KR20130072983A - Composition for dbp gels and costal chondrocytes for regenerating cartilage - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A composition for treating cartilage damage containing 97 %v/v of moisture is provided to absorb shock by injecting into body, and to prevent dissolution by inflammatory reaction or toxic materials without cytotoxicity. CONSTITUTION: A composition for treating cartilage damage contains demineralized bone particle (DBP) gel and a costal chondrocyte composition. The DBP is derived from mammalian bone. The particle size of the DBP is 10-300 micrometer. The weight ratio of the DBP is 5-20 wt%. The composition has pH 6-7.

Description

연골 재생을 위한 ＤＢＰ 겔과 늑연골세포 조성물 {Composition for DBP Gels and Costal Chondrocytes for Regenerating Cartilage} Composition for DBP Gels and Costal Chondrocytes for Regenerating Cartilage

본 발명은 연골재생을 위한 탈미네랄화된 골분 (Demineralized Bone Particle, DBP) 및 늑연골세포를 포함하는 DBP 겔을 포함하는 연골 손상 치료용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for treating cartilage damage comprising a DBP gel comprising demineralized Bone Particles (DBP) and costal chondrocytes for cartilage regeneration.

관절 연골의 손상은 현대인에게 많이 발생되는 질병 중 하나이며, 그 원인은 노화, 스포츠, 노동, 비만 및 교통사고 등의 다양한 원인이 있다. 관절연골은 특이하게 혈관, 림프 및 신경 조직이 없어 한번 손상 받으면 자가 재생이 어렵다. 상기 관절면에 형성되어 있는 연골은 통상 인간의 무릎 관절에 있어서는 두께가 약 2 ㎜이며, 외상이나 질병 등에 의해 면적이 1∼4 ㎟ 정도 손상된 경우에는, 자연 치유에 의해 재생의 가능성이 있지만, 20 ㎟나 손상된 경우에는, 자력에 의한 재생은 곤란하며, 또한, 일반적으로 큰 고통을 수반한다. Articular cartilage damage is one of many diseases that occur in modern people, and the causes are various causes such as aging, sports, labor, obesity, and traffic accidents. Articular cartilage is unusually free of blood vessels, lymph and nerve tissue, so once damaged it is difficult to self-renewal. The cartilage formed on the joint surface is usually about 2 mm thick in the human knee joint, and when the area is damaged by about 1 to 4 mm 2 due to trauma or disease, there is a possibility of regeneration by natural healing. In the case of mm 2 or damaged, regeneration by magnetic force is difficult and generally involves great pain.

추가로, 종양, 괴사 등의 여러 가지 원인에 의해 관절 연골을 완전히 잃은 경우에는, 관절 기능을 복원하기 위해서, 예컨대, 인공 관절을 해당 개소에 매립하는 등의 처치가 행해지고 있다. 그러나, 인공 관절은 어디까지나 관절 기능과 유사하게 인공적으로 구성된 것으로, 생체에 있어서는 이물이기 때문에, 생체 적합성을 유지하는 것은 곤란하다. 따라서 약물요법, 물리치료, 관절연골 성형술, 골수자극술 (미세천공술), 자가 관절 이식술, 연골 치환술 등의 방법이 전통적으로 임상에 이용되어 왔다 [E.B. Hunziker, Articular cartilage repair: basic science and clinical progress. A review of the current status and prospects, Osteoarthritis and cartilage, 10(6), 432-463, 2002]. 하지만, 기존 방법은 시술이 어렵거나 치료 효과가 떨어지는 문제가 있다. 최근에는 자가연골세포 이식술이라는 조직공학적 치료방법이 이용되고 있다. 자가 연골세포 이식술은 기존 골수자극술 등과 비교하였을 때, 시술 초기에는 우수한 효과를 보이지만, 장기간 비교하였을 때, 다음과 같은 단점을 갖는다. 즉 기존의 결함부위 주위에서 세포를 채취 하였을 때, 세포를 얻기가 어렵고, 상처부위로 이동한 세포가 fibrocartilage로 분화되며, 무릎전체를 절개하는 경우 흉터가 크게 남아 미관상 좋지 못하고, 초기 손상 단계에서만 적용할 수 있는 등 여러 가지 문제점이 존재한다. In addition, when joint cartilage is completely lost due to various causes such as tumors and necrosis, treatment is performed, for example, embedding an artificial joint at a corresponding position in order to restore joint function. However, artificial joints are artificially constructed similarly to joint functions to the last, and because they are foreign substances in living bodies, it is difficult to maintain biocompatibility. Therefore, pharmacotherapy, physiotherapy, articular cartilage plastic surgery, bone marrow stimulation (microporation), autograft, cartilage replacement, etc. have traditionally been used in clinical practice [EB Hunziker, Articular cartilage repair: basic science and clinical progress. A review of the current status and prospects, Osteoarthritis and cartilage , 10 (6), 432-463, 2002]. However, the existing method has a problem that the treatment is difficult or less effective treatment. Recently, a histological treatment method called autologous chondrocyte transplantation has been used. Autologous chondrocyte transplantation shows an excellent effect at the beginning of the procedure when compared to conventional bone marrow stimulation, etc., but has the following disadvantages when compared to a long term. That is, when cells are collected around existing defects, it is difficult to obtain the cells, and the cells moved to the wound area are differentiated into fibrocartilage. There are a number of problems.

늑연골 세포는 이러한 문제점을 극복하고, 무릎 연골 세포를 대신할 새로운 세포자원으로 이용이 가능하다. 늑연골 세포는 나이가 들어도 손상되지 않고 보존이 잘 되어 있어 나이에 관계없이 세포를 얻기가 쉽고, 세포의 분열능력이 좋다는 장점이 있다. 국내 다른 연구진의 연구에서 늑연골 세포가 in vitro 조건에서 배양시 계대수가 증가될 수록 fibroblast 와 유사한 형태를 갖고, 연골세포로서의 특성을 잃는 것을 확인하였다. 이렇게 연골세포로서의 특성을 잃은 늑연골 세포는 면역조직화학염색 결과 중배엽 유래 줄기세포와 비슷한 표식자 발현을 보여주는 등 중배엽 유래 줄기세포와 비슷한 특성을 나타내었다. 이렇게 탈분화 되어 중배엽 유래 줄기세포와 비슷한 특성을 갖게 된 늑연골 세포를 무릎관절 손상 치료에 사용하기 위하여 hyalinecartilage 로 재분화시키기위해 연골분화배지에서 배양한후, safranin-O 염색과 면역조직화학염색을 이용하여 분석한 결과 늑연골 세포가 hyaline cartilage로 재분화 된 것을 확인 할 수 있었다고 보고되었다. 따라서 이러한 실험 결과를 토대로 늑연골 세포가 무릎연골 손상 치료를 위한 새로운 세포자원으로 이용가능 하다는 것을 확인할 수 있었다 [Jungsun Lee, Eunkyung Lee, Hwi-yool Kim,, et al ., Comparison of articular cartilage with costal cartilage in initial cell yield, degree of dedifferentiation during expansion and redifferentiation capacity Biotechnol. Appl. Biochem. 48, (2007) 149158].
Rib chondrocytes overcome these problems and are available as new cellular resources to replace knee cartilage cells. The costal cartilage cells are not damaged even with age and are well preserved, so it is easy to obtain the cells regardless of age, and there is an advantage of good cell division ability. In the study of other researchers in Korea, it was confirmed that as the passage number increased in in vitro conditions, the costal chondrocytes had a morphology similar to fibroblast and lost the characteristics as chondrocytes. Thus, the costal chondrocytes, which lost their properties as chondrocytes, showed similar characteristics to mesoderm-derived stem cells by immunohistochemical staining. These dedifferentiated riboid cells, which have similar characteristics to mesoderm-derived stem cells, were cultured in cartilage differentiation medium to be re-differentiated into hyalinecartilage for the treatment of knee joint damage, and analyzed by safranin-O staining and immunohistochemical staining. As a result, it was reported that the chondrocytes were re-differentiated into hyaline cartilage. Therefore, based on the experimental results, it was confirmed that the chondrocytes could be used as a new cell resource for the treatment of knee cartilage damage [Jungsun Lee, Eunkyung Lee, Hwi-yool Kim ,, et al ., Comparison of articular cartilage with costal cartilage in initial cell yield, degree of dedifferentiation during expansion and redifferentiation capacity Biotechnol. Appl. Biochem. 48, (2007) 149 158].

이에 본 발명자들은 늑연골을 채취하여, 무릎연골세포로 재분화시켜 무릎연골 손상치료를 위해 사용하며, 잔류칼슘과 프로테오글리칸 등의 유기물질의 분해 성분, 콜라겐과 프로테오글리칸 등의 기질 및 골형성 단백질 (BMP)로 구성되어, 세포 성장을 증가시키는 DBP 겔과 함께 주입함으로써, 그 효과를 증대시키고자 하였다.Accordingly, the present inventors collect rib cartilage, re-differentiate it into knee cartilage cells, and use it for the treatment of knee cartilage damage. It was intended to enhance the effect by injecting with a DBP gel, which is configured to increase cell growth.

이에 본 발명의 목적은 연골 결함의 치료를 위해 골형성을 유도하는 탈 미네랄화된 골분을 이용하여, DBP 겔과 늑연골 세포를 포함하는 연골 치료용 조성물을 제공하는데에 있다.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for treating cartilage comprising DBP gel and costal cartilage cells, using demineralized bone meal to induce bone formation for the treatment of cartilage defects.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 연골 형성을 유도하는 탈 미네랄화된 골분(Demineralized Bone Particle, DBP)겔 및 늑연골 세포를 함께 포함하는 연골 손상 치료용 조성물을 제공한다.
According to an aspect of the present invention, there is provided a composition for treating cartilage damage, including demineralized bone powder (DBP) gel and ribosomal cells that induce cartilage formation.

본원 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.The features and advantages of the present invention are summarized as follows.

(i) 본 발명은 적합한 생체활성 천연재료인 탈미네랄화된 골분 (demineralized bone particle, DBP)을 이용한 연골 형성을 유도하는 탈 미네랄화된 골분(Demineralized Bone Particle, DBP)겔 및 늑연골 세포를 함께 포함하는 연골 손상 치료용 조성물에 관한 것이다. (i) The present invention includes demineralized Bone Particle (DBP) gels and ribochondrial cells that induce cartilage formation using demineralized bone particles (DBP), which are suitable bioactive natural materials. It relates to a composition for treating cartilage damage.

(ii) 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물은 수분이 97 v/v % 을 함유하고있어, 체내에 주입하면, 충격을 흡수하고 상쇄할 수 있다. (ii) The composition for treating cartilage damage of the present invention contains 97 v / v% of water, and when injected into the body, it can absorb and offset the impact.

(iii) 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물은 세포 독성을 가지지 않으며, 염증 반응이나 독성 물질에 의해 녹지 않는다.
(iii) The composition for treating cartilage damage of the present invention does not have cytotoxicity and is not dissolved by an inflammatory reaction or a toxic substance.

도 1은 DBP 골분의 제조 과정 시 (A) 대퇴골, (B) 탈미네랄화된 뼈, (C) 탈미네랄화된 뼈를 분쇄하여 주사현미경(SEM)으로 관찰한 사진이다.
도 2는 제조한 10 % DBP 겔의 (A) 실온에서 모습, (B) 4 ℃, 4시간동안 냉장시킨 모습, (C) 실린지에 겔을 넣어 관찰한 모습이다.
도 3은 계대수 0인 늑연골 세포의 (A) 40 배, (B)100 배 확대한 현미경 사진 이다.
도 4는 생체 내 에서 1, 2, 3주 동안 in vivo 한 후에 DBP 겔의 분해와 물 함유량을 측정한 결과이다.
도 5는 대조군인 DBP 스펀지 및 겔에서 각각 Raw 264.7 대식세포(macrophage cell)을 in vitro 상태에서 3일간 배양하여 세포 독성을 평가한 결과이다.
도 6은 대조군인 DBP 스펀지 및 겔에서 각각 수핵 세포(Nucleus Pulposus cell)을 in vivo 한 후에 1, 2, 3주 동안 배양한 후 MTT 분석을 통해 세포 성장을 확인한 결과이다.
도 7은 5, 10 % DBP 겔에서 섬유륜 세포(Annulus fibrosus cell)을 in vivo 한 후에 1, 2, 3 주 동안 배양한 후 황산화글라이코스아미노글라이칸(Sulfated glycosaminoglycan, sGAG)의 양을 측정한 결과이다.
도 8은 5, 10 % DBP 겔에서 섬유륜 세포(Annulus fibrosus cell)을 in vivo 한 후에 1, 2, 3주 동안 배양한 후 생성된 콜라겐 양을 측정한 결과이다.
도 9는 대조군인 DBP 스펀지 및 겔에서 각각 수핵 세포(Nucleus Pulposus cell)을 in vivo 한 후에 1, 2, 3주 동안 배양한 후 RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하여 (A) 베타 액틴(β-actin), 어그리칸(aggrecan), 제 1형과 2형 콜라겐을 전기영동을 통해 확인한 결과이며, (B)는 베타 액틴(β-actin)으로 표준화 시킨 그래프를 나타낸 결과이다.
도 10은 5, 10 % DBP gel에서 Raw 264.7 대식세포(macrophage cell)을 in vivo 한 후에 1, 2, 3주 동안 배양한 후 TNF-α의 방출량을 측정한 결과이다.
도 11은 대조군인 DBP 스펀지 및 겔에서 각각 수핵 세포(Nucleus Pulposus cell)을 in vivo 한 후에 1, 2, 3주 동안 배양한 후, 조직학적 평가 H&E (Hematoxylin-Eosin)염색을 통하여 세포활성을 평가한 결과이다.
도 12은 대조군인 DBP 스펀지 및 겔에서 각각 수핵 세포(Nucleus Pulposus cell)을 in vivo 한 후에 1, 2, 3주 동안 배양한 후, 조직학적 평가를 위해 Safranin-O 염색을 통하여 프로테오글리칸 분비을 확인한 결과이다.
도 13는 대조군인 DBP 스펀지 및 겔에서 각각 수핵 세포(Nucleus Pulposus cell)을 in vivo 한 후에 1, 2, 3주 동안 배양한 후, 면역조직화학평가를 통하여 제 2형 콜라겐을 확인한 결과이다.
도 14는 5, 10 % DBP 겔에서 섬유륜 세포(Annulus fibrosus cell)을 in vivo 한 후에 1, 2, 3주 동안 배양한 후, MTS 염색을 확인한 결과이다.
도 15은 5, 10 % DBP 겔에서 섬유륜 세포(Annulus fibrosus cell)을 in vivo 한 후에 1, 2, 3주 동안 배양한 후 면역조직화학평가를 통하여 ED-1 을 확인한 결과이다.Figure 1 is a photograph of the microbial bone (A) femur, (B) demineralized bone, (C) demineralized bone during the manufacturing process of DBP bone meal observed by scanning microscope (SEM).
Figure 2 shows the appearance of the prepared 10% DBP gel (A) at room temperature, (B) 4 ℃, refrigerated for 4 hours, (C) the syringe in the gel.
Figure 3 is a micrograph (A) 40 times, (B) 100 times magnification of the subchondral costal cartilaginous cells.
4 is a result of measuring the decomposition and water content of DBP gel after in vivo for 1, 2, 3 weeks in vivo .
FIG. 5 shows the results of evaluating cytotoxicity by culturing Raw 264.7 macrophage cells in vitro for 3 days in the control DBP sponge and gel.
6 is a result of confirming cell growth through MTT analysis after incubating for 1, 2, 3 weeks after incubating the nucleus cells (Nucleus Pulposus cells) in the control DBP sponge and gel, respectively.
7 is a result of measuring the amount of Annulus cells (Annulus fibrosus cell) the in vivo one after one, two, three weeks hwageul cultured after sulfuric acid while Lycos amino article Mau (Sulfated glycosaminoglycan, sGAG) at 5, 10% DBP gel to be.
8 is 5 to 10% Annulus cells (Annulus fibrosus cell) in DBP in gel vivo After incubation for 1, 2 and 3 weeks, the amount of collagen produced was measured.
Figure 9 shows the nucleus cells (nucleus Pulposus cells) in the control DBP sponge and gel, respectively vivo After incubation for 1, 2 and 3 weeks, RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) was performed to perform (A) beta-actin, aggrecan, type 1 and type 2 collagen. The result is confirmed by electrophoresis, (B) is a result showing a graph normalized to beta actin (β-actin).
FIG. 10 shows Raw 264.7 macrophage cells in 5, 10% DBP gel in vivo After culturing for 1, 2, 3 weeks, the amount of TNF-α released was measured.
Figure 11 shows the nucleus cells (Nucleus Pulposus cells) in the control DBP sponge and gel, respectively vivo After incubation for 1, 2 and 3 weeks, the cell activity was evaluated through histological evaluation H & E (Hematoxylin-Eosin) staining.
Figure 12 shows the nucleus cells (nucleus Pulposus cells) in the control DBP sponge and gel, respectively vivo After incubation for 1, 2 and 3 weeks, proteoglycan secretion was confirmed by Safranin-O staining for histological evaluation.
Figure 13 shows the nucleus cells (nucleus Pulposus cells) in the control DBP sponge and gel, respectively vivo After incubation for 1, 2, 3 weeks, the type 2 collagen was confirmed by immunohistochemistry.
Figure 14 is 5 to 10% Annulus cells (Annulus fibrosus cell) in DBP in gel vivo After incubation for 1, 2, 3 weeks, the result of confirming the MTS staining.
Figure 15 shows Annulus fibrosus cells in 5, 10% DBP gel in vivo After 1, 2, and 3 weeks of incubation, ED-1 was confirmed through immunohistochemistry.

본 발명의 일 양태에 따르면, 연골 형성을 유도하는 탈미네랄화된 골분(Demineralized Bone Particle, DBP)겔 및 늑연골 세포를 함께 포함하는 연골 손상 치료용 조성물을 제공한다.
According to an aspect of the present invention, there is provided a composition for treating cartilage damage, including demineralized bone powder (DBP) gel and ribocartilage cells that induce cartilage formation.

골격 계통의 한 부분인 연골은 뼈와 마찬가지로 변형된 결합조직의 일종이다. 연골은 혈관이나 신경의 분포가 없는 것이 특징이다. 우리 몸에 있는 연골은 아교섬유 또는 탄력섬유의 양에 따라 3종류로 나눌 수 있다.Cartilage, a part of the skeletal lineage, is a kind of deformed connective tissue like bone. Cartilage is characterized by no distribution of blood vessels or nerves. Cartilage in our body can be divided into three types depending on the amount of glue fibers or elastic fibers.

첫 째로 맑고 투명한 청백색의 연골인 유리연골, 둘째는 매우 질기고 압력에 견디는 힘이 큰 연골인 섬유연골, 셋째는 탄력성이 가장 큰 연골인 탄력연골이 있다. 이 중 본 발명에서 사용하는 늑연골은 유리연골에 해당한다.
The first is glass cartilage, which is clear and transparent blue-white cartilage, the second is fiber cartilage, which is very tough and pressure-resistant cartilage, and the third is elastic cartilage, which is the most flexible cartilage. Of these, the costal cartilage used in the present invention corresponds to free cartilage.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 탈미네랄화된 골분(Demineralized Bone Particle, DBP)은 포유류의 골이다. 상기 포유류는 사람 뿐 아니라 소, 돼지, 양, 토끼, 쥐, 고양이, 말, 개 등의 이종의 골을 이용하여도 된다. 본원 발명에서는 소의 대퇴골 및 경골을 체취하여 사용하였다.According to a preferred embodiment of the present invention, the demineralized bone powder (DBP) is mammalian bone. The mammal may use not only human but also different kinds of bone such as cattle, pigs, sheep, rabbits, mice, cats, horses, and dogs. In the present invention, bovine femurs and tibias were used in the body.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 탈미네랄화된 골분의 입자 크기는 300 ㎛ 까지 이다. 300 ㎛ 이상의 크기인 경우 상기 연골 손상 치료용 조성물을 체내에 주입할 경우, 이물감을 느낄 수 있게 되며, 골형성 인자의 자극에 큰 영향이 없는 것으로 보고 된 바 있다. [Julie Glowacki, David Altobelli, and John B. Mulliken, Fate of Mineralized and Demieralized Osseous Implants in Cranial Defects, Calcif. Tissue Int.,33, 71 (1981)]. 따라서, 입자의 크기가 작을수록 골형성 인자의 방출을 쉽게 유도할 수 있으므로, 치료 효과를 높일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the particle size of the demineralized bone meal is up to 300 μm. In the case of the size of 300 ㎛ or more, when the composition for treating cartilage damage is injected into the body, it is possible to feel a foreign body, and it has been reported that there is no significant effect on the stimulation of bone formation factors. Julie Glowacki, David Altobelli, and John B. Mulliken, Fate of Mineralized and Demieralized Osseous Implants in Cranial Defects, Calcif. Tissue Int., 33, 71 (1981). Therefore, the smaller the size of the particles can easily induce the release of osteogenic factors, thereby improving the therapeutic effect.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 탈미네랄화된 골분은 전체 조성물에서의 중량비가 5 - 20 중량(%, 40 ml 기준)이다. 보다 바람직하게 최적화한 상기 탈 미네랄화된 골분의 함량은 8-12 중량(%)로 3.2 - 4.8 g/ml 의 DBP 를 함유하도록 제조하였다. 중량비가 5 % 미만인 경우에는 너무 낮은 점도로 겔화의 부족 문제가 있고, 중량비가 20 % 을 초과하는 경우에는 DBP 의 고른 분산이 어려워 겔을 제조하는데 한계가 발생할 뿐만 아니라 실린지를 이용한 주입에 어려운 문제가 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the demineralized bone meal has a weight ratio of 5 to 20% by weight (%, based on 40 ml) in the total composition. More preferably, the content of the optimized demineralized bone meal was prepared to contain 3.2-4.8 g / ml of DBP at 8-12% by weight. If the weight ratio is less than 5%, there is a problem of lack of gelation with too low viscosity, and if the weight ratio is more than 20%, it is difficult to evenly disperse DBP, which causes limitations in preparing the gel and also difficult to inject using a syringe. have.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 연골 손상 치료용 조성물은 pH 6-7인 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료용 조성물. pH 6-7 의 조건을 유지하여야 생체 내 이식 조건을 맞출 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition for treating cartilage damage is cartilage damage treatment composition, characterized in that the pH 6-7. Maintaining the pH 6-7 conditions to meet the implantation conditions in vivo.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 연골 손상 치료용 조성물은 생리 활성 물질을 추가적으로 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition for treating cartilage damage further comprises a bioactive substance.

상기 생리활성 물질은 미량으로 생체의 기능(생리)에 큰 영향을 미치는 물질. 생물 활성 물질이라고도 하며, 비타민, 호르몬, 효소, 신경 전달 물질 등을 지칭한다. 생리 활성 물질의 대부분은 펩티드이지만 프로스타글란딘과 스테로이드 같은 지질도 있다.The bioactive substance is a substance having a large effect on the function (physiology) of the living body in a trace amount. Also known as biologically active substances, it refers to vitamins, hormones, enzymes, neurotransmitters and the like. Most of the biologically active substances are peptides, but there are also lipids such as prostaglandins and steroids.

생리활성물질은 항산화 작용, 해독 작용, 면역기능증강 작용, 호르몬 조절 작용, 항균 또는 항바이러스 작용을 통해 노화를 지연시키거나 각종 성인병을 예방한다.Bioactive substances delay aging or prevent various adult diseases through antioxidant, detoxification, immune function, hormonal control, antibacterial or antiviral action.

상기 생리 활성 물질인 연골형성 성장인자에는 IGF (Insulin-like growth factor), TGF-β1 (Transforming growth factor β1)등이 있다.
Cartilage-forming growth factors that are bioactive materials include IGF (Insulin-like growth factor), TGF-β1 (Transforming growth factor β1), and the like.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are intended to illustrate the invention, and the content of the invention is not limited by the following examples.

(1) (One) 실시예Example 1:  One: 골분Bone meal ( ( DBPDBP ) 제조 방법A) manufacturing method

DBP 는 소의 대퇴부를 사용하여 Urist 방법으로 제조하였다. 소의 대퇴골과 경골을 채취하여 원위골단부, 근위골다부, 골막과 골수 및 연조직을 깨끗이 제거한 후 에탄올로 세척하여 잘게 분쇄하였다. 분쇄된 뼈를 클로로 포름과 메탄올의 혼합용매로 지방을 제거한 후 아세톤으로 건조시켰다. DBP was prepared by the Urist method using the femur of the cow. The femur and tibia of the cow were collected, the distal tip, proximal bone, periosteum, bone marrow, and soft tissue were removed, and then washed with ethanol and finely pulverized. The crushed bone was dried with acetone after removing fat with a mixed solvent of chloroform and methanol.

0.5 N HCl 용액으로 탈 미네랄화 과정을 거친 후 이렇게 얻은 DBP 를 다시 인산완충용액 (PBS pH 7.3-7.4, Sigma)으로 세척하여 pH 7.4 로 조절하였으며 -80 ℃ 에서 동결건조 시켰다. 동결건조된 DBP 는 액체질소 내에서 동결분쇄기 (6700 SPEX Inc, USA)를 이용하여 180 ㎛ 이하의 고운 분말을 얻었다.(도 1)
After demineralization with 0.5 N HCl solution, the DBP thus obtained was washed with phosphate buffer solution (PBS pH 7.3-7.4, Sigma), adjusted to pH 7.4 and lyophilized at -80 ° C. Lyophilized DBP obtained a fine powder of 180 μm or less using a freeze mill (6700 SPEX Inc, USA) in liquid nitrogen (FIG. 1).

(2) (2) 실시예Example 2:  2: DBPDBP gelgel 제조 방법 Manufacturing method

3 % 아세트산 (sigma)에 0.02 % 펩신 (Sigma)을 함유한 용액에 10 %의 DBP 을 첨가시켜 상온에서 48시간 동안 교반시킨 후, 생체 내 이식 조건을 맞추기 위해 pH 를 6으로 맞추었다. 겔은 4 ℃ 에서 24시간 동안 보관 후 오토클레이브(autoclave)에서 20분, 100 ℃ 하에 멸균하여 사용하였다.(도 2)
10% DBP was added to a solution containing 0.02% pepsin (Sigma) in 3% acetic acid (sigma), and the mixture was stirred at room temperature for 48 hours, and then the pH was adjusted to 6 to match the implantation conditions in vivo. The gel was stored at 4 ° C. for 24 hours and sterilized under autoclave for 20 minutes at 100 ° C. (FIG. 2).

(3) (3) 실시예Example 3:  3: 늑연골Costal cartilage 세포의 채취 및 배양 Collection and Culture of Cells

늑연골 세포는 늑연골에서 채취하여, 1 - 2 ㎟ 크기로 잘게 썰고, 항생제(100 units/ml 페니실린 & 100 μg/ml 스트렙토마이신)를 1 % 로 인산완충용액 (PBS)로 희석한 후 3회 세척하였다. 잘게 썬 연골을 2 mg/ml 콜라겐나아제 A(collagenase A ,Roche Diagnostics GmbH), 1 mg/ml 히알루니다제(hyaluronidase ,Roche Diagnostics GmbH), 0.7 mg/ml DNase (Roche Diagnostics GmbH)을 섞은 용액에 넣어 37 ℃, 5 % CO2 에서 하룻밤 배양하였다. 하루 동안 배양한 용액을 40 ㎛ 나일론 메쉬를 이용하여 여과 한 후 세포를 10 % FBS (fetal bovine serum ,Hyclone technologies), 1 % 항생제(100 units/ml 페니실린 & 100 μg/ml 스트렙토마이신)및 1 % ascorbic acid (Sigma) 가 포함된 MEM-α로 3회 씻어주었다. 이렇게 얻어진 늑연골세포 5x105 를 75 T-flask에 배양하여 늑연골 세포를 얻었다.(도 3)
Chondrocytes were harvested from the cartilaginous cartilage, chopped to 1-2 mm 2, diluted with 1% of antibiotics (100 units / ml penicillin & 100 μg / ml streptomycin) and washed three times. . Chopped cartilage is mixed with a solution of 2 mg / ml collagenase A (Roche Diagnostics GmbH), 1 mg / ml hyaluronidase (Rolu Diagnostics GmbH), and 0.7 mg / ml DNase (Roche Diagnostics GmbH). Incubated overnight at 37 ℃, 5% CO 2 . The cultured solution was filtered using a 40 μm nylon mesh for one day, and then the cells were filtered with 10% FBS (fetal bovine serum, Hyclone technologies), 1% antibiotic (100 units / ml penicillin & 100 μg / ml streptomycin) and 1%. Washed three times with MEM-α containing ascorbic acid (Sigma). Thus obtained chondroblasts 5x10 5 were cultured in 75 T-flask to obtain the chondrochondral cells (Fig. 3).

(4) (4) 실험예Experimental Example 1: 생체 적합성 평가 1: Biocompatibility Assessment

In vivo 환경에서 겔 내 섬유륜 세포와 수핵 세포의 거동을 확인하기 위하여 누드마우스 피하에 세포와 함께 겔을 주입한 후 1, 2 및 3주 후에 적출하여 실험하였다.
In In order to confirm the behavior of fibroblasts and nucleus cells in the gel in vivo, the mice were injected with the cells subcutaneously in the nude mouse, and extracted after 1, 2 and 3 weeks.

1-1. 1-1. 물함유량Water content 평가 evaluation

겔 분해에 대한 물리적 특성을 관찰하기 위하여 물 함유량을 확인한 결과 시간이 지남에 따라 생체 내에서 겔에서 물의 함량이 감소됨을 확인할 수 있었다. 이는 DBP 겔의 분해능과 조직과의 생체 친화력을 보여준다. (도 4)
As a result of confirming the water content in order to observe the physical properties of the gel decomposition, it was confirmed that the water content of the gel decreases in vivo with time. This shows the resolution of the DBP gel and its biocompatibility with tissue. (Figure 4)

1-2. 세포 독성 평가1-2. Cytotoxicity Assessment

세포의 사멸 정도을 확인하기 위해 LDH(Cytotox 96Non- Radioactive Cytotoxicity assay)를 시행한 결과, 적정 pH 를 맞춘 DBP 겔이 스펀지에 비해 훨씬 독성이 낮은 것으로 평가되었다. 이러한 결과로써 DBP 겔이 생체친화성이 높은 안전한 물질임을 확인할 수 있었다. (도 5)
Cytotox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (LDH) was used to determine the degree of cell death. DBP gels with appropriate pH were much less toxic than sponges. As a result, DBP gel was confirmed to be a safe material with high biocompatibility. (Fig. 5)

(5) (5) 실험예Experimental Example 2: 생체 내 거동 평가 2: in vivo behavior evaluation

2-1. 세포의 증식률 평가2-1. Evaluation of Cell Proliferation Rate

DBP 겔에서 세포의 증식률을 알아보고자 MTT(디메틸치아졸-2-일-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)분석법을 시행한 결과, 시간이 지날수록 세포가 증식률이 높아짐을 확인할 수 있었다. (도 6)
MTT (dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay was performed to determine the proliferation rate of the cells in the DBP gel. As a result, the proliferation rate of the cells increased with time. (Fig. 6)

2-2. 2-2. GAGGAG &  & CollagenCollagen 평가 evaluation

세포외 기질 형성 능력을 평가하기 위해 이식 후, 겔을 적출하여 DBP 겔 내 글라이코스아미노글라이칸(GAG)의 함량을 측정한 결과, 시간에 따라 GAG 함량이 증가함을 알 수 있었다. 이는 DBP 겔내에서 세포가 세포외 기질인 수분을 함유하는 GAG 의 합성 및 분비를 할 수 있도록 긍정적인 영향을 준 것으로 사료된다. (도 7)
In order to evaluate the extracellular matrix formation ability, the gel was extracted and the content of glycosaminoglycan (GAG) in the DBP gel was measured. As a result, the GAG content increased with time. This is thought to have a positive effect on the synthesis and secretion of GAGs containing water, which is an extracellular matrix, in the DBP gel. (Fig. 7)

DBP 겔 내 콜라겐 함량을 측정한 결과 시간이 지남에 따라 콜라겐 함량이 급격하게 증가하는 결과를 보였고, 이는 콜라겐 합성에 DBP 의 영향이 크며 세포가 성장할 수 있는 틀을 유지하는 콜라겐 섬유질이 적절히 합성된다는 것을 알 수 있었다. (도 8)
As a result of measuring collagen content in the DBP gel, the collagen content increased rapidly over time, indicating that collagen fibers are properly synthesized, which has a large DBP effect on collagen synthesis and maintains a framework for cell growth. Could know. (Fig. 8)

2-3. 유전자 발현 분석2-3. Gene expression analysis

DBP 겔과 스폰지의 mRNA 표현형이 비교되었을 때, NP 세포 표현형 손실 주요 마커인 제 1형 콜라겐의 발현정도가 큰 차이 없이 확인되었다. 어그리칸과 제 2형 콜라겐과 같은 세포외 기질(ECM)-연관 유전자 발현결과에 따르면, DBP 겔은 DBP 스폰지보다 NP 세포의 기능을 유지하고 바람직한 ECM 의 합성을 향상시키는 더 적합한 미세환경을 제공할 수 있을 것으로 사료된다. (도 9)
When the mRNA phenotypes of DBP gel and sponge were compared, the expression level of collagen type 1, a major marker of NP cell phenotype loss, was confirmed without significant difference. Extracellular matrix (ECM) -associated gene expressions, such as aggrecan and type 2 collagen, show that DBP gels provide a more suitable microenvironment than DBP sponges to maintain NP cell function and enhance the synthesis of desirable ECMs. It seems to be possible. (Fig. 9)

2-4. 염증 사이토카인 방출량 측정2-4. Inflammatory cytokine release

DBP 겔의 염증 정도의 완화 정도를 비교 분석하기 위하여 ELISA 방법을 이용하였으며, DBP 겔에 24, 48, 및 72시간 동안 RAW 264.7 세포를 배양한 후 상층액을 각 시간마다 취하여 염증 매개사이토카인인 TNF-α를 정량한 결과 DBP 겔에서는 낮은 TNF-α방출을 보였다. (도 10)
The ELISA method was used to compare the degree of inflammation of DBP gel, and after culturing RAW 264.7 cells in DBP gel for 24, 48, and 72 hours, the supernatant was taken for each hour, and TNF, an inflammation mediated cytokine. Quantification of -α showed low TNF-α release in DBP gel. (Fig. 10)

(6) (6) 실험예Experimental Example 3: 조직학적 평가 3: histological evaluation

3-1. H&E 염색3-1. H & E dyeing

조직학적 평가인 H&E 염색을 통해 DBP 겔이 주변 조직과의 융합이 우수하였으며, 신생혈관이 더 많이 분포함을 확인할 수 있었다. (도 11)
H & E staining, a histological evaluation, showed that DBP gel had excellent fusion with the surrounding tissues and that neovascularization was more distributed. (Fig. 11)

3-2. 3-2. SafraninSafranin -O 염색-O dye

DBP 겔에서 세포외기질의 수분을 함유하는 글라이코스아미노글라이칸(GAG)의 발현정도를 확인하기 위하여 Safranin-O 를 수행한 결과 역시 DBP 겔에서 붉은색이 더 강하게 나타나는 것으로 보아 GAG 합성이 우수함을 알 수 있었다. (도 12)
Safranin-O was performed to confirm the expression level of glycosaminoglycans (GAG) containing water in the extracellular matrix in the DBP gel. Could. (Fig. 12)

3-3. 3-3. 면역조직화학염색 제Immunohistochemical Staining Agents 2형 콜라겐 Type 2 collagen

DBP 겔에서 디스크 세포의 발현을 증명하기 위해 면역조직화학염색을 실시하였고, 시간이 지날수록 제 2형 콜라겐의 발현이 많이 나타남을 알 수 있었다. (도 13)
Immunohistochemical staining was performed to verify the expression of the disc cells in the DBP gel. As time passed, the expression of type 2 collagen was increased. (Figure 13)

3-4. 3-4. MTSMTS 염색 dyeing

DBP 겔에서 디스크 세포의 교원섬유 생성 능력을 확인하기 위하여 MTS 염색을 수행하였다. 5 % DBP겔은 1일까지 붉은색을 나타내며 교원섬유가 생성되지 않음을 알 수 있고, 시간이 지남에 따라 교원섬유가 생성됨을 확인할 수 있다. 또한 5 % DBP겔 보다 10 % DBP 겔에서 교원섬유 생성이 활발히 진행됨을 확인할 수 있었다. (도 14)
MTS staining was performed to confirm the collagen production capacity of the disc cells in the DBP gel. 5% DBP gel shows a red color until one day, it can be seen that no collagen fibers are produced, it can be seen that the collagen fibers are produced over time. In addition, it was confirmed that collagen fiber production was more active in 10% DBP gel than 5% DBP gel. (Figure 14)

3-5. 면역조직화학염색 3-5. Immunohistochemical Staining EDED -1-One

대식세포 발생 정도를 확인하기위해 ED-1 단일클론 항체를 이용한 면역조직화학염색을 실시하였다. 적출한 겔 및 주변조직에 염색을 통한 세포 분포 양상을 확인한 결과 선천성면역을 일으키는 대표적인 세포인 대식세포가 겔이 이식된 주변에 침윤됨을 확인하였다. 1주 후 결과에서, 1주에 겔 주변에서 많은 수의 대식세포가 넓게 분포되었으나 2, 3주 후에는 1주일 때보다 ED-1 양성세포 발생 정도가 두 그룹 모두 감소함을 보였다. (도 15)Immunohistochemical staining using ED-1 monoclonal antibody was performed to confirm the degree of macrophage development. As a result of confirming the cell distribution pattern by staining the gel and surrounding tissues, it was confirmed that macrophages, which are representative of innate immunity, infiltrated around the implanted gel. After one week, the results showed that macrophages were widely distributed around the gel at 1 week, but after 2 and 3 weeks, the incidence of ED-1 positive cells was decreased in both groups than at 1 week. (Figure 15)

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 DBP 겔은 기존의 제조 방법보다 간단하고, 다른 첨가제를 넣지 않고도, 겔 형태를 유지 할 수 있고, 보관이 용이하다. 또한 세포의 성장이 완결된 후에는 자연적으로 생분해 되어 몸에 흡수 되기 때문에 다른 재료 보다 생체 적합한 장점을 가진다.
As described above, the DBP gel according to the present invention is simpler than the conventional manufacturing method, it is possible to maintain the gel form without adding other additives, and is easy to store. In addition, since the growth of cells is naturally biodegradable and absorbed by the body has the advantage of biocompatibility than other materials.

Claims (7)

연골 형성을 유도하는 탈미네랄화된 골분(Demineralized Bone Particle, DBP) 겔 및 늑연골 세포를 함께 포함하는 연골 손상 치료용 조성물.
A composition for treating cartilage damage, comprising demineralized bone powder (DBP) gel and ribosomal cells inducing cartilage formation.
청구항 1에 있어서, 상기 탈미네랄화된 골분(Demineralized Bone Particle, DBP)은 포유류의 골인 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료용 조성물.
The composition of claim 1, wherein the demineralized bone powder (DBP) is mammalian bone.
청구항 1에 있어서, 상기 탈미네랄화된 골분의 입자 크기는 10 - 300 ㎛ 인 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료용 조성물.
The composition of claim 1, wherein the particle size of the demineralized bone meal is 10-300 μm.
청구항 1에 있어서, 상기 탈 미네랄화된 골분은 전체 조성물에서의 중량비가 5 - 20 중량%인 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료용 조성물.
The composition for treating cartilage damage according to claim 1, wherein the demineralized bone meal has a weight ratio of 5 to 20% by weight in the total composition.
청구항 1에 있어서, 상기 연골 손상 치료용 조성물은 pH 6-7 인 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료용 조성물.
The composition of claim 1, wherein the composition for treating cartilage damage is pH 6-7.
청구항 1에 있어서, 상기 연골 손상 치료용 조성물은 생리 활성 물질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 1, wherein the composition for treating cartilage damage further comprises a bioactive substance.
청구항 6에 있어서, 상기 생리 활성 물질은 연골형성 성장인자 IGF(Insulin-like growth factor), TGF-β1(Transforming growth factor β1)인 것을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 6, wherein the physiologically active substance is a cartilage growth factor IGF (Insulin-like growth factor) or TGF-β1 (Transforming growth factor β1).
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