KR20130057888A - Spr kit for discriminating cow-meat specific age and method for discriminating cow-meat specific age - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: An SPR(Surface Plasmon Resonance) kit for determining the specific age of cow meat containing anti-p21 antibody and PBS(Phosphate Buffered Saline), and a method for determining the specific age of cow meat using the same are provided to effectively select 30-month old or younger cows by measuring the concentration of p21. CONSTITUTION: An SPR kit for determining the specific age of cow meat contains anti-p21 antibody, a metal thin film coated with an anti-p21 antibody-conjugated linker molecule, and PBS solution. The SPR kit additionally contains a muscle tissue of 30-month old or younger cows, which is homogenized with the PBS solution. A method for determining the specific age of cow meat comprises: a step of adding a cow meat sample to the PBS solution and homogenizing; a step of touching the homogenized sample to the thin film; and a step of measuring the concentration of p21.

Description

소고기 월령 판별용 ＳＰＲ 키트 및 이를 이용한 소고기 월령 판별 방법{SPR Kit for discriminating cow-meat specific age and method for discriminating cow-meat specific age}SPR kit for discriminating beef age and method for discriminating beef age using same {SPR Kit for discriminating cow-meat specific age and method for discriminating cow-meat specific age}

본 발명은 소고기 월령 판별용 SPR 키트 및 이를 이용한 소고기 월령 판별 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 항 p21 항체 및 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트 및 소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키고 이를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시킨 후 SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 소고기 월령 판별 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to an SPR kit for determining the monthly age of beef and a method for determining the monthly age of beef using the same. More specifically, the SPR kit for determining the monthly age of beef and a sample for determining the monthly age of beef, comprising an anti-p21 antibody and a PBS sample buffer It is related to the method of determining the age of beef in the PBS buffer, homogenizing and contacting it with a metal thin film to which the anti-p21 antibody is attached and then measuring the concentration of p21 in the sample by SPR method.

소고기의 수입 개방에 따라 막대한 양의 수입산 소고기가 캐나다, 미국 등으로부터 수입되고 있다. 그러나, 캐나다, 미국 등의 북미산 소고기에는 광우병 발병율이 높은 30개월령 이상의 소고기가 많이 포함되어 있어 국민들의 불안감이 상당히 크다. 광우병에 걸린 소의 95%가 30개월령 이상인 것으로 알려져 있다. 따라서, 30개월령 미만인 소고기를 선별하여 수입하여야 하는데, 소의 월령을 판별하기가 쉽지 않다.With the opening up of beef imports, a large amount of imported beef is imported from Canada and the United States. However, North American beef, such as Canada and the United States, contains a lot of beef over 30 months of age, which has a high incidence of mad cow disease. 95% of cows with mad cow disease are known to be over 30 months of age. Therefore, the beef that is less than 30 months of age must be selected and imported, it is not easy to determine the age of the cow.

현재 통용되고 있는 소의 월령 판별 방법으로는 1) 소의 출생증명서, 2) 도축한 소의 척추 뼈의 골화(骨化) 상태를 판정하는 방법, 3) 치아감별법 등 3가지가 있다. 상기 방법 중 소의 출생증명서를 보고 소의 월령을 판별 하는 방법이 가장 정확하지만, 미국의 소는 주로 방목하여 키우기 때문에 미국 소의 출생 월령 확인율은 20%로 매우 낮다. 또한, 도축한 소의 척추를 이분할하여 척추 뼈의 골화 상태를 보고 판정하는 방법, 즉 뼈의 노화 정도를 보고 추측하는 방법은 육안 식별방법으로는 아직까지 가장 신빙성이 있지만, 이 방법도 판정단계에서 대략 15% 정도의 오차가 발생한다. 또한, 치아감별법은 사육조건에 따라 변이가 커서 정확하지 않다는 것이 과학적 정설이며, 특히 사료급여 조건이 인간의 통제를 받지 않는 자연 방목 소의 경우는 더 부정확하다.Currently, there are three methods of judging the age of a cow: 1) a birth certificate of a cow, 2) a method of determining the ossification of the vertebral bones of a slaughtered cow, and 3) a tooth discrimination method. Among the above methods, the birth certificate of the cow is the most accurate method of determining the age of the cow, but because the American cattle are mainly grazing and raising the birth age of the American cattle is very low as 20%. In addition, the method of judging the ossification state of the vertebral bone by dividing the spine of the slaughtered cow, that is, the method of judging the aging degree of the bone, is still the most reliable as the visual identification method. An error of about 15% occurs. In addition, the scientific orthodoxy is that the differentiation method according to the breeding conditions is large and inaccurate. In particular, it is more inaccurate for natural grazing cows in which feeding conditions are not controlled by humans.

상기한 바와 같이, 소의 출생증명서에 의한 것을 제외하고는 도축된 소고기 상태에서 실제의 월령을 판별할 수 있는 과학적인 방법은 전무한 상태이다. 현재 소고기의 원산지, 등급, 숙성도 등의 판별 방법에 관하여는 다양하게 연구되어 있어 한우 및 수입 소고기의 원산지, 등급, 숙성도 등의 판별이 가능하지만, 한우 및 수입 소고기 모두에서 월령을 판별하는 방법에 관한 연구는 전무한 상태이다. 또한, 소고기의 월령을 판정하기에는 수입 물량의 방대한 양에 비해 실제적인 검사 역시 많은 시간과 비용이 소모되는 문제점이 있다.As described above, there is no scientific method to determine the actual age of the slaughtered beef, except by the birth certificate of the cow. Currently, various methods of determining the origin, grade, and maturity of beef have been studied. Therefore, the origin, grade, and maturity of Korean beef and imported beef can be distinguished, but the age of both the beef and imported beef can be determined. There is no research on this. In addition, there is a problem that the actual inspection also consumes a lot of time and money compared to the vast amount of imported quantity to determine the age of beef.

따라서, 시간과 비용을 줄일 수 있으면서 도축된 이후의 소고기의 월령을 판별할 수 있는 과학적인 방법에 대한 연구의 필요성이 요구되고 있다.Therefore, there is a need for research on a scientific method for determining the age of beef after slaughter while reducing time and cost.

이에 본 발명자들은 본 발명자들은 도축된 이후의 소고기의 월령을 필드에서 간편히 판별할 수 있는 방법에 대해 연구하던 중, p21 단백질이 30개월 미만의 소고기 근육조직에서는 높게 발현됨을 확인하였고, 이를 SPR 키트화 함으로써 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the inventors of the present invention, while studying the method of the present inventors can easily determine the age of beef after slaughter in the field, it was confirmed that the p21 protein is highly expressed in beef muscle tissue less than 30 months, SPR kitization By this, the present invention was completed.

따라서 본 발명의 목적은 항 p21 항체 및 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide an SPR kit for determining the age of beef, comprising an anti-p21 antibody and a PBS sample buffer.

본 발명의 다른 목적은 (a)소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키는 단계; (b)상기 균질화된 시료를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시키는 단계; 및 (c)SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 소고기 월령 판별 방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention comprises the steps of (a) homogenizing the sample age determination of beef in PBS buffer; (b) contacting the homogenized sample with a metal thin film to which an anti-p21 antibody is attached; And (c) to provide a beef age determination method comprising the step of measuring the concentration of p21 in the sample by the SPR method.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항 p21 항체 및 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an SPR kit for determining the age of beef, characterized in that it comprises an anti-p21 antibody and PBS sample buffer.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 (a)소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키는 단계; (b)상기 균질화된 시료를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시키는 단계; 및 (c)SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 소고기 월령 판별 방법을 제공한다.
In order to achieve another object of the present invention (a) a homogenization of the sample to be determined for the age of beef in PBS buffer; (b) contacting the homogenized sample with a metal thin film to which an anti-p21 antibody is attached; And (c) provides a method for determining the age of beef comprising the step of measuring the concentration of p21 in the sample by the SPR method.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 항 p21 항체 및 PBS(Phosphate Buffered Saline) 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR(Surface Plasmon Resonance) 키트를 제공한다.The present invention provides an SPR (Surface Plasmon Resonance) kit for beef age determination, comprising an anti-p21 antibody and a Phosphate Buffered Saline (PBS) sample buffer.

표면 플라즈몬이란 주로 금, 은 등과 같은 귀금속 박막 표면에 존재하는 자유전자의 집단적인 진동을 지칭한다.(간단하게 자유전자의 진동) 외부에서 특정한 파장을 갖는 빛이 금속 박막에 입사되었을 때 빛이 가진 대부분의 에너지가 금속 표면에 존재하는 자유전자로 전달되어, 표면 자유전자의 진동이 발생되는 현상을 플라즈몬 공명 현상이라 한다. 이 경우, 외부에서 볼 때 반사된 빛의 세기가 거의 제로(零)에 가깝다.Surface plasmons refer to the collective vibration of free electrons mainly on the surface of noble metal thin films such as gold and silver (simply free electron vibrations). Most of the energy is transferred to the free electrons present on the metal surface, the vibration of the surface free electrons is called plasmon resonance phenomenon. In this case, the intensity of the reflected light when viewed from the outside is almost zero.

표면 플라즈몬 공명 현상은 일반적으로 프리즘을 사용하여 일으킬 수 있다. 도 4과 같이 금속 박막칩을 반원통 프리즘에 올려놓고, 입사각도 변화에 따른 반사광 세기를 측정하면 도 5와 같이 입사각도에 대한 반사광 세기 스펙트럼을 얻을 수 있다. 도 5에서 반사광세기가 최소가 될 때의 입사각을 표면 플라즈몬 공명각(줄여서 공명각)이라 한다. 금속박막 표면에 분자가 흡착되면 이 공명각이 증가하게 되는데, 이를 이용하여 금속박막 표면에 흡착된 분자의 양을 분석할 수 있다. Surface plasmon resonance can generally occur using prisms. As shown in FIG. 4, when the metal thin film chip is placed on a semi-cylindrical prism and the reflected light intensity according to the incident angle change is measured, the reflected light intensity spectrum of the incident angle can be obtained as shown in FIG. 5. In Fig. 5, the incident angle when the reflected light intensity is minimum is referred to as surface plasmon resonance angle (reduced resonance angle). When the molecules are adsorbed on the surface of the metal thin film, the resonance angle increases, and the amount of molecules adsorbed on the surface of the metal thin film can be analyzed.

이를 활용하여 시료에 존재하는 목적 물질의 양을 측정할 수 있으며 이는 키트(SPR 키트)의 형태로 제공될 수 있다.This may be used to determine the amount of the target substance present in the sample, which may be provided in the form of a kit (SPR kit).

일반적으로 SPR 키트에는 항체, 링커분자, 금속박막 및 시료의 처리 및/또는 반응을 위한 버퍼가 포함된다. SPR kits generally include buffers for the treatment and / or reaction of antibodies, linker molecules, metal thin films and samples.

항체는 목적 물질, 예를 들어 항원을 검출하기 위한 목적으로 사용되며, 목적 물질의 종류에 따라서 다양하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있으며, 본 발명의 SPR 키트는 p21을 검출하기 위한 것이므로 바람직하게는 항-p21 항체일 수 있다.
The antibody is used for the purpose of detecting a target substance, for example, an antigen, and may be used in various ways depending on the type of target substance. By "antibody" is meant herein a specific protein molecule directed against the antigenic site. Antibodies used in the present invention include monoclonal or polyclonal antibodies, immunologically active fragments (eg, Fab or (Fab) 2 fragments), antibody heavy chains, humanized antibodies, antibody light chains, genetically engineered single chain Fv molecules, Chimeric antibodies and the like, and the SPR kit of the present invention is for detecting p21, and may preferably be an anti-p21 antibody.

p21은 cyclin-dependent kinase inhibitor 1 (또는 CDK-interacting protein 1)으로 알려져 있는 단백질로, cyclin-CDK2 또는 CDK4 복합체에 결합하여 이의 작용을 저해하는 활성을 가져 G1 단계에서의 cell cycle 진행의 조절자 역할을 하는 단백질이다. 본 발명에서 p21은 소에서 30개월 전후의 발현 변화가 크게 나타나는 특징이 있으며, 본 발명의 p21은 바람직하게는 소 p21로 Genbank Accession No.가 NM_001098958인 것일 수 있다.
p21, a protein known as cyclin-dependent kinase inhibitor 1 (or CDK-interacting protein 1), binds to and inhibits the action of cyclin-CDK2 or CDK4 complexes and acts as a regulator of cell cycle progression in the G1 phase. It is a protein. In the present invention, p21 is characterized by a large expression change around 30 months in the bovine, p21 of the present invention is preferably bovine p21 Genbank Accession No. may be NM_001098958.

링커분자는 SPR 측정을 위하여 금속 박막에 항체를 결합시키기 위한 목적으로 사용된다. 본 발명에서 링커분자는 항-p21 항체를 금속박막에 부착시키기 위한 것이라면 제한없이 사용이 가능하여, 예를 들어, Protein G (Cys-Protein G), SAM(self assembled monolayer)이 사용될 수 있다.
The linker molecule is used for the purpose of binding the antibody to the metal thin film for SPR measurement. In the present invention, the linker molecule may be used without limitation as long as it is for attaching the anti-p21 antibody to the metal thin film. For example, Protein G (Cys-Protein G) or SAM (self assembled monolayer) may be used.

금속박막은 SPR 측정에 사용가능한 것이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 금박막, 은박막, 구리박막, 백금박막, 알루미늄 박막일 수 있다.
The metal thin film can be used without limitation as long as it can be used for the SPR measurement, but preferably may be a gold thin film, silver thin film, copper thin film, platinum thin film, aluminum thin film.

시료의 처리 및/또는 반응을 위한 버퍼는 PBS가 바람직하며, 이는 p21의 SPR 측정방법에 따른 검출을 위해서 필수적으로 필요하다. PBS(phosphated buffered saline) buffer는 당업계에 공지된 통상의 조성 (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM) 또는 이의 용인가능한 오차(상하오차 각각 5% 내) 범위내의 buffer 조성물을 나타낸다.
The buffer for processing and / or reaction of the sample is preferably PBS, which is necessary for the detection according to the SPR measuring method of p21. PBS (phosphated buffered saline) buffer is a conventional composition known in the art (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na 2 HPO 4 10 mM, KH 2 PO 4 2 mM) or its tolerable error (5% top and bottom error respectively) Buffer composition within the range).

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있으며, 바람직하게는 조직, 보다 바람직하게는 근육조직일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있으며, 가장 바람직하게는 소로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
The term "biological sample" or "sample" as used herein includes solid tissue samples such as blood and other liquid samples of biological origin, biopsy samples, tissue cultures or cells derived therefrom. More specifically, for example, but not limited to, tissues, extracts, cell lysates, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, peritoneal fluid, and the like, are preferred. Preferably tissue, more preferably muscle tissue. The sample can be obtained from an animal, preferably a mammal, and most preferably from a cow. The sample may be pretreated before use for detection. For example, it may include homogenization, filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interference components, addition of reagents, and the like.

한편, 본 발명의 키트는 미리 제조된 형태로 제공될 수 있으며, 예를 들어, 항-p21 항체 및 이와 결합된 링커분자가 코팅된 금속박막 및 PBS 시료 버퍼를 포함할 수 있다.On the other hand, the kit of the present invention may be provided in a pre-prepared form, for example, may include a metal thin film and PBS sample buffer coated with an anti-p21 antibody and a linker molecule bound thereto.

PBS 시료버퍼는 측정의 대상이 되는 시료를 균질화 등을 통해 측정가능한 시료화할 수 있으며, 이를 상기 항-p21 항체 및 이와 결합된 링커분자가 코팅된 금속박막이 장착된 SPR 기기에서 간편하게 측정하여 소고기 월령 판별을 할 수 있다.
The PBS sample buffer can measure the sample to be measured through homogenization, etc., and it is easily measured in an SPR device equipped with a metal thin film coated with the anti-p21 antibody and a linker molecule bound thereto. Discrimination can be made.

아울러, 본 발명의 키트는 참조(reference)를 위하여 30개월령 미만의 소고기 조직(특히 근육조직)을 PBS를 첨가하여 균질화시킨 것을 포함할 수 있다. 기준월령의 소고기 근육조직과 시료의 p21 함량을 비교하여 소고기 월령 판별을 할 수 있다.
In addition, the kit of the present invention may include homogenizing beef tissue (particularly muscle tissue) of less than 30 months of age by the addition of PBS for reference. Beef monthly determination can be determined by comparing the p21 content of the beef muscle tissue of the reference age.

또한, 본 발명의 키트는 각 SPR 측정 단계마다 사용되는 세척버퍼 (washing buffer)를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게 세척버퍼는 1x PBS일 수 있다.
In addition, the kit of the present invention may further include a washing buffer (washing buffer) used for each SPR measurement step. Preferably the wash buffer may be 1 × PBS.

아울러, 본 발명의 키트는 SPR 기기를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 SPR 기기는 소형화된 기기일 수 있다. SPR 기기는 예를 들어 도 6에서와 같은 측정부를 비롯하여, 시료 전처리 및 로딩부, 시료 이송 채널이 형성되어 있는 시료 이송부, 소고기 월령 판단을 위해 항체가 고정화 되어 있는 SPR 센서부를 포함할 수 있다.
In addition, the kit of the present invention may further include an SPR device, the SPR device may be a miniaturized device. The SPR device may include, for example, a measurement unit as shown in FIG. 6, a sample pretreatment and loading unit, a sample transfer unit in which a sample transfer channel is formed, and an SPR sensor unit in which an antibody is immobilized to determine beef age.

본 발명의 일실시예에서 항체는 항 p21항체가 사용되었고, 링커분자는 Cys3-Protein G, SAM(self assembled monolayer), 금속박막으로는 금박막으로써 골드 칩이 사용되었다.
In an embodiment of the present invention, the antibody was used as an anti-p21 antibody, and the linker molecule was Cys3-Protein G, SAM (self assembled monolayer), and a gold chip was used as a gold thin film as a metal thin film.

소고기 근육조직에서 소고기 특이적 월령 판별용 마커인 p21 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 p21 단백질을 검출하여 소고기의 월령을 판별할 수 있는데 (대한민국특허 제10-1047455호 참조) SPR에 적용시키기 위해서는 시료의 전처리가 필요하다.
The age of beef can be determined by detecting p21 protein through an antigen-antibody combining reaction using an antibody that specifically binds to p21 protein, a marker for determining the specific age of beef, in beef muscle tissue (Korea Patent No. 10-1047455) Sample pretreatment is required for application to SPR.

본 발명에서 SPR 측정에 적용시키기 위해 PBS 버퍼를 이용해 전처리를 하였다. 본 발명에서 사용한 PBS 버퍼는 1x PBS 버퍼로 1L 증류수에 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4를 첨가하고, HCl로 pH를 7.4로 조절한 것을 사용하였고, 추가로 상용의 단백질 저해제 혼합액 (protease inhibitor cocktail)을 첨가한 것을 사용하였다. 전처리는 소 조직, 특히 근육 조직이 포함된 조직에 5배 내지 20배(w/w)의 PBS 버퍼를 첨가하여 homogenator를 이용해 조직을 곱게 갈고, 0 내지 5℃에서 10분 내지 30분간 incubation 시킨 후 4℃, 원심분리하여 상층액만 따내서 일정량의 단백질 함량을 가지도록 각 시료를 표준화(normalized)한 것을 사용할 수 있다. 상기에서 incubation은 생략될 수 있고, 원심분리 대신 필터링 등을 통해 시료를 전처리할 수 있다.
In the present invention it was pretreated using a PBS buffer to apply to the SPR measurement. The PBS buffer used in the present invention was added with 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na 2 HPO 4 , 0.24 g KH 2 PO 4 in 1 L distilled water, and adjusted the pH to 7.4 with 1 × PBS buffer. In addition, the addition of a commercial protein inhibitor cocktail (protease inhibitor cocktail) was used. Pretreatment was performed by adding 5 to 20 times (w / w) PBS buffer to small tissues, especially muscle tissues, and grinding the tissue finely using a homogenator and incubating at 0 to 5 ° C for 10 to 30 minutes. After centrifugation at 4 ° C., only the supernatant was extracted, and each sample was normalized to have a predetermined amount of protein content. Incubation may be omitted in the above, and the sample may be pretreated by filtering instead of centrifugation.

즉, 본 발명의 일비교예에서는 상기 SPR 키트가 소 개월별 p21농도를 측정할 수 있는지 여부를 알아보기 위하여 골드칩을 SPR 키트에 고정하였다. 골드칩 위에 항 p21항체를 고정하기 위하여 Cys3-Protein G를 고정화 하고 골드표면의 비특이적 흡착을 없애기 위하여 BSA를 이용하여 처리 하였다. 그 후, 항 p21항체를 Cys3-Protein G 위에 고정시키고 20개월, 35개월, 47개월 소 시료를 주입하여 SPR의 RU변화를 비교하였다. 또한, 가장 중요한 변별력이 필요한 28개월, 35개월 소 시료를 주입하여 비교 분석하였다. 그 결과 개월별 소 시료는 분별력이 없었다. 이유로 정제되지 않은 소 시료 안에는 다양한 종류의 단백질들을 포함하고 있기 때문이었다.
That is, in one comparative example of the present invention, the gold chip was fixed to the SPR kit to determine whether the SPR kit can measure the p21 concentration for each month. Cys3-Protein G was immobilized to immobilize the anti-p21 antibody on the gold chip and treated with BSA to eliminate the nonspecific adsorption of the gold surface. Thereafter, anti-p21 antibody was immobilized on Cys3-Protein G, and bovine samples were injected for 20 months, 35 months, and 47 months to compare RU changes of SPR. In addition, a small sample of 28 months and 35 months, which requires the most important discrimination, was injected and analyzed. As a result, the monthly bovine sample was not discernible. The reason is that the bovine sample contains many different types of protein.

이에 비해서, 본 발명의 일실시예에서는 상기 SPR 키트가 소 개월별 p21농도를 측정할 수 있는지 여부를 알아보기 위하여 골드칩을 SPR 키트에 고정하고 PBS 버퍼로 준비한 27개월, 31개월 소 시료를 각 채널에 주입하고 SPR의 RU 변화를 비교, 분석 하였다. 그 결과, 도 3에서 보듯이, 30개월이 안되는 소 시료는 p21의 농도가 증가하는 분별력을 확인 하였다.
In contrast, in one embodiment of the present invention, in order to determine whether the SPR kit can measure the p21 concentration for each small month, a 27 month and 31 month small sample prepared by fixing the gold chip in the SPR kit and prepared with PBS buffer, respectively. Injected into the channel and analyzed for RU changes in SPR. As a result, as shown in Figure 3, the small sample less than 30 months confirmed the discrimination ability to increase the concentration of p21.

또한, 본 발명은 (a)소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키는 단계; (b)상기 균질화된 시료를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시키는 단계; 및 (c)SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 소고기 월령 판별 방법을 제공한다.
In addition, the present invention comprises the steps of (a) homogenizing the sample of the age determination of beef in PBS buffer; (b) contacting the homogenized sample with a metal thin film to which an anti-p21 antibody is attached; And (c) provides a method for determining the age of beef comprising the step of measuring the concentration of p21 in the sample by the SPR method.

본 발명의 방법을 단계별로 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.When explaining the method of the present invention in more detail step by step as follows.

(a)단계는 소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키는 단계이다.Step (a) is a step of homogenizing the sample to be determined the age of beef in PBS buffer.

본 발명에서 SPR 측정에 적용시키기 위해 PBS 버퍼를 이용해 전처리를 하였다. 전처리는 소 조직, 특히 근육 조직이 포함된 조직에 5배 내지 20배(w/w)의 PBS 버퍼를 첨가하여 homogenator를 이용해 조직을 곱게 갈고, 고형물을 제거한 것을 사용할 수 있다.In the present invention it was pretreated using a PBS buffer to apply to the SPR measurement. Pretreatment may be used to finely grind the tissue using a homogenator and remove solids by adding 5 to 20 times (w / w) PBS buffer to small tissues, particularly tissues containing muscle tissue.

보다 구체적으로 전처리는 소 조직, 특히 근육 조직이 포함된 조직에 5배 내지 20배(w/w)의 PBS 버퍼를 첨가하여 homogenator를 이용해 조직을 곱게 갈고, 0 내지 5℃에서 10분 내지 30분간 incubation 시킨 후 원심분리하여 상층액만 따내는 등 고형물을 제거한 것을 사용할 수 있다. 고형물의 제거는 공지된 다른 방법, 예를 들어, 필터처리 등에 의해서 수행될 수도 있다. More specifically, pretreatment is performed by adding 5-fold to 20-fold (w / w) PBS buffer to small tissues, particularly tissues containing muscle tissue, to finely grind the tissue using a homogenator, and 10 to 30 minutes at 0 to 5 ° C. After incubation, centrifugation can be used to remove solids, such as to extract only the supernatant. Removal of the solids may be performed by other known methods, for example, by filter treatment.

본 발명에서 시료의 준비는 일정량의 단백질 함량을 가지도록 각 시료를 표준화(normalized)한 것을 사용할 수 있으나, 유사한 부위 (조직)에 대해서 거의 동일한 질량의 시료를 대상으로 전처리함으로써 표준화 과정을 생략할 수도 있으며, 이는 본 발명의 p21을 SPR 방법에 적용시킴으로써 필드에서 간단하게 월령 판별을 할 수 있게 해 준다.
In the present invention, the preparation of the sample may be a normalized (normalized) of each sample to have a certain amount of protein content, but the standardization process may be omitted by pre-treatment of a sample of almost the same mass for a similar site (tissue). This makes it possible to easily determine the age of the month in the field by applying the p21 of the present invention to the SPR method.

(b)단계는 (a)단계에서 균질화된 시료를 항 p21항체가 부착된 금속박막과 접촉 시키는 단계이다. SPR 분석을 위해서, 금속박막에 부착된 항체에 marker가 되는 시료 내 단백질이 결합되도록 해야 한다. 이 때 금속박막은 바람직하게는 금, 은등과 같은 귀금속 박막일 수 있으며, 더 바람직하게는 골드칩 일 수 있다. 금속박막에의 항체의 부착은 링커 분자에 의해서 매개된다. 시료와 항체와의 반응은 반응 버퍼 내에서 이루어지는데 본 발명의 일비교예에서와 같이 Tris 버퍼를 이용한 경우는 시료간의 분별력이 없는 결과가 나온 반면, 본 발명의 일실시예에서와 같이 PBS버퍼를 이용한 경우는 시료간의 분별력이 있는 결과를 얻었다.
Step (b) is a step of contacting the sample homogenized in step (a) with a metal thin film to which the anti-p21 antibody is attached. For SPR analysis, the protein in the sample to be bound should be bound to the antibody attached to the metal thin film. In this case, the metal thin film may be preferably a noble metal thin film such as gold or silver, and more preferably, a gold chip. The attachment of the antibody to the metal thin film is mediated by linker molecules. The reaction between the sample and the antibody is carried out in the reaction buffer. In the case of using the Tris buffer as in the comparative example of the present invention, there was no discrimination between the samples, whereas the PBS buffer was used as in the embodiment of the present invention. In the case of the use, results with discrimination between samples were obtained.

(c)단계는 (b)단계에서 상기 균질화된 시료가 접촉한 항 p21 항체가 부착된 금속박막을 반원통 프리즘에 올려놓고, 입사각도 변화에 따른 반사광 세기를 측정하여 입사각도에 대한 반사광 세기 스펙트럼을 얻었다. 금속박막 표면에 분자가 흡착되면 공명각이 증가하게 되는데, 이를 이용하여 금속박막 표면에 흡착된 분자의양, 즉 p21의 농도를 측정하였다.
In step (c), the anti-p21 antibody-coated metal thin film contacted with the homogenized sample is placed on a semi-cylindrical prism, and the reflected light intensity spectrum of the incident angle is measured by measuring the reflected light intensity according to the incident angle change. Got. When the molecules are adsorbed on the surface of the metal thin film, the resonance angle increases. The amount of molecules adsorbed on the surface of the metal thin film, that is, the concentration of p21 was measured.

따라서, 본 발명은 소고기 월령 판별용 SPR 키트 또는 소고기 월령 판별 방법을 제공한다. 본 발명의 소고기 월령 판별용 SPR 키트를 사용하는 경우, p21의 농도를 측정하여 30개월 미만의 소고기를 효과적으로 선별해낼 수 있어 소고기의 월령을 판별하는 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the present invention provides a beef month age determination SPR kit or beef age determination method. In the case of using the SPR kit for determining the monthly age of the beef, by measuring the concentration of p21 can be effectively selected for less than 30 months can be useful for the purpose of determining the age of beef.

도 1은 실시예 1의 실험군의 RU변화 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1의 대조군의 RU변화 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2의 RU변화 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4 및 도 5는 표면 플라즈몬 공명 현상의 분석원리를 나타낸 것이다.
도 6은 회전거울을 이용한 레이저 광원의 변조를 나타낸 것이다.
도 7은 초소형 SPR 바이오칩 분석시스템 상용화 제품을 나타낸 것이다.Figure 1 shows a comparison of the RU change results of the experimental group of Example 1.
Figure 2 shows the comparison of the RU change results of the control of Example 1.
Figure 3 shows the comparison of the RU change results of Example 2.
4 and 5 show the analysis principle of the surface plasmon resonance phenomenon.
6 shows modulation of a laser light source using a rotating mirror.
Figure 7 shows the miniature SPR biochip analysis system commercialized products.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 실시하기 위하여 제시된 하나의 예시일 뿐이며, 하기의 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are only examples given to practice the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.

<< 비교예Comparative example 1> 1>

Tris buffer를 이용한 p21 SPR 키트 개발P21 SPR kit development using Tris buffer

골드칩을 피라나 용액(황산:과산화수소=3:1)을 이용하여 깨끗하게 처리 후 3차 증류수를 이용하여 닦아내고, 질소가스를 이용하여 건조 후 카트리지를 이용하여 SPR 장비에 고정하였다. 1X PBS를 이용하여 장비 안정화를 한 후 Cys3-Protein G를 주입하여 칩 표면에 고정한 후 1X PBS를 이용하여 세척했다. BSA를 이용하여 노출되어 남아있는 골드 칩 표면을 막고, Tris buffer를 이용하여 기준 신호를 잡았다. Antibody를 이용하여 Cys3-Protein G위에 고정한 후 1X PBS를 이용하여 세척하였다. 20개월, 35개월, 47개월 소 시료를 각 채널에 주입하고 SPR의 RU 변화를 측정하여 데이터를 비교, 분석 하였다.
Gold chips were treated with Pirana solution (sulfuric acid: hydrogen peroxide = 3: 1) and then wiped off with tertiary distilled water, dried with nitrogen gas and fixed with SPR equipment using a cartridge. After stabilizing the equipment using 1X PBS, Cys3-Protein G was injected and fixed on the chip surface, and then washed with 1X PBS. BSA was used to block the remaining gold chip surface and Tris buffer was used to capture the reference signal. It was fixed on Cys3-Protein G by using Antibody and washed with 1X PBS. 20 months, 35 months, 47 months bovine samples were injected into each channel, and RU changes in SPR were measured to compare and analyze the data.

상기에서 소시료는 연령별로 시료를 채취하여 -70℃에서 보관후 사용하였다. 시료의 준비를 위해서, 소 조직 0.1g에 1M Tris-HCl(pH 8.0) 1ml 넣고 homogenator를 이용해 조직을 곱게 갈아주고, ice에서 20분간 incubation 시켰다. 이를 4℃, 13,000rpm에서 20분 동안 원심분리 한 후 상층액만 따내서 단백질 농도를 측정하여 각 샘플의 최종 농도를 1μg/μl로 맞춘 것을 사용하였다.
In the above sample was collected by age and stored at -70 ℃ was used. To prepare the sample, 1 ml of 1M Tris-HCl (pH 8.0) was added to 0.1 g of small tissue, and the tissue was finely ground using a homogenator and incubated for 20 minutes on ice. After centrifugation at 4 ° C. and 13,000 rpm for 20 minutes, only the supernatant was extracted and the protein concentration was measured to adjust the final concentration of each sample to 1 μg / μl.

그 결과, 도 1에서 보듯이 35개월이 넘어가는 소 시료와 30개월이 안되는 소 시료의 분별력이 없었다.
As a result, as shown in Figure 1 there was no discrimination between the bovine sample over 35 months and the bovine sample less than 30 months.

<비교예 2>Comparative Example 2

TrisTris bufferbuffer 를 이용한 Using p21p21 SPRSPR 키트Kit 개발 Development

골드칩을 피라나 용액(황산:과산화수소=3:1)을 이용하여 깨끗하게 처리 후 3차 증류수를 이용하여 닦아내고, 질소가스를 이용하여 건조 후 카트리지를 이용하여 SPR 장비에 고정하였다. 1X PBS를 이용하여 장비 안정화를 한 후 Cys3-Protein G를 주입하여 칩 표면에 고정한 후 1X PBS를 이용하여 세척했다. BSA를 이용하여 노출되어 남아있는 골드 칩 표면을 막고, 1X PBS로 세척 하였다. Antibody를 이용하여 Cys3-Protein G위에 고정한 후 1X PBS를 이용하여 세척하였다. 28개월, 35개월 소 시료를 각 채널에 주입하고 SPR의 RU 변화를 측정하여 데이터를 비교, 분석 하였다.
Gold chips were treated with Pirana solution (sulfuric acid: hydrogen peroxide = 3: 1) and then wiped off with tertiary distilled water, dried with nitrogen gas and fixed with SPR equipment using a cartridge. After stabilizing the equipment using 1X PBS, Cys3-Protein G was injected and fixed on the chip surface, and then washed with 1X PBS. The remaining gold chip surface was exposed using BSA and washed with 1X PBS. It was fixed on Cys3-Protein G by using Antibody and washed with 1X PBS. A 28-month, 35-month bovine sample was injected into each channel, and RU changes in SPR were measured to compare and analyze the data.

그 결과, 도 2에서 보듯이 28개월 소 시료와 35개월 소 시료의 분별력이 없었다.
As a result, as shown in FIG. 2, there was no discrimination between the 28-month cow sample and the 35-month cow sample.

상기 비교예 1, 2에서 분별력이 없는 결과가 나온 원인에는 정제 되지 않은 혼합물에서 한 종에 의한 결합을 확인하고자 한 것, 혼합된 단백질들의 비특이적 반응, 그리고 Buffer 선정의 오류가 있다.
In Comparative Examples 1 and 2, the reason for the result of lack of discrimination is to confirm the binding by one species in the unpurified mixture, nonspecific reaction of the mixed proteins, and errors in the selection of the buffer.

<실시예 1>&Lt; Example 1 >

PBS buffer를 이용한 p21 SPR 키트 개발Development of p21 SPR Kit Using PBS Buffer

시료의 전처리를 PBS 버퍼로 사용한 것을 제외하고는 상기 비교예 1과 동일하게 하여 실험을 수행하였다. PBS 버퍼를 이용한 시료의 준비는 다음과 같이 수행하였다: cow 조직 0.1g에 1x PBS 1ml 넣고 homogenator를 이용해 조직을 곱게 갈아준다음 ice에서 20분간 incubation 시켰다. 이를 4℃, 13,000rpm에서 20분 동안 원심분리 한 후 상층액만 따내서 단백질 농도를 측정하여 각 샘플의 최종 농도를 1μg/μl로 맞추어서 사용하였다.
The experiment was carried out in the same manner as in Comparative Example 1 except that the pretreatment of the sample was used as the PBS buffer. Preparation of the sample using PBS buffer was performed as follows: 1x PBS 1ml in 0.1g cow tissue was finely ground using a homogenator and incubated for 20 minutes on ice. After centrifugation at 4 ℃, 13,000rpm for 20 minutes, the supernatant was extracted and the protein concentration was measured to adjust the final concentration of each sample to 1μg / μl.

그 결과, 30개월이 안되는 소 시료는 p21의 농도가 30개월이 경과된 소 시료에 비해 증가되어 있는 것을 측정할 수 있었다.
As a result, it could be determined that the bovine sample of less than 30 months has increased the concentration of p21 compared to the bovine sample of 30 months.

<실시예 2><Example 2>

PEG COOH SAM로 고정한 p21 SPR 키트 개발Development of p21 SPR kit fixed with PEG COOH SAM

PEG COOH SAM[HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH-COOH]을 에탄올에 녹여 1mM 용액을 준비하였다. 상기 비교예 1에서와 같이 세척한 골드 칩을 준비한 SAM 용액에 12시간 이상 담근 후 SAM으로 표면 처리 된 골드 칩을 3차 증류수를 이용하여 세척하고 질소가스를 이용하여 건조 후 카트리지를 이용 SPR 장비에 고정하였다. 1X PBS를 이용하여 장비 안정화를 한 후 3차 증류수에 각각 녹인 0.4M EDC(N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) 용액과 0.1M NHS(N-Hydroxysuccinimide) 용액을 1:1로 혼합하여 주입하였다. 1X PBS를 이용하여 세척 후 10mM sodium acetate (pH 5) 용액을 이용하여 희석한 Antibody 용액을 주입하여 고정화 하였다. 1X PBS를 이용하여 세척 후 3차 증류수에 녹인 1M ethanolamine 용액을 이용하여 골드 표면 위에 남아있는 NHS 부분을 치환 하였다. 1X PBS를 이용하여 세척한 후 27개월, 31개월 소 시료 (상기 실시예 1과 동일하게 준비)를 각 채널에 주입하고 SPR의 RU 변화를 비교, 분석 하였다.
PEG COOH SAM [HS- (CH 2 ) 11- (OCH 2 CH 2 ) 6 -OCH-COOH] was dissolved in ethanol to prepare a 1 mM solution. After dipping in the SAM solution prepared for the gold chip washed as in Comparative Example 1 for 12 hours or more, the gold chip surface-treated with SAM was washed with tertiary distilled water and dried using nitrogen gas, and then used in the SPR equipment using the cartridge. Fixed. After stabilization of the equipment using 1X PBS, 0.4M EDC (N-Ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) solution and 0.1M NHS (N-Hydroxysuccinimide) solution dissolved in tertiary distilled water It was injected by mixing. After washing with 1X PBS, the solution was immobilized by injecting a diluted Antibody solution using a 10 mM sodium acetate (pH 5) solution. After washing with 1X PBS, 1M ethanolamine solution dissolved in tertiary distilled water was used to replace the remaining NHS portion on the gold surface. After washing with 1X PBS, a 27-month, 31-month small sample (prepared in the same manner as in Example 1) was injected into each channel, and the RU change of SPR was compared and analyzed.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 30개월이 안되는 소 시료는 p21의 농도가 증가하는 분별력을 확인 하였다.
As a result, as shown in Figure 3, the small sample less than 30 months confirmed the discrimination ability to increase the concentration of p21.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 소고기 월령 판별용 SPR 키트 또는 소고기 월령 판별 방법을 제공한다. 본 발명의 소고기 월령 판별용 SPR 키트를 사용하는 경우, p21의 농도를 측정하여 30개월 미만의 소고기를 효과적으로 선별해낼 수 있어 소고기의 월령을 판별할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 높다.As described above, the present invention provides a method for determining beef age or SPR kit for determining beef age. When using the SPR kit for determining the age of beef of the present invention, by measuring the concentration of p21 can be effectively screening beef less than 30 months to determine the age of beef can be industrially high availability.

Claims (4)

SPR 키트에 있어서, 항-p21 항체 및 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트.
The SPR kit, characterized in that the anti-p21 antibody and PBS sample buffer SPR kit for determining the age of beef.
항-p21 항체 및 이와 결합된 링커분자가 코팅된 금속박막 및 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트.
Anti-p21 antibody and a linker molecule coupled to the SPR kit for determining the age of beef, characterized in that it comprises a metal film coated with a PBS sample buffer.
제1항 또는 제2항에 있어서, PBS를 첨가하여 균질화시킨 30개월령 미만의 소고기 근육조직을 추가로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트.
The SPR kit for determining beef age according to claim 1 or 2, further comprising beef muscle tissue of less than 30 months old homogenized by adding PBS.
(a)소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키는 단계;
(b)상기 균질화된 시료를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시키는 단계; 및
(c)SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 소고기 월령 판별 방법.(A) homogenizing the sample to be determined the age of beef in PBS buffer;
(b) contacting the homogenized sample with a metal thin film to which an anti-p21 antibody is attached; And
(C) method of determining the age of beef comprising the step of measuring the concentration of p21 in the sample by the SPR method.
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