KR20130044429A

KR20130044429A - 연잎과 비파혼합추출물의 다기능성 방부 효과를 가지는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20130044429A
Application number: KR1020110108483A
Authority: KR
Inventors: 이충우; 양수옥; 유병국
Original assignee: 이충우
Priority date: 2011-10-24
Filing date: 2011-10-24
Publication date: 2013-05-03

Abstract

본 발명은 연잎추출물을 포함하고, 비파엽, 비파종자, 비파나무 추출물 중 2가지 이상을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 세균, 곰팡이, 효모에 대해 매우 우수한 항균 활성을 나타내고 항산화, 항노화 기능을 갖는 다기능성 방부 활성을 가지는 화장료 조성물에 관한 것이다.
(색인어)
연잎, 비파엽, 비파나무, 비파종자, 항균, 방부, 항산화, 항노화

Description

연잎과 비파혼합추출물의 다기능성 방부 효과를 가지는 화장료 조성물{Anti-microbial effect from Lotus leaf extract and Eriobotrya japonica}

본 발명은 연잎추출물, 비파엽 추출물, 비파종자 추출물, 비파나무 추출물을 복합적으로 사용하거나 적절한 비율로 혼합하여, 방주 기능을 갖는 혼합추출물을 제조하는 방법 및 이를 이용한 항산화, 항노화 기능을 갖는 다기능성 방부 활성 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서는 화장품 방부제로 기존에 널리 사용되었던 화학방부제의 단점인 자극성을 보완할 수 있는 천연물질로부터 다기능성 방부제를 개발하기 위하여 연잎추출물을 포함하고 비파엽 추출물, 비파종자 추출물, 비파나무 추출물 중 2가지 이상을 혼합하여 매우 우수한 항균 활성을 나타내며, 항균 스펙트럼이 넓어 화장료에 대한 방부능력이 우수하고, 또한 물리화학적인 안정성 및 화장료 제형에 미치는 영향이 매우 적으며, 피부 자극 유발 가능성이 낮으면서 항산화, 항노화 기능까지 첨부된 다기능성 방부 기능을 갖는 화장료 조성물을 기술하고자 한다.

기존 화장품 조성물은 화학 방부제(표시지정 성분)를 첨가하지 아니하고 제조하거나 유통할 시에는 제조과정이나 유통과정, 소비자의 사용 중에 곰팡이, 효모, 세균 등의 미생물 오염이 쉽게 이루어질 수 있으며, 미생물이 오염된 제품은 향취이상, 색상변화, 점도변화, 질감변화, 곰팡이 발생 등의 품질저하 현상을 나타낼 뿐만 아니라 인체에 유해한 질병을 유발하게 되어 이로 인한 피부안전성에 문제가 야기될 수 있다. 화장품에 있어서 방부제란 단순히 제품의 부패를 막기 위해 첨가하는 첨가물이 아니라, 화장품이 공장에서 제조될 때부터, 소비자가 그 상품을 사용하여 그 사용이 최종적으로 완료될 때까지, 불가역적으로 또는 우발적으로 제품에 함유되거나, 오염되는 미생물의 생육을 억제하여 , 미생물의 증식에 의해 일어나는 화장품의 변질, 변취, 변패 등을 방지할 목적으로 첨가하는 첨가물의 총칭이라 할 수 있다. 따라서, 미생물 성장을 억제하기 위한 최소량으로 최대의 항균력을 나타낼 수 있는 방부제를 첨가하여야 하며, 화장품 제품 중의 영양성분의 배합, pH, 유화형태, 방부제의 혼합사용 및 그 안정성을 고려하여야 함은 물론이고 제품 중의 모든 원료 성분에 대한 항균활성능 및 피부자극 여부를 사전에 미리 파악하여 각 제품별로 적절한 방부체계를 선택하는 것이 매우 중요하다.

화장품에 사용되는 방부제의 종류는 매우 다양하며 또한 화장품 생산의 증가에 따라 방부제는 더울 다양해지고 그 사용량도 증가되고 있다. FDA(Food and Drug Administration)에 의하면 화장품에 배합이 허가된 방부제는 약 159 종류 이상이며, 대표적인 화장품 방부제로는 파라옥시안식향산에스텔류인 메틸 파라벤(Methyl paraben), 에틸 파라벤(Ethyl paraben), 프로필 파라벤(propyl paraben), 부틸 파라벤(Butyl paraben) 등과 쿼터눔-15(Quaternium-15), 이미다졸리디닐우레아(Imidazolidinyl Urea), 디나졸리디닐 우레아(Diazolidinyl Urea), 페녹시에탄올(Phenozyethanol), 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride), 글루콘산 클로로헥시딘(chlorohexidine gluconic acid) 및 트리클로산(Trichlosam), 클로로페네신 등의 화학 방부제를 들 수 있다. 화학 방부제는 제형의 안정성 및 방부 유효성이 우수하지만, 기존의 방부제로서 안전하다고 알려져 있는 방부제들조차 피부알러지 및 환경호르몬으로서의 가능성이 보고되어 있어서 식물용 방부제들도 허용된 기준내의 사용도 불신되고 있고 지속적인 체내축적인 급 만성독선, 돌연변이 유발 등의 새로운 문제가능성이 대두되고 있다. 또한, 화장품에서 많이 사용하고 있는 방부제 4종(mehtylparapen, propylparaben, phenpxyethanol, chlorophenecin)에 대한 자극감에 영향을 주는 연구에서, 서로 다른 방부제가 혼합된 경우에 자극감이 높아지는 결과는 나타내었고, 혼합되는 원료의 특성에 따라 자극감의 정도가 차이가 있는 것으로 확인되어 화장품의 새로운 원료 선택시 고려사항으로 간주되고 있다. 따라서, 가급적 화장료에서 방부제 배합량을 줄이거나 배제하고도 제품의 안정성 및 유효성이 높은 보존 기술이 요구되고 있다.

현재까지, 천연 항균성 물질에 대한 연구로는 향료, 우유 및 어류 등의 식품류, 정유, 한약재 등으로부터 많은 천연항균성물질이 보고되었고, Alkaloid, flavonoid, phytoalexin, 항균 펩타이드에 대한 것도 보고되었고, 많이 알려진 천연 방부제로는 유기산, 지방산, 저급지방산, 라이소자임, 락토페인, 박테리오신 등의 항균성에 대한 것도 보고되었다. 천연 방부제로 실용화된 것으로는 미국의 Chemi-research 사가 개발한 자몽종자 오일(Grandfruit Seed Extract; GFSE)로 제조된 DF-100이 있다. 그러나 천연물질로서의 한계성 즉 냄새, 색상, 안정성 저하, 좁은 항균스펙트럼, 제형상의 문제점, 많은 사용량 등의 물리적, 경제적 문제로 인하여 대부분이 상용화 되지 못하고 있어 보다 진보된 천연항균제의 연구가 필요한 실정이다.따라서, 기존의 화학 방부제가 가지는 부작용을 해결하고, 기존 천연 항균제 등의 화장품 원료로서의 문제점을 극복하기 위해 본 발명자는 천연 식물을 대상으로 항균 활성뿐만 아니라, 화장품 원료로서의 특성을 연구하던 중 연잎추출물, 비파엽 추출물, 비파종자 추출물, 비파나무 추출물을 적절히 배합하여 사용할 경우, 세균 및 곰팡이, 효모를 포함한 진균류에 대해 매우 우수한 항균 활성을 나타내며, 항균 스펙트럼이 매우 넓어 화장료에 대한 방부능력이 탁월함을 알 수 있었고, 항산화, 항노화 활성이 있을 뿐 아니라 또한 물리화학적인 안정성 및 화장료 제형에 미치는 영향이 매우 적고, 기존 화학 방부제에 비해 피부 자극 가능성이 매우 낮은 다기능 방부 활성을 갖는 화장료 조성물을 개발하게 되었다.

본 발명은 연잎추출물, 비파엽 추출물, 비파종자 추출물, 비파나무 추출물을 복합적으로 사용하거나 적절한 비율로 혼합하여, 천연 혼합추출물을 제조하는 방법 및 이를 이용한 항산화, 항노화 기능을 갖는 다기능성 방부 활성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 항균 및 방부 활성을 갖는 추출물을 이용한 화장료 조성물에 관한 것으로 연잎추출물 0.01내지 80중량%를 함유하는 추출물은 비파엽 추출물 0.01 내지 20중량%, 비파종자 추출물 0.01 내지 20중량%, 비파나무 추출물 0.01 내지 20중량%로 이루어진 군중에서 선택되는 2종 이상의 추출물을 혼합하여 항산화, 항노화 활성을 가진 다기능 천연 항균 및 방부 활성을 가지는 화장료 조성물이다.

상기 화장료 조성물은 연잎추출물을 포함하고 비파엽 추출물, 비파종자 추출물, 비파나무 추출물을 적절한 비율로 혼합한 것으로서 추출물 간의 상호협력 작용에 따른 우수한 항균 활성을 나타내 주어 다기능성 천연 방부제로서 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 연잎은 수련과의 여러해살이 수생식물인 연꽃(Nelumbo nucifera Gaertn.)의 잎 부위로 성미는 달고 떫으며 평범하다. 장수와 건강의 상징일 뿐 아니라, 명예와 영생, 행운을 나타내기도 하는 연의 잎은 인도와 이집트 같은 열대지방이 원산지로 우리나라를 비롯하여 일본, 중국, 시베리아 등 동양의 여러 나라에서 널리 재배한다. 연잎은 가능한 6월 초순부터 10월 중순에 채취하게 되는데 통상 연잎은 6월 초순에 나기 시작해서 10월 중순이 되면 연잎이 퇴색하기 때문에 가능한 그 전에 채취하여 사용한다. 연의 잎에는 로에메린(roemerine), 누씨페린(nuciferine), 노르누씨페린(nornuciferine), 아르메파빈(armepavine), 프로투씨페린(pronuciferine), N-노르누씨페린(N-nornuciferine), D-N-메틸코클라우린(D-Nmethylcoclaurine), 아노나인(anonaine), 리리오데닌(liriodenine), 쿠에르세틴(quercetin), 이소쿠에르시트린(isoquercitrin), 네룸보시드(nelumboside), 타타르산(tataric acid), 말산(malic acid), 글루콘산(gluconic acid), 아세트산(acetic acid), 숙신산(succinic acid) 등이 알려져 있고, 약리작용으로 서열번갈을 치료하며, 토혈과 하열에 대하여 지혈 효과가 있으며, 여름에 설사를 그치게 하고 두통과 어지럼증을 해소시킨다. 또한, 토혈, 코피, 대변출혈, 자궁출혈을 그치게 하고, 산후에 어혈로 인한 어지럼증을 치료하는데 이용되었다.

본 발명의 비파(Eriobotrya japonica L.)는 장미과의 상록 교목으로 원산지는 일본과 중국이며, 우리나라에서는 제주도, 경남 및 전남지방 등 온화한 기후 조건에서 주로 자생하고 예로부터 민간요법으로 청폐, 진해, 거담, 건위, 이뇨, 패혈해소, 기관지염, 구역질, 딸국질, 각종암, 복수, 각종출혈, 신장염, 고혈압, 방광염, 이뇨, 천식, 간염, 황달 및 부종 등에 효능이 있다고 알려져 있다. 또한 비파 잎에는 털페노이드와 플라보노이드 등의 유용한 화합물을 다량 함유하고 있어 항산화, 항염증, 항주름, 여드름 개선, 항HIV, 항균, 항돌연변이 및 항암활성이 보고되고 있다.

본 발명에 사용된 연잎, 비파엽, 비파종자, 비파나무로부터 침출, 전출하여 얻은 침출액, 또는 그 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또는 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출액 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

본 발명의 연잎추출물, 비파엽 추출물, 비파종자 추출물, 비파나무 추출물은 시료를 세절하여 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로파놀, 헥산, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 아세토나이트릴, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 페트로레움에테르, 디에틸에테르, 글리세린으로 이루어진 군으로부터 어느 하나이거나 이들 중 둘 이상의 용매로 추출한 것이다.

추출방법은 건조하여 세절한 시료를 안정적인 온도에서 용매하에 침지시키거나 냉각콘덴서가 장착된 추출기에서 가온 환류 추출한 후, 여과하여 60도시 이하에서 감압농축하고 감압 농축물을 동결 건조하여 제조한다. 또한, 추출공정 수행 후 저온 숙성 또는 고온 숙성하는 공정을 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기의 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않고 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분등을 함유하는 것도 무방하다. 상기 연잎, 비파엽, 비파종자, 비파나무 추출물은 조성물 전체에 대하여 동결건조 중량 기준 0.01 내지 20 중량%로 조성물에 존재할 수 있다.

만약 상기 식물추출물이 추출물을 함유하는 나노캡슐, 마이크로캡슐, 나노좀등의 제형으로 용액 또는 파우더 형태로 존재한다면 당업자는 상기 농도 범위 내에서 본 발명에 따른 조성물 내에 이 용액 또는 파우더의 양을 조절할 수 있을 것이다. 상기한 바와 같이 광범위한 항균 스펙트럼을 갖는 본 발명에 따른 항균 조성물로 가공된 화장품, 식품, 의약품, 농약, 생활용품 등에 제공된다. 본 발명의 항균 조성물은 피부외용제로서 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 유연화장수, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩 또는 보디 오일 등의 기초 화장료 및 파운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 화장료를 세정제로 사용할 경우, 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다. 이하 본 발명을 하기 위해 실시예와 실험예를 통하여 상세하게 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 연잎 추출물을 포함하고 비파엽 추출물, 비파종자 추출물, 비파나무 추출물 중 2가지 이상을 적절한 비율로 함유하여, 단독 추출물보다 매우 우수한 항균 활성을 나타내며, 항균 스펙트럼이 넓어 화장료에 대한 방부 능력이 우수며, 화학 방부제를 첨가하지 않아 피부 자극 유발 가능성이 매우 낮은 생체 친화적 화장료 조성물이다. 또한, 연잎 추출물과 비파 혼합 추출물의 복합 추출물에 의한 항산화, 자외선에 의한 항노화 활성이 우수하여, 다기능성 방부 목적으로 유용하게 이용 가능하다.

<실시예 1> 연잎추출물의 제조

건조 중량 200g의 분쇄한 연잎을 10배 양의 증류수를 가하여 95도시에서 3시간 가온 환류 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다. 각 추출물은 냉침한 후, 8마이크로미터 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하였다. 이 여과된 추출액을 60도시이하에서 감압농축한 후 감압건조기를 이용해 완전히 건조시켜 연잎 추출물을 수득하였다

<실시예 2> 비파나무, 비파엽, 비파종자 추출물의 제조

건조 중량 200g의 분쇄한 비파나무, 비파엽, 비파종자를 10배 양의 증류수를 가하여 95도시에서 3시간 가온 환류 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다. 각 추출물은 냉침한 후, 8마이크로미터 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하였다. 이 여과된 추출액을 60도시 이하에서 감압농축한 후 감압건조기를 이용해 완전히 건조시켜 비파나무, 비파엽, 비파종자 추출물 추출물을 수득하였다

<실시예 3> 혼합추출물의 제조

혼합추출물을 제조하기 위한 연잎과 비파나무, 비파엽, 비파종자의 배합 중량비율은 1-10: 0.05-5: 0.05-5: 0.05-5 의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 이들 혼합물 건조중량의 10배 양의 증류수를 가하여 95도시에서 3시간 가온 환류 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다. 각 추출물은 냉침한 후, 8마이크로미터 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하였다. 이 여과된 추출액을 60도시 이하에서 감압농축한 후 감압건조기를 이용해 완전히 건조시켜 비파나무, 비파엽, 비파종자 추출물을 수득하였다

<실험예 1> 항균활성 검정

상기 추출물들의 항균 활성 스펙트럼을 조사하기 위해 원판 확산법 (Kirby-Bauer method)를 이용하였다. 사용한 균주로는 그람양성균으로 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus ATCC 6538P), 그람음성균으로 대장균 (Escherichia coli ATCC 8739), 효모로는 캔디다 효모 (Candida albicans ATCC 10231), 곰팡이로는 Aspergillus niger (ACTCC 22343)을 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양 받아 사용하였다.

세균은 레신 액체 배지(Letheen broth)를 사용하였고 배지에 균을 접종하여 37도시 진탕 배양기에서 24시간 동안 접종 배양하여 사용하였다. 효모는 와이엠 액체 배지 (YM Broth)를 사용하였고, 배지에 균을 접종하여 25도시 진탕배양기에서 2일간 전배양하여 사용하였다.

보다 구체적인 항균시험은 먼저 세균의 경우, 레신 액체 배지 (Letheen broth)에 균을 접종하여 35도시에서 24시간 전배양하여 준비하고, 효모의 경우, 와이엠 액체 배지 (YM broth)에 균을 접종하여 25도시에서 2일간 전배양한 후, 멸균된 식염수에 희석하여 세균은 약 1x10⁶ CFU의 균 농도로 각각의 한천평판배지에 도말하고 효모는 약 1x10⁵ CFU의 균 농도로 한천평판배지에 도말한다. 그 위에 0,1, 5, 10% 로 농도를 달리한 추출용액에 침지하여 포화시킨 후, 고체배지 위에 8mm 페이퍼 디스크 (paper disc)를 일정한 간격으로 놓는다. 그 다음, 세균은 35도시에서 48시간 동안 배양하고 효모는 25도시에서 72시간 배양한 후 디스크 주위의 투명대 (clear zone)의 크기 (mm)를 측정하여 비교하였다.

각각의 균주에 대한 연잎의 항균 활성 능력

구분	항균스펙트럼(mm)
구분	S. aureus	E. coli	P. aeuginosa	C. albicans	A. niger
연잎 추출물	9	10	8.5	8	9.5
비파엽	10.5	11	10	10	10
비파종자	8	15	10.5	9.5	8
비파나무	8	8	9	9	8
혼합추출물	10	11	10	10	10

<실험예 2> 항균력 시험 (MIC)

상기 추출물들의 항균력을 평가하기 위하여 농도별로 저해력을 측정하여 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 를 확인하였다. 사용한 균주로는 그람양성균으로 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus ATCC 6538P), 그람음성균으로 대장균 (Escherichia coli ATCC 8739), 효모로는 캔디다 효모 (Candida albicans ATCC 10231), 곰팡이로는 Aspergillus niger (ACTCC 22343)을 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양 받아 사용하였다. 항균활성 검정시에 사용한 균주이고 균주마다 배양준비과정은 상기 방법과 동일하다.

보다 구체적으로는 일반세균은 트립틱 소이 브로스에 각 균주를 접종하여 35도시 진탕 배양기에서 24시간 배양 후, OD 600nm 값으로 농도를 측정한 후 최종농도 1x106 cells/ml 로 상기 추출물들이 농도별로 함유된 배지에 접종하였다. 그런 다음 35도시, 48시간 배양한 후 육안으로 미생물의 증식이 확인되지 않은 농도를 결정하여 최소저해농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 진균류는 30도시, 72시간 배양하였고 상기와 같은 방법으로 수행하였다.

각각의 균주에 대한 연잎 추출물에 대한 MIC 측정

구분	최소저해 농도(ppm)
구분	S. aureus	E. coli	P. aeuginosa	C. albicans	A. niger
연잎 추출물	25	50	300	250	450
비파엽	25	50	100	200	400
비파종자	50	50	150	300	500
비파나무	100	100	300	>1000	>1000
혼합추출물	25	50	100	200	400

<실험예 3> 연잎과 비파 혼합 추출물의 항산화 활성

<3-1> 항산화 활성

500 uM DPPH (2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 용액을 에칠 알콜에 녹여 여과한 후 즉시 사용하였다. 제조된 DPPH 용액과 시료 용액을 1:1로 혼합하여 격렬하게 섞은 후, 상온 암소에 20 분간 방치하였다. 540 nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 수학식 1를 통해 DPPH 라디칼 제거율(%)을 산출하였다. 이때 라디칼을 제거하는 양성 대조군(positive control)으로 1 mM의 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다.

(수학식)

DPPH 라디칼 제거율(scavenging,%) = (A - B) / A x 100

상기 식에서, A는 공시험액에서 얻은 흡광도이고, B는 검액에서 얻은 흡광도임

연잎, 비파 혼합물, 연잎과 비파 혼합물 추출물의 항산화 활성 비교

농도(%)	항산화력(%)
농도(%)	연잎 추출물	비파 혼합물 추출물	연잎+비파혼합추출물
0.0005	50%	30.9%	60%
0.001	75.1%	74.1%	83.3%
0.01	92.1%	82.7%	95%

항산화 활성을 살펴보기 위해서 연잎추출물, 비파 혼합물(비파엽, 비파종자, 비파나무), 연잎과 비파 혼합물을 함께 처리한 경우를 비교한 결과, 표 1 에 나타난 바와 같이 단독으로 처리한 경우보다 연잎 추출물과 비파 혼합 추출물을 함께 처리하였을 때 항산화 효과가 높게 나타났다.

<실험예 4> 자외선에 의한 항노화 활성

<4-1> 콜라겐 생합성 평가

시료에 대한 Fibroblast 세포 내에서 새로 생성되는 collagen 양을 측정하기 위해 procollagen assay 를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 1% Antibiotic-Antimycotic (AA, Welgene, Korea)과 10% Fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37 도시, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 2x10⁵ 농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 무혈청 배지를 처리하여 24시간 동안 starvation 시킨다. 24시간 후, 무혈청 배지를 제거하고 PBS로 세척한후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, 시료를 phenolred free DMEM 배지에 농도 별로 처리하여 48시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 50 uM 을 positive control 로, UV(+)군을 Negative control 로, 배지만 처리한 그룹을 control 로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 추출물 처리 후 48시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio Inc. MK101) 를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. Antibody-POD conjugate solution 100ul를 각 well에 첨가하고, sample이나 standard를 20ul씩 넣은 뒤 잘 섞어서 37도시에서 3시간 방치하였다. 반응이 끝나면 내용물을 제거한 뒤 PBS 400ul로 4번 세척하였다. 제거 후 기질용액 100ul를 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 뒤 stop solution 100ul 첨가하여 부드럽게 섞어주었다, 450nm에서 흡광도를 측정한 후 표준 농도곡선을 작성하여 콜라겐 양을 산정하였다(표 4).

연잎 추출물, 비파 혼합 추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 콜라겐 생합성

시험군	procollagen conc.(ug/ml)
시험군	0.0004%	0.002%
UV(+)	78
AS 25uM	101
연잎추출물	118	125
비파complex	112	120
연잎+비파complex	145	160

표 4 에 나타난 바와 같이 추출물들의 자외선에 의한 자극에 의한 항노화 활성을 살펴보기 위해서 연잎 추출물, 비파 혼합 추출물 (비파나무, 비파엽, 비파종자), 연잎 추출물과 비파 혼합 추출물을 함께 처리하였을 경우를 비교하였다. 연잎 및 비파 혼합추출물 단독으로 처리했을 때보다 연잎추출물과 비파 혼합 추출물을 함께 처리하였을 경우에 새로 생성되는 콜라겐양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 연잎 추출물과 비파 혼합 추출물을 함께 처리했을 경우에 다기능성 방부제 가능성을 시사해준다.

<4-2> MMP-1 저해 평가

Collagen 을 분해하는 효소는 그 종류가 다양하며 가장 많이 알려져 있는 것이 collagen type I을 분해하는 MMP-1 (Matrix metalloproteinase I, collagenase)으로 이를 측정하기 위해 MMP-1 assay 를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 1% Antibiotic-Antimycotic (AA, Welgene, Korea)과 10% Fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37 도시, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 2x10⁵ 농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 무혈청 배지를 처리하여 24시간 동안 starvation 시킨다. 24시간 후, 무혈청 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, 시료를 phenolred free DMEM 배지에 농도 별로 처리하여 48시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 50 uM 을 positive control 로, UV(+)군을 Negative control 로, 배지만 처리한 그룹을 control 로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 추출물 처리 후 48시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 MMP-1 측정 키트 (RPN 2610, Amersham Bioscience, UK) 를 이용하여 ELISA reader 로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Anti-MMP1 antibody로 코팅된 96 well plate에 buffer를 well 하나에 첨가하여 blank로 삼고, 배지 중에 유리된 샘플과 표준액 100ul를 각각의 well 에 넣는다, 실온에서 shaking 없이 2시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 3회 반복해서 세척 한 후 물기를 완전히 제거한다. 100ul peroxide conjugate를 첨가하고, 실온에서 shaking 없이 2시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 30분간 shaking 하면서 반응시킨다. 100ul 1M H2SO4로 반응을 중지시킨 후 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다(표 5).

연잎 추출물, 비파 혼합 추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 MMP-1 활성 저해도

시험군	MMP-1 (% of control)
시험군	0.0004%	0.002%
UV(+)	100
AS 50uM	73
연잎	95	85
비파complex	115	90
연잎+비파complex	80	75

표 5 에 나타난 바와 같이 추출물들의 자외선에 의한 자극에 의한 항노화 활성을 살펴보기 위해서 MMP-1을 측정하여 연잎 추출물, 비파 혼합 추출물 (비파엽, 비파종자, 비파나무), 연잎 추출물과 비파 혼합 추출물을 함께 처리하였을 경우를 비교하였다. 연잎 및 비파 혼합추출물 단독으로 처리했을 때보다 연잎추출물과 비파 혼합 추출물을 함께 처리하였을 경우에 새로 생성되는 콜라겐양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 도면 1의 콜라겐 생합성에 상응하는 결과를 보여준다.

<실험예 5> 에멀젼 베이스 제조

상기 추출물을 함유한 화장료 및 기존 화학 방부제를 포함한 에멀젼 베이스를 제조하였다. 실험에 사용된 화장료는 유화형 화장액 형태이고, 그 조성은 표에 나타낸 바와 같다. 우선 표에 기록되어 있는 식물 추출물 또는 화학 방부제를 중량별로 첨가한 후 (가)상을 가열하여 90도시로 유지하고 정제수(30%)를 90도시까지 가열한 후 (가)수상 중에 천천히 첨가하여 호모믹서로 균일하게 유화한다. 그 후 실온까지 냉각하고 남은 (나)상의 정제수를 첨가하고 균일하게 교반하여 화장액을 제조하였다.

에멀젼 베이스 제조

구분	성분	중량%
가	글리세린	3.00
	디소듐이디티에이	0.02
	폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	1.5
	세테아릴알코올	0.5
	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	7.0
	폴리아크릴아마이드 & C13-14이소파라핀 & 라우레스-7	0.60
	항균 천연물 또는 방부제	적량
나	정제수	to 100

<실시예 4 내지 10> 항균 활성 추출물을 함유한 에멀젼 베이스의 제조

실험예 5의 방법으로 표 7의 조성에 따라 실시예 4 내지 10의 상기 추출물 첨가량을 함유한 에멀젼 베이스를 제조하였다.

항균 활성 추출물을 함유한 에멀젼 베이스의 제조

성분	실시4	실시5	실시6	실시7	실시8	실시9	실시10
연잎 추출물	1%	-	-	-	0.5%	0.5%	0.5%
비파엽	-	1%	-	-	0.5%	-	-
비파종자	-	-	1%	-	-	0.5%	-
비파나무	-	-		1%	-	-	0.5%

<실시예 11 내지 14> 항균 활성 추출물을 함유한 에멀젼 베이스의 제조

실험예 5의 방법으로 표 8의 조성에 따라 실시예 11 내지 14의 상기 추출물 첨가량을 함유한 에멀젼 베이스를 제조하였다.

<비교예 1 내지 2> 에멀젼 베이스의 제조

실험예 5의 방법으로 표 8의 조성에 따라 화학 방부제를 함유한 비교예 1과 화학방부제 및 상기 추출물을 함유하지 않은 비교예 2의 에멀젼 베이스를 제조하였다.

항균 활성 추출물을 함유한 에멀젼 베이스의 제조

성분	실시11	실시12	실시13	실시14	비교예1	비교예2
연잎 추출물	0.5%	0.5%	0.5%	0.25%	-	-
비파엽	0.25%	0.25%	-	0.25%	-	-
비파종자	-	0.25%	0.25%	0.25%	-	-
비파나무	0.25%	-	0.25%	0.25%	-	-
메칠 파라벤	-	-	-	-	0.4%	-
프로필 파라벤	-	-	-	-	0.2%	-
페녹시에탄올	-	-	-	-	0.4%	-
정제수	-	-	-	-	-	1%

<실험예 6> 제형 내 방부력 실험 (Challenge test)

상기 추출물을 함유한 제형 내 방부력을 알아보기 위해, 실시예 8 내지 14, 비교예 1, 비교예 2에서 제조한 에멀젼 베이스의 방부활성 확인 시험을 수행하였다. 방부제 유효성 테스트는 소비자에게 피부 자극을 일으키지 않고 제품을 안전하게 보존하는데 필요로 하는 방부제의 최소농도를 찾기 위한 이유로 제품의 안전성과 소비자 수용에 있어 중요하다. 화장품의 방부력을 측정하는 방법으로 유에스피(USP)와 씨티에프에이(CTFA)의 방법을 많이 사용한다. 본 시험 방법은 미국화장품공업협회 (Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, 이하 CTFA) 의 미생물 가이드라인의 시험법을 사용하였다. 사용한 균주로는 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus ATCC 6538P), 그람음성균으로 대장균 (Escherichia coli ATCC 8739), 효모로는 캔디다 효모 (Candida albicans ATCC 10231), 곰팡이로는 Aspergillus niger (ACTCC 22343)을 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양 받아 사용하였다.

세균은 35도시, 효모는 25도시 의 배양조에서 각각 24시간 내지 72시간 배양한 후, 0.8% 생리식염수로 현탁하여 세균은 약 1x10⁶ CFU, 효모는 1x10⁵ CFU가 되도록 하였다. 실시예 5 내지 14, 비교예 1 내지 2의 각각 에멀젼 베이스 시료 10g에 세균 4종 혼합현탁액과 효모 1종, 곰팡이 1종을 각각 100ul씩 접종한다. 이 후, 접종된 각각의 시료는 실온에서 보관하며, 1일, 2일, 3일, 7일, 14일 21일, 28일 경과 시마다 무균 조작 하에서 시료 1g을 채취하여 희석액으로 적절히 희석하고 세균 및 진균류를 고체배지에서 각각 35도시, 25도시에서 24 내지 72시간 배양 후 계수 하였다. 방부력 유효성으로 세균은 접종 7일 이내 99.9% 이상 균수가 감소해야 하며, 시험기간 동안 증식이 없어야 한다. 또한 진균은 접종 7일 이내 최소 90% 이상 균수가 감소해야 하며, 시험 기간 동안 증식하지 않아야 한다. 그 결과를 표 9, 표 10 에 나타내었다.

화장품 제형내 방부력 측정

구분	세균수(cells/ml)
구분	3일	1주	2주	3주	4주
실시예 8	2x10²	<100	0	0	0
실시예 9	3x10²	<100	<100	0	0
실시예 10	4x10⁴	2x10³	1x10²	<100	<100
실시예 11	3x10³	1x10²	<100	0	0
실시예 12	1x10²	<100	0	0	0
실시예 13	1x10³	<100	0	0	0
실시예 14	2x10³	<100	0	0	0

상기 표 9에 나타난 바와 같이 에멀젼 베이스 제형으로 제조한 실시예 10, 11에서는 세균류 사멸에 있어 매우 약한 매우 약한 방부활성을 가지는 것으로 나타났으나, 실시예 8, 9, 12-14 에서는 상대적으로 7일 경과 후에는 모두 사멸시켜 적절한 방부활성을 가지고 있는 것으로 확인되어 연잎추출물 및 비파나무, 비파엽, 비파종자 추출물이 상호 협력 작용에 의해 방부력이 우수해진 것으로 판단된다.

화장품 제형내 방부력 측정

구분	진균수(cells/ml)
구분	3일	1주	2주	3주	4주
실시예 8	4x10⁴	<100	0	0	0
실시예 9	7x10⁴	<100	<100	0	0
실시예 10	6x10⁴	2x10³	1x10²	<100	<100
실시예 11	8x10³	7x10³	2x10²	<100	<100
실시예 12	2x10³	<100	0	0	0
실시예 13	4x10³	<100	0	0	0
실시예 14	3x10³	<100	0	0	0

상기 표 10 에 나타난 바와 같이 에멀젼 베이스 제형으로 제조한 실시예 9-11 에서는 진균류 사멸에 있어 매우 약한 매우 약한 방부활성을 가지는 것으로 나타났으나, 실시예 8, 12, 13, 14 에서는 상대적으로 14일 경과 후에는 모두 사멸시켜 표 9의 세균류에 대한 방부력과 유사한 성향으로 적절한 방부력 결과를 보였다.

Claims

연잎추출물을 포함하고 비파엽 추출물, 비파종자 추출물, 비파나무 추출물 중에서 선택되는 2종 이상의 식물의 추출물을 포함하는 다기능성 항균 조성물.
제 1항에 있어서, 연잎추출물 0.01 내지 80중량%를 함유하고, 비파엽 추출물 0.01내지 20중량%, 비파종자 추출물 0.01 내지 20중량%, 비파나무 추출물 0.01 내지 20중량%로 이루어진 군중에서 선택되는 2종 이상의 혼합물에 물 또는 유기용매 중 어느 하나이거나 이들의 혼합물을 가하여 추출한 천연 항균, 방부 활성 및 항산화, 항노화 활성을 갖는 화장료 조성물.
제 1항 내지 2항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로파놀, 헥산, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 아세토나이트릴, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌3글리콜, 페트로레움에테르, 디에틸에테르, 글리세린 중 어느 하나이거나 이들 중 둘 이상의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 천연 항균, 방부 활성 및 항노화 활성을 갖는 혼합 추출물.
제 1항 내지 2항에 있어서, 상기 식물 추출물이 추출물을 함유하는 나노캡슐, 마이크로캡슐, 나노좀 등의 제형으로 항균 및 방부 활성을 갖는 화장료 조성물
제 1항 내지 2항에 있어서, 상기 화장료 조성물의 제형은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유(O/W) 또는 유중수(W/O)형의 에멀젼, 페이스크성 또는 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 또는 비이온성 형태의 지질 소포체의 형태, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩 또는 보디오일 등의 기초 화장료, 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 등의 색조 화장료 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항균 및 방부 활성을 가지는 화장료 조성물.
제 1항 내지 2항에 있어서, 항균 조성물을 사용하여 제조된 화장품, 식품, 의약품 또는 생활용품