KR20130068005A

KR20130068005A - 흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 ｃｅｌ－ＫＧ３５ 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20130068005A
Application number: KR1020110135111A
Authority: KR
Inventors: 이경태; 김태헌; 이현정; 안정현; 김영주; 안현승; 김지훈; 변미정
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-06-25
Also published as: KR101479696B1

Abstract

본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 (endo-glucanase) 단백질, 상기 엔도글루카나아제 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 엔도글루카나아제 단백질 대한 항체, 상기의 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 엔도글루카나아제를 과발현하는 단계를 포함하는 숙주세포에서 엔도글루카나아제를 대량생산하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 재조합 엔도글루카나아제 단백질, 상기 엔도글루카나아제 단백질 또는 상기 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 글루칸 분해 증진용 사료 첨가제 또는 세제 조성물 및 바이오매스 물질에 상기 엔도글루카나아제 단백질 또는 상기 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료 (Biofuel)의 제조 방법을 제공한다.

Description

흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 ｃｅｌ－ＫＧ３５ 유전자 및 이의 용도 {Cel-KG35 endo-glucanase gene from ruminant stomach microorganism of black goat and uses thereof}

본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 cel - KG35 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 (endo-glucanase) 단백질, 상기 엔도글루카나아제 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 엔도글루카나아제 단백질 대한 항체, 상기의 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 엔도글루카나아제를 과발현하는 단계를 포함하는 숙주세포에서 엔도글루카나아제를 대량생산하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 재조합 엔도글루카나아제 단백질, 상기 엔도글루카나아제 단백질 또는 상기 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 글루칸 분해 증진용 사료 첨가제 또는 세제 조성물 및 바이오매스 물질에 상기 엔도글루카나아제 단백질 또는 상기 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료 (Biofuel)의 제조 방법에 관한 것이다.

식물 세포벽의 주요 구성요인은 셀룰로오스 (cellulose), 헤미-셀룰로오스 (hemi-cellulose), 펙틴 (pectin)이며 이들은 초식동물의 반추위에서 복잡하고도 효과적인 미생물 분해과정에 의하여 소화되어진다. 반추위의 미생물은 극도의 혐기성이며 곰팡이, 프로토조아 및 박테리아로 이루어져 있으며, 섬유소분해는 주로 박테리아와 곰팡이에서 이루어지는 것으로 알려져 있다. 하지만 이들 미생물은 대부분은 배양이 어려워서 잘 알려져 있지 않은 상태이다. 현재까지 반추위 박테리아 중에서 식물 세포벽을 소화하는데 주요하게 관여하는 박테리아로는 피브로박터 숙시노게네스 (Fibrobacter succinogenes), 루미노코커스 플라베파시엔스 (Ruminococcus flavefaciens), 루미노코커스 알부스 (Ruminococcus albus), 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens), 유박테리움 셀룰로솔벤스 (Eubacterium cellulosolvens), 프레보텔라 (Prevotella) 그리고 일부분의 클로스트리디움 (Clostridium) 속에 속하는 박테리아로 밝혀져 있다. 현재까지 대부분의 반추동물의 섬유소분해효소 유전자를 발굴하기 위하여 소와 토끼, 캥거루의 소화기관의 총 미생물 DNA, 혹은 메타게놈 (metagenome; 환경미생물의 총 DNA를 일컬음)을 연구하였고 이로부터 다수의 글루카나아제 (glucanase), 자일라나아제 (xylanase) 및 셀룰로솜 복합체 (cellulosome complex)들이 밝혀진 바가 있다. 하지만 이들은 대부분 연질의 식물 섬유소원을 먹이로 진화한 경우이며, 섬유소분해효소 중 보다 경질의 섬유소원에 대한 분해 능력이 요구된다.

흑염소는 나뭇가지 및 껍질 그리고 초목과 같은 보다 조악한 섬유소원의 사료를 잘 소화하도록 현재까지 진화하였다. 이는 흑염소의 반추위 미생물군이 다른 초식동물과 다르게 공생되어 진화되었다는 것을 의미한다. 난배양성 미생물군에 대한 유전자 탐색을 위하여 포스미드 (fosmid), 코스미드 (cosmid) 및 BAC (bacterial artificial chromosome) 유전자은행을 이용하여 신규 물질을 탐색하는 기술이 널리 사용되고 있다. 이러한 방법으로 현재까지 많은 섬유소분해효소 유전자가 밝혀졌지만 본 발명의 흑염소 유래 섬유소분해효소 유전자는 현재까지 밝혀진 어떤 유전자와도 상이한 신규의 것이다.

한편, 한국공개특허 제2010-0053285호에는 '신균주 페니실륨 피노필럼 ＫＭＪ601 유래 엔도글루카네이즈의 생산 최적화 및 유전자 클로닝'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0029398호에는 '마늘 유래의 엔도-1,4-베타-글루카나아제 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 흑염소 반추위 미생물의 섬유소분해 능력에 초점을 두고, 흑염소 반추위 미생물 메타게놈에 대하여 포스미드 (fosmid) 유전자은행을 구축하고, 이로부터 CMC (carboxymethyl cellulose; 셀룰로오스 유사체) 기질을 분해하는 활성을 갖는 포스미드 클론을 선발하여, 그 클론의 플라스미드 DNA를 해독함으로써 유전정보를 확보하였다. 확보한 DNA 유전정보가 섬유소분해 활성을 갖기 위한 필수 도메인인 글라이코시드 하이드롤라아제 (GH; glycoside hydrolase) 도메인과 탄수화물 결합 단위 (CBM; carbohydrate binding module) 도메인을 갖는 엔도글루카나아제 코딩 유전자인 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 (endo-glucanase) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 엔도글루카나아제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 엔도글루카나아제 단백질 대한 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 엔도글루카나아제를 과발현하는 단계를 포함하는 숙주세포에서 엔도글루카나아제를 대량생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 엔도글루카나아제 단백질 또는 상기 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 글루칸 (glucan) 분해 증진용 사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 엔도글루카나아제 단백질 또는 상기 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 세제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 바이오매스 물질에 상기 엔도글루카나아제 단백질 또는 상기 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료 (Biofuel)의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 cel - KG35 유전자의 산물인 엔도글루카나아제는 매우 조악한 섬유소 사료에 대해서도 소화력이 뛰어난 흑염소의 반추위 미생물로부터 섬유소 분해효소 유전자 발굴을 통하여 획득되었고 경질의 섬유소원에 대한 분해 능력이 높기 때문에, 본 발명의 엔도글루카나아제 단백질은 사료 첨가제 및 세제 조성물에 이용될 수 있으며 나아가 화석 연료 고갈 문제에 에너지 대책으로 대두되는 바이오연료 개발 분야에서도 그 효용성이 높다.

도 1은 포스미드 (Fosmid) 유전자 은행 구축을 위한 메타게놈 DNA 부분절단 조건 확립 및 삽입 DNA 절단 결과를 나타낸다.
도 2는 Ad (Ad; adherent phase) 분획과 Lq (Lq; liquid phase) 분획에 대한 포스미드 유전자은행 평균 삽입 크기를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 CMC-Agar 플레이트 상에 접종 후 CMC 분해 활성을 갖는 포스미드 클론 선발의 예 (콩고레드/NaCl에 의한 클리어 존 (clear zone) 확인)를 나타낸다.
도 4는 뉴클레오티드 블라스트 (nucleotide blast) 검색 결과를 나타낸다.
도 5는 단백질 블라스트 (protein blast) 검색에 따른 주요 도메인을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 단백질 블라스트 검색 결과 중 최상위 상동 단백질에 대한 유사성 검토 (phylogenetic tree) 및 상동성과 추정값을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 (endo-glucanase) 단백질을 제공한다.

본 발명의 엔도글루카나아제 단백질은 농촌진흥청 국립축산과학원 가축유전자원시험장 출생 흑염소 3두(수컷 2두, 암컷 1두)에 대하여 동물유전체과에서 관리이전 후 볏짚 사료와 미네랄 보충제로만 한 달간 급여한 후 도축하여 얻은 반추위 미생물 시료로부터 얻어졌다.

본 발명에 따른 엔도글루카나아제 단백질의 범위는 흑염소 반추위 미생물로부터 유래된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 엔도글루카나아제 활성을 의미한다.

본 발명은 또한 엔도글루카나아제 단백질의 단편, 유도체 및 유사체 (analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 엔도글루카나아제 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적 (conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기 (바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드 (상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물 (폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열 (예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠 (proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

서열번호 2로 표시되는 성숙 (mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드 (및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.

용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안 (alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.

또한, 본 발명은 엔도글루카나아제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 엔도글루카나아제 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA는 게놈 DNA, cDNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩 (coding) 가닥 또는 넌코딩 (non-coding) 가닥일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열 및 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50% (v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2로 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.

본 발명의 구현 예에 따라, 엔도글루카나아제 유전자는 바람직하게는 흑염소 반추위 미생물 유래라는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명의 구현 예는 엔도글루카나아제 유전자와 높은 상동성 (예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖는 다른 생물로부터 유래한 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단 (예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 엔도글루카나아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 엔도글루카나아제 단백질에 대한 항체를 제공한다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 모노클로날 항체, 다중특이적 (multispecific) 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화 항체 (camelised antibody), 키메라 항체, 단일 체인 Fvs (scFv), 단일 체인 항체, 단일 도메인 항체, Fab 프래그먼트, F(ab) 프래그먼트, 디설피드-결합 Fvs (sdFv), 및 항이디오타입 (항-Id) 항체, 및 상기 임의의 에피토프 결합 단편을 말한다. 특히, 항체는 면역 글로불린 분자 및 면역학적으로 활성이 있는 면역글로불린 분자 단편, 즉 항원결합부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 종류(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예: IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂) 또는 서브클래스일 수 있다.

본 발명의 항체는 본 발명의 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 엔도글루카나아제 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

또한, 본 발명은 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 엔도글루카나아제를 과발현하는 단계를 포함하는 숙주세포에서 엔도글루카나아제 단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다. 상기 숙주세포에서 생산된 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 분리 및 정제하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 엔도글루카나아제 단백질 또는 상기 숙주세포에 의해 생산된 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 글루칸 분해 증진용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 사료 첨가제에는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨 (catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물 (rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제와 같은 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 사료 첨가제는 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 리파제와 같은 지방 분해효소, 피틴산 (phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제 (phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합 (α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제 (phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 가축 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 가축 사료 첨가용 조성물에는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은 새 등과 같은 가금류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 사료 첨가제에 포함되는 본 발명의 엔도글루카나아제의 양은 특별히 한정되지 않으나, 가축의 소화관에서 장기간 잔존하면서 섬유질계 및 반섬유질계 물질을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다.

또한, 본 발명은 엔도글루카나아제 단백질 또는 상기 숙주세포에 의해 생산된 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 세제 조성물을 제공한다.

본 발명의 세제 조성물은 1부 및 2부 수성 세제 조성물, 비수성 액체 세제 조성물, 성형 고체 (cast solid), 과립 형태, 입자 형태, 압축 정제, 겔 및/또는 페이스트 및 슬러리 형태일 수 있다. 상기와 같은 세제 조성물을 사용하여 음식물의 찌든 때, 음식물 잔류막 및 기타 소량의 식품 조성물을 신속하게 제거할 수 있다. 본 발명의 세제 조성물은 전분 다당류를 촉매 가수분해하여 말라붙은 얼룩 제거에 효과적일 수 있다.

본 발명의 세제 조성물은 단단한 표면을 세정하는 세제 조성물, 직물을 세정하는 세제 조성물, 설거지용 세제 조성물, 구강 세정용 세제 조성물, 의치 세정용 세제 및 콘택트 렌즈 세정 용액을 비롯한 세제 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 바이오매스 물질에 상기 엔도글루카나아제 단백질 또는 상기 숙주세포에 의해 생산된 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료 (Biofuel)의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 바이오매스 물질은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질로, 본 발명의 바이오연료(Biofuel)를 제조하는 방법은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질을 전처리하는 단계, 전처리한 바이오매스를 효소로 가수분해시키는 단계 및 가수분해된 바이오매스 물질을 발효시키는 단계로 이루어지는 당업계에 통상적으로 이용되는 바이오연료(Biofuel)의 제조방법을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 바이오연료의 제조방법에 있어서, 상기 바이오매스는 전분질계 (곡물, 감자류 등), 셀룰로오스계 (초본, 임목, 왕겨 등), 당질계 (사탕수수, 사탕무 등) 및 단백질계 (가축분뇨, 사체, 미생물 균체 및 이들로부터 유래하는 종이와 음식물찌꺼기 등 유기성 자원) 등의 고분자량의 탄수화물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 바이오연료를 제공한다. 상기 바이오연료는 바이오에탄올, 바이오디젤, 바이오가스 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 흑염소 반추위 미생물 분리 및 DNA 추출

수컷 2마리와 암컷 1마리 흑염소에 대하여 1개월간 볏짚 사료와 미네랄 보충제만으로 사육한 후, 도축을 실시하였고 이로부터 4개의 위 중에서 첫 번째 위인 반추위를 취하여 그 내용물을 확보하였다. 확보된 내용물은 먼저 거즈를 이용하여 위액상 (Lq; liquid phase)과 사료 소화상 (Ad; adherent phase)로 구분하여 시료를 준비하였다. 사료 소화상 Ad는 거즈로 걸른 후의 찌꺼기를 다시 0.15% (volume/volume) Tween-80, PBS 용액에 현탁하여 볏짚 소화물에 부착된 미생물을 회수한 것이다. 이들에 대해 각각 5g의 침전 시료를 마련하고 이를 CTAB (hexadecylmethylammonium bromide)와 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 이용하여 총 DNA를 추출하였다.

실시예 2: 흑염소 반추위 미생물 포스미드 ( fosmid ) 유전자은행 구축

Ad와 Lq에서 추출된 DNA에 대하여 포스미드 유전자은행을 구축하기 위한 적절한 크기로 임의 부분절단 조건을 위해, 여러 HindIII 제한효소의 양을 조절한 결과, Ad는 HindIII 5units 그리고 Lq는 2.5units를 사용하도록 결정하였다 (도 1). 부분절단된 DNA 절편들은 Pulse-Field Gel 전기영동 방법을 사용하여 10 ~ 50kb 사이의 영역을 오려내어 이로부터 다시 삽입 DNA 단편을 마련하였다. 마련된 DNA는 말단 평활화 반응을 수행하고 이를 pCC1FOS 벡터에 ligation 반응으로 연결하였다. Ligation 연결 반응 후, 이를 DH5α 대장균에 전기적 충격법으로 형질전환하여 유전자은행을 구축하였다. 구축된 포스미드 유전자은행에 대하여 평균 삽입크기를 확인하기 위하여 NotI 효소 처리를 하여 이를 전기영동으로 확인한 결과, Ad의 경우 30 kb, Lq의 경우는 31kb로 판명되었다 (도 2). 이들에 대해서 각각 384 well plate 총 150 plates에 냉동보존 가능 배지에 접종하여 초저온냉동고 (-70℃)에 보관하였다.

실시예 3: CMCase 활성을 지닌 포스미드 클론 선발

Ad와 Lq의 포스미드 클론 전부인 115,200개 클론에 대하여 MultiMek 96 기기를 사용하여 384 클론 단위로 0.25% CMC LB 클로람페니콜 아가 배지에 접종을 하고 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양된 플레이트는 0.2%의 콩고레드 용액을 붓고 30분간 방치를 한 후, 이를 1차 증류수로 3회 이상 세척을 실시하고 여기에 다시 1M NaCl 용액을 넣고 5분 정도 방치하였다. 이 단계가 끝나면 light box에 플레이트를 올려 놓고 클리어 존 (clear zone)이 확인된 클론의 주소를 알아내었다 (도 3).

실시예 4: CMCase 활성 포스미드 클론에 대한 염기서열 해독

상기 실시예 3에서 확인된 포스미드 클론 Ad_125D08에 대하여 포스미드 플라스미드 추출을 Qiagen plasmid midi prep kit을 사용하여 수행하였으며, 추출된 플라스미드 DNA는 Sanger shotgun 염기서열 해독 방법과 한 방향 파이로 염기서열 해독 기법을 병행하여 해당 클론의 플라스미드에 삽입된 DNA의 서열 정보를 확보하였다. Sanger shotgun 염기서열 해독은 추출된 플라스미드 DNA를 임의 절단하여 말단 평활화를 하고 이를 SmaI 제한효소로 마련된 탈인산화된 pUC19 벡터와 ligation 반응을 한 후, 이를 DH5α 대장균에 형질전환하여 이로부터 생성된 단일 클론 192개에 대한 플라스미드 DNA를 추출하여 양방향으로 M13_정방향 프라이머 (GTAAAACGACGGCCAGT: 서열번호 3)와 M13_역방향 프라이머 (AACAGCTATGACCATG: 서열번호 4)를 사용하여 Dye termination sequencing kit를 사용하여 염기서열 해독 반응을 하였고, 반응물은 에탄올 정제를 거친 후, ABI사의 Genome Analyzer 3730XL 기종을 사용하여 해독 작업을 진행하였다. 해독된 염기서열 데이터는 phredphrap 프로그램을 이용하여 조합작업 (assembly)를 진행하여 공통서열 정보를 일차 확보하였다. 또한 같은 클론의 DNA에 대하여 네블라이저를 이용하여 임의 절단한 조각에 대하여 파이로 염기서열 해독 기법을 이용하여 GS Junior 기종을 사용하여 총 7200개 서열을 확보하고 이를 Newbler2.5 de novo assembler 프로그램을 이용하여 조합작업을 진행하였다. Sanger 염기서열 해독 데이터와 파이로 염기서열 해독 데이터는 Lasergene의 Seqman 프로그램을 이용해서 통합하여 최장 긴 서열을 확보하였다.

실시예 5: 유전자 탐색 및 유사성 조사

확보된 포스미드 클론의 삽입 DNA 염기서열 정보에 대해서는 MetaGeneMark 프로그램을 이용하여 유전자 영역을 탐색하였다. 탐색된 유전자 정보에 대해서는 일차적으로 자체 pfam 도메인 데이터베이스에서 글라이코시드 하이드롤라아제 (GH; glycoside hydrolase) 도메인과 탄수화물 결합 단위 (CBM; carbohydrate binding module) 도메인을 갖는 유전자를 탐색한 결과, KG35 유전자에서 셀룰라아제 도메인을 확인하였고, 다음으로 NCBI에서 운영하는 뉴클레오티드 블라스트 (nucleotide blast)와 단백질 블라스트 (protein blast)를 이용하여 동일 서열이 존재하는지 여부를 확인하였다. 2011년 10월 현재 뉴클레오티드 블라스트 결과 기본 검색 조건에서 어떠한 DNA 서열과도 일치하지 않음을 확인하였다 (도 4). 또한 단백질 블라스트 결과 일반적인 셀룰라아제 도메인과 엔도글루카나아제에서 보이는 멀티 도메인인 Bg1C를 갖고 있음을 확인하였고, cel - KG35 유전자가 셀룰라아제의 일종임을 알 수 있었으며 (도 5), 가장 유사한 유전자는 유박테리움 셀룰로솔벤스 6 (Eubacterium cellulosolvens 6)의 셀룰라아제 유전자 (Accession No. ZP_07839109)로서 총 320개 아미노산 중에서 188개의 아미노산이 서로 상동성 (43%)을 보였다. 이로써 본 발명에서 밝혀낸 cel - KG35 유전자 및 그의 산물은 신규 섬유소분해효소 엔도글루카나아제라고 할 수 있다 (도 6).

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Cel-KG35 endo-glucanase gene from ruminant stomach microorganism of black goat and uses thereof <130> PN11268 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 963 <212> DNA <213> Ruminant stomach microorganism of blackgoat <400> 1 atgaacaaga acgacgagcg aaagggagaa gcgacgatga atacctgttt tgaccgacac 60 ggcgcgctgc gcgtgtccgg cacccagctg ttggacgagg cggagaggag ggtccagctg 120 aggggagtga gcaccctggg cctggcctgg tatcccgaat atgtgaacga ggccgccttt 180 cggacccttc gcgacggctg gggcgcgaac accgtgcgcc tggcgatgta cacctgcgag 240 tcgggcggct acatgaccgg cggcgacagg gcggcgctcg aggcgctgat cgaccggggc 300 gtgaagctct gcgcggcgct gggcctgtac gtcatcatcg actggcacat tttaagcgac 360 ggcgacccga acacccacgc cgatgccgcc gaggatttct ttggccggat cagcgcgcgc 420 tatgccggcc agccccacgt gctctacgag atctgcaacg agccgaacgg ccccgcggcg 480 acctggccgg cggtgaagcg ctacgccagg cggatcatcc ccgtgatccg cgccaacgcg 540 cccgacgcgg tgatcctgtg cgggacgccg aactggtccc aggacgtgga cctcgcggcg 600 gccgatcccc tggacgacgg gaacctcatg tacgcgctgc acttctacgc cgcgacccat 660 aaggaggcgc tgcgggagaa ggcggagcgc gcgctcgcgg ccggcgcgcc gctgtttatc 720 accgaattca gcatctgcga tgcctcgggc gacggcgcga tcgactatga ctccgccgcg 780 gcgtggcgcg ctctgatcgc gaagcacggg ctctcctatg tggcgtggag cctgtccaac 840 cgggatgaga gcgccgcgct gatccgcgcc gattgcccga ggacgtccga ctggaccgac 900 gacgacctca ccgacaccgg cagatggctc aaggcggcgc tgaacgagga cagattgcag 960 taa 963 <210> 2 <211> 320 <212> PRT <213> Ruminant stomach microorganism of blackgoat <400> 2 Met Asn Lys Asn Asp Glu Arg Lys Gly Glu Ala Thr Met Asn Thr Cys 1 5 10 15 Phe Asp Arg His Gly Ala Leu Arg Val Ser Gly Thr Gln Leu Leu Asp 20 25 30 Glu Ala Glu Arg Arg Val Gln Leu Arg Gly Val Ser Thr Leu Gly Leu 35 40 45 Ala Trp Tyr Pro Glu Tyr Val Asn Glu Ala Ala Phe Arg Thr Leu Arg 50 55 60 Asp Gly Trp Gly Ala Asn Thr Val Arg Leu Ala Met Tyr Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ser Gly Gly Tyr Met Thr Gly Gly Asp Arg Ala Ala Leu Glu Ala Leu 85 90 95 Ile Asp Arg Gly Val Lys Leu Cys Ala Ala Leu Gly Leu Tyr Val Ile 100 105 110 Ile Asp Trp His Ile Leu Ser Asp Gly Asp Pro Asn Thr His Ala Asp 115 120 125 Ala Ala Glu Asp Phe Phe Gly Arg Ile Ser Ala Arg Tyr Ala Gly Gln 130 135 140 Pro His Val Leu Tyr Glu Ile Cys Asn Glu Pro Asn Gly Pro Ala Ala 145 150 155 160 Thr Trp Pro Ala Val Lys Arg Tyr Ala Arg Arg Ile Ile Pro Val Ile 165 170 175 Arg Ala Asn Ala Pro Asp Ala Val Ile Leu Cys Gly Thr Pro Asn Trp 180 185 190 Ser Gln Asp Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Pro Leu Asp Asp Gly Asn 195 200 205 Leu Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Ala Thr His Lys Glu Ala Leu 210 215 220 Arg Glu Lys Ala Glu Arg Ala Leu Ala Ala Gly Ala Pro Leu Phe Ile 225 230 235 240 Thr Glu Phe Ser Ile Cys Asp Ala Ser Gly Asp Gly Ala Ile Asp Tyr 245 250 255 Asp Ser Ala Ala Ala Trp Arg Ala Leu Ile Ala Lys His Gly Leu Ser 260 265 270 Tyr Val Ala Trp Ser Leu Ser Asn Arg Asp Glu Ser Ala Ala Leu Ile 275 280 285 Arg Ala Asp Cys Pro Arg Thr Ser Asp Trp Thr Asp Asp Asp Leu Thr 290 295 300 Asp Thr Gly Arg Trp Leu Lys Ala Ala Leu Asn Glu Asp Arg Leu Gln 305 310 315 320 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 aacagctatg accatg 16

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 (endo-glucanase) 단백질.
제1항의 엔도글루카나아제 단백질을 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제1항의 엔도글루카나아제 단백질에 대한 항체.
제4항의 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 엔도글루카나아제를 과발현하는 단계를 포함하는 숙주세포에서 엔도글루카나아제를 대량생산하는 방법.
제7항의 방법에 의해 제조된 재조합 엔도글루카나아제 단백질.
제1항의 엔도글루카나아제 단백질 또는 제8항의 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 글루칸 분해 증진용 사료 첨가제.
제1항의 엔도글루카나아제 단백질 또는 제8항의 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 세제 조성물.
바이오매스 물질에 제1항의 엔도글루카나아제 단백질 또는 제8항의 숙주세포에 의해 생산된 재조합 엔도글루카나아제 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료(Biofuel)의 제조 방법.