KR20130033273A - A fusion monoclonal antibody comprising igf-r1 antibody and il-2, and pharmaceutical composition comprising the same - Google Patents

A fusion monoclonal antibody comprising igf-r1 antibody and il-2, and pharmaceutical composition comprising the same Download PDF

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Abstract

PURPOSE: A fusion monoclonal antibody containing anti-IGF-1R monoclonal antibody and IL-2 and a composition containing the same for cancer treatment area provided to strongly activate immunocytes around cancer cells and to ensure antibody-dependent cytotoxicity. CONSTITUTION: A fusion monoclonal antibody contains IL-2 and an antibody which specifically binds to IGF-1R(Insulin like growth factor-1 receptor). The antibody is an IgG type and a scFv(single-chain variable fragment) type. The IL-2 is linked at the C-terminal of an Fc region of the antibody. A composition for cancer treatment contains the fusion monoclonal antibody as an active ingredient. The composition additionally contains a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluents.

Description

항 ＩＧＦ-1Ｒ 단일클론 항체와 ＩＬ-2를 포함하는 융합 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암치료용 조성물{A fusion monoclonal antibody comprising IGF-R1 antibody and IL-2, and pharmaceutical composition comprising the same}A fusion monoclonal antibody comprising IGF-R1 antibody and IL-2, and pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 항 IGF-1R 단일클론 항체와 IL-2를 포함하는 융합 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 항 IGF-1R 단일클론 항체와 면역세포의 활성을 증가시키는 IL-2가 결합된 융합 단일클론 항체, 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법 및 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a fusion monoclonal antibody comprising an anti-IGF-1R monoclonal antibody and IL-2, and to a composition for treating cancer comprising the same. More specifically, the present invention specifically relates to IGF-1R, a cancer cell surface antigen. A fusion monoclonal antibody to which an anti-IGF-1R monoclonal antibody which can bind and IL-2 which increases the activity of immune cells, a gene encoding the fusion monoclonal antibody, an expression vector comprising the gene, the expression The present invention relates to a transformant having a vector introduced therein, a method for preparing the fusion monoclonal antibody using the transformant, and a composition for treating cancer, comprising the fusion monoclonal antibody as an active ingredient.

인슐린 유사 성장인자(Insulin like growth factor) 1 및 2("IGF-1" 및 "IGF-2")는 혈장내에 존재하는 약 7.5kDa 크기의 폴리펩티드로서, 대부분의 조직에서 검출되고, 매우 다양한 포유동물 세포의 분화 및 증식을 촉진한다고 알려져 있다. 상기 IGF-1 및 IGF-2는 모두 세포표면에 위치한 IGF-1 수용체(IGF-1R, Insulin-like growth factor 1 receptor)에 결합하여 세포의 작용을 조절할 뿐만 아니라 초기 분화에서 중요한 역할을 수행하지만, 정상 성체에서는 특별히 중요한 역할을 수행하지는 않는 것으로 알려져 있다. Insulin like growth factor 1 and 2 ("IGF-1" and "IGF-2") are polypeptides of about 7.5 kDa size that are present in plasma and are detected in most tissues and vary widely in mammals. It is known to promote differentiation and proliferation of cells. Both IGF-1 and IGF-2 bind to IGF-1 receptors (IGF-1R, Insulin-like growth factor 1 receptors) located on the cell surface, not only to regulate the action of cells but also play an important role in early differentiation. It is not known to play a particularly important role in normal adults.

IGF-1R은 알파 서브유닛과 베타 서브유닛으로 구성되는데, 알파 서브유닛은 세포막 외부에 존재하여 IGF-1 및 IGF-2와 직접적으로 결합하는 약 130-135kDa의 크기를 가지는 폴리펩티드이고, 베타 서브유닛은 막투과 영역과 티로신 키나제 활성을 가지는 세포질 영역으로 구성되는 약 95kDa의 크기를 가지는 폴리펩티드이다. 기능적으로 볼 때, 상기 IGF-1R은 티로신 키나아제 성장인자 수용체 군에 속하고, 인슐린 수용체와 구조적으로 유사하다고 알려져 있다. 상기 IGF-IR은 처음에는 단일쇄(single chain) 프로수용체(proreceptor) 폴리펩타이드로서 합성된 다음 글라이코실화, 단백질 분해에 의해 가공되며 공유결합되어 2개의 알파 서브유닛과 2개의 베타 서브유닛을 포함하는 성숙한 460kDa 헤테로테트라머(heterotetramer)를 형성한다.IGF-1R consists of an alpha subunit and a beta subunit, which is a polypeptide having a size of about 130-135 kDa that is external to the cell membrane and directly binds to IGF-1 and IGF-2, and the beta subunit Is a polypeptide having a size of about 95 kDa consisting of a transmembrane region and a cytoplasmic region having tyrosine kinase activity. Functionally, the IGF-1R belongs to the tyrosine kinase growth factor receptor family and is known to be structurally similar to the insulin receptor. The IGF-IR is first synthesized as a single chain proreceptor polypeptide and then processed by glycosylation, proteolysis and covalently bound to contain two alpha subunits and two beta subunits. To form a mature 460 kDa heterotetramer.

한편, 성체에서 IGF-1, IGF-2, IGF-1R 등이 비정상적으로 활성화되는 경우에는 암의 발생과 관련성이 있는 것으로 보고되었다. 특히, IGF-1R은 유방암, 폐암, 대장암, 전립선암, 자궁암 등 다양한 암 환자의 조직에서 과발현 된다고 보고되고 있으며, 최근에 발표된 논문에 의하면 조사 대상 181명의 유방암 환자 중 절반 이상인 109명에서 IGF-1R를 과발현하고 있다고 보고하고 있어, IGF-1R가 훌륭한 유방암 바이오마커(biomarker)로 사용될 수 있을 가능성을 강하게 제시하고 있어, 항암제의 표적(target)으로 최근에 관심이 집중되고 있다. 예를 들어, WO 2002/53596, WO 2005/016967 및 WO 2006/01347 에는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체 또는 인간의 단클론 항체 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물이 개시되어 있고, WO 2006/138729에는 환자에게 IGF-1R 길항제 및/또는 PDGFRα 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 골암을 치료하는 방법이 개시되어 있으며, WO 2010/066868에는 사람 IGF-1에 결합하고 IGF-2와 교차반응하여 IGF-1 수용체에 대한 IGF-1 및 IGF-2의 결합을 방해하고 IGF-1 수용체를 통한 신호전달을 억제하는 인간 항체 및 상기 인간 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 상기 IGF-1R을 표적으로 하는 다양한 항암제는 암세포의 치료효과가 특별히 우수하지 못하기 때문에 아직까지는 상업적으로 이용되지 않고 있는 실정이다.On the other hand, the abnormal activation of IGF-1, IGF-2, IGF-1R, etc. in adults has been reported to be associated with the occurrence of cancer. In particular, IGF-1R has been reported to be overexpressed in tissues of various cancer patients such as breast cancer, lung cancer, colon cancer, prostate cancer and uterine cancer. According to a recently published study, 109 of the 181 breast cancer patients, -1R overexpression, suggesting that IGF-1R can be used as a good breast cancer biomarker, and attention has recently been focused on the target of anticancer drugs. For example, WO 2002/53596, WO 2005/016967 and WO 2006/01347 disclose an antibody or human monoclonal antibody specifically binding to IGF-1R and a cancer treatment composition comprising the antibody as an active ingredient. WO 2006/138729 discloses a method for treating bone cancer comprising administering an IGF-1R antagonist and / or PDGFRα antagonist to a patient, and WO 2010/066868 binds to human IGF-1 and binds IGF-2. Cross-reaction with a human antibody that interferes with the binding of IGF-1 and IGF-2 to the IGF-1 receptor and inhibits signaling through the IGF-1 receptor, and a composition for treating cancer comprising the human antibody as an active ingredient Is disclosed. However, various anticancer agents targeting IGF-1R have not been used commercially yet, because the therapeutic effect of cancer cells is not particularly excellent.

IL-2는 체내에 항원이 침입했을 때 분비되어 T세포를 매개로 한 면역 반응을 촉진시키는 면역 촉진 사이토카인의 하나로, T세포의 증식 및 분화, B세포의 항체생산, NK세포의 활성화를 촉진시켜 외부 침입물질로부터 우리 몸을 방어하는 역할을 한다. 이러한 면역촉진의 기능을 이용하여 Chiron Corporation에서 recombinant IL-2를 개발하여 악성흑색종(malignant melanoma)과 신장세포암(renal cell cancer) 치료제로 판매하고 있으나, 과량(수 백 mg/kg)으로 사용할 경우 혈관 손상, 간독성을 유발하는 치명적인 부작용이 보고되고 있다. 이러한 부작용을 방지하고, 암치료에 보다 효율적인 치료제를 개발하고자 IL-2의 효능을 암발생부위에 집중시키기 위한 방법들이 개발되고 있다.IL-2 is an immune-promoting cytokine that is released when antigens invade the body and promotes a T-cell-mediated immune response.It promotes the proliferation and differentiation of T cells, the production of B cells, and the activation of NK cells. It protects our body from external invading substances. Chiron Corporation has developed recombinant IL-2 using these immune-promoting functions and sells it to treat malignant melanoma and renal cell cancer, but it can be used in excess (hundreds of mg / kg). Cases of fatal side effects causing vascular damage and hepatotoxicity have been reported. In order to prevent such side effects and to develop more effective therapeutic agents for cancer treatment, methods for concentrating the efficacy of IL-2 on cancerous sites have been developed.

예를 들어, US 7,462,350에는 항체, 항체의 일부, 알부민 등의 비-IL-2 부분과 혈청내 반감기가 증가하도록 변이된 돌연변이 IL-2 부분이 융합된 융합 단백질이 개시되어 있고, US 7,851,599에는 암마커로 알려진 EDb-피브로넥틴 도메인에 특이적인 항체의 일부가 IL-2와 융합된 융합단백질과 암치료제인 젬시타빈의 조합물을 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 돌연변이 IL-2 부분을 포함하는 융합단백질의 효과는 돌연변이된 IL-2 부분을 포함할 경우에만 나타날 수 있을 뿐, 정상적인 IL-2 부분을 포함할 경우에는 적용될 수 없다는 문제점이 있고, ED-B-피브로넥틴 도메인에 대한 항체를 포함하는 융합단백질은 IL-2의 효능을 암발생부위에 집중시키는 효과를 나타낼 수는 있으나, 항체자체는 별다른 항암효과를 나타내지 못한다는 단점이 있었다.
For example, US 7,462,350 discloses a fusion protein in which a non-IL-2 moiety, such as an antibody, a portion of an antibody, albumin, etc., and a mutant IL-2 moiety mutated to increase serum half-life are fused, and US 7,851,599 Disclosed is a composition for treating cancer comprising a combination of a fusion protein fused with IL-2 and a gemcitabine, which is a cancer treatment agent, in which a part of an antibody specific for the EDb-fibronectin domain known as a marker is an active ingredient. However, the effect of a fusion protein comprising a mutant IL-2 moiety can only be seen when including a mutated IL-2 moiety, but cannot be applied when a normal IL-2 moiety is included. The fusion protein containing the antibody against the B-fibronectin domain may have the effect of focusing the efficacy of IL-2 on the site of cancer, but the antibody itself does not show any anticancer effect.

이에 본 발명자들은 개선된 항암효과를 나타내는 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 항 IGF-1R 단일클론 항체의 카르복실 말단에 IL-2가 융합된 새로운 형태의 융합 단일클론 항체를 제조하였고, 증가된 항암 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors have made efforts to develop a therapeutic agent exhibiting an improved anticancer effect. As a result, the inventors have prepared a new type of fusion monoclonal antibody in which IL-2 is fused to the carboxyl terminus of an anti-IGF-1R monoclonal antibody. The effect was confirmed and the present invention was completed.

본 발명의 하나의 목적은 암세포 표면 항원인 IGF-1R와 특이적으로 결합하는 항체 및 IL-2가 연결된 융합 단일클론 항체를 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide an antibody that specifically binds to IGF-1R, which is a cancer cell surface antigen, and a fusion monoclonal antibody to which IL-2 is linked.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the fusion monoclonal antibody.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide an expression vector comprising the polynucleotide.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a transformant into which the expression vector is introduced.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for preparing the fusion monoclonal antibody using the transformant.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a composition for treating cancer comprising the fusion monoclonal antibody as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 IL-2가 연결된 융합 단일클론 항체를 제공한다.
As one embodiment for achieving the above object, the present invention provides a monoclonal antibody that specifically binds to IGF-1R, a cancer cell surface antigen, and a fusion monoclonal antibody to which IL-2 is linked.

본 발명의 용어, "단일클론 항체"란 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미하는데, 상기 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명의 목적상 상기 단일클론 항체는 암세포 표면항원인 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체일 수 있다. 본 발명의 암세포 표면항원인 IGF-R1에 결합할 수 있는 항체는 본 발명의 융합 단일클론 항체를 IGF-R1을 발현하는 암세포로 집중시킬 수 있을 뿐만 아니라, IGF-R1과 결합하여 그 자체로도 항암활성을 가질 수 있다. 또한, 암세포에 집중되어 상기 항체에 연결된 IL-2에 의해 면역세포를 자극하여 암세포 의존성 항암활성을 최대화시킬 수 있다. 상기 단일클론 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgT, IgY, 단일쇄 항체 등의 천연형 항체; 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키거나, 인간화 항체와 같이 체내에서 항체에 대한 거부반응을 감소시키거나 또는 항체의 안정성을 증대시키기 위하여 천연형 항체의 일부를 변이시킨 형태의 변이항체; 상기 천연형 항체의 일부를 포함하도록 구성된 재조합 항체 등이 될 수 있고, 바람직하게는 IgG 등의 천연항체, 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키도록 변이된 변이항체, 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정영역(CDR, complementarity determining region)을 포함하는 재조합 항체 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 3 또는 7의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 펩타이드, 서열번호 4 또는 8의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 펩타이드, 서열번호 5 또는 9의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 펩타이드 또는 서열번호 6 또는 10의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 펩타이드로 구성된 단일클론 항체 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 펩타이드와 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 펩타이드로 구성된 단일클론 항체, 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 펩타이드와 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 펩타이드로 구성된 단일클론 항체 등이 될 수 있다.As used herein, the term “monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of a single molecular composition obtained from substantially the same antibody population, wherein the monoclonal antibody exhibits single binding specificity and affinity for a particular epitope. For the purposes of the present invention, the monoclonal antibody may be a monoclonal antibody that can specifically bind to IGF-1R, which is a cancer cell surface antigen. The antibody capable of binding to IGF-R1, a cancer cell surface antigen of the present invention, can not only concentrate the fusion monoclonal antibody of the present invention to cancer cells expressing IGF-R1, but also bind to IGF-R1 by itself. It can have anticancer activity. In addition, it is possible to maximize cancer cell dependent anticancer activity by stimulating immune cells by IL-2 linked to the antibody concentrated on cancer cells. The monoclonal antibody is not particularly limited thereto, but may be a natural antibody such as IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgT, IgY, single chain antibody; Variant antibodies in which a portion of the native antibody is mutated to lower the dissociation constant of the antibody to the antigen, to reduce the rejection of the antibody in the body, such as a humanized antibody, or to enhance the stability of the antibody; It may be a recombinant antibody or the like configured to include a portion of the naturally-type antibody, preferably a natural antibody such as IgG, mutated antibody, which binds directly to the mutated antibody to reduce the dissociation constant value of the antibody to the antigen, It may be a recombinant antibody comprising a complementarity determining region (CDR), and more preferably, a heavy chain peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 7, a light chain peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 8 , A monoclonal antibody composed of a heavy chain peptide having an amino acid sequence encoded by a polynucleotide of SEQ ID NO: 5 or 9, or a light chain peptide having an amino acid sequence encoded by a polynucleotide of SEQ ID NO: 6 or 10, and the like. Preferably having a amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 Can be a monoclonal antibody, such as consisting of a light chain polypeptide having the monoclonal antibody, the amino acid sequence of the heavy chain peptides and SEQ ID NO: 8 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 consisting of a light chain polypeptide has the amino acid sequence of the peptide with SEQ ID NO: 4.

또한, 항체 단편이 사용될 수 있다. 본 발명의 용어, "항체 단편"은 항원결합능력을 가지는 단편, 예를 들면, Fab', F(ab')2, Fab, Fv 및 rIgG를 포함하는, 항체의 항원 결합 형태를 포함한다. In addition, antibody fragments may be used. As used herein, the term "antibody fragment" includes antigen-binding forms of an antibody, including fragments having antigen-binding ability, such as Fab ', F (ab') 2, Fab, Fv and rIgG.

아울러, 상기 항체단편은 IGF-R1과 결합할 수 있는 scFv(Single-chain variable fragment) 도메인 일 수 있다. 본 발명의 용어 “scFv”는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 갖는 최소 항체 단편을 의미하며, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다.
In addition, the antibody fragment may be a single-chain variable fragment (scFv) domain capable of binding to IGF-R1. As used herein, the term “scFv” refers to the minimum antibody fragment having a complete antigen-recognition and antigen-binding site, comprising the VH and VL domains of an antibody, wherein the domain is present in a single polypeptide chain.

본 발명의 용어, "면역세포(immunocyte)"란 항체를 만드는 세포를 의미하는데, 통상적으로 B 세포, 자연 살상 세포(Natural killer cell, NK cell) 또는 T 세포 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 면역세포는 항체의존성 세포독성 메커니즘에 작용하는 자연 살상 세포 또는 T 세포를 의미할 수 있다.As used herein, the term "immunocyte" refers to a cell that makes an antibody, and may generally be a B cell, a natural killer cell (NK cell), or a T cell. For the purposes of the present invention, the immune cells may refer to natural killer cells or T cells that act on antibody-dependent cytotoxic mechanisms.

본 발명의 용어 "인터루킨 2(Interleukin 2, IL-2)"란, Th1 세포에서 발현되고 이의 수용체는 CD25/IL2RA, CD122/IL2RB 및 CD132/IL2RG이며, 면역반응을 촉진시키고, 면역시스템에 관여하는 T 세포, B 세포, 단핵구 세포 등의 다양한 세포를 활성화시킬 수 있으며, 상기 T 세포의 성장인자로 작용할 수 있는 효과를 나타내는 15.5kD 크기의 사이토카인을 의미한다. 본 발명에서, 상기 IL-2는 상기 IGF-1R과 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체(“항-IGF-1R-mAb”)에 결합하여 본 발명의 융합 단일클론 항체를 구성하기 위한 융합파트너로서 사용되며, 이때 사용되는 IL-2는 IL-2의 활성을 나타내는 한 전체, 단편, 뮤테인(mutein) 등 일 수 있으나, 바람직하게는 IL-2 전체가 될 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 IL-2 또는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된 IL-2가 될 수 있다.
The term "Interleukin 2 (IL-2)" of the present invention is expressed in Th1 cells and its receptors are CD25 / IL2RA, CD122 / IL2RB and CD132 / IL2RG, which promote immune responses and are involved in the immune system. It refers to a 15.5kD size cytokine capable of activating various cells such as T cells, B cells, monocytes, and the like and acting as a growth factor of the T cells. In the present invention, the IL-2 binds to a monoclonal antibody (“anti-IGF-1R-mAb”) capable of specifically binding to the IGF-1R, a fusion for constructing the fusion monoclonal antibody of the present invention. Used as a partner, the IL-2 used may be whole, fragments, muteins, etc., as long as it exhibits the activity of IL-2, but may preferably be whole IL-2, most preferably IL-2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or IL-2 expressed from the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.

본 발명의 융합 단일클론 항체에 포함된 항-IGF-1R-mAb와 IL-2는 직접적으로 결합할 수도 있고, 링커를 통하여 결합할 수도 있다. 상기 항-IGF-1R-mAb과 IL-2를 직접적으로 결합하는 방법은 특별이 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 펩티드 결합, 이황화 결합 등을 이용하여 상기 두 개의 단백질을 결합시킬 수 있다.Anti-IGF-1R-mAb and IL-2 included in the fusion monoclonal antibody of the present invention may bind directly or through a linker. The method of directly binding the anti-IGF-1R-mAb and IL-2 is not particularly limited thereto, but the two proteins may be preferably bound by using peptide bonds, disulfide bonds, and the like.

본 발명의 용어, "링커(linker)"란 기본적으로는 두개의 서로 다른 융합 파트너(예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소 결합, 정전기적 상호작용, 반데르 바알스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미하는데, 바람직하게는 생리학적 조건 또는 다른 표준 펩타이드 조건(예를 들면, 펩타이드 정제 조건, 펩타이드 저장 조건)하에서 적어도 하나의 이황화 결합에 참여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있으며, 단순히 각각의 융합 파트너를 연결하는 역할 이외에도, 융합파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나 또는 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공하는 힌지의 역할을 수행할 수도 있다. 본 발명에서 상기 링커는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 항-IGF-1R-mAb과 IL-2를 연결할 수 있는 폴리펩티드 또는 상기 항-IGF-1R-mAb을 암호화하는 유전자와 IL-2를 암호화하는 유전자를 연결할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화된 폴리펩티드가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 항-IGF-1R-mAb의 Fc 영역의 C-말단과 IL-2의 N-말단을 연결할 수 있는 펩타이드성 링커가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 GGGGS 모티프가 3번 반복된 형태의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드성 링커가 될 수 있고, 상기 GGGGS 모티프는 1~10번 반복될 수 있으며, 가장 바람직하게는 하기의 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의하여 암호화된 아미노산 서열로 구성됨이 바람직하다.
As used herein, the term "linker" basically refers to two different fusion partners (e.g., biological polymers, etc.) that are hydrogen bonds, electrostatic interactions, van der Waals forces, disulfide bonds, salt bridges, It refers to a linker that can be linked using hydrophobic interactions, covalent bonds, etc., preferably to at least one disulfide bond under physiological conditions or other standard peptide conditions (eg, peptide purification conditions, peptide storage conditions). It can have at least one cysteine that can participate, and in addition to simply connecting each fusion partner, it also plays a role of providing a certain amount of spacing between fusion partners, or a hinge that provides flexibility or rigidity to the fusion. You can also do In the present invention, the linker is not particularly limited, but preferably a polypeptide capable of linking the anti-IGF-1R-mAb and IL-2 or a gene encoding the anti-IGF-1R-mAb and IL-2. It can be a polypeptide encoded by a polynucleotide capable of linking a gene encoding, more preferably can connect the C-terminus of the Fc region of the anti-IGF-1R-mAb and the N-terminus of IL-2 It may be a peptidic linker, more preferably a peptidic linker consisting of an amino acid sequence of the form repeated three times GGGGS motif, the GGGGS motif may be repeated 1 to 10 times, most preferably It is preferable that the amino acid sequence encoded by the following amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

링커 펩타이드: GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 1)Linker Peptide: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1)

링커 뉴클레오티드: 5'-GGTGGAGGTGGCAGCGGTGGTGGCGGCAGTCCCGGTGGCGGCTCC-3'(서열번호 2)
Linker nucleotide: 5'-GGTGGAGGTGGCAGCGGTGGTGGCGGCAGTCCCGGTGGCGGCTCC-3 '(SEQ ID NO: 2)

본 발명의 용어, "융합 단일클론 항체"란 단일클론 항체와 다른 펩타이드의 전체 또는 일부가 연결되어 형성된 형태를 가지고, 자연적으로는 존재하지 않는 인위적으로 생산된 단일클론 항체를 의미한다. 본 발명에서는 “융합 단일클론 항체”라는 용어를 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론 항체와 IL-2가 직접적으로 또는 링커를 통하여 간접적으로 연결된 형태의 융합 단백질을 지칭할 때 사용되는데, 이때, IL-2가 직접적으로 또는 링커를 통하여 간접적으로 연결되는 부위는 상기 단일클론 항체의 모든 부위가 될 수 있고, 특정부위에 제한되지 않으며, 바람직하게는 Fc 부분, Fab', F(ab')2, Fab, Fv 등이 될 수 있고, 상기 융합 단일클론 항체는 면역세포를 자극함과 동시에 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 나타낸다. As used herein, the term “fused monoclonal antibody” refers to an artificially produced monoclonal antibody which has a form in which all or part of a monoclonal antibody and other peptides are linked to each other and does not exist naturally. In the present invention, the term “fusion monoclonal antibody” refers to a fusion protein in a form in which a monoclonal antibody specifically binding to IGF-1R, a cancer cell surface antigen, and IL-2 are directly or indirectly linked through a linker. In this case, a site where IL-2 is directly or indirectly linked through a linker may be any site of the monoclonal antibody, and is not limited to a specific site, preferably, the Fc moiety, Fab ′, F (ab ') 2, Fab, Fv and the like, the fusion monoclonal antibody exhibits the property of stimulating immune cells and at the same time specifically binding to IGF-1R, a cancer cell surface antigen.

상기 융합 단일클론 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 항-IGF-1R-mAb의 전체 또는 일부와 IL-2의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 또는 항-IGF-1R-mAb의 전체 또는 일부와 IL-2의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론 항체가 될 수 있다. The fusion monoclonal antibody is not particularly limited thereto, but a fusion monoclonal antibody in a form in which all or a portion of the anti-IGF-1R-mAb and all or a portion of IL-2 are linked to each other; Or a fusion monoclonal antibody in a form in which all or a portion of the anti-IGF-1R-mAb and all or a portion of the IL-2 are linked by a peptide linker.

바람직하게는 상기 융합 단일클론 항체는, 항-IGF-1R-mAb의 중쇄의 전체 또는 일부와, IL-2의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄의 전체 또는 일부와, IL-2의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 중쇄의 전체 또는 일부와, IL-2의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄의 전체 또는 일부와, IL-2의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.Preferably, the fusion monoclonal antibody comprises a fusion monoclonal antibody in a form in which all or part of the heavy chain of anti-IGF-1R-mAb and all or part of IL-2 are linked; Fused monoclonal antibodies in a form in which all or a portion of the light chain of anti-IGF-1R-mAb is linked to all or a portion of IL-2; Fused monoclonal antibodies in the form in which all or part of the heavy chain of anti-IGF-1R-mAb and all or part of IL-2 are linked by a peptide linker; Fused monoclonal antibodies in the form in which all or part of the light chain of anti-IGF-1R-mAb and all or part of IL-2 are linked by a peptide linker; Or a combination thereof.

보다 바람직하게는 상기 융합 단일클론 항체는, 항-IGF-1R-mAb의 중쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL-2의 전체 또는 일부의 N-말단이 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL-2의 전체 또는 일부의 N-말단이 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 중쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL-2의 전체 또는 일부의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL-2의 전체 또는 일부의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론 항체; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.More preferably, the fusion monoclonal antibody is a fusion monoclonal antibody in a form in which the C-terminus of all or part of the heavy chain of anti-IGF-1R-mAb and the N-terminus of all or part of IL-2 are linked; Fused monoclonal antibodies in a form in which the C-terminus of all or part of the light chain of anti-IGF-1R-mAb and the N-terminus of all or part of IL-2 are linked; Fused monoclonal antibodies in the form wherein the C-terminus of all or part of the heavy chain of anti-IGF-1R-mAb and the N-terminus of all or part of IL-2 are linked by peptide linkers; Fused monoclonal antibodies in the form wherein the C-terminus of all or part of the light chain of anti-IGF-1R-mAb and the N-terminus of all or part of IL-2 are linked with a peptide linker; Or a combination thereof.

가장 바람직하게는 상기 융합 단일클론 항체는, 항-IGF-1R-mAb 중쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL-2의 전체 또는 일부의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결된 형태(서열번호 13 또는 14)의 융합 단일클론 항체가 될 수 있다.
Most preferably, the fusion monoclonal antibody is a form in which the C-terminus of all or part of the anti-IGF-1R-mAb heavy chain and the N-terminus of all or part of IL-2 are connected by a peptide linker (SEQ ID NO: 13 Or the fusion monoclonal antibody of 14).

이때, 본 발명에서 제공하는 융합 단일클론 항체의 암세포 표면 IGF-1R 항원에 대한 해리 상수값(KD 값)은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 100 nM 이하임이 바람직하다.
At this time, the dissociation constant value (KD value) for the cancer cell surface IGF-1R antigen of the fusion monoclonal antibody provided in the present invention is not particularly limited thereto, but is preferably 100 nM or less.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 IgG1_IL-2형태로 항IGF-1R_IL-2의 융합 단일클론 항체를 제작하였으며(실시예 1), FACS 방법으로 유방암 세포주인 MCF-7의 표면에 발현하는 IGF-1R에 항IGF-1R 항체(A12)와 이 항체에 IL-2를 결합시킨 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)가 IL-2를 결합시키지 않은 A12 항체와 유사하게 MCF-7 세포의 IGF-1R과 결합하는 것을 확인하였고, 이 항체들은 같은 부위를 인식하고 있음을 확인하였다(실시예 2-1). 또한, CTLL-2 세포주를 이용한 IL-2 의존성 세포증식을 확인한 결과, 융합항체의 IL-2가 세포증식능이 있어, IL-2의 활성을 가지고 있음을 확인하였다(실시예 2-2).
According to an embodiment of the present invention, the present inventors produced a fusion monoclonal antibody of anti-IGF-1R_IL-2 in the form of IgG1_IL-2 (Example 1), and expressed on the surface of breast cancer cell line MCF-7 by FACS method. Anti-IGF-1R antibody (A12) to IGF-1R and fusion monoclonal antibody (A12_IL-2) in which IL-2 was bound to this antibody were similar to those of MCF-7 cells similar to A12 antibody without IL-2 binding. It was confirmed that binding to IGF-1R, it was confirmed that these antibodies recognize the same site (Example 2-1). In addition, as a result of confirming IL-2 dependent cell proliferation using the CTLL-2 cell line, it was confirmed that IL-2 of the fusion antibody had cell proliferation ability and IL-2 activity (Example 2-2).

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입되어 상기 융합 단일클론 항체를 발현할 수 있는 형질전환체를 제공한다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention is a polynucleotide encoding the fusion monoclonal antibody, an expression vector comprising the polynucleotide and the expression vector can be introduced to express the fusion monoclonal antibody Provide a transformant.

본 발명에서 제공하는 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 항-IGF-1R-mAb을 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 항-IGF-1R-mAb을 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.The polynucleotide encoding the fusion monoclonal antibody provided in the present invention is not particularly limited, but all or part of the gene encoding the anti-IGF-1R-mAb and all or part of the gene encoding IL-2. Polynucleotides in linked form; Alternatively, all or part of a gene encoding anti-IGF-1R-mAb and all or part of a gene encoding IL-2 may be a polynucleotide in a form linked by a polynucleotide encoding a peptide linker.

바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는, 항-IGF-1R-mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.Preferably, the polynucleotide is a polynucleotide in a form in which all or part of a gene encoding the heavy chain of anti-IGF-1R-mAb and all or part of a gene encoding IL-2 are linked; Polynucleotides in a form in which all or a portion of a gene encoding the light chain of anti-IGF-1R-mAb is linked to all or a portion of a gene encoding IL-2; Polynucleotides in the form in which all or a portion of the gene encoding the heavy chain of anti-IGF-1R-mAb and all or a portion of the gene encoding IL-2 are linked by a polynucleotide encoding a peptide linker; Polynucleotides in the form in which all or a portion of the gene encoding the light chain of anti-IGF-1R-mAb and all or a portion of the gene encoding IL-2 are linked by a polynucleotide encoding a peptide linker; Or a combination thereof.

보다 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는, 항-IGF-1R-mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 3‘-말단과 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 3‘-말단과 IL-2의 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 3‘-말단과 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 항-IGF-1R-mAb의 경쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 3‘-말단과 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.More preferably, the polynucleotide is a 3'-terminus of all or a portion of the gene encoding the heavy chain of anti-IGF-1R-mAb and a 5'-terminus of all or a portion of the gene encoding IL-2. Polynucleotides in form; A polynucleotide in which the 3'-terminus of all or a portion of the gene encoding the light chain of anti-IGF-1R-mAb and the 5'-terminus of all or a portion of the gene encoding IL-2 of IL-2 are linked; 3'-terminus of all or part of the gene encoding the heavy chain of anti-IGF-1R-mAb and 5'-terminus of all or part of the gene encoding IL-2 is linked by a polynucleotide encoding the peptide linker Polynucleotides; 3'-terminus of all or a portion of the gene encoding the light chain of anti-IGF-1R-mAb and 5'-terminus of all or a portion of the gene encoding IL-2 is linked by a polynucleotide encoding a peptide linker Polynucleotides; Or a combination thereof.

가장 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는, 항-IGF-1R-mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 3‘-말단과 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.
Most preferably, the polynucleotide is a 3'-terminus of all or part of a gene encoding a heavy chain of anti-IGF-1R-mAb and a 5'-terminus of all or part of a gene encoding IL-2. It may be a polynucleotide in a form linked by a polynucleotide encoding a linker.

본 발명에서 제공하는 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스, 레트로바이러스 벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
Expression vectors comprising the polynucleotide encoding the fusion monoclonal antibody provided in the present invention is not particularly limited to, but is not limited to mammalian cells (eg, human, monkey, rabbit, rat, hamster, mouse cells, etc.), plants May be a vector capable of replicating and / or expressing the polynucleotide in eukaryotic or prokaryotic cells, including cells, yeast cells, insect cells or bacterial cells (e.g., E. coli), preferably in a host cell. The polynucleotide is operably linked to an appropriate promoter for expression and may be a vector comprising at least one selection marker, more preferably phage, plasmid, cosmid, mini-chromosome, virus, retrovirus The polynucleotide may be introduced into a vector or the like.

본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 E. coli, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
The transformant introduced with the expression vector provided in the present invention is not particularly limited thereto, but the bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium transformed by introducing the expression vector; Yeast cells; Fungal cells such as Pchia pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; Animal cells such as CHO, COS, NSO, 293, bow melanoma cells; Or plant cells.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법을 제공한다. As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a method for producing the fusion monoclonal antibody.

구체적으로, 본 발명의 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법은(ⅰ) 상기 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;(ⅱ) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계;(ⅲ) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및,(ⅳ) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 융합 단일클론 항체를 회수하는 단계를 포함한다. Specifically, the method for producing a fusion monoclonal antibody of the present invention (i) obtaining a polynucleotide encoding the fusion monoclonal antibody; (ii) cloning the obtained polynucleotide to obtain an expression vector (Iii) introducing the obtained expression vector into a host cell to obtain a transformant; And (iii) culturing the transformant and recovering the fused monoclonal antibody therefrom.

이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 IL-2가 융합된 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 상기 중쇄 또는 경쇄와 함께 항체를 형성할 수 있는 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다.In this case, the polynucleotide is not particularly limited thereto, but a combination of a polynucleotide encoding a heavy or light chain fused with IL-2 and a polynucleotide encoding a heavy or light chain capable of forming an antibody together with the heavy or light chain. Can be.

또한, 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드의 조합을 각각 포함하는 2개의 발현벡터, 또는 상기 조합의 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 바이시스트로닉 벡터일 수 있다.
In addition, the expression vector may be two expression vectors each comprising a combination of the polynucleotides, or a bisisttronic vector including both the polynucleotides of the combination.

아울러, 상기 중쇄 또는 경쇄는 IL-2와 직접적으로 연결되거나 또는 링커 펩타이드를 통하여 연결될 수 있다. 이때, 링커 펩타이드는 특별히 이에 제한되지 않으나, GGGGS의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 일 수 있고, 이는 1~10번 반복 될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성됨이 바람직하며, 상기 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 구성됨이 바람직하다.
In addition, the heavy or light chain may be directly linked with IL-2 or through a linker peptide. At this time, the linker peptide is not particularly limited, but may be a peptide consisting of the amino acid sequence of GGGGS, which may be repeated 1 to 10 times, preferably consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the linker peptide Polynucleotide encoding the is not particularly limited, but is preferably composed of the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

상기 융합 단일클론 항체를 제조하는 다른 실시양태에 의하면, 본 발명의 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법은(ⅰ) 암세포 표면항원 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 포함하는 항체의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 수득하는 단계;(ⅱ) 인간의 IL-2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;(ⅲ) 상기 수득한 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단과, 상기 수득한 인간의 IL-2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단을 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 연결함으로써, 융합 폴리펩티드를 암호화하는 융합 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;(ⅳ) 상기 수득한 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 융합 폴리뉴클레오티드를 각각 클로닝하여 각각의 발현벡터를 수득하는 단계;(ⅴ) 상기 수득한 각각의 발현벡터를 하나의 숙주세포에 동시에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및,(ⅵ) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 융합 단일클론 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
According to another embodiment of preparing the fusion monoclonal antibody, the method for producing a fusion monoclonal antibody of the present invention (i) a heavy chain of an antibody comprising a domain capable of specifically binding to cancer cell surface antigen IGF-1R Or obtaining each of a polynucleotide encoding a light chain; (ii) obtaining a polynucleotide encoding human IL-2; (iii) the 3'-terminus of the polynucleotide encoding the obtained heavy chain; Linking the 5'-terminus of the obtained polynucleotide encoding human IL-2 with a polynucleotide encoding a linker peptide to obtain a fusion polynucleotide encoding a fusion polypeptide; (iii) obtaining Cloning a polynucleotide and a fusion polynucleotide encoding one light chain, respectively, to obtain respective expression vectors. (Iii) simultaneously introducing each of the obtained expression vectors into one host cell to obtain a transformant; And (iii) culturing the transformant and recovering the fused monoclonal antibody therefrom.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 IGF-1R 항원에 결합하는 항체(A12 또는 AMG479)의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자와, 인간의 IL-2를 암호화하는 유전자를 각각 수득하고, 상기 수득한 중쇄를 암호화하는 유전자의 3'-말단과 인간 IL-2를 암호화하는 유전자의 5'-말단을 링커 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결하여 융합 폴리뉴클레오티드를 수득하였다. 이어, 상기 경쇄를 암호화하는 유전자 및 상기 융합 폴리뉴클레오티드를 각각 클로닝하여 각각의 발현벡터를 수득하고, 상기 수득한 각 발현벡터를 하나의 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하였다. 끝으로, 상기 형질전환체를 배양하여 목적하는 융합 단일클론 항체를 생산하고, 이를 배양액으로부터 정제하여 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)를 제조하였다(실시예 1).
According to one embodiment of the present invention, the present inventors obtain a gene encoding the heavy and light chains of the antibody (A12 or AMG479) that binds to the IGF-1R antigen, and a gene encoding human IL-2, respectively, The 3'-end of the gene encoding the obtained heavy chain and the 5'-end of the gene encoding human IL-2 were linked with a polynucleotide encoding a linker polypeptide to obtain a fusion polynucleotide. Subsequently, the gene encoding the light chain and the fusion polynucleotide were cloned, respectively, to obtain respective expression vectors, and the obtained expression vectors were introduced into one host cell to obtain a transformant. Finally, the transformant was cultured to produce a desired fusion monoclonal antibody, which was purified from the culture to prepare a fusion monoclonal antibody (A12_IL-2) (Example 1).

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물을 제공한다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a composition for treating cancer comprising the fusion monoclonal antibody as an active ingredient.

본 발명의 용어, "암"이란 통상적으로 알려진 원인에 의하여 발병하는 악성종양을 의미하는데, 본 발명에서는 특별히 이에 제한되지 않으나, 유방암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종, 혈액암 등이 될 수 있고, 바람직하게는 세포의 표면에 IGF-1R이 비정상적으로 과발현되는 유방암, 폐암, 대장암, 전립선암, 자궁암 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 유방암이 될 수 있다.As used herein, the term "cancer" refers to a malignant tumor that is caused by a commonly known cause, but is not particularly limited thereto, and includes breast cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, lung cancer, Colon cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, prostate cancer, testicular cancer, bladder cancer, kidney cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bone cancer, connective tissue cancer, skin cancer, brain cancer, thyroid cancer, leukemia, Hodgkin's disease, lymphoma, multiple Myeloma, hematologic cancer, and the like, preferably, breast cancer, lung cancer, colon cancer, prostate cancer, uterine cancer, etc., in which IGF-1R is abnormally overexpressed on the surface of cells, and most preferably breast cancer. have.

본 발명의 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
As used herein, the term "treatment" means any action that improves or advantageously alters the symptoms caused by cancer by administration of the composition.

아울러, 본 발명의 암치료용 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 적소두 추출물과 분획물들을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 적소두 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. In addition, the cancer treatment composition of the present invention may further include a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of a pharmaceutical composition. Cancer treatment composition comprising the fusion monoclonal antibody of the present invention as an active ingredient, oral formulations, external preparations, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. It can be formulated in the form of suppositories and sterile injectable solutions. In the present invention, carriers, excipients and diluents that may be included in the composition comprising red soybean extract and fractions include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, in the red bean extract and fractions thereof. , Sucrose or lactose, gelatin and the like are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc are also used. Liquid preparations for oral use may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used to include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. have. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 상기 융합 단일클론 항체가 암세포 사멸기능인 항체기능인 항체의존성 세포독성(ADCC)효과가 있음을 확인하였으며, 이를 통해 항암용 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 유방암종인 MCF-7 세포를 투여한 암 모델 Xenogrft 항암치료효과를 확인하였으며(도 4), 또한, 상기 융합 단일클론 항체를 구성하는 IL-2와 단일클론 항체를 조합하여 투여한 것보다도 상기 융합 단일클론 항체를 투여하는 경우에 보다 우수한 항암치료효과를 나타냄을 확인하였다(도 5). 상기 결과는 본 발명의 융합 단일클론 항체가 암치료용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 뒷받침하는 것으로 분석되었다.
According to one embodiment of the present invention, the present inventors confirmed that the fusion monoclonal antibody has an antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) effect, which is an antibody function of cancer cell death, and confirmed that it can be used as an anticancer composition. Specifically, the cancer model Xenogrft anti-cancer treatment administered MCF-7 cells, which is a breast carcinoma, was confirmed (FIG. 4), and compared with the administration of a combination of IL-2 and monoclonal antibody constituting the fusion monoclonal antibody When the fusion monoclonal antibody was administered it was confirmed to exhibit a better anti-cancer treatment effect (Fig. 5). The results were analyzed to support the fusion monoclonal antibody of the present invention can be used as an active ingredient of the composition for cancer treatment.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 암치료용 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a method for treating cancer comprising administering a composition comprising the fusion monoclonal antibody as an active ingredient to a subject having cancer in a pharmaceutically effective amount. Provide a method. In this case, the cancer treatment composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent.

상기 암을 치료하는 방법에서 투여되는 상기 암치료용 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. The cancer treatment composition administered in the method for treating cancer may be administered in the form of a liquid, powder, aerosol, capsule, enteric skin tablet or capsule or suppository. Routes of administration include, but are not limited to, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, endothelial administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, and the like. However, upon oral administration, since the peptide is digested, the oral composition must be formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach. In addition, the composition may be administered by any device capable of transferring the active agent to the target cell.

본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat or prevent a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or prevention, and an effective dose level refers to the severity of the disease, the activity of the drug, Factors including the age, body weight, health, sex of the patient, sensitivity to the drug of the patient, time of administration of the composition of the invention used, route of administration and duration of treatment, the drug used in combination with or concurrently with the composition of the invention used And other factors well known in the medical arts.

본 발명의 융한 단일클론 항체는 IL-2에 의해 암세포 주변의 면역세포가 강하게 활성화 되어 대조 항암항체 또는 보고된 항IGF-1R 항체보다 증가된 항체의존성 세포독성을 나타낼 수 있으므로, 보다 효과적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
The fused monoclonal antibody of the present invention is strongly activated by immune cells around cancer cells by IL-2, and may exhibit increased antibody-dependent cytotoxicity than the control anticancer antibody or the reported anti-IGF-1R antibody. It can be widely used.

도 1은 본 발명의 융합 단일클론 항체의 구조를 보여주는 개략도이다.
도 2는 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 기기를 통한 MCF-7 세포 표면 IGF-1R 항원에 대한 항암항체(A12), 융합 항암항체(A12_IL-2) 및 대조군 항체(IgG1)의 결합력(좌측) 및 경쟁 결합능 측정결과(우측)를 나타내는 그래프이다.
도 3은 IL-2, 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)에 따른 CTLL-2 세포의 증식촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 IL-2, 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)가 처리된 누드마우스에서 발생된 종양크기의 변화를 시간의 경과에 따라 나타낸 그래프이다.
도 5는 IL-2, 항IGF-1R 항체(AMG479), IL-2와 항IGF-1R 항체(AMG479)의 조합 또는 융합 단일클론 항체(AMG479_IL-2)가 처리된 누드마우스에서 발생된 종양크기의 변화를 시간의 경과에 따라 나타낸 그래프이다.1 is a schematic diagram showing the structure of a fusion monoclonal antibody of the present invention.
Figure 2 shows the binding force (left) of the anticancer antibody (A12), the fusion anticancer antibody (A12_IL-2) and the control antibody (IgG1) to MCF-7 cell surface IGF-1R antigen through a Fluorescence-activated cell sorting (FACS) instrument And a graph showing competitive binding capacity measurement results (right).
Figure 3 is a graph showing the growth promoting effect of CTLL-2 cells according to IL-2, anti-IGF-1R antibody (A12) or fusion monoclonal antibody (A12_IL-2).
Figure 4 is a graph showing the change in tumor size generated over time in nude mice treated with IL-2, anti-IGF-1R antibody (A12) or fusion monoclonal antibody (A12_IL-2).
Figure 5 shows tumor size developed in nude mice treated with IL-2, anti-IGF-1R antibody (AMG479), a combination of IL-2 and anti-IGF-1R antibody (AMG479) or fused monoclonal antibody (AMG479_IL-2). The graph shows the change over time.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 항 1: Port IGFIGF -1R 항체와 인간Human with -1R antibody ILIL -2가 -2 결합된Combined 융합 단일클론 항체의 제조 Preparation of Fusion Monoclonal Antibodies

CHO-S 포유동물 세포주에서 항IGF-1R 항체와 IL-2를 결합시킨 융합 단일클론 항체를 생산하기 위한 목적으로 항IGF-1R 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자는 Imclone사(A12)(서열번호 5 및 6) 또는 Amgen사(AMG479)(서열번호 9 및 10) 항IGF-1R항체의 유전자를 사용하였고, 인간 IL-2 유전자는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 공개된 유전자 서열(서열번호 12)을 사용하였다.Genes encoding the heavy and light chains of anti-IGF-1R antibodies for the purpose of producing fusion monoclonal antibodies that combine anti-IGF-1R antibodies with IL-2 in CHO-S mammalian cell lines are sequenced by Imclone (A12) Nos. 5 and 6) or Amgen (AMG479) (SEQ ID NOs. 9 and 10) genes of anti-IGF-1R antibodies were used, and the human IL-2 gene was a gene sequence (SEQ ID NO: Published in the National Center for Biotechnology Information). Number 12) was used.

융합항체를 암호화하는 핵산의 발현은 원핵세포 또는 진핵세포에서 통상의 방법으로 수행할 수 있는데 진핵세포 숙주-벡터 시스템은 많은 상이한 종에 대한 광범위한 벡터를 포함한다. DNA를 증폭시키기 위한 대표적인 벡터는 pcDNA3.1 벡터이고 이를 다시 유전자 재조합을 통해 CHO-S 포유동물세포주에서 항체 폴리펩타이드를 암호화하는 항체 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 확보하였다.
Expression of nucleic acids encoding fusion antibodies can be carried out by conventional methods in prokaryotic or eukaryotic cells, and eukaryotic host-vector systems include a wide range of vectors for many different species. A representative vector for amplifying DNA is a pcDNA3.1 vector, and again, a vector capable of expressing an antibody protein encoding an antibody polypeptide in a CHO-S mammalian cell line through gene recombination was obtained.

먼저, 링커로서 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 1)를 암호화하는 유전자(서열번호 2)를 사용하여 항IGF-1R 항체의 중쇄영역을 암호화하는 유전자의 3'-말단과 인간 IL-2를 암호화하는 유전자의 5'-말단을 연결하여, 항IGF-1R 항체의 중쇄영역을 암호화하는 부위와 IL-2를 암호화하는 부위가 링커 유전자를 통하여 연결된 융합 펩타이드(서열번호 13 또는 14)를 암호화하는 유전자를 수득하고 이를 발현벡터에 클로닝하였다.
First, the 3'-terminus of the gene encoding the heavy chain region of an anti-IGF-1R antibody using the gene encoding GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1) as a linker and 5 of the gene encoding human IL-2 The '-terminus is linked to obtain a gene encoding a fusion peptide (SEQ ID NO: 13 or 14) in which the region encoding the heavy chain region of the anti-IGF-1R antibody and the region encoding IL-2 are linked through a linker gene. Cloned into the expression vector.

또한, 항IGF-1R 항체의 경쇄영역을 암호화하는 유전자를 또 다른 발현벡터 pcDNA3.1에 클로닝하였다. 그런 다음, 상기 클로닝하여 얻어진 각 발현벡터를 CHO-S 포유동물세포주에 함께 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 500㎖ 배양용 삼각 플라스크에서 병 1개 당 200㎖의 부피로 세포배양기(SanYo, Japan)에서 4일동안 배양하여 융합 단일클론 항체를 생산하였다. 이때, 사용된 배지는 IgG 함량이 매우 낮은(ultra low IgG) 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 배지(Invitrogen Co., U.S.A.)와 CHO-S세포 전용 배지의 혼합액(혼합비 1:1)을 사용하였다.
In addition, the gene encoding the light chain region of the anti-IGF-1R antibody was cloned into another expression vector pcDNA3.1. Then, the expression vectors obtained by cloning were introduced together into the CHO-S mammalian cell line to obtain transformants, and the transformants were injected into cells in a volume of 200 ml per bottle in a 500 ml culture flask. Four days of incubation was performed in an incubator (SanYo, Japan) to produce fusion monoclonal antibodies. At this time, the medium used was a mixture of RPMI medium (Invitrogen Co., USA) supplemented with ultra low IgG fetal bovine serum (Invitrogen Co., USA) and CHO-S cell-only medium (mixing ratio 1: 1).

배양이 종료된 후, 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하고, 이를 0.22㎛ 진공 필터 장치(Millipore, U.S.A.)로 여과하여, 목적하는 융합 단일클론 항체를 포함하는 배양액을 수득하였다.
After the incubation was completed, the culture solution was centrifuged to obtain a supernatant, which was filtered through a 0.22 μm vacuum filter device (Millipore, USA) to obtain a culture solution containing the desired fusion monoclonal antibody.

상기 수득한 배양액을 재조합 프로틴-A 세파로즈 컬럼(Hitrap MabSelect Sure, 5㎖, GE healthcare, U.S.A.)에 적용하여. 상기 배양액으로부터 융합 단일클론 항체를 정제하였다.The obtained culture was applied to a recombinant protein-A Sepharose column (Hitrap MabSelect Sure, 5 ml, GE healthcare, U.S.A.). The fusion monoclonal antibody was purified from the culture.

구체적으로, 상기 수득한 배양액을 재조합 프로틴-A 세파로즈 컬럼에 로딩하고, 상기 컬럼을 50mM Tris-Cl(pH7.5), 150mM NaCl로 20배 컬럼부피만큼 1차 세척한 다음, 10배 컬럼 부피의 50mM Na-citrate(pH5.0)로 2차 세척하였다. 이어, 용출액(50mM Na-citrate 150mM NaCl, pH 3.4)을 가하여 항체분획을 용출시키고, 용출된 항체분획에 1M Tris-HCl(pH 9.0) 완충액을 가하여 중화시켰다. Specifically, the obtained culture was loaded on a recombinant Protein-A Sepharose column, and the column was first washed with 20 mM column volume with 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, followed by a 10-fold column volume. Washed with 50 mM Na-citrate (pH 5.0). Then, an eluate (50 mM Na-citrate 150 mM NaCl, pH 3.4) was added to elute the antibody fraction, and the eluted antibody fraction was neutralized by adding 1M Tris-HCl (pH 9.0) buffer.

상기 용출된 항체분획을 SDS-PAGE로 분석하고, 활성분획을 수집한 다음, 원심분리형 농축기(Amicon Ultra, 30,000 MWCO, Millipore, U.S.A.)에 적용하여 인산완충액으로 완충액을 교환하면서 농축시켰다. 그런 다음, 농축된 항체분획을 0.22㎛ 공극 직경의 시린지 필터로 멸균 여과하고, 흡광도(A280)를 측정하여 항체 농도를 결정하였다. 도 1은 본 발명의 융합 단일클론 항체의 구조를 보여주는 개략도이다. 도 1에서 보듯이, IgG 형태의 항체 말단에 IL-2가 결합한 형태의 새로운 융합 단일클론 항체를 생산할 수 있음을 확인하였다.
The eluted antibody fractions were analyzed by SDS-PAGE, the active fractions were collected, and then subjected to a centrifugal concentrator (Amicon Ultra, 30,000 MWCO, Millipore, USA) and concentrated while exchanging buffers with phosphate buffer. The concentrated antibody fraction was then sterile filtered with a 0.22 μm pore diameter syringe filter, and the absorbance (A280) was measured to determine antibody concentration. 1 is a schematic diagram showing the structure of a fusion monoclonal antibody of the present invention. As shown in Figure 1, it was confirmed that can produce a new fusion monoclonal antibody in the form of IL-2 bound to the antibody terminal of the IgG form.

실시예Example 2:  2: FACSFACS 기기를 이용한  Using a device MCFMCF -7 세포에 발현된 Expressed in -7 cells IGFIGF -1R에 대한 융합항체의 Of fusion antibodies against -1R 결합능Binding capacity 측정 Measure

MCF-7 유방암 세포주에서 발현되는 IGF-1R에 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 융합 단일클론 항체가 결합하는지의 여부를 확인하였다.
Whether or not the fusion monoclonal antibody of the present invention prepared in Example 1 binds to IGF-1R expressed in MCF-7 breast cancer cell line.

먼저, 1 x 105 MCF-7 세포에 1㎍/㎖의 대조군 IgG, 항IGF-1R 항체(A12), 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)를 각각 처리하여 1시간동안 반응시켰으며, 반응이 종료된 후 FITC로 표식이 된 2차항체(항 인간 IgG-FITC, Sigma)를 가하여 추가로 반응시키고, FACS 기기로 IGF-1R에 대한 각 항체의 결합능을 측정하였다(도 2의 좌측 그래프). 도 2의 좌측 그래프는 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 기기를 이용한 MCF-7 세포 표면 IGF-1R 항원에 대한 대조군 항체(IgG1), 항암항체(A12) 및 융합 항암항체(A12_IL-2)의 결합력 측정결과를 나타내는 그래프이다. 도 2의 좌측 그래프에서 보듯이, 대조군 항체에 비하여, 항암항체(A12)와 융합 항암항체(A12_IL-2)는 MCF-7 세포 표면 IGF-1R 항원에 대하여 높은 결합력을 나타내었으므로, 상기 항암항체(A12) 및 융합 항암항체(A12_IL-2)는 MCF-7 세포 표면 IGF-1R 항원에 특이적으로 결합하는 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
First, 1 × 10 5 MCF-7 cells were treated with 1 μg / ml control IgG, anti-IGF-1R antibody (A12), or fusion monoclonal antibody (A12_IL-2), and reacted for 1 hour. After completion of the reaction, FITC-labeled secondary antibodies (anti-human IgG-FITC, Sigma) were added and further reacted, and the binding capacity of each antibody to IGF-1R was measured using a FACS instrument (left graph in FIG. 2). . 2 shows the binding capacity of the control antibody (IgG1), anticancer antibody (A12) and fusion anticancer antibody (A12_IL-2) to MCF-7 cell surface IGF-1R antigen using a Fluorescence-activated cell sorting (FACS) instrument A graph showing the measurement results. As shown in the left graph of Figure 2, compared with the control antibody, the anticancer antibody (A12) and fusion anticancer antibody (A12_IL-2) showed a high binding capacity to the MCF-7 cell surface IGF-1R antigen, the anticancer antibody (A12) and the fusion anticancer antibody (A12_IL-2) were found to exhibit the activity of specifically binding to the MCF-7 cell surface IGF-1R antigen.

다음으로, 1 x 105 MCF-7 세포에 6.4pM, 32pM, 0.16nM, 0.8nM, 4nM, 20nM 또는 100nM의 rhIGF1-sR를 먼저 처리한 다음, 상기 rhIGF1-sR가 처리된 각각의 MCF-7 세포에 1㎍/㎖의 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)를 각각 처리하여 1시간동안 반응시켰으며, 반응이 종료된 후 FITC로 표식이 된 2차항체를 가하여 추가로 반응시키고, FACS 기기로 IGF-1R에 대한 각 항체의 결합능을 측정하였다(도 2의 우측 그래프). 도 2의 우측 그래프는 FACS 기기를 통한 MCF-7 세포 표면 IGF-1R 항원에 대한 항암항체(A12) 및 융합 항암항체(A12_IL-2)의 경쟁 결합능 측정결과를 나타내는 그래프이다. 도 2의 우측 그래프에서 보듯이, 항IGF-1R 항체(A12)와 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)가 유사한 수준으로 rhIGF1-sR과의 경쟁을 통해 MCF-7 세포 표면의 IGF-1R에 결합할 수 있음을 확인하였다.
Next, 1 x 10 5 MCF-7 cells were first treated with 6.4 g, 32 pM, 0.16 nM, 0.8 nM, 4 nM, 20 nM or 100 nM of rhIGF1-sR, and then each MCF-7 treated with the rhIGF1-sR. The cells were treated with 1 μg / ml of anti-IGF-1R antibody (A12) or fusion monoclonal antibody (A12_IL-2) for 1 hour, and after completion of the reaction, the secondary antibody labeled with FITC The reaction was further performed, and the binding capacity of each antibody to IGF-1R was measured by FACS instrument (graph on the right of FIG. 2). 2 is a graph showing the results of measuring the competitive binding capacity of the anticancer antibody (A12) and the fusion anticancer antibody (A12_IL-2) against MCF-7 cell surface IGF-1R antigen through FACS instrument. As shown in the right graph of FIG. 2, anti-IGF-1R antibody (A12) and fusion monoclonal antibody (A12_IL-2) bind to IGF-1R on MCF-7 cell surface through competition with rhIGF1-sR at similar levels. It was confirmed that it can be done.

이와 같은 결과는, 본 발명의 융합 항체가 항암항체와 동일하게 암세포에 발현하는 IGF-1R에 결합되어 ADCC를 야기할 수 있음을 의미하는 것으로 분석되었다.
These results were analyzed to mean that the fusion antibody of the present invention can bind to IGF-1R expressing cancer cells in the same manner as the anticancer antibody and cause ADCC.

실시예Example 3:  3: InIn vitrovitro ILIL -2 의존성 세포독성 T 세포주의 증식 확인Proliferation of -2 dependent cytotoxic T cell lines

IL-2R가 과발현되는 세포독성 T 세포주인 CTLL-2(ATCC, TIB-214) 세포를 96웰 플레이트에 5 x 104 세포수가 되도록 분주하고, 원하는 농도로 희석한 IL-2, 항암항체인 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)를 단독으로 또는 IL-2와 병용하여 처리한 다음, 37℃ 배양기에서 72시간 배양하였다. 이어, WST-8(Dojindo laboratories)를 각 웰당 10㎕씩 넣어주고 1시간동안 반응시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다(도 3). 도 3은 IL-2, 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)에 따른 CTLL-2 세포의 증식촉진 효과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)가 IL-2와 유사한 정도로 세포의 증식을 촉진하는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. CTLL-2 (ATCC, TIB-214) cells, which are cytotoxic T cell lines overexpressing IL-2R, were divided into 96-well plates at 5 x 10 4 cells and diluted to a desired concentration. IGF-1R antibody (A12) or fusion monoclonal antibody (A12_IL-2) was treated alone or in combination with IL-2 and incubated for 72 hours in a 37 ° C. incubator. Subsequently, 10 μl of WST-8 (Dojindo laboratories) was added to each well and reacted for 1 hour, and then absorbance was measured at 450 nm (FIG. 3). Figure 3 is a graph showing the growth promoting effect of CTLL-2 cells according to IL-2, anti-IGF-1R antibody (A12) or fusion monoclonal antibody (A12_IL-2). As shown in Figure 3, it was confirmed that the fusion monoclonal antibody (A12_IL-2) has an effect of promoting the proliferation of cells to a similar degree to IL-2.

이와 같은 결과는, 본 발명의 융합항체가 IGF-R1을 발현하는 세포로 항암항체를 집중시킬 뿐만 아니라, IL-2에 의해 세포독성을 나타내는 T 세포의 증식을 증가시켜 항체의존성 세포독성으로 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 뒷받침하며, 생체내에서 항암항체 단독 또는 IL-2와의 병용투여보다 본 발명의 융합항체가 보다 더 높은 항체의존성 세포독성을 나타낼 가능성이 있음을 시사하는 것으로 분석되었다.
These results indicate that the fusion antibody of the present invention not only concentrates anticancer antibodies into cells expressing IGF-R1, but also increases cancer cell proliferation by antibody-dependent cytotoxicity by increasing the proliferation of T cells that exhibit cytotoxicity by IL-2. Supporting effective killing, it was analyzed to suggest that the fusion antibody of the present invention is likely to exhibit higher antibody-dependent cytotoxicity than anticancer antibody alone or in combination with IL-2 in vivo.

실시예Example 4: 항암모델동물에서 융합 단일클론 항체의 항암효과 확인 4: Identification of anticancer effects of fusion monoclonal antibodies in anticancer model animals

실시예Example 4-1: A12_ 4-1: A12_ ILIL -2의 항암효과 확인-2 anticancer effect confirmed

누드마우스의 배면 피하에 베타-에스트라디올 서방형 팰렛을 이식하고, 3일이 경과한 후 MCF-7세포를 매트리젤(matrigel)과 1:1(v/v)로 혼합하고, 상기 혼합세포를 1 x 107 세포/200㎕/마우스의 농도로 상기 누드마우스의 등부위에 피하이식 하였다. 이식한 종양의 크기가 200㎣이 되는 시점(종양이식 후 7-8일)부터 주 2회 대조군(Vehicle), 항암항체인 항IGF-1R 항체(A12)(100㎍), IL-2(10㎍) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)(110㎍)를 각각 복강에 투여하고, 주 2회 종양의 크기를 측정하였다(도 4). 도 4는 IL-2, 항IGF-1R 항체(A12) 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)가 처리된 누드마우스에서 발생된 종양크기의 변화를 시간의 경과에 따라 나타낸 그래프이다.Beta-estradiol sustained-release pallets were implanted under the back of nude mice, and after 3 days, MCF-7 cells were mixed with matrigel 1: 1 (v / v), and the mixed cells were mixed. Subcutaneous transplantation was performed on the back of the nude mouse at a concentration of 1 × 10 7 cells / 200 μl / mouse. Twice a week from the time when the size of the transplanted tumor reached 200 mm (7-8 days after tumor transplantation), the control group (Vehicle), the anti-cancer antibody anti-IGF-1R antibody (A12) (100 µg), IL-2 (10 [Mu] g) or fusion monoclonal antibody (A12_IL-2) (110 [mu] g) was administered intraperitoneally, respectively, and tumor size was measured twice a week (Figure 4). Figure 4 is a graph showing the change in tumor size generated over time in nude mice treated with IL-2, anti-IGF-1R antibody (A12) or fusion monoclonal antibody (A12_IL-2).

도 4에서 보듯이, 융합 단일클론 항체(A12_IL-2) 투여군에서는 1회 항체 투여 후부터 종양의 증식정도가 현저하게 억제됨을 알 수 있었고, 실험 종료시점에는 대조군(vehicle) 대비 80% 이상의 종양증식 억제효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 이 군들에서는 종양부위에 괴사가 일어나 점점 종양의 크기가 줄어들었으며, 2마리의 마우스에서는 종양이 완전히 사라졌다. 반면, 항IGF-1R 항체(A12) 투여군에서는 실험 21일째까지는 유의하게 종양 억제능을 보였으나 그 이후 급속도로 점차 종양의 크기가 증가됨을 확인할 수 있었고, 실험 종료일에는 대조군에 비하여 20% 정도의 종양증식 억제효과가 나타남을 확인할 수 있었다. 한편, IL-2 단독 투여군은 대조군과 비교하여 유의한 종양 억제능을 보이지 못하였다. As shown in Figure 4, in the fusion monoclonal antibody (A12_IL-2) administration group it can be seen that the tumor proliferation is significantly inhibited after the administration of a single antibody, at the end of the experiment suppressed tumor growth more than 80% compared to the control (vehicle) It confirmed that the effect is shown. In particular, in these groups necrosis occurred at the tumor site and the tumor size gradually decreased, and the tumor disappeared completely in two mice. On the other hand, in the anti-IGF-1R antibody (A12) administration group, the tumor suppression ability was significantly increased until the 21st day of the experiment, but the tumor size gradually increased thereafter, and at the end of the experiment, tumor growth was about 20% compared to the control group. Inhibitory effect was confirmed. On the other hand, IL-2 alone group did not show a significant tumor suppression ability compared to the control group.

따라서, 항IGF-1R 항체(A12) 또는 IL-2를 단독으로 투여할 경우보다도 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)를 투여할 경우에 우수한 암치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
Therefore, when the fusion monoclonal antibody (A12_IL-2) is administered than when the anti-IGF-1R antibody (A12) or IL-2 alone is administered, it was confirmed that the excellent cancer treatment effect.

실시예Example 4-2:  4-2: AMG479AMG479 __ ILIL -2의 항암효과 확인-2 anticancer effect confirmed

누드마우스의 배면 피하에 베타-에스트라디올 서방형 팰렛을 이식하고, 3일이 경과한 후 MCF-7세포를 매트리젤과 1:1(v/v)로 혼합하고, 상기 혼합세포를 1 x 107 세포/200㎕/마우스의 농도로 상기 누드마우스의 등부위에 피하이식 하였다. 이식한 종양의 크기가 200㎣이 되는 시점(종양이식 후 7-8일)부터 주 2회 대조군(Vehicle), IL-2(10㎍), 항IGF-1R 항체(AMG479_IL-2)(100㎍), IL-2(10㎍)와 항IGF-1R 항체(AMG479_IL-2)(100㎍)의 조합 또는 융합 단일클론 항체(A12_IL-2)(110㎍)를 각각 복강에 투여하고, 주 2회 종양의 크기를 측정하였다(도 5). 도 5는 IL-2, 항IGF-1R 항체(AMG479), IL-2와 항IGF-1R 항체(AMG479)의 조합 또는 융합 단일클론 항체(AMG479_IL-2)가 처리된 누드마우스에서 발생된 종양크기의 변화를 시간의 경과에 따라 나타낸 그래프이다.Beta-estradiol sustained-release pallets were implanted under the back of nude mice, and after 3 days, MCF-7 cells were mixed with Matrigel 1: 1 (v / v), and the mixed cells were 1 × 10. Subcutaneous transplantation was performed on the back of the nude mouse at a concentration of 7 cells / 200 μl / mouse. From the time when the tumor size reached 200 mm 2 (7-8 days after tumor transplantation), twice a week, the control group (Vehicle), IL-2 (10 µg), and anti-IGF-1R antibody (AMG479_IL-2) (100 µg) ), A combination of IL-2 (10 μg) and anti-IGF-1R antibody (AMG479_IL-2) (100 μg) or a fusion monoclonal antibody (A12_IL-2) (110 μg), respectively, intraperitoneally, twice a week Tumor size was measured (FIG. 5). Figure 5 shows tumor size developed in nude mice treated with IL-2, anti-IGF-1R antibody (AMG479), a combination of IL-2 and anti-IGF-1R antibody (AMG479) or fused monoclonal antibody (AMG479_IL-2). The graph shows the change over time.

도 5에서 보듯이, 융합 단일클론 항체(AMG479_IL-2) 투여군에서는 1회 항체 투여 후부터 종양의 증식정도가 현저하게 억제됨을 알 수 있었고, 실험 종료시점에는 대조군(vehicle) 대비 현저한 종양증식 억제효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 이 군들에서는 종양부위에 괴사가 일어나 점점 종양의 크기가 줄어들었다. 반면, 대조군(vehicle)에 비해 상대적으로 종양증식 억제효과를 보인 항IGF-1R 항체(AMG479), 또는 항IGF-1R 항체(AMG479)(100ug)와 IL-2(10ug)의 병용 투여군의 경우에는 초기에는 우수한 종양증식 억제효과를 나타내었지만 시간이 경과함에 따라 종양의 크가가 점차 증가함을 확인할 수 있었다. 한편, IL-2 단독 투여군은 대조군과 비교하여 유의한 종양 억제능력을 보이지 않았다. As shown in Figure 5, in the fusion monoclonal antibody (AMG479_IL-2) administration group it can be seen that the tumor proliferation is significantly inhibited after the administration of a single antibody, at the end of the experiment has a significant tumor growth inhibitory effect compared to the control (vehicle) It confirmed that it was shown. In particular, in these groups necrosis occurred at the tumor site and the tumor size gradually decreased. On the other hand, the anti-IGF-1R antibody (AMG479) or anti-IGF-1R antibody (AMG479) (100ug) and IL-2 (10ug) in combination treatment group showed a tumor growth inhibition relative to the control group (vehicle) Initially, it showed excellent tumor growth inhibitory effect, but it was confirmed that the tumor size gradually increased with time. On the other hand, IL-2 alone group did not show significant tumor suppression ability compared to the control group.

따라서, 항IGF-1R 항체(AMG479), IL-2 또는 항IGF-1R 항체(AMG479)와 IL-2를 병용투여할 경우보다도 본 발명의 융합 단일클론 항체(AMG479_IL-2)를 투여할 경우에 더욱 우수한 암치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
Therefore, when the anti-IGF-1R antibody (AMG479), IL-2 or anti-IGF-1R antibody (AMG479) and IL-2 are administered in combination, the fusion monoclonal antibody (AMG479_IL-2) of the present invention is administered. It was confirmed that the better cancer treatment effect.

<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> A fusion monoclonal antibody comprising IGF-R1 antibody and IL-2, and pharmaceutical composition comprising the same <130> PA120455/KR <150> KR 10-2011-0097132 <151> 2011-09-26 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding linker peptide <400> 2 ggtggaggtg gcagcggtgg tggcggcagt cccggtggcg gctcc 45 <210> 3 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A12 heavy chain peptide <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135 140 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165 170 175 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 195 200 205 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 210 215 220 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 225 230 235 240 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 4 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A12 light chain peptide <400> 4 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Ala Glu Cys 210 <210> 5 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding A12 heavy chain peptide <400> 5 gaggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctccggcgg caccttctcc tcctacgcca tctcctgggt gcggcaggcc 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggcggc atcatcccca tcttcggcac cgccaactac 180 gcccagaagt tccagggccg ggtgactatc accgccgaca agtccacctc caccgcctac 240 atggagctgt cctccctgcg gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgggccccc 300 ctgcggttcc tggagtggtc cacccaggac cactactact actactacat ggacgtgtgg 360 ggcaagggca ccacggtgac cgtgtcctcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc 420 ctggccccct cctccaagtc cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag 480 gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg 540 cacaccttcc ccgccgtgct gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc 600 gtgccctcct cctccctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc 660 aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgccct 720 ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc tcctaagccc 780 aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc gaggtgactt gcgtggtggt ggacgtgtcc 840 cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 900 aagaccaagc cccgggagga gcagtacaac tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc 960 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc 1020 ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatctcc aaggccaagg gccagccccg ggagccccag 1080 gtgtacaccc tgcccccctc ccgggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1140 ctggtgaagg gcttctaccc ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc 1200 gagaacaact acaagaccac cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 1260 tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg 1320 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag 1380 tga 1383 <210> 6 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding A12 light chain peptide <400> 6 tcctccgagc tgacccagga ccccgccgtg tccgtggccc tgggccagac cgtgcggatc 60 acctgccagg gcgactccct gcggtcctac tacgccacct ggtaccagca gaagcccggc 120 caggccccca tcctggtgat ctacggcgag aacaagcggc cctccggcat ccccgaccgg 180 ttctccggct cctcctccgg caacaccgcc tccctgacca ttaccggcgc ccaggccgag 240 gacgaggccg actactactg caagagccgg gacggctccg gccagcacct ggtgttcggc 300 ggcggcacca agctgaccgt gctgggccag cccaaggccg ccccctccgt gaccctgttc 360 cctccctcct ccgaggagct gcaggccaac aaggccaccc tggtgtgcct gatctccgac 420 ttctaccccg gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgact cctcccccgt gaaggccggc 480 gtggagacca ccaccccctc caagcagtcc aacaacaagt acgccgcctc ctcctacctg 540 tccctgaccc ccgagcagtg gaagtcccac cggtcctact cctgccaggt gacccacgag 600 ggctccaccg tggagaagac cgtggccccc gccgagtgca gctgagcggc cgct 654 <210> 7 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AMG479 heavy chain peptide <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val 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Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln   1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala              20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr          35 40 45 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser      50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu  65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His                  85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys             100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln         115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly     130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala                 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser             180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val         195 200 205 Ala Pro Ala Glu Cys     210 <210> 5 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding A12 heavy chain peptide <400> 5 gaggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctccggcgg caccttctcc tcctacgcca tctcctgggt gcggcaggcc 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggcggc atcatcccca tcttcggcac cgccaactac 180 gcccagaagt tccagggccg ggtgactatc accgccgaca agtccacctc caccgcctac 240 atggagctgt cctccctgcg gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgggccccc 300 ctgcggttcc tggagtggtc cacccaggac cactactact actactacat ggacgtgtgg 360 ggcaagggca ccacggtgac cgtgtcctcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc 420 ctggccccct cctccaagtc cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag 480 gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg 540 cacaccttcc ccgccgtgct gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc 600 gtgccctcct cctccctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc 660 aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgccct 720 ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc tcctaagccc 780 aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc gaggtgactt gcgtggtggt ggacgtgtcc 840 cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 900 aagaccaagc cccgggagga gcagtacaac tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc 960 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc 1020 ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatctcc aaggccaagg gccagccccg ggagccccag 1080 gtgtacaccc tgcccccctc ccgggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1140 ctggtgaagg gcttctaccc ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc 1200 gagaacaact acaagaccac cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 1260 tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg 1320 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag 1380 tga 1383 <210> 6 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding A12 light chain peptide <400> 6 tcctccgagc tgacccagga ccccgccgtg tccgtggccc tgggccagac cgtgcggatc 60 acctgccagg gcgactccct gcggtcctac tacgccacct ggtaccagca gaagcccggc 120 caggccccca tcctggtgat ctacggcgag aacaagcggc cctccggcat ccccgaccgg 180 ttctccggct cctcctccgg caacaccgcc tccctgacca ttaccggcgc ccaggccgag 240 gacgaggccg actactactg caagagccgg gacggctccg gccagcacct ggtgttcggc 300 ggcggcacca agctgaccgt gctgggccag cccaaggccg ccccctccgt gaccctgttc 360 cctccctcct ccgaggagct gcaggccaac aaggccaccc tggtgtgcct gatctccgac 420 ttctaccccg gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgact cctcccccgt gaaggccggc 480 gtggagacca ccaccccctc caagcagtcc aacaacaagt acgccgcctc ctcctacctg 540 tccctgaccc ccgagcagtg gaagtcccac cggtcctact cctgccaggt gacccacgag 600 ggctccaccg tggagaagac cgtggccccc gccgagtgca gctgagcggc cgct 654 <210> 7 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AMG479 heavy chain peptide <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly   1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser              20 25 30 Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp          35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu      50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser  65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys                  85 90 95 Ala Arg Trp Thr Gly Arg Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly             100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe         115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu     130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu                 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser             180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro         195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys     210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser                 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ser Glu Asp             260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn         275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val     290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys                 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr             340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr         355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu     370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys                 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu             420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly         435 440 445 Lys     <210> 8 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AMG479 light chain peptide <400> 8 Asp Val Met Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly   1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser              20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser          35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro      50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile  65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly                  85 90 95 Thr His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys             100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu         115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe     130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser                 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu             180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser         195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys     210 215 <210> 9 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding AMG479 heavy chain peptide <400> 9 caagtacaac tacaagaatc aggaccaggg ctagtcaaac catcgggaac attgtcgtta 60 acatgcgctg tgtcaggtgg ctcgatcagc tcgtcaaact ggtggtcctg ggtacgtcaa 120 ccaccgggta agggtcttga gtggataggc gagatttatc attcaggctc tacgaactat 180 aacccaagcc tcaaatcaag ggttacgata agtgttgaca agtcaaagaa tcaattttca 240 cttaaactct cgtcggttac tgcggctgat accgcggtct attattgcgc acgatggacc 300 ggcagaacgg atgcgttcga tatttggggg caaggaacaa tggttactgt ttcaagtgct 360 tcaactaaag ggccaagtgt ctttccattg gcaccgtcat ctaaatctac gtcaggtggt 420 actgcggcac tcggatgcct agttaaagac tattttcctg aaccagtaac tgtttcgtgg 480 aattctggag cgttaacgtc gggtgttcac acttttccag cagttttgca atcttcggga 540 ctatattcac tatctagtgt cgttacggtg ccttcaagct cgctaggtac acaaacttac 600 atctgtaatg ttaaccataa accttcgaac acgaaagtcg ataaaaaagt ggaaccgaag 660 tcgtgcgata aaacacacac atgtccacca tgtcctgcac cagaattgct aggcggccca 720 tcagtcttcc tatttccgcc aaaacccaaa gatacgttga tgatttctcg cacacccgag 780 gttacttgtg tagtagttga tgtcagtcat gaggatccgg aagtgaaatt taattggtat 840 gtggatggtg ttgaggtcca taatgctaaa actaaaccgc gtgaagaaca atataacagc 900 acataccgtg tcgtttctgt tctcacagtt ttgcatcaag actggttgaa tggtaaagaa 960 tacaaatgca aggtaagtaa taaggcgctg ccggcaccga tagagaaaac gattagtaaa 1020 gctaaagggc aaccgcgaga gccccaggtg tacacactac caccctcgcg cgaagaaatg 1080 accaaaaacc aagtttcgtt aacgtgccta gttaagggtt tttatcctag tgatattgca 1140 gtagaatggg aatcgaatgg tcagccggaa aataattata agaccacgcc accagtatta 1200 gattctgacg gctcattttt tttatatagc aaattaactg tagataagtc acgatggcaa 1260 caagggaatg tattcagttg ttcagttatg catgaagctc ttcataatca ctacacccaa 1320 aagtctttga gtctatctcc aggttga 1347 <210> 10 <211> 668 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding AMG479 light chain peptide <400> 10 gatgtagtca tgacgcaaag tccgctaagt cttcctgtta cacctggcga accagcaagt 60 atttcatgcc ggtcgtcgca gtcactatta cattctaacg gttataacta tttagattgg 120 tacctgcaaa agccaggcca aagtccgcaa ctcttaatat atctcggcag caacagagcg 180 agtggcgtac cggatcgttt tagcggtagc ggttctggga cagattttac gttgaaaata 240 tctcgtgtag aggcagaaga tgtaggtgtt tattattgca tgcagggtac ccattggccg 300 ttgacattcg gtcaaggaac gaaagttgaa ataaaacgta cggttgcggc accatcagta 360 tttatattcc cacctagtga cgaacaacta aaatcgggca cggcgtcggt agtatgtctc 420 ctcaataact tctatccgcg ggaagcaaaa gtccaatgga aagtcgacaa tgctttgcaa 480 tctggcaact cgcaagagtc tgttaccgaa caggattcca aggactcgac atactccctg 540 agttcgactc taactcttag taaagcagat tatgaaaagc ataaagttta tgcatgtgaa 600 gttactcatc aaggacttag ttcgccagta acaaaatcgt ttaatcgagg ggagtgctga 660 gcggccgc 668 <210> 11 <211> 134 <212> PRT <213> IL-2 <400> 11 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His   1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys              20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys          35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys      50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu  65 70 75 80 Arg Pro As Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu                  85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala             100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile         115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Ala     130 <210> 12 <211> 407 <212> DNA <213> nucleotide encoding IL-2 <400> 12 gcccccacct cctcctccac caagaagacc cagctgcagc tggagcacct gctgctggac 60 ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120 accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgagctga agcacctgca gtgcctggag 180 gaggagctga agcccctgga ggaggtgctg aacctggccc agtccaagaa cttccacctg 240 cggccccggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggagctgaa gggctccgag 300 accaccttca tgtgcgagta cgccgacgag accgccacca tcgtggagtt cctgaaccgg 360 tggatcacct tctgccagtc catcatctcc accctgaccg cggccgc 407 <210> 13 <211> 609 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A12_IL-2 heavy chain peptide <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser   1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr              20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met          35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe      50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr  65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys                  85 90 95 Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr             100 105 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val         115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser     130 135 140 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu                 165 170 175 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu             180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr         195 200 205 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val     210 215 220 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 225 230 235 240 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe                 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val             260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe         275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro     290 295 300 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val                 325 330 335 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala             340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg         355 360 365 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly     370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser                 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln             420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His         435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly     450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser 465 470 475 480 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu                 485 490 495 Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr             500 505 510 Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu         515 520 525 Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val     530 535 540 Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu 545 550 555 560 Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr                 565 570 575 Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe             580 585 590 Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr         595 600 605 Ala     <210> 14 <211> 598 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AMG479_IL-2 heavy chain peptide <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly   1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser              20 25 30 Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp          35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu      50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser  65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys                  85 90 95 Ala Arg Trp Thr Gly Arg Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly             100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe         115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu     130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu                 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser             180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro         195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys     210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser                 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ser Glu Asp             260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn         275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val     290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys                 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr             340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr         355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu     370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys                 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu             420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly         435 440 445 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser     450 455 460 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 465 470 475 480 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys                 485 490 495 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys             500 505 510 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys         515 520 525 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu     530 535 540 Arg Pro As Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 545 550 555 560 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala                 565 570 575 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile             580 585 590 Ile Ser Thr Leu Thr Ala         595

Claims (22)

암세포 표면 항원인 IGF-1R(Insulin like growth factor-1 receptor)에 대하여 특이적으로 결합하는 항체 및 IL-2(Interleukin-2)가 연결된 융합 단일클론 항체.
An antibody that specifically binds to IGF-1R (Insulin like growth factor-1 receptor), a cancer cell surface antigen, and a fusion monoclonal antibody to which IL-2 (Interleukin-2) is linked.
제1항에 있어서,
상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체는 IgG 형태인 것인 융합 단일클론 항체.
The method of claim 1,
The antibody that specifically binds to IGF-1R is an fusion monoclonal antibody in the form of an IgG.
제1항에 있어서,
상기 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체는 scFv(Single-chain variable fragment) 형태인 것인 융합 단일클론 항체.
The method of claim 1,
The antibody that specifically binds to IGF-1R is a fusion monoclonal antibody in the form of a scFv (Single-chain variable fragment).
제1항에 있어서,
상기 IL-2는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체의 Fc 영역의 C-말단에 연결된 것인 융합 단일클론 항체.
The method of claim 1,
The IL-2 is a fusion monoclonal antibody that is linked to the C-terminus of the Fc region of the antibody that specifically binds to IGF-1R.
제1항에 있어서,
상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체와 IL-2는 링커로 연결된 것인 융합 단일클론 항체.
The method of claim 1,
The antibody specifically binding to IGF-1R and IL-2 is a fusion monoclonal antibody linked by a linker.
제5항에 있어서,
상기 링커는 펩타이드 링커인 것인 융합 단일클론 항체.
The method of claim 5,
The linker is a peptide linker is a fusion monoclonal antibody.
제6항에 있어서,
상기 펩타이드 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합 단일클론 항체.
The method according to claim 6,
The peptide linker is a fusion monoclonal antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서,
암세포 표면 항원에 대한 해리 상수(KD value)가 100nM 이하인 친화력을 가지는 것인 융합 단일클론 항체.
The method of claim 1,
A fusion monoclonal antibody having affinity of dissociation constant (KD value) for cancer cell surface antigen is 100 nM or less.
제1항에 있어서,
상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 펩타이드 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 펩타이드로 정의되거나 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 정의되는 중쇄 펩타이드 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 정의되는 경쇄 펩타이드로 정의되는 것인 융합 단일클론 항체.
The method of claim 1,
The antibody specifically binding to IGF-1R is defined as a heavy chain peptide defined by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain peptide defined by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a heavy chain defined by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 A fusion monoclonal antibody defined as a peptide and a light chain peptide as defined by the amino acid sequence of SEQ ID NO.
제1항에 있어서,
상기 IL-2는 서열번호 11의 아미노산 서열로 정의되는 것인 융합 단일클론 항체.
The method of claim 1,
The IL-2 is a fusion monoclonal antibody is defined by the amino acid sequence of SEQ ID NO.
제1항에 있어서,
서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는 것인 융합 단일클론 항체.
The method of claim 1,
A fusion monoclonal antibody comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or 14.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
A polynucleotide encoding the fusion monoclonal antibody of any one of claims 1-11.
제12항에 있어서,
상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 항체를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL-2를 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드 것인 폴리뉴클레오티드.
The method of claim 12,
A polynucleotide having a form in which all or a portion of a gene encoding an antibody specifically binding to the IGF-1R is linked to a whole or a portion of a gene encoding IL-2; Or a polynucleotide in which all or a portion of the gene encoding the antibody and all or a portion of the gene encoding IL-2 are linked by a polynucleotide encoding a peptide linker.
제12항에 있어서,
상기 항체를 암호화하는 유전자는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열로 정의되거나 또는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열로 정의되는 것인 폴리뉴클레오티드.
The method of claim 12,
The gene encoding the antibody is defined as a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
제12항에 있어서,
상기 IL-2를 암호화하는 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 것인 폴리뉴클레오티드.
The method of claim 12,
The gene encoding IL-2 has a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
제12항의 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
An expression vector comprising a polynucleotide encoding the fusion monoclonal antibody of claim 12.
제16항의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체.
A transformant transformed by introducing the expression vector of claim 16 into a host cell.
제17항의 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물로부터 융합 단일클론 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 융합 단일클론 항체의 제조방법.
A method for producing a fusion monoclonal antibody comprising culturing the transformant of claim 17 and recovering the fusion monoclonal antibody from the culture thereof.
(ⅰ) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합 단일클론 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;
(ⅱ) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계;
(ⅲ) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및,
(ⅳ) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 융합 단일클론 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합 단일클론 항체를 제조하는 방법.
(Iii) obtaining a polynucleotide encoding the fusion monoclonal antibody of any one of claims 1-11;
(Ii) cloning the obtained polynucleotide to obtain an expression vector;
(Iii) introducing the obtained expression vector into a host cell to obtain a transformant; And
(Iii) culturing the transformant and recovering the fused monoclonal antibody therefrom, the method of producing the fused monoclonal antibody of any one of claims 1 to 11.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물.
12. A cancer treatment composition comprising the fusion monoclonal antibody of any one of claims 1 to 11 as an active ingredient.
제20항에 있어서,
약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 암치료용 조성물.
21. The method of claim 20,
A cancer treatment composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
제20항에 있어서,
상기 암은 유방암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종 또는 혈액암으로 구성되는 군에서 선택된 것인 암치료용 조성물.21. The method of claim 20,
The cancer is breast cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, lung cancer, colon cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, prostate cancer, testicular cancer, bladder cancer, kidney cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bone cancer, combined A cancer treatment composition selected from the group consisting of tissue cancer, skin cancer, brain cancer, thyroid cancer, leukemia, Hodgkin's disease, lymphoma, multiple myeloma or hematologic cancer.
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