KR20130053647A - 순차적 산­염기 전처리를 통한 셀룰로즈 함량이 증가된 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스의 제조방법 - Google Patents

순차적 산­염기 전처리를 통한 셀룰로즈 함량이 증가된 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 팜 열매 껍질 섬유질(Empty Palm Fruit Bunch Fiber)을 산-염기로 순차적으로 전처리 하여, 헤미셀룰로오즈(hemicellulose) 및 리그닌(lignin) 성분이 최소화되고, 셀룰로오즈의 함량이 증가된 바이오매스를 제조하는 방법 및 상기 제조된 바이오매스를 발효시켜 에탄올을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명을 통해 헤미셀룰로오스와 리그닌 함량이 낮고 셀룰로오스 함량이 높은 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스를 얻을 수 있으며, 상기 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스를 효모를 이용하여 발효시켜 고수율의 에탄올을 얻을 수 있다.

Description

순차적 산­염기 전처리를 통한 셀룰로즈 함량이 증가된 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스의 제조방법 {Method for Producing Biomass from Empty Palm Fruit Bunch Fiber with High Cellulose Content Through a Sequential Acidic-/Alkali-pretreatment Procedure}
본 발명은 팜 열매 껍질 섬유질(Empty Palm Fruit Bunch Fiber)을 산-염기로 순차적으로 전처리 하여, 헤미셀룰로오즈(hemicellulose) 및 리그닌(lignin) 성분이 최소화되고, 셀룰로오즈의 함량이 증가된 바이오매스를 제조하는 방법 및 상기 제조된 바이오매스를 발효시켜 에탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 국제적으로 고유가가 지속되면서 석유를 대체할 차세대 에너지원으로 주목받고 있는 바이오에너지(bioenergy)는 에너지원이나 산업적 소재에 사용되는 식물 및 농작물, 동물 배설물, 생물성 폐기물 등의 바이오매스를 연소 또는 생물학적 처리공정을 통해 제조한 연료로, 바이오에탄올, 바이오디젤, 바이오가스, 바이오수소가 대표적이다.
그 중, 그린 에너지(green energy) 혹은 달콤한 에너지(sweet energy)로 불리는 바이오에탄올은 옥수수, 사탕수수, 밀, 감자, 보리 등 녹말작물을 발효시켜 만들어지고, 석유자원과 달리 재생이 가능하며, 공해나 온실가스의 다량방출 염려가 없는 청정에너지라는 점에서 크게 각광받고 있으며, 현재 바이오에너지 중 바이오디젤과 더불어 수송용 연료로 가장 각광받고 있다.
이전에는 톱밥이나 폐목재 조각을 압축해 칩이나 펠릿형태로 만들어 연료로 사용하는 개발이 이어졌으나, 낮은 열량과 높아진 단가 때문에 원료에 대한 시각을 넓히면서, 최근 주목받는 것은 팜나무의 부산물이다.
팜은 말레이시아와 인도네시아 등 적도를 중심으로 식재 된지 4∼5년에 연료 수확을 시작해 10∼20년 연간생산량이 최대가 되며, 20년 이후에는 연간 생산량이 감소되기 시작하므로 25년생 정도에서 도태시키는 식물로 연중 1억 톤 이상의 열매가 생산된다. 팜나무는 연중 내내 지표를 피복하고 있으므로 토양 침식이 거의 없으며 단위 면적당 탄소 저장을 열대림보다 더 많이 하고 있으므로 탄소 배출권, 탄소세 등 탄소 관련 국제 환경문제에서 주목받고 있다.
팜에서 발생하는 부산물은 다양하게 바이오 연료로 개발되고 있으며, 일부 개발된 바이오 연료는 6천㎉/㎏ 이상의 열량이 나와 석탄 대체용으로도 검토되고 있다. 말레이시아의 2008년 기준 팜오일(Crude Palm Oli) 생산량은 연간 1천773만 톤으로 하루 생산량은 4만8천570톤으로 계산되며, 100톤의 팜 열매로 오일을 짤 경우 25톤 정도의 팜 관련 오일들이 생산되는데, 오일을 짜고 난 부산물들은 그동안 비료로 사용됐거나 아니면 폐기된다.
착유공정 중 생기는 부산물은 팜 열매 껍질 섬유질(palm oil empty fruit bunch fiber), 팜커널껍질(palm kernel shell), 팜커널박(palm kernel cake), 팜공장폐수(POME)가 있다. 또한 주기적으로 오일팜 나무의 생장을 위해 줄기 아랫부분에서 제거한 잎(frond)과 수명이 오래되어 잘라내는 나무(trunk)까지 합치면 말레이시아 전체에서 생산되는 팜 부산물의 양은 국내 총생산 바이오매스 가용량의 13배에 이른다.
팜 열매 껍질 섬유질(palm oil empty fruit bunch fiber) 바이오매스는 평균 5-10cm의 길이로 엉겨있는 상태로 존재하며, 이러한 특성은 전단응력(shear stress)을 제공하여 바이오에탄올 발효 시 수분 함수량이 증가하게 되면, 강한 전단응력으로 발효기(fermentor) 내에 회전축(impellor)의 가동에 부하를 준다. 따라서 10% (w/v) 이상의 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스를 이용하는데 장애가 있어 섬유질의 길이를 잘게 세절하는 물리적 전처리 과정이 필요하다.
또한, 팜 열매껍질 섬유질은 100g 당 30-40% 셀룰로오즈, 20-25% 헤미셀룰로오즈, 25-30% 리그린을 포함하고 있어, 셀룰레이즈와 효모 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 효소 당화 발효 과정 시, 리그닌과 강하게 결합하고 있는 셀룰로오즈 및 헤미셀룰로오즈의 해리를 위해 화학적 전처리 과정을 통해 바이오매스 조직을 이완시키는 과정이 요구됨. 바이오매스의 특성에 따라 물리, 화학적인 다양한 방법이 사용되고 있으며 (Volynets and Dahman, International Journal of Energy and Environment 2:427, 2011), 팜 열매 껍질 섬유질의 경우 산 처리 방법(Yunus et al., Bioresource Technology 101:9792, 2010)이 있긴 하나 알칼리 처리 방법 중에서 암모니아 (Lau et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 162: 1847, 2010), 수산화나트륨(Han et al., Journal of Chemical Technology and Biotechnology 86:1527, 2011; Piarpuzan et al ., Biomass and Bioenergy 35:1130, 2011; Hamzah et al ., Biomass and Bioenergy 35: 1055, 2011) 등이 사용되고 있으며, 이중 수산화나트륨을 사용한 방법이 바이오매스에서 리그닌 제거(delignification)에 탁월한 효과를 보여준다고 알려져 있다 (Silverstein et al., Bioresource Technology 98:3000, 2007). 하지만 수산화나트륨을 사용한 전처리 방법의 경우, 헤미셀룰로오즈 성분이 바이오매스에서 제거되지 않고 바이오매스에 보존되는 특성이 있으며, 전처리 후 바이오매스에서 알칼리성분을 제거하는 과정에서 리그닌을 포함한 다량의 알칼리 폐수를 발생한다.
헤미셀룰로오즈 성분이 바이오매스에 보존되는 알칼리 전처리 된 팜 열매 껍질 섬유질을 효소-당화 발효시키게 되면, 헤미셀룰로오즈의 구성 성분인 비발효 당인 자일로스가 효모의 대사과정에 의해 에탄올 발효 과정에 소모되지 않기 때문에 에탄올 발효 과정 중에 배지에 축척 되어 효소 당화 및 에탄올 발효에 저해 작용을 가져오게 된다.
팜오일 부산물인 팜 열매 껍질 섬유질을 이용한 방법에 관한 선행기술로는 활성탄 및 바이오탄 제조방법에 관한 기술(한국특허공개 10-2008-0094647, 한국특허공개 10-2010-0118865), 자일리톨 제조방법(한국특허공개 10-2007-0072682), 크실로스 회수방법(한국특허공개 10-2004-0018323), 리그노셀룰로오스 분별방법(한국특허공개 10-2009-0060397), 팜 열매 껍질 섬유질을 이용한 연료생산방법(미국특허공개12/648,483) 등이 있다. 그러나, 본 발명과 같이 순차적인 산-알칼리 전처리 방법을 이용하여 셀룰로오즈의 함량 증대 및 통합적 공정 개발에 대한 사례는 보고된바 없었다.
이에, 본 발명자들은 셀룰로오즈 함량이 증대된 바이오매스를 수득하기 위하여 예의 노력한 결과, 팜 열매 껍질 섬유질을 물리적인 전처리 과정 없이 산-염기를 이용하여 순차적으로 화학적 전처리하는 경우, 단위 건조중량당 5% 미만 헤미셀룰로오즈 70% 이상의 셀룰로오즈 함량을 갖는 팜 열매 껍질 유래 섬유질 바이오매스를 수득할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 헤미셀룰로오즈(hemicellulose) 및 리그닌(lignin) 성분이 최소화되고 셀룰로오즈의 함량의 증가시킨 팜 열매 껍질 섬유질(Empty Palm Fruit Bunch Fiber) 유래 바이오매스를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 팜 열매 껍질 섬유질을 이용해 바이오에탄올을 효과적으로 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 팜 열매 껍질 섬유질을 산 처리하는 단계; 및 (b) 상기 산 처리된 팜 열매 껍질 섬유질을 알칼리로 처리하여 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스를 수득하는 단계를 포함하는 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스를 당화 및 발효시켜 에탄올을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 팜 열매 껍질 섬유질(Empty Palm Fruit Bunch Fiber)을 순차적인 산-염기 화학적 전처리 방법을 통해 헤미셀룰로오즈(hemicellulose) 및 리그닌(lignin) 성분을 최소화하여 상대적으로 팜 열매 껍질 섬유질 단위 중량당 셀룰로오즈의 함량을 증가시킬 수 있으며, 효모를 이용한 효소 당화 에탄올 발효시 비발효 당인 헤미셀룰로오즈의 구성 성분인 자일로스(xylose)와 효소 당화 및 발효 저해산물인 리그닌의 최소화를 통해 바이오에탄올을 효과적으로 생산하기에 유용하다.
도 1은 순차적 산-염기 전처리를 통한 셀룰로오즈 함량이 증가된 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스 생산을 위한 전체적 프로세스를 나타낸 것이다.
도 2는 1차 묽은 황산 전처리, 2차 수산화나트륨 전처리 후 변화되는 팜 열매 껍질 섬유질의 성상을 나타낸 것이다.
도 3은 팜 열매 껍질 섬유질를 1차 산처리를 통해 분획되는 자일로즈를 포함하는 산 처리액내에서의 성분을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 4는 순차적 산-알칼리 처리된 섬유질의 당화 효소 cellulase의 양(10 FPU 및 50 FPU)에 따른 효소 당화 산물 변화 양상을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 5는 셀룰로오즈 함량이 증가된 팜 열매 껍질 섬유질(EPFB fiber)를 이용한 동시당화 발효를 통한 에탄올 생산량을 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 팜 열매 껍질 섬유질을 산 처리하는 단계; 및 (b) 상기 산 처리된 팜 열매 껍질 섬유질을 알칼리로 처리하여 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스를 수득하는 단계를 포함하는 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 건조 팜 열매 껍질 섬유질을 묽은 황산과 수산화나트륨을 이용한 전처리 후 생산되는 최종적 바이오매스, 자일로스 부산물, 리그닌, 세척액으로 사용되는 물(용수)의 양과 단계 별 상세한 반응 조건을 제공하였다(도 1).
팜 열매 껍질 섬유질의 섬유질 바이오매스는 평균 5-10 cm의 길이로 엉겨있는 상태로 존재하며, 이러한 특성은 전단응력(shear stress)을 제공하여 바이오에탄올 발효 시 수분 함수량이 증가하게 되면, 강한 전단응력으로 발효기(fermentor) 내에 회전축(impellor)의 가동에 부하를 준다. 따라서 10% (w/v) 이상의 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스를 이용하는데 장애가 있어 섬유질의 길이를 잘게 세절하는 물리적 전처리 과정이 필요하다.
그러나 본 발명에서는 물리적 전처리 과정 대신 팜 열매 껍질 섬유질을 최적화된 농도인 0.1-8.0%의 묽은 황산을 이용해 산-열처리를 통해 헤미셀룰로오즈 성분을 제거하고, 반응시킨 팜 열매 껍질 섬유질을 물속에 침적시켜 펄프 작업을 통해 팜 열매 껍질 섬유질 조직을 이완시켜 섬유질 조직을 연약하게 하였다.
본 발명의 (a) 단계의 산처리는 100~200℃, 10-20psi에서 10~60분동안 수행하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 일 실시예에서 사용된 팜 열매 껍질 섬유질(empty palm fruit bunch fiber) 바이오매스는 말레이시아 사바주의 현지 팜 오일 공장에서 입수하였으며, 팜 오일 생산 공정에서 나오는 부산물을 사용하였다. 산 처리 전 팜 열매 껍질 섬유질에서 이물질을 제거하기 위하며 세척을 하였으며, 세척 후 50-90℃의 건조기에서 1-3일간을 건조하였다. 건조된 팜 열매 껍질 섬유질을 다른 물질적 처리 없이 200g을 0.1-8.0% 황산용액 1 L에 첨가하여, 완전히 바이오매스가 습식 상태가 되도록 한 후, 고압멸균 장치를 이용하여 반응온도 100-200℃, 압력 10-20 psi에서 10-60분 반응시켰다. 이때 산 가수분해 용액과 바이오매스의 비율을 1:1-1:20이 되도록 하였다. 반응 후 산 처리된 팜 열매 껍질 섬유질를 산 용액에서 회수한 후, 최대한 수분을 제거하여 산 용액과 동일 부피의 증류수에 넣고 1-24 시간 동안 천천히 교반 시킨 후, 다시 바이오매스를 회수 하였다. 회수된 바이오매스는 건조기에서 50-90℃의 건조기에서 1-3일간 수분을 바이오매스로 부터 제거하였다. 건조된 바이오매스의 산 처리후의 성분 변화는 미국 에너지성 산하 국가재생에너지 연구실 (National Renewable Energy Laboratory, NREL)의 chemical analysis and testing laboratory analytical procedures (LAPs)의 방법에 따라 분석하였다.
본 발명은 (a)단계의 부산물로 발생되는 산처리액을 교반하여 자일로스 분획을 회수하는 것을 특징으로 하고 있다.
(a) 단계에서 묽은 황산 전처리시 배출되는 산 용액은 자일로즈가 과량으로 포함되어 있으며, 다시 1차 산 처리 공정에 연속적인 재활용을 통해 산 폐액 내에 자일로즈의 함량 증대를 통해 과량의 자일로즈가 포함된 용액 제조가 가능하다. 또한 펄프 작업에서 배출되는 약산 용액에도 상당량의 자일로즈가 포함되어 있어, 상기 산 폐액과 혼합하여 팜 열매 껍질 섬유질로부터 고농도의 자일로즈 분획 산물을 수득할 수 있다. 수분을 제거한 팜 열매 껍질 섬유질을 2차적으로 10 N 농도의 수산화나트륨 용액에 침적시켜 상온에서 반응시킨 후, 필터링을 통해 다시 고농도의 수산화나트륨을 제거한 팜 열매 껍질 섬유질을 열처리 공정을 통해 리그닌을 제거한다. 열처리된 팜 열매 껍질 섬유질을 연속 세척 작업을 통해 표면에 잔여 알칼리 및 리그닌 성분을 제거한 후, 오븐에서 건조시켜 최종적으로 단위 중량당 헤미셀룰로오즈와 리그닌이 함량이 감소되고 셀룰로오즈 함량이 증가된 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스를 얻을 수 있다.
1차 산처리 및 2차 알칼리 처리 후의 팜 열매 껍질 섬유질의 물리적 표면 및 섬유질 조직의 변화 양상은 육안 및 주사전자현미경(Scanning electronic microscopy, SEM)으로 관찰하였다. 본 발명에 의한 순차적 산-알칼리 연속 처리에 의해 순차적 산-알칼리 처리를 통한 팜 열매 껍질 섬유질은 처리 전에는 1-10cm의 부피가 큰 바이오매스였으나, 처리 후에는 최종적으로 평균 길이가 0.5-1.0 cm 크기로 세절된 형태로 변하는 것을 육안으로 관찰할 수 있었다 (도 2A). 또한 섬유질 형태의 바이오매스의 굵기의 감소가 1차 산처리 및 2차 알칼리 처리에서 관찰되었으며, 육안으로 관찰했을 때도 분명하게 섬유질의 조직이 약하게 되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 더 상세하게 분석하기 위하여 주사현미경으로 처리하지 않는 팜 열매 껍질 섬유질를 대조군으로 1차 산처리 팜 열매 껍질 섬유질 및 2차 알칼리 처리 팜 열매 껍질 섬유질를 실험군으로 관찰한 결과, 전처리 전의 팜 열매 껍질 섬유질의 표면은 분명하고 단단한 섬유질 조직처럼 보이나 1차, 2차 전처리를 거쳐가면서 섬유질 조직 표면이 거칠어지고 조직과 조직 사이에 홈이 생겨나기 시작하면서 거칠어짐이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 표면 변화는 1차 산처리에 보다, 2차 알칼리 처리가 진행됨에 따라 더 가속화 되는 것을 주사현미경을 이용한 표면 관찰을 통해 확인할 수 있었다(도 2B).
즉, 본 발명의 일 실시예에서 순차적 산-알칼리 처리를 통한 팜 열매 껍질 섬유질은 최종적으로 평균 길이가 0.5-1.0 cm 크기로 세절된 형태를 확인하였다.
본 발명의 (b)단계의 알칼리처리는 1~27.8M 수산화나트륨(NaOH)용액을 20~200℃에서 12~100시간동안 수행하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 1차 산 처리된 팜 열매 껍질 섬유질의 건조된 바이오매스를 1-27.8 M 수산화나트륨 용액에 완전히 침적시킨 후, 20-200℃에서 넣고 1-72 시간 동안 천천히 교반 시킨 후, 알칼리 처리된 바이오매스를 회수한 후 바이오매스에 남아있는 수산화나트륨 용액을 체(sieve)를 이용하여 최대한 제거하였다. 수산화나트륨이 코딩 되어 있는 바이오매스를 습식 및 고상 상태로 되도록 한 후, 고압멸균 장치를 이용하여 반응온도 100-200℃, 압력 10-20 psi에서 10-60분 반응시켰다. 반응 후 알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질에 증류수의 비율이 1:1-1:20이 되도록 한 후, 1-5 시간 동안 천천히 교반 시킨후, 이 작업을 수회 반복하여 바이오매스에서 잔여 알칼리 성분 및 바이오매스에 서 용해된 리그닌 성분을 제거하였다. 알칼리 성분 및 리그닌 성분이 제거된 바이오매스를 회수 한 후, 건조기에서 50-90℃의 건조기에서 1-3일간 수분을 바이오매스로 부터 제거하였다.
고농도 수산화나트륨 용액에 침적 및 필터링을 통한 고농도 수산화나트륨 용액의 회수를 통해 수산화나트륨 용액의 재사용이 가능하다. 또한 필터링을 통해 고체상태로 회수된 팜 열매 껍질 섬유질은 표면에 코팅되어 있는 고농도 알칼리용액으로 리그닌 제거를 위해 반 고상 상태로 전처리 되기 때문에, 현재 사용되고 있는 물에 침적 상태로 열처리 하는 방법에 비해 최소한의 물을 사용하여, 전처리 및 세척과정에서 발생하는 과량의 리그닌이 함유된 알칼리성 폐수의 발생량을 저감시킬 수 있다. 또한, 이때 고농도 수산화나트륨 용액 및 세척과정에서 용융되어 있는 리그닌은 활성탄(activated carbon) 컬럼을 이용해 제거 및 분획이 가능하며, 탈리그닌된 탈색 폐수는 1차 전처리 과정 중에서 얻어진 고농도 자일로즈 분획액에서 자일로즈를 회수한 후, 남는 산성 폐액과의 혼합을 통해 중화시킨 후, 이온교환성 수지 및 필터링 과정을 통해 황화나트륨 성분을 제거한 후, 세척액으로 재사용될 수 있다.
1차 묽은 황산을 이용한 산처리와 1차의 고농도 수산화나트륨을 이용한 알칼리 처리에서 확인한 결과를 기초로, 45.7% 셀룰로오즈, 25% 헤미셀룰로오즈, 23% 리그닌을 포함하는 팜 열매 껍질 섬유질 150 g을 1차 산처리 과정으로 4% (v/v) 묽은 황산 용액에 침적시켜 고압멸균 장치를 이용하여 반응온도 121℃, 압력 15 psi에서 60분 반응시켰다. 반응 후 산 처리된 팜 열매 껍질 섬유질와 산 처리 용액을 분리한 후, 산처리 용액을 다시 처리하지 않은 새로운 150 g의 팜 열매 껍질 섬유질를 다시 침적시켜 같은 조건으로 산처리 반응을 수행하였다. 첫번째 산 처리된 섬유질와 두번째 산 처리된 섬유질를 증류수 2 L에 각각를 침적시킨 후, 24시간 동안 천천히 교반 시켜 섬유질 표면 및 내부에 산 처리에 의해 추출 및 산 가수분해되어 나오는 자일로스를 회수 하였다. 회수된 용액 내에서의 자일로스의 성분은 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)를 이용하여 확인하였다 (도 3). HPLC 분석 결과 자일로스(xylose)가 82%, 글루코스(glucose) 4%, 올리고-자일로스(oligo-xylose) 3%, 아세트산(acetate) 3%가 산 처리 용액에 포함되어 있는 것으로 확인되었으며 최종적으로 300g의 팜 열매 껍질 섬유질를 반응시켜 46.4g의 자일로스를 1차 산처리액에서 16.0g 의 자일로스를 증류수 세척액에서 회수할 수 있었다.
상기에서 1차 산 처리한 300 g의 팜 열매 껍질 섬유질를 다시 2차 알칼리 처리를 수행하였다. 산처리 된 바이오매스를 10 N 수산화나트륨 용액에 완전히 침적시킨 후, 상온에서 3 시간 동안 천천히 교반 시킨 후, 알칼리 처리된 바이오매스를 회수한 후 바이오매스에 남아있는 수산화나트륨 용액을 체를 이용하여 최대한 제거하였다. 수산화나트륨이 코딩 되어 있는 바이오매스를 고상 상태로 고압멸균 장치를 이용하여 반응온도 121℃, 압력 15 psi에서 15 분 반응시켰다. 반응 후 알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질에 2 L 증류수를 넣은 후, 교반시켰으며, 이 작업을 4회 반복하여 바이오매스에서 잔여 알칼리 성분 및 바이오매스에서 용해된 리그닌 성분을 제거하였다. 알칼리 성분 및 리그닌 성분이 제거된 바이오매스를 회수 한 후, 건조기에서 90℃의 건조기에서 3일간 수분을 제거하였다. 최종적으로 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스에 포함되어 있는 셀룰로오즈(글루칸), 헤미셀룰로오즈(자일란), 리그닌 성분을 조사한 결과 72%, 1%, 9%로 각각 분석되었다.
상기의 방법으로 제조된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스의 효소 당화반응은 Cellicㄾ CTec2 cellulase (Novozyme)을 이용하여 수행하였다. 순차적 산알칼리 전처리된 바이오매스를 pH 6의 인산완충용액 10% (w/v)가 되도록 주입한 후, 건조 바이오매스 중량을 기준으로 10-50 FPU (Filter Paper Unit)의 Cellicㄾ CTec2 cellulase를 첨가하여, 42℃에서 200 rpm 교반 속도로 48 시간 반응시켰다. 효소 반응 후 생성되는 당화된 글루코스와 자일로스의 양을 HPLC를 이용하여 분석하였다 (도 4A).
순차적 산-알칼리 처리된 바이오매스에서 유리되는 글루코스와 자일로스의 양은 첨가 Cellicㄾ CTec2 cellulase 양에 비례하는 것이 관찰되었다. 건조 전처리된 바이오매스 중량 당 10-50 FPU의 효소를 반응 시켰을 때, 54.1 ± 0.5 g/L에서 84.1 ± 0.8 g/L의 글루코스와 1.1 ± 0.1 g/L에서 1.8 ± 0.1 g/L 자일로스가 생성되는 것을 확인하였다 (도 4B). 이때 당화효율은 61.8%에서 99.7%으로 확인되었다 (도 4C). 효소 반응을 통해 순차적 산-알카리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질는 건조 중량당 2% 미만의 헤미셀룰로오즈를 포함하고 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명은 다른 관점에서, 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스를 당화 및 발효시켜 에탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스의 효소 동시당화를 통한 에탄올 발효효율을 확인하기 위하여, 5 리터 배치 발효기(5 L batch jar-fermentor) R'ALF (Bioengineering AG, Wald, Switzerland)를 사용하여 실제용적 부피(working volume)를 1.5-L로 하여 전처리된 바이오매스 10% (v/w)를 주 탄소원으로, 1% Bacto yeast extract, 2% Bacto peptone를 질소원으로 조성된 배양 배지에 Saccharomyces cereviaise W303-1A를 접종하여 30℃에서 분당 300 rpm의 교반속도로 발효를 수행하였다. 이때 동시당화 발효를 위해 건조 전처리 바이오매스 중량당 10 - 100 FPU Cellic® CTec2 cellulase를 동시에 주입하였다. 발효 효모 S. cerevisiae W303-1A의 동시 당화발효 (Simultaneous saccharification and fermentation, SSF) 시 생산되는 에탄올의 양 (●), 생성되는 포도당 (○) 및 자일로스(▲)의 양의 변화의 변화 (도 5A) 및 에탄올 생산을 위한 동시 당화발효 시 부산물로 생성되는 대사산물인 숙신산(succinate, □), 젓산(lactate, ▲), 초산(acetate, ▽), 글리세롤(glycerol, ◆) (도 5B)을 조사하였다.
각각의 생성물은 refractive index detector (Waters, Milford, MA, USA)와 auto-sampler가 장착된 High-performance liquid chromatography (HPLC) 시스템 (Young-Lin instrument, Anyang, Korea)을 이용하여, 분석 컬럼으로 Rezex ROA-Organic Acid H+ column (7.8 x 300 mm; Rhenomenex, Torrance, CA, USA)와 guard cartridge (KJ0-4282; Rhenomenex, Torrance, CA, USA)가 포함되어 잇는 SecurityGardTM가드컬럼을 이용하여, 컬럼 온도를 65℃로 유지하면서 이동상으로 2.5 mM 황산용액으로 0.6 mL min-1유속으로 하였다. 이때 글루코스, 자일로스, 숙신산, 젖산, 글리세롤, 초산, 에탄올은 각각 t R 19.1 분, t R20.4분, t R24.0분, t R25.5분, t R28.2분, t R29.8분, t R40.1분으로 측정된다.
발효산물의 분석 결과, 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스의 효모를 이용한 동시당화 발효는 37.8 g/L 에탄올이 발효 60시간 후에 생산되었으며, 에탄올 생산성은 단위 건조 전처리 바이오매스당 0.378 그램 에탄올 (0.378 g ethanol/ g dry pretreated biomass)로 확인되었다. 또한 효소 동시당화 발효를 통한 글루코스에 대한 전환율은 단위 그램 글루코스당 0.444 그램 에탄올 (0.444 g ethanol/g glucose)로 확인되었다. 최종적으로 효소당화를 통해 전처리된 바이오매스 내의 전환 가능한 당에 대한 에탄올 발효 수율은 87.1%로 조사되었다. 또한, 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스를 이용한 효모 S. cerevisiae 동시당화 발효에서는 숙신산, 젖산, 글리세롤, 초산이 발효 부산물로 확인이 되었으며, 그 농도는 약 1.4 g/L에서 2.0 g/L 미만으로 측정되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 순차적 산-알칼리 처리를 통한 팜 열매 껍질 섬유질은 최종적으로 평균 길이가 0.5-1.0 cm 크기로 세절된 형태를 가지며, 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스의 효모를 이용한 동시당화 발효는 37.8 g/L 에탄올이 발효 60시간 후에 생산되었으며, 에탄올 발효수율이 87.1%로 나타내었다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 팜 열매 껍질 섬유질 바이오 매스의 1차 산 처리 단계
산 처리 전 팜 열매 껍질 섬유질에서 이물질을 제거하기 위하여 세척을 하였으며, 세척 후 50-90℃의 건조기에서 1-3일간을 건조하였다. 건조된 팜 열매 껍질 섬유질을 다른 물질적 처리 없이 200g을 0.1-8.0% 황산용액 1 L에 첨가하여, 완전히 바이오매스가 습식 상태가 되도록 한 후, 고압멸균 장치를 이용하여 반응온도 100-200℃, 압력 10-20 psi에서 10-60분 반응시켰다. 이때 산 가수분해 용액과 바이오매스의 비율을 1:1-1:20이 되도록 하였다. 반응 후 산 처리된 팜 열매 껍질 섬유질를 산 용액에서 회수한 후, 최대한 수분을 제거하여 산 용액과 동일 부피의 증류수에 넣고 1-24 시간 동안 천천히 교반 시킨 후, 다시 바이오매스를 회수 하였다. 회수된 바이오매스는 건조기에서 50-90℃의 건조기에서 1-3일간 수분을 바이오매스로 부터 제거하였다.
팜 열매 껍질 섬유질 100g 당 (건조 중량) 묽은 황산 농도에 따른 팜 열매 껍질의 셀룰로오즈, 헤미셀룰로오즈, 리그닌의 3성분 변화와 리그닌 제거 효율(delignification)을 표 1에 나타내었다. 0.1~8% 농도의 묽은 황산으로 전처리한 결과 최대 31.9%의 리그닌을 제거하는 효과를 확인하였다.
1차 묽은 황산 전처리 후 팜 열매 껍질 섬유질(EPFB fiber)의 셀룰로오즈, 헤미셀룰로오즈, 리그닌의 성분 변화
묽은 황산 구성/ 팜 열매 껍질 섬유질 100g 탈리그닌
(%) 가용성 (%) 불가용성 (%) 셀룰로오즈 (g) 헤미셀룰로오즈 (g) 리그닌 (g) (%)
전처리하지 않은 팜 열매껍질 - 100.0 36.3 18.7 30.6 -
0.0 17.9 82.1 37.5 17.2 28.2 7.7
0.1 19.1 80.9 39.5 16.2 27.1 11.3
0.5 30.2 69.8 37.1 9.2 26.2 14.3
1.0 33.7 66.3 30.3 5.2 26.0 14.9
2.0 34.9 65.1 29.3 2.5 25.4 16.9
4.0 40.1 59.9 26.5 1.3 23.6 23.0
8.0 46.2 53.8 21.0 0.2 20.2 33.9
실시예 2: 산 처리된 팜 열매 껍질 섬유질의 2차 알칼리 처리 단계
1차 산 처리된 팜 열매 껍질 섬유질의 건조된 바이오매스를 1-27.8 M 수산화나트륨 용액에 완전히 침적시킨 후, 20-200℃에서 넣고 1-72 시간 동안 천천히 교반 시킨 후, 알칼리 처리된 바이오매스를 회수한 후 바이오매스에 남아있는 수산화나트륨 용액을 체(sieve)를 이용하여 최대한 제거하였다. 수산화나트륨이 코딩 되어 있는 바이오매스를 습식 및 고상 상태로 되도록 한 후, 고압멸균 장치를 이용하여 반응온도 100-200℃, 압력 10-20 psi에서 10-60분 반응시켰다. 반응 후 알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질에 증류수의 비율이 1:1-1:20이 되도록 한 후, 1-5 시간 동안 천천히 교반 시킨후, 이 작업을 수회 반복하여 바이오매스에서 잔여 알칼리 성분 및 바이오매스에 서 용해된 리그닌 성분을 제거하였다. 알칼리 성분 및 리그닌 성분이 제거된 바이오매스를 회수 한 후, 건조기에서 50-90℃의 건조기에서 1-3일간 수분을 바이오매스로 부터 제거하였다.
건조된 바이오매스는 1차 산처리 단계에서와 동일한 방법으로 셀룰로오즈, 헤미셀룰로오즈, 리그닌 및 알칼리 전, 후의 바이오매스의 무게변화를 분석하였다. 1차 산 처리된 바이오매스의 10 M 수산화나트륨을 이용한 2차 알칼리 처리 전, 후의 건조된 팜 열매 껍질 섬유질의 잔여성분의 무게 및 셀룰로오즈, 헤미셀룰로오즈, 리그닌의 함량 변화는 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 바와 같이, 0.1~8% 농도의 묽은 황산을 처리한 후 2차로 10N 수산화나트륨에 담근 결과, 리그닌이 90%까지 용해되어 나옴으로서 약 70%의 리그닌 제거효과를 나타내었다.
2차 수산화나트륨 전처리 후 팜 열매 껍질 섬유질(EPFB fiber)의 셀룰로오즈, 헤미셀룰로오즈, 리그닌의 성분 변화
1차 처리 2차 처리 구성/ 팜 열매 껍질 섬유질 100g 탈리그닌
묽은 황산 10N 수산화나-트륨 가용성 (%) 불가용성 (%) 셀룰로오-즈 (g) 헤미셀룰-로오즈 (g) 리그닌 (g) (%)
전처리하지 않은
팜 열매껍질		 처리전 - 100.0 36.3 18.7 30.6 -
0.0 처리 33.7 66.3 37.9 17.2 27.5 10.5
0.1 처리 35.5 64.5 38.0 15.2 22.5 26.5
0.5 처리 46.9 53.1 40.2 7.6 15.3 50.0
1.0 처리 47.2 52.8 41.2 4.9 10.2 66.7
2.0 처리 50.4 49.6 42.0 2.1 9.2 69.9
4.0 처리 26.0 74.0 44.0 0.9 9.1 70.3
8.0 처리 10.0 90.0 42.2 <0.1 8.9 70.7
실시예 3: 산처리 단계에서의 부산물로 발생되는 산처리액에서의 자일로스의 분획
1차 묽은 황산을 이용한 산처리와 2차의 고농도 수산화나트륨을 이용한 알칼리 처리에서 확인한 결과를 기초로, 45.7% 셀룰로오즈, 25% 헤미셀룰로오즈, 23% 리그닌을 포함하는 팜 열매 껍질 섬유질 150 g을 1차 산처리 과정으로 4% (v/v) 묽은 황산 용액에 침적시켜 고압멸균 장치를 이용하여 반응온도 121℃, 압력 15 psi에서 60분 반응시켰다. 반응 후 산 처리된 팜 열매 껍질 섬유질와 산 처리 용액을 분리한 후, 산처리 용액을 다시 처리하지 않은 새로운 150 g의 팜 열매 껍질 섬유질를 다시 침적시켜 같은 조건으로 산처리 반응을 수행하였다. 첫번째 산 처리된 섬유질와 두번째 산 처리된 섬유질를 증류수 2 L에 각각를 침적시킨 후, 24시간 동안 천천히 교반 시켜 섬유질 표면 및 내부에 산 처리에 의해 추출 및 산 가수분해되어 나오는 자일로스를 회수 하였다. 회수된 용액 내에서의 자일로스의 성분을 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)를 이용하여 분석한 결과(도 3), 자일로스(xylose)가 82%, 글루코스(glucose) 4%, 올리고-자일로스(oligo-xylose) 3%, 아세트산(acetate) 3%가 산 처리 용액에 포함되어 있는 것으로 확인되었으며 최종적으로 300g의 팜 열매 껍질 섬유질를 반응시켜 46.4g의 자일로스를 1차 산처리액에서 16.0g 의 자일로스를 증류수 세척액에서 회수할 수 있었다.
실시예 4: 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스의 효소 당화반응
상기에서 1차 산 처리한 300 g의 팜 열매 껍질 섬유질를 다시 2차 알칼리 처리를 수행하였다. 산처리 된 바이오매스를 10 N 수산화나트륨 용액에 완전히 침적시킨 후, 상온에서 3 시간 동안 천천히 교반 시킨 후, 알칼리 처리된 바이오매스를 회수한 후 바이오매스에 남아있는 수산화나트륨 용액을 체를 이용하여 최대한 제거하였다. 수산화나트륨이 코딩 되어 있는 바이오매스를 고상 상태로 고압멸균 장치를 이용하여 반응온도 121℃, 압력 15 psi에서 15 분 반응시켰다. 반응 후 알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질에 2 L 증류수를 넣은 후, 교반 시켰으며, 이 작업을 4회 반복하여 바이오매스에서 잔여 알칼리 성분 및 바이오매스에 서 용해된 리그닌 성분을 제거하였다. 알칼리 성분 및 리그닌 성분이 제거된 바이오매스를 회수 한 후, 건조기에서 90℃의 건조기에서 3일간 수분을 제거하였다. 최종적으로 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스에 포함되어 있는 셀룰로오즈(글루칸), 헤미셀룰로오즈(자일란), 리그닌 성분을 조사한 결과 72%, 1%, 9%로 각각 분석되었다(도 4A).
순차적 산-알칼리 처리된 바이오매스에서 유리되는 글루코스와 자일로스의 양은 첨가 Cellicㄾ CTec2 cellulase 양에 비례하는 것이 관찰되었다. 건조 전처리된 바이오매스 중량 당 10-50 FPU의 효소를 반응 시켰을 때, 54.1 ± 0.5 g/L에서 84.1 ± 0.8 g/L의 글루코스와 1.1 ± 0.1 g/L에서 1.8 ± 0.1 g/L 자일로스가 생성되는 것을 확인하였다 (도 4B). 이때 당화효율은 61.8%에서 99.7%으로 확인되었다 (도 4C). 효소 반응을 통해 순차적 산-알카리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질는 건조 중량당 2% 미만의 헤미셀룰로오즈를 포함하고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스의 동시당화를 통한 에탄올 발효
순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스의 효소 동시당화를 통한 에탄올 발효효율을 확인하기 위하여, 5 리터 배치 발효기(5 L batch jar-fermentor) R'ALF (Bioengineering AG, Wald, Switzerland)를 사용하여 실제용적 부피(working volume)를 1.5-L로 하여 전처리된 바이오매스 10% (v/w)를 주 탄소원으로, 1% Bacto yeast extract, 2% Bacto peptone를 질소원으로 조성된 배양 배지에 Saccharomyces cereviaise W303-1A를 접종하여 30℃에서 분당 300 rpm의 교반속도로 발효를 수행하였다. 이때 동시당화 발효를 위해 건조 전처리 바이오매스 중량당 10 -100 FPU CellicㄾCTec2cellulase를 동시에 주입하였다.
각각의 생성물은 refractive index detector (Waters, Milford, MA, USA)와 auto-sampler가 장착된 High-performance liquid chromatography (HPLC) 시스템 (Young-Lin instrument, Anyang, Korea)을 이용하여, 분석 컬럼으로 Rezex ROA-Organic Acid H+ column (7.8 x 300 mm; Rhenomenex, Torrance, CA, USA)와 guard cartridge (KJ0-4282; Rhenomenex, Torrance, CA, USA)가 포함되어 있는 SecurityGardTM가드컬럼을 이용하여, 컬럼 온도를 65℃로 유지하면서 이동상으로 2.5 mM 황산용액으로 0.6 mL min-1유속으로 하였다. 이때 글루코스, 자일로스, 숙신산, 젖산, 글리세롤, 초산, 에탄올은 각각 t R 19.1 분, t R20.4분, t R24.0분, t R25.5분, t R28.2분, t R29.8분, t R40.1분으로 측정된다(도 5B).
발효산물의 분석 결과, 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스의 효모를 이용한 동시당화 발효는 37.8 g/L 에탄올이 발효 60시간 후에 생산되었으며, 에탄올 생산성은 단위 건조 전처리 바이오매스당 0.378 그램 에탄올 (0.378 g ethanol/ g dry pretreated biomass)로 확인되었다. 또한 효소 동시당화 발효를 통한 글루코스에 대한 전환율은 단위 그램 글루코스당 0.444 그램 에탄올 (0.444 g ethanol/g glucose)로 확인되었다. 최종적으로 효소당화를 통해 전처리된 바이오매스 내의 전환 가능한 당에 대한 에탄올 발효 수율은 87.1%로 조사되었다. 또한, 순차적 산-알칼리 처리된 팜 열매 껍질 섬유질 바이오매스를 이용한 효모 S. cerevisiae 동시당화 발효에서는 숙신산, 젖산, 글리세롤, 초산이 발효 부산물로 확인이 되었으며, 그 농도는 약 1.4 g/L에서 2.0 g/L 미만으로 측정되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 다음 단계를 포함하는 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스의 제조방법:
    (a) 팜 열매 껍질 섬유질을 산 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 산 처리된 팜 열매 껍질 섬유질을 알칼리로 처리하여 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, (a) 단계는 0.1~8%의 묽은 황산(H2SO4)을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, (a) 단계는 100-200℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, (a) 단계는 10-20psi의 압력에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, (a) 단계의 산처리는 10-60분동안 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, (b) 단계는 1-27.8M 수산화나트륨(NaOH) 용액을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, (b) 단계는 20-200℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, (b) 단계의 알칼리 처리는 12~100시간동안 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 추가적으로 (a) 단계의 부산물로 발생되는 산처리액을 교반하여 자일로스 분획을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 추가적으로 (b) 단계의 알칼리 처리된 바이오매스에서 리그닌 성분을 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, (d) 단계에서 수득되는 바이오메스는 2% 미만의 헤미셀룰로오즈를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 의해 제조된 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스를 당화 및 발효시켜 에탄올을 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 당화 및 발효는 셀룰레이즈 및 효모를 이용하여 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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