Culturing for 3 days at 37 ° C in mMRS liquid medium containing peptone, meat extract, yeast extract, galactose, polysorbate (Tween 80), dipotassium hydrogen phosphate, triammonium citrate, magnesium sulfate hepta hydrate and manganese sulfate tetrahydrate , Clostridium sp. Strain having a property of converting 25 wt% or more of galactose into butyric acid.
최적 생장 온도가 40℃이고 최적 생장 pH가 5.5인 클로스트리디움 속 균주.2. The method according to claim 1, wherein the Clostridial subsp.
Clostridium sp. Strain having an optimal growth temperature of 40 ° C and an optimal growth pH of 5.5.
갈락토스에 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 클로스트리디움 속 균주를 처리하여 배양함으로써 갈락토스를 부티르산으로 전환시키는 것을 포함하는 갈락토스로부터의 부티르산 생산방법.As a method for producing butyric acid from galactose,
A method for producing butyric acid from galactose, comprising converting galactose to butyric acid by treating galactose with the strain of the genus Clostridium according to any one of claims 1 to 9.
클로스트리디움 속 균주를 처리하기 전, 또는 후에, 또는 동시에 아세트산 또는 그 염; 락틱산 또는 그 염; 2-(N-모르홀리노)에탄설포닉산(MES) 버퍼 중 하나 이상을 갈락토스에 첨가하는 갈락토스로부터의 부티르산 생산방법.The method of claim 10,
Before or after treatment of Clostridium spp., Or simultaneously with acetic acid or a salt thereof; Lactic acid or a salt thereof; A method for producing butyric acid from galactose, wherein at least one of 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer is added to galactose.
상기 갈락토스는 해조류 바이오매스로부터 유래된 갈락토스인 갈락토스로부터의 부티르산 생산방법.14. The method according to any one of claims 10 to 13,
Wherein said galactose is galactose derived from seaweed biomass.
클로스트리디움 속 균주를 처리하기 전에 해조류 바이오매스를 당화시켜 갈락탄을 갈락토스로 분해하는 것을 더 포함하는 갈락토스로부터의 부티르산 생산방법.15. The method of claim 14,
A method for producing butyric acid from galactose, which further comprises saccharifying the seaweed biomass to decompose the galactan to galactose before treating the strain of Clostridium sp.
해조류 바이오매스를 당화시켜 갈락탄을 갈락토스로 분해하는 단계; 및
갈락탄이 갈락토스로 분해된 해조류 바이오매스에 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 클로스트리디움 속 균주를 처리하여 배양함으로써 갈락토스를 부티르산으로 전환시키는 단계를 포함하는 해조류 바이오매스로부터의 부티르산 생산방법.A method for producing butyric acid from seaweed biomass,
Hydrolyzing the seaweed biomass to decompose galactan into galactose; And
Butyric acid from algae biomass comprising converting galactose to butyric acid by treating and incubating a strain of Clostridium sp. Production method.
클로스트리디움 속 균주를 처리하기 전, 또는 후에, 또는 동시에 아세트산 또는 그 염; 락틱산 또는 그 염; 및 2-(N-모르홀리노)에탄설포닉산(MES) 버퍼 중 하나 이상을 해조류 바이오매스에 첨가하는 해조류 바이오매스로부터의 부티르산 생산방법.17. The method of claim 16,
Before or after treatment of Clostridium spp., Or simultaneously with acetic acid or a salt thereof; Lactic acid or a salt thereof; And 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer to the seaweed biomass, to produce butyric acid from the seaweed biomass.
상기 클로스트리디움 속 균주는, 갈락토스를 이용하여 부티르산을 생산하는 균주이며,
상기 방법은,
혐기성 슬러지를 열처리하여 그람 음성균을 제거하는 단계;
상기 열처리된 혐기성 슬러지를 갈락토스를 함유한 배지에 접종하여 배양시키는 단계;
상기 배양으로부터 얻어진 배양액을 부티르산 또는 그 염을 함유한 배지에 도말하여 부티르산에 저항성이 있는 콜로니들을 선발하는 단계; 및
상기 선발된 콜로니들의 부티르산 생산량을 측정하여 부티르산 생산량이 가장 높은 균주를 분리하는 단계를 포함하는 클로스트리디움 속 균주의 분리 방법.As a method of obtaining a Clostridium strain,
The Clostridium sp. Strain is a strain that produces butyric acid using galactose,
The method comprises:
Treating the anaerobic sludge with heat to remove Gram-negative bacteria;
Culturing the heat-treated anaerobic sludge in a culture medium containing galactose;
Selecting a colony which is resistant to butyric acid by sprinkling the culture obtained from the culture on a medium containing butyric acid or a salt thereof; And
And isolating the strain having the highest production of butyric acid by measuring the butyric acid production of the selected colonies.
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