KR20130047023A - 신규한 폐암세포주 및 이를 포함하는 폐암 치료제 스크리닝용 키트 - Google Patents

신규한 폐암세포주 및 이를 포함하는 폐암 치료제 스크리닝용 키트 Download PDF

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KR20130047023A
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성균관대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 환자로부터 유래된 신규한 폐암세포주, 상기 폐암세포주에 폐암치료용 후보물질을 처리하고 상기 폐암세포주의 생존여부를 확인하는 단계를 포함하는 폐암치료제를 스크리닝하는 방법 및 상기 폐암세포주를 포함하는 폐암치료제 스크리닝용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 종양세포주는 환자의 폐암세포의 특성을 그대로 나타내므로, 유사한 유전형을 나타내는 폐암환자를 치료하기 위한 환자 맞춤형 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 폐암세포주 및 이를 포함하는 폐암 치료제 스크리닝용 키트{A Novel lung cancer cell line and screening kit for therapeutic agents for lung cancer comprising the same}
본 발명은 신규한 폐암세포주 및 이를 포함하는 폐암 치료제 스크리닝용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 환자로부터 유래된 신규한 폐암세포주, 상기 폐암세포주에 폐암치료용 후보물질을 처리하고 상기 폐암세포주의 생존여부를 확인하는 단계를 포함하는 폐암치료제를 스크리닝하는 방법 및 상기 폐암세포주를 포함하는 폐암치료제 스크리닝용 키트에 관한 것이다.
폐암은 폐에 생긴 악성 종양을 통틀어 말하는 것이며, 암세포가 기관지나 폐포에서 처음 발생한 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생겨나 혈관이나 림프관을 타고 폐로 이동해 증식하여 발생한 전이성 폐암으로 나눌 수 있다. 일반적으로 폐암이라고 하는 원발성 폐암은 현미경학적으로 암세포의 형태에 따라 비소세포 폐암과 소세포 폐암으로 구분된다. 이와 같이 비소세포 폐암과 소세포 폐암을 구분하는 것은 임상적 경과와 치료 방법의 차이가 크기 때문이다. 비소세포 폐암은 조기에 진단되면 수술적 치료만으로도 완치를 기대할 수 있는 반면, 소세포 폐암은 대부분 진단 당시에 수술적 절제가 어려울 정도로 진행되어 있는 상태로 발견되는 경우가 많고 급속히 성장하며 전신 전이율이 높아서 수술보다는 항암 화학요법이나 방사선치료가 선택된다. 통상적으로 폐암이라고 하면 폐암의 약 80 내지 85%를 차지하는 비소세포 폐암을 의미하며, 이러한 비소세포 폐암은 편평상피암종, 선암종, 대세포암종 및 기타 폐암으로 세분된다.
특히, 폐암은 19세기까지만 해도 드문 질환이었으나, 20세기 들어 흡연이 보편화되면서 급격히 증가하기 시작하여, 서양에서는 남성과 여성 모두에서 가장 많이 발생하는 악성 종양이 되었고 우리나라에서도 폐암 발생이 가파르게 상승하여 위암에 이어 발병률 2위의 암질환이다. 이러한 발생빈도의 증가는 흡연뿐 아니라 대기오염 및 산업공해의 증가 등에 기인한다. 또한 폐암은 다른 암에 비해 치료가 어려워 발병률은 1위가 아니나, 사망자는 암환자 중 가장 많은 것으로 알려져 있다. 완치의 기준인 5년 생존률이 15%에 지나지 않는다.
이러한 폐암의 치료방법은 병기에 따라 다르며 기본적으로 수술적 제거, 방사선치료, 항암화학요법의 세 가지 방법이 있다. 수술적 제거는 폐암치료에서 유일하게 완치를 기대할 수 있는 방법으로 수술 후 재발이나 전이를 줄이기 위해 방사선 치료와 화학 약물요법 등의 보조요법이 병행되고 있다. 폐암의 종류에 따라서도 적용가능한 치료 방법이 상이하다. 비소세포 폐암의 경우 조기 발견되면 수술로 완치 가능성이 높으므로 무엇보다 조기 발견이 중요하다. 그렇지 못한 경우 수술적 치료와 항암화학요법 및 방사선 치료법을 병행한다. 한편 소세포 폐암의 경우, 비교적 빨리 자라고 전신으로 원격전이가 용이하므로 대부분의 경우 수술적 치료를 시행하지 않는다. 그러나 항암화학요법 및 방사선 치료에 대한 감응성이 높아 제한성 병기의 경우 항암화학 및 방사선 병용요법을, 확장성 병기의 경우 항암화학요법을 시행하게 된다.
항암화학요법은 효과적인 암치료 방법 중 하나이지만 항암제의 지속적인 투여는 항암화학요법의 실패를 초래하는 원인으로 지적되고 있다. 이는 세포가 항암제에 내성을 획득하게 되기 때문이며, 한 항암제에 내성을 획득하면 구조가 다른 항암제에 대해서도 내성을 갖게 되는 교차내성을 가진다. 이와 같이 암세포가 항암제 구조에 상관없이 비 특이적인 내성을 획득하는 것을 다중약물내성(multidrug resistance; MDR)이라 한다[Gottesman et al., Nat. Rev. Cancer, 2: 48-58, 2002; Ambudkar et al., Oncogene, 22: 7468-85, 2003). 이러한 암세포의 MDR 획득은 항암화학요법 실패의 가장 큰 원인 중 하나로 잘 알려져 있다. 항암제 내성은 크게 2가지로 분류될 수 있는데 하나는 약물이 세포 내로 유입되지 못해 생기는 것이고, 또 다른 하나는 암세포 자체가 유전적 또는 후생유전적 변화에 의해 항암제에 대한 감수성이 떨어져 나타날 수 있는 것이다. 또한 항암제는 특유의 부작용도 가진다. 가장 중요한 것이 골수 기능 억제에 의한 백혈구 및 혈소판의 감소로 이는 면역기능과 관련되어 감염으로 연결될 수 있는 환자에게 치명적인 부작용이다. 이 외에도 소화기계 또는 생식기계에서의 이상을 초래하거나 탈모증을 유발하는 등의 부작용이 항암제의 적용을 제한한다.
폐암의 치료가 어려운 가장 중요한 이유는 다양성이다. 종양마다 다양한 유전적 특성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 동일한 환자의 동일한 종양내에도 다양한 종류의 유전적 특성을 가진 암세포들이 다양한 정상세포들과 섞여있기 때문에 한가지 약물이 특정 암세포를 죽이는 효과가 있어서 종양의 크기가 줄어드는 효과가 나타나더라도 다른 특성을 가진 암세포들까지 모두 죽이지 못하기 때문에 소수의 세포들이 다시 분열해서 종양이 성장을 하면, 항암치료 이후에는 항암제에 내성이 있는 세포들로 바뀌는 결과가 발생한다. 현재 이러한 다양한 암세포의 성장기전을 차단하는 200여종의 항암제들이 개발되고 있으나, 어떤 종양에 어떤 약제를 사용해야 하는지를 결정하는데 필요한 시험방법은 전무한 상태여서, 환자당 약 6종의 약제밖에 사용하지 못하는 실정이다. 따라서, 폐암 환자별로 적합한 항암제를 처치하는 것이 매우 중요한 문제로 대두되고 있으며, 미리 환자 맞춤형의 항암제를 스크리닝하기 위한 환자의 세포 확보가 필요한 실정이다. 그러나, 폐암 환자로부터 폐암세포의 분리 및 증식에 효과적인 방법이 아직까지 보고가 미미한 실정이다.
이에 본 발명자들은 환자에 대한 약효가 검증되지 않은 항암물질의 무분별한 사용으로 인한 부작용을 방지하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 환자의 폐암조직으로부터 효과적으로 폐암세포를 분리, 증식하여 수득한 신규한 폐암세포주를 이용하여 폐암치료제를 스크리닝하는 방법을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 폐암세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폐암세포주를 이용하여 폐암치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폐암세포주를 포함하는 폐암치료제 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 실시양태로서, 본 발명은 신규한 폐암세포주인 SMC-L001(기탁번호: KCLRF-BP-00274)를 제공한다.
본 발명의 용어 "폐암세포주"란 폐암환자로부터 유래된 폐암세포 중에서 불멸화되어 지속적으로 계대배양이 가능한 세포주를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 폐암세포주는 바람직하게는 SMC-L001(KCLRF-BP-00274)을 의미한다.
상기 세포주는 정상 세포에 비하여 일부 유전자가 결실되거나 또는 증폭되어 정상세포와는 상이한 copy number를 나타낸다: 예를 들어, 결실되어 copy number가 감소하거나 또는 완전히 없어진 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, A2BP1, ACP1, AGBL4, AJAP1, ANKFY1, ANKRD11, ANKRD26P1, ANKRD36, ANO10, AQP7P1, AQP7P2, ASPG, BAGE4, BRAF, BTBD9, C3orf39, C8orf48, C9orf66, C14orf177, C21orf15, C21orf99, C21orf34, C21orf34, C20orf46, C17orf97, C14orf64, CARKD, CBLN4, CCDC144A, CCDC85C, CCT8L2, CDH8, CDH11, CEBPD, CHL1, CNTN3, CNTN4, CNTN6, CNTNAP2, CNTNAP5, CNV_0018, CNV_0294, CNV_0295, CNV_0523, CNV_0530, CNV_0563, CNV_0983, CNV_1115, CNV_1116, CNV_1377, CNV_1565, CNV_1649, CNV_2364, CNV_2462, CNV_2920, CNV_2921, CNV_3067, CNV_3223, CNV_3390, CNV_3434, CNV_3825, CNV_6849, CNV_7349, CNV_8889, CNV_9826, CNV_32467, CNV_79601, CNV_79602, COL4A2, COLEC12, CSMD1, CYB5D2, CYLC2, DDR1, DEGS2, DIO2, DKFZp686A1627, DLC1, DNMT1, DOCK8, DOK2, DOK5, DUSP22, EFCAB6, EHMT1, ELAVL2, ESCO1, EVL, EXOC2, FAHD2B, FAM101B, FAM110C, FAM168A, FAM178B, FAM27B, FAM86D, FANK1, FBXO25, FLJ40292, FNTB, FOLH1, GALNT1, GFRA2, GOLGA5, GREB1L, GRIN3A, HAUS8, HHIPL1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DPB2, IL17F, INO80C, IPO5, IRF4, KANK1, KDM4C, KHDRBS2, KIAA0146, KIF26A, KLF5, KLF12, LGMN, LARGE, LGSN, LOC 100129396, LOC 100132288, LOC 162632, LOC 284661, LOC 284900, LOC 285501, LOC 348021, LOC 440040, LOC 644649, LOC 650368, LRRC4C, LRRTM4, MAS1L, MAX, MBD3L1, MBNL2, MC3R, MCM3, MIR1324, MIR187, MIR203, MIR548F4, MIR548I4, MRPL4, MTERFD2, MYH4, MYH8, MYH13, MYO9B, MX1, MX2, NRXN1, NRXN3, NTM, OR2H1, OR2T10, OR2T11, OR2T34, OR2Z1, OR4A47, OR5D13, OR5D14, OR5L1, OR11H1, PAQR8, PDPN, PIBF1, PITPNB, PLEKHB1, POTED, POTEH, PRDM2, PRKDC, PSMF1, PTP4A1, RAB20, RAD51L1, RAP2A, RIN3, RPH3AL, S1PR2, SH3YL1, SHCBP1, SLC14A1, SLC14A2, SLC5A9, SMC2, SNAR-H, SNED1, SNRK, SNRPD1, SOX11, SPATA6, SPG7, SPPL2B, SYN3, THOC1, TIMM13, TLE2, TLE6, TMPRSS9, TPTE, TRPC2, TRIML1, TRIML2, TTTY12, TTTY14, TUBA3C, UBD, USE1, USP14, USP25, VPS35, XPO7, YY1, ZFAND3, ZFP42, ZNF93, ZNF195, ZNF253, ZNF441, ZNF506, ZNF558, ZNF596, ZNF823, ZNF833, ZNF717, ZZEF1, CNV_1248, CNV_1496, CNV_1742, CNV_4185, CNV_4843, CNV_6753, CNV_23125, CNV_23827, CNV_23930, CNV_37072, GSTT1, GSTTP2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-DRB6, LOC391322, PRB2, PRKY, APOBEC3A, CNV_0499, CNV_0549, CNV_0830, CNV_1082, CNV_2026, CNV_4036, CNV_4182, CNV_5527, CNV_5528, CNV_7159, CNV_22576, CNV_23144, CNV_39017, CNV_47848, CNV_83928, CNV_97191, FAM41AY1, FAM41AY2, LOC401629, NLGN4Y, RPS4Y1, SRY, TACC2, TGIF2LY, TJP2, UGT2B15, UGT2B17, UTY, ZFY, BCORL2, CNV_0383, CNV_0602, CNV_0832, CNV_1005, CNV_1006, CNV_1137, CNV_1425, CNV_3603, CNV_4493, CNV_4767, CNV_6851, CNV_7740, CNV_22510, CNV_22786, CNV_22867, CNV_22872, CNV_23932, CNV_31589, CNV_34863, CNV_35073, CNV_35074, CNV_36150, CNV_36484, CNV_36485, CNV_36942, CNV_44420, CNV_66693, CNV_76697, CNV_87301, DDX3Y, EIF1AY, RBMY1F, SCAP, TCERG1L, TTTY10, TTTY15, USP9Y, CNV_0829, CNV_0831, CNV_0833, CNV_2285, CNV_3229, CNV_4180, CNV_4184, CNV_10595, CNV_31588, CNV_32444, CNV_38809, CYorf15A, CYorf15B, PRKY, RBMY2EP, RBMY3AP, TBL1Y 등이 될 수 있고, 증폭되어 copy number가 증가한 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, ABP1, ADAM3A, ADAM5P, ANKRD33B, ANXA6, APOD, C1orf95, CALHM1, CALHM2, CCDC127, CDH18, CHRNA9, CNV_1197, CNV_1700, CNV_2705, CNV_3270, CNV_3358, CNV_4175, CNV_6398, CNV_8369, CNV_8484, CNV_9354, CNV_30066, CNV_30946, CTNND2, DAP, DENND3, ERO1L, GPR137C, GPX3, IQSEC3, ISLR2, ITPKB, KCNH2, KSR1, LGALS9, LOC283731, LOC728411, LOC728855, LOC728875, LRRC14B, MIR570, MMD2, NFIC, OSGIN2, PAPOLB, PARP1, PDCD11, PLEKHG4B, PNPO, PPIAL4C, PSMC6, PTPRN2, PTK2, PUS7, RADIL, RBM47, RIPK2, RNF128, SDHAP2, SLC45A4, SLC6A12, SP2, SP6, SRPK2, TBC1D8B, TNIP1, WSB1, ZNF3, ZSCAN21, BRUNOL4, CNTNAP4, CNV_0279, CNV_0536, CNV_0704, CNV_3565, CNV_4468, CNV_5052, CNV_6598, CNV_6599, CNV_7509, CNV_35409, CNV_37296, CNV_47853, DOCK5, SIRPB1, TPPP, CNV_2970, CNV_3099, CNV_3874, CNV_6996, CNV_35700, CNV_35701, CNV_58898, CNV_67993, CNV_96773, MAGT1, SELS, CNV_4479, CNV_59234, PCBD2, CNV_3530, CNV_31209, PDLIM3 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 비소세포성 폐암의 일종인 선암(adenocarcinoma)이 발병된 환자(74세, 남성)로부터 Tstage II기에서 종양조직을 적출하고, 이로부터 종양세포를 수득한 다음, N2 조성물을 포함하는 기본배지에서 5 내지 7일간 배양하여 종양세포 이외의 세포를 제거함으로써, 순수한 종양세포를 수득하였다. 상기 종양세포는 폐조직 유래의 세포에서 나타내는 상피성 조직마커 단백질(EpiCAM 및 Cytokeratin)이 발현됨을 확인하였고(도 1), 상기 환자의 종양조직과 유사한 수준의 비정상적인 세포분열 양상을 나타내었으며(도 2a 및 도 2b), 이를 마우스 모델에 이식할 경우, 상기 환자의 종양조직과 유사한 형태의 종양을 형성할 수 있음을 확인하였다(도 4). 아울러, 상기 종양세포는 6개월 이상의 시간동안 계대배양하여도 세포가 노화되지 않았으므로, 상기 종양세포가 분리된 환자의 생체내 폐암세포와 동일한 특성을 가진 종양세포주임을 확인하여, 상기 세포주를 "SMC-L001"로 명명하고, 2011년 10월 21일 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Research Foundation, 서울시 종로구 연건동 28번지 서울대학교 의과대학 암연구소)에 기탁번호 KCLRF-BP-00274로 기탁하였다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 폐암세포주를 이용하여 폐암치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 폐암치료제를 스크리닝하는 방법은 (ⅰ) 상기 폐암세포주를 배양하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 배양된 폐암세포주에 폐암치료제의 후보물질을 처리하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 후보물질을 처리한 다음, (ⅲ) 상기 후보물질이 처리된 폐암세포주를 배양하여 상기 폐암세포주의 형태학적, 생리학적 또는 유전학적 변화량을 측정하는 단계; 및, (ⅳ) 상기 측정된 변화량이 유의한 수준일 경우 상기 후보물질이 폐암치료제로서 사용될 수 있는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 용어 "폐암치료제"란 폐암이 발병한 환자의 증상을 개선, 경감 또는 치료하는 효과를 나타내는 물질을 의미하는데, 폐암세포의 형태학적, 생리학적 또는 유전학적 변화를 유의하게 나타내는 한, 이들의 물리적 성상, 화학적 성상, 생물학적 기원 등은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 원발 비소세포암 및 소세포암 외에도 전이성 폐암, 폐전이 대장암, 유방암, 임파절 전이, 및 육종 등 폐에서 성장하는 모든 원발암과 전이암의 치료에 선택되는 암치료제일 수 있고, 보다 바람직하게는 폐암 치료에 사용되는 카보플라틴(파라플라틴)[Carboplatin(paraplatin)], 시스플라틴(Cisplatin), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 이포스파미드(Ifosfamide), 니드란(Nidran), 질소머스타드(메클로에타민 염산염)[Nitrogen mustar(Mechlorethamine HCL)], 블레오마이신(Bleomycin), 독소루비신(Doxorubicin), 미토마이신 C(Mitomycin C), 시타라빈(Cytarabine), 플루로우라실(Flurouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 트리메트렉세이트(Trimetrexate), 메토크렉세이트(Methotrexate), 에토포시드(Etoposide), 빈블라스틴(Vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 알림타(Alimta), 알트레타민(Altretamine), 프로카바진(Procarbazine), 탁솔(Taxol), 탁소텔(Taxotere), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 베바시주맙(Bevacizumab), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 피시바닐 바이알(Picibanil Vial), 아크라루비신(Aclarubicin), 테가푸르(Tegafur), 에피루비신(Epirubicin), 베로테칸(Belotecan), 안트라싸이클린(anthracycline), 이다루비신(idarubicin), 닥티노마이신(dactinomycin) 등이 될 수 있다. 상기 형태학적 변화는 특별히 이에 제한되지 않으나, 폐암세포가 사멸하거나 또는 폐암세포의 형태가 정상적인 폐조직 세포의 형태로 바뀌는 것을 의미하고, 상기 생리학적 변화는 특별히 이에 제한되지 않으나, 폐암세포의 증식특성, 전이특성, 발현단백질의 종류 등이 소멸하거나 또는 정상적인 폐조직 세포의 특성으로 바뀌는 것을 의미하며, 유전학적 변화는 특별히 이에 제한되지 않으나, 폐암세포에서 발현되는 폐암특이적인 유전자의 발현이 억제되거나 또는 유전자의 발현양상이 정상적인 폐조직 세포의 것으로 바뀌는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "암치료 후보물질"이란 암환자에 적용하여 암에 의한 환자의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 항암제, 항종양 항생제 등 상기 특성을 나타내는 물질은 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 폐암세포주는 CNV 분석결과를 통하여 유전형이 특정될 수 있고, 상기 폐암세포주는 환자 생체 내의 폐암세포와 동일한 특성을 나타낸다. 따라서, 상기 폐암세포주는 적어도 상기 폐암세포주의 유전형과 유사한 수준의 유전형을 나타내는 폐암환자의 맞춤형 치료에 활용될 수 있을 것이다. 예를 들어, 상기 폐암세포주의 유전형과 유사하게 EGFR(epidermal growth factor receptor), K-ras, N-ras, PIK3CA, LKB1, EML4-ALK, p53 등의 유전자가 변이된 유전형을 가지는 폐암환자를 치료하기 위하여, 상기 폐암세포주를 배양하고, 이에 공지된 폐암치료제 또는 폐암치료효과를 나타낼 것으로 예상되는 후보물질을 처리한 다음, 상기 폐암세포의 형태학적, 생리학적 또는 유전학적 변화를 분석함으로써 상기 처리된 폐암치료제 또는 후보물질을 상기 폐암환자의 치료에 사용할 수 있는지의 여부를 결정할 수 있을 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폐암세포주를 포함하는 폐암치료제 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명의 용어 "스크리닝용 키트"란 다수의 후보물질 중에서 특정한 효과를 나타내는 물질을 선발하는데 사용되는 키트를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 스크리닝용 키트는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 본 발명의 폐암세포주를 이용하여 폐암을 개선, 경감 또는 치료할 수 있는 효과를 나타내는 물질을 선발하는데 사용되는 키트가 될 수 있다. 보다 바람직하게는 기판에 상기 폐암세포주가 위치하여 세포 배양을 용이하게 수행하고, 폐암세포주의 변화를 용이하게 검출할 수 있는 세포주칩을 포함하는 키트가 될 수 있다. 이때, 상기 키트는 상기 폐암세포주의 형태학적, 생리학적 또는 유전학적 변화를 측정할 수 있는 항체, 프라이머, 프로브 등의 검출수단을 추가로 포함할 수도 있고, 상기 세포주 칩에는 본 발명의 폐암세포주 뿐만 아니라, 공지된 유전자형을 나타내는 다른 폐암세포주를 포함하여, 다양한 유전자형을 나타내는 환자에게 적용할 수 있도록 구성할 수도 있다.
본 발명의 종양세포주는 환자의 폐암세포의 특성을 그대로 나타내므로, 유사한 유전형을 나타내는 폐암환자를 치료하기 위한 환자 맞춤형 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1는 본 발명의 종양세포를 대상으로 하여 항-Cytokeratin 항체를 이용한 면역염색을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2a는 종양세포의 세포분열 양상을 나타내는 면역염색 현미경사진이다.
도 2b는 분열된 종양세포에서 얻어진 염색체의 수를 나타내는 사진이다.
도 3은 종양세포가 이식된 마우스 모델에서 생성된 종양을 나타내는 사진이다.
도 4는 종양세포가 이식된 마우스 모델에서 생성된 종양의 조직학적 분석 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 종양세포의 수득 및 배양
비소세포성 폐암의 일종인 선암(adenocarcinoma)이 발병된 환자(74세, 남성)로부터 Tstage II기에서 종양조직을 적출하고, 이로부터 종양세포를 수득하였다. 구체적으로, 환자로부터 적출한 종양조직에 페니실린과 스트렙토마이신을 처리하여 잡균의 오염을 방지한 다음, 무균상태에서 종양조직을 40 내지 100㎛의 크기가 되도록 물리적으로 세절하고, 세절된 종양조직에 콜라게나제와 DNase I을 처리하여 종양조직의 기질층(stromal layer)으로부터 분리된 세포를 수득하였다.
다음으로, 1% 마트리겔(BD Bioscience)이 코팅된 배양용기를 준비하고, 상기 배양용기에 N2 조성물(Gibco-BRL)이 첨가된 기본 배지(DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco-BRL). 1mM L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산, 및 0.1mM 머캅토에탄올)를 가한 다음, 상기 분리된 세포를 접종하고, 5 내지 7일동안 배양하여 상기 종양세포 이외의 세포를 제거하고, 종양세포만이 배양용기에 잔류하도록 하였다. 이어, 상기 배지를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Hyclone)과 BEI(10% FBS, 10 ng/ml bFGF(R&D system)가 첨가된 기본배지로 교체하고, 다시 7일 동안 배양하였다. 그 결과, 상기 잔류하는 세포에서 세포괴가 형성됨을 확인하였으므로, N2 조성물이 첨가된 기본 배지에 의하여 제거되지 않고 잔류한 세포가 종양세포임을 확인하였다.
실시예 2: 배양된 종양세포의 특성분석
폐의 세포는 상피성 세포이므로, 상기 실시예 1의 방법으로 배양된 종양세포가 폐로부터 유래된 상피성 세포의 특성을 그대로 유지하고 있는지의 여부를 상피성 세포의 마커로 사용되는 Cytokeratin을 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1의 방법으로 배양된 종양세포를 슬라이드 글라스에 고정시키고, 이에 항-Cytokeratin 항체를 처리하여 반응시킨 다음, HRP가 결합된 2차 항체를 처리하여 2차 반응을 수행하였으며, 이어 상기 HRP의 기질인 DAB를 처리하여 최종적으로 발색반응을 수행하고, 발색여부를 현미경으로 관찰하였다(도 1). 도 1는 본 발명의 종양세포를 대상으로 하여 항-Cytokeratin 항체를 이용한 면역염색을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, 상단의 2개 사진은 종양세포를 면역염색한 결과를 나타내는 사진이고, 하단의 2개 사진은 대조군으로서 섬유아세포를 면역염색한 결과를 나타내는 사진이다. 도 1에서 보듯이, 본 발명의 종양세포는 상피성 세포의 마커인 Cytokeratin이 발현되는 반면, 대조군으로 사용되는 섬유아세포에서는 상기 마커인 Cytokeratin이 발현되지 않음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 종양세포는 배양하더라도 폐암세포의 주요특성을 그대로 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 배양된 종양세포의 염색체 분열 분석
상기 실시예 1의 방법으로 배양된 종양세포를 대상으로, 세포의 DNA를 염색할 수 있는 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)-면역염색기법을 이용한 염색체 분열을 조사하였다(도 2a 및 도 2b). 도 2a는 종양세포의 세포분열 양상을 나타내는 면역염색 현미경사진이고, 도 2b는 분열된 종양세포에서 얻어진 염색체의 수를 나타내는 사진이다. 도 2a에서 보듯이, 종양세포의 핵을 DAPI로 염색한 결과, 상기 종양세포에서는 정상적인 세포분열과 비정상적인 세포분열이 동시에 나타남을 확인할 수 있었고, 도 2b에서 보듯이 분열된 종양세포에 존재하는 염색체의 수가 비정상적임을 알 수 있었다. 따라서, 상기 실시예 1에서 확인된 종양세포는 환자 생체 내의 세포와 동일한 특성을 갖는다는 것을 확인하였다.
실시예 4: 폐암세포주의 CNV ( copy number variants ) 분석
상기 실시예 1의 방법으로 배양된 종양세포가 정상인의 폐조직과 유전체 수준에서 어떠한 차이가 있는지를 확인하기 위하여, Microarray comparative genomic hybridization(array CGH) 방법을 이용한 CNV 분석을 수행하였다.
이때, 대조군으로는 정상인의 폐조직으로부터 수득한 gDNA(genomic DNA)를 사용하고, 실험군으로는 상기 배양된 종양세포로부터 수득한 gDNA를 사용하였으며, array로는 Agilent 180K(Agilent Technologies, USA)를 사용하고, 상기 array의 제조사로부터 발행된 프로토콜에 따라 CNV 분석을 수행하였다(표 1).
CNV 분석결과
측정값 유전자 명칭
-4 CNV_0829, CNV_0831, CNV_0833, CNV_2285, CNV_3229, CNV_4180, CNV_4184, CNV_10595, CNV_31588, CNV_32444, CNV_38809, CYorf15A, CYorf15B, PRKY, RBMY2EP, RBMY3AP, TBL1Y
-3 BCORL2, CNV_0383, CNV_0602, CNV_0832, CNV_1005, CNV_1006, CNV_1137, CNV_1425, CNV_3603, CNV_4493, CNV_4767, CNV_6851, CNV_7740, CNV_22510, CNV_22786, CNV_22867, CNV_22872, CNV_23932, CNV_31589, CNV_34863, CNV_35073, CNV_35074, CNV_36150, CNV_36484, CNV_36485, CNV_36942, CNV_44420, CNV_66693, CNV_76697, CNV_87301, DDX3Y, EIF1AY, RBMY1F, SCAP, TCERG1L, TTTY10, TTTY15, USP9Y
-2 APOBEC3A, CNV_0499, CNV_0549, CNV_0830, CNV_1082, CNV_2026, CNV_4036, CNV_4182, CNV_5527, CNV_5528, CNV_7159, CNV_22576, CNV_23144, CNV_39017, CNV_47848, CNV_83928, CNV_97191, FAM41AY1, FAM41AY2, LOC401629, NLGN4Y, RPS4Y1, SRY, TACC2, TGIF2LY, TJP2, UGT2B15, UGT2B17, UTY, ZFY
-1 CNV_1248, CNV_1496, CNV_1742, CNV_4185, CNV_4843, CNV_6753, CNV_23125, CNV_23827, CNV_23930, CNV_37072, GSTT1, GSTTP2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-DRB6, LOC391322, PRB2, PRKY
-0 A2BP1, ACP1, AGBL4, AJAP1, ANKFY1, ANKRD11, ANKRD26P1, ANKRD36, ANO10, AQP7P1, AQP7P2, ASPG, BAGE4, BRAF, BTBD9, C3orf39, C8orf48, C9orf66, C14orf177, C21orf15, C21orf99, C21orf34, C21orf34, C20orf46, C17orf97, C14orf64, CARKD, CBLN4, CCDC144A, CCDC85C, CCT8L2, CDH8, CDH11, CEBPD, CHL1, CNTN3, CNTN4, CNTN6, CNTNAP2, CNTNAP5, CNV_0018, CNV_0294, CNV_0295, CNV_0523, CNV_0530, CNV_0563, CNV_0983, CNV_1115, CNV_1116, CNV_1377, CNV_1565, CNV_1649, CNV_2364, CNV_2462, CNV_2920, CNV_2921, CNV_3067, CNV_3223, CNV_3390, CNV_3434, CNV_3825, CNV_6849, CNV_7349, CNV_8889, CNV_9826, CNV_32467, CNV_79601, CNV_79602, COL4A2, COLEC12, CSMD1, CYB5D2, CYLC2, DDR1, DEGS2, DIO2, DKFZp686A1627, DLC1, DNMT1, DOCK8, DOK2, DOK5, DUSP22, EFCAB6, EHMT1, ELAVL2, ESCO1, EVL, EXOC2, FAHD2B, FAM101B, FAM110C, FAM168A, FAM178B, FAM27B, FAM86D, FANK1, FBXO25, FLJ40292, FNTB, FOLH1, GALNT1, GFRA2, GOLGA5, GREB1L, GRIN3A, HAUS8, HHIPL1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DPB2, IL17F, INO80C, IPO5, IRF4, KANK1, KDM4C, KHDRBS2, KIAA0146, KIF26A, KLF5, KLF12, LGMN, LARGE, LGSN, LOC 100129396, LOC 100132288, LOC 162632, LOC 284661, LOC 284900, LOC 285501, LOC 348021, LOC 440040, LOC 644649, LOC 650368, LRRC4C, LRRTM4, MAS1L, MAX, MBD3L1, MBNL2, MC3R, MCM3, MIR1324, MIR187, MIR203, MIR548F4, MIR548I4, MRPL4, MTERFD2, MYH4, MYH8, MYH13, MYO9B, MX1, MX2, NRXN1, NRXN3, NTM, OR2H1, OR2T10, OR2T11, OR2T34, OR2Z1, OR4A47, OR5D13, OR5D14, OR5L1, OR11H1, PAQR8, PDPN, PIBF1, PITPNB, PLEKHB1, POTED, POTEH, PRDM2, PRKDC, PSMF1, PTP4A1, RAB20, RAD51L1, RAP2A, RIN3, RPH3AL, S1PR2, SH3YL1, SHCBP1, SLC14A1, SLC14A2, SLC5A9, SMC2, SNAR-H, SNED1, SNRK, SNRPD1, SOX11, SPATA6, SPG7, SPPL2B, SYN3, THOC1, TIMM13, TLE2, TLE6, TMPRSS9, TPTE, TRPC2, TRIML1, TRIML2, TTTY12, TTTY14, TUBA3C, UBD, USE1, USP14, USP25, VPS35, XPO7, YY1, ZFAND3, ZFP42, ZNF93, ZNF195, ZNF253, ZNF441, ZNF506, ZNF558, ZNF596, ZNF823, ZNF833, ZNF717, ZZEF1
+0 ABP1, ADAM3A, ADAM5P, ANKRD33B, ANXA6, APOD, C1orf95, CALHM1, CALHM2, CCDC127, CDH18, CHRNA9, CNV_1197, CNV_1700, CNV_2705, CNV_3270, CNV_3358, CNV_4175, CNV_6398, CNV_8369, CNV_8484, CNV_9354, CNV_30066, CNV_30946, CTNND2, DAP, DENND3, ERO1L, GPR137C, GPX3, IQSEC3, ISLR2, ITPKB, KCNH2, KSR1, LGALS9, LOC283731, LOC728411, LOC728855, LOC728875, LRRC14B, MIR570, MMD2, NFIC, OSGIN2, PAPOLB, PARP1, PDCD11, PLEKHG4B, PNPO, PPIAL4C, PSMC6, PTPRN2, PTK2, PUS7, RADIL, RBM47, RIPK2, RNF128, SDHAP2, SLC45A4, SLC6A12, SP2, SP6, SRPK2, TBC1D8B, TNIP1, WSB1, ZNF3
+1 BRUNOL4, CNTNAP4, CNV_0279, CNV_0536, CNV_0704, CNV_3565, CNV_4468, CNV_5052, CNV_6598, CNV_6599, CNV_7509, CNV_35409, CNV_37296, CNV_47853, DOCK5, SIRPB1, TPPP
+2 CNV_2970, CNV_3099, CNV_3874, CNV_6996, CNV_35700, CNV_35701, CNV_58898, CNV_67993, CNV_96773, MAGT1, SELS
+3 CNV_4479, CNV_59234, PCBD2
+4 CNV_3530, CNV_31209, PDLIM3
상기 표 1에서, 측정값은 본 발명의 종양세포에 포함된 유전자의 copy number를 정상세포의 것과 비교하여 상대적인 비율로 나타낸 값으로서, 상기 비율의 범위에 따라 10개의 군으로 분류하였다: 이때, -4는 상기 비율이 -4 이하인 경우를 나타내고, -3은 상기 비율이 -3 내지 -4인 경우를 나타내며, -2는 상기 비율이 -2 내지 -3인 경우를 나타내고, -1은 상기 비율이 -1 내지 -2인 경우를 나타내며, -0은 상기 비율이 0 내지 -1인 경우를 나타내고, +0은 상기 비율이 0 내지 +1인 경우를 나타내며, +1은 상기 비율이 +1 내지 +2인 경우를 나타내고, +2는 상기 비율이 +2 내지 +3인 경우를 나타내며, +3은 상기 비율이 +3 내지 +4인 경우를 나타내고, +4는 상기 비율이 +4 이상인 경우를 나타낸다.
상기 값이 클 수록(+4에 수렴) 해당하는 유전자가 증폭되어 종양세포내에서 copy number가 증가된 것으로 간주되고, 상기 값이 작을 수록(-4에 수렴) 해당하는 유전자가 결실되어 종양세포내에서 copy number가 감소된 것으로 간주된다.
상기 표 1에서 보듯이, 본 발명의 종양세포는 정상세포와 비교하여 대다수 유전자의 copy number가 전혀 상이함을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 폐암세포주의 생체내 이식 및 종양형성 능력 분석
상기 실시예 1의 방법으로 배양된 종양세포가 암세포의 특성을 갖는지 확인하고자 하였다.
먼저, 상기 종양세포에 Cy5.5 형광물질을 표지하여 면역결핍 생쥐의 등에 이식하고 제노겐(xenogen) 장비로 세포 생존여부 및 종양형성 여부를 확인하였다(도 3). 도 3은 종양세포가 이식된 마우스 모델에서 생성된 종양을 나타내는 사진이다. 도 3에서 보듯이, 마우스 모델에 이식된 종양세포는 6주 경과 후에도 생존하고 있었으며, 적출하여 확인한 결과 종양과 유사한 형태의 조직임을 확인할 수 있었다.
다음으로, 상기 마우스 모델에서 생성된 종양조직을 냉동절단(cryo-section)하여, 헤마톡실린 및 에오신과 마송 삼색(Masson's trichrome)으로 염색하여 분석하였다(도 4). 도 4는 종양세포가 이식된 마우스 모델에서 생성된 종양의 조직학적 분석 결과를 나타내는 사진이다. 도 4에서 보듯이, 상기 마우스 모델에서 생성된 종양은 비정상적인 세포증식 및 세포의 크기, 모양, 세포핵의 다양성으로 보아 전형적인 종양의 특성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 종양세포의 세포주 여부 확인
상기 실시예 1의 방법으로 배양된 종양세포가 종양세포주로서의 특징을 나타내는지를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1의 방법으로 배양된 종양세포에 디스파아제(Gibco-BRL)를 처리하여, 배양용기의 바닥으로부터 종양세포로부터 형성된 세포괴만을 분리하였다. 이어, 상기 분리된 세포괴를 10% FBS와 BEI가 첨가된 기본배지에 다시 접종하여 7일 동안 배양하는 방식으로 6개월 동안 계대배양하면서, 상기 세포괴를 형성하는 종양세포가 노화되는지의 여부를 확인하였다. 그 결과, 6개월 동안 계대배양하여도, 상기 세포괴를 형성하는 종양세포가 노화되지 않음을 확인하였으므로, 상기 종양세포가 불멸화된 세포주(cell line)임을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 세포주를 "SMC-L001"로 명명하고, 2011년 10월 21일 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Research Foundation, 서울시 종로구 연건동 28번지 서울대학교 의과대학 암연구소)에 기탁번호 KCLRF-BP-00274로 기탁하였다.
한국세포주연구재단(국외) KCLRF-BP-00274 20111021

Claims (9)

  1. 신규한 폐암세포주인 SMC-L001(기탁번호: KCLRF-BP-00274).
  2. (ⅰ) 제1항의 폐암세포주를 배양하는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 배양된 폐암세포주에 폐암치료제의 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는, 폐암치료제 스크리닝 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    (ⅱ) 단계를 수행한 다음, (ⅲ) 상기 후보물질이 처리된 폐암세포주를 배양하여 상기 폐암세포주의 형태학적, 생리학적 또는 유전학적 변화량을 측정하는 단계; 및, (ⅳ) 상기 측정된 변화량이 유의한 수준일 경우 상기 후보물질이 폐암치료제로서 사용될 수 있는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 스크리닝 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 스크리닝된 폐암치료제는 EGFR(epidermal growth factor receptor), K-ras, N-ras, PIK3CA, LKB1, EML4-ALK 및 p53으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자가 변이된 유전형을 가지는 폐암환자의 치료에 사용되는 것인 스크리닝 방법.
  5. 제1항의 폐암세포주를 포함하는 폐암치료제 스크리닝용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 폐암세포주는 기판에 상기 폐암세포주가 위치하여 세포 배양을 용이하게 수행하고, 폐암세포주의 변화를 용이하게 검출할 수 있는 세포주칩의 형태로 포함되는 것인 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 세포주칩은 상기 폐암세포주와 상이한 유전자형을 나타내는 다른 폐암세포주를 추가로 포함하는 것인 키트.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 폐암세포주의 형태학적, 생리학적 또는 유전학적 변화를 측정할 수 있는 검출수단을 추가로 포함하는 것인 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 검출수단은 항체, 프라이머 또는 프로브인 것인 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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