KR20130031194A - The obtaining method of hydrolysate from silkworm gland - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 누에를 동결건조하여 수집한 실샘으로부터 가수분해물의 수득방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유해한 용매를 사용하지 않으면서, 상온추출로 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득이 가능한 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for obtaining a hydrolyzate from a silk gland collected by lyophilization of silkworms, and more particularly, to a silkworm gland-derived hydrolyzate capable of obtaining silkworm silk gland-derived hydrolyzate by room temperature extraction without using a harmful solvent. It relates to a method of obtaining.
누에로부터 수득이 가능한 실크 단백질은 물에 잘 녹지 않는 피브로인과 물에 잘 용해되는 세리신을 주요 성분으로 나눌 수 있다. 이 중 세리신은 고분자 단백질로 극성용매에 녹거나, 산이나 알칼리 용액에 분해되거나, 단백질 분해효소에 의해 분해될 때 온도, pH, 처리시간 등의 다양한 요소에 의해 최종 산물의 분자량 및 특성이 변화될 수 있다.Silk proteins obtainable from silkworms can be divided into fibroin, which is insoluble in water, and sericin, which is soluble in water. Among these, sericin is a high molecular protein, and when it is dissolved in polar solvent, decomposed in acid or alkaline solution, or decomposed by protease, various factors such as temperature, pH, and processing time may change the molecular weight and characteristics of the final product. Can be.
이러한 고분자 실크 단백질은 의학 생재료, 기능성 멤브레인, 하이드로겔, 그리고 기능성 섬유로서 대부분 사용되어 왔다.These polymeric silk proteins have been mostly used as medical raw materials, functional membranes, hydrogels, and functional fibers.
견사에는 세리신 30%와 피브로인 70%의 2종 단백질로 구성되어 있고, 세리신은 피브로인을 코팅한 상태로 존재하고 있다.Silk silk consists of two proteins, 30% sericin and 70% fibroin, and sericin is present in a fibroin-coated state.
현재 이러한 견사 등으로부터 세리신을 얻는 방법으로, 일본 특허 제3011759호(세리신 미분 및 그 제조법)에는 종래의 정련 폐액으로부터 세리신을 회수하는 방법이 공개되어 있는데 이는, 평균 분자량 50,000이하의 저분자량의 것밖에 얻을 수 없었다. 즉, 견사 중의 세리신은 결정화되어 있기 때문에, 대부분 물에 녹지않으며, 알칼리성 용매로는 용해 가능함을 알 수 있다. As a method of obtaining sericin from such silk thread, Japanese Patent No. 3011759 (Sericin fine powder and its manufacturing method) discloses a method of recovering sericin from a conventional refining waste liquid, which has a low molecular weight of 50,000 or less on average molecular weight. Could not get That is, since sericin in silk yarn is crystallized, it is found that most of it is insoluble in water and soluble in an alkaline solvent.
또한, 일본특허 제3959452호(세리신의 추출방법)에는 세리신 추출을 위해 고온가열로 용해를 해야만 추출이 가능함을 알 수 있다.In addition, Japanese Patent No. 3959452 (Sericin extraction method) shows that extraction is possible only by dissolving with high temperature heating to extract sericin.
이에, 현재까지 공지된 발명들은 누에고치로부터 복잡한 공정들을 거쳐야지만 세리신 생산이 가능하므로 공정 및 기간이 오래 걸려 비경제적인 면이 있으며, LiBr과 같은 유해한 용매를 사용하며, 90℃이상의 고온가열로 용해를 해야만 세리신 수득이 가능하였다.
Therefore, the inventions known to date have to go through complicated processes from cocoon, but since it is possible to produce sericin, it takes an uneconomical process because it takes a long time and process, uses a harmful solvent such as LiBr, and dissolves by heating at a high temperature of 90 ° C. or higher. Only sericin could be obtained.
본 발명의 목적은 유해한 용매를 사용하지 않고, 상온추출로 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득이 가능하며, 세포증식효과가 우수한 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법을 제공하기 위한 것이다.An object of the present invention is to provide a method for obtaining silkworm gland-derived hydrolyzate, which is capable of obtaining silkworm gland-derived hydrolyzate by room temperature extraction without using harmful solvents, and has an excellent cell proliferation effect.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are not intended to limit the invention to the particular embodiments that are described. It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are not restrictive of the invention, There will be.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법은, 누에를 준비하는 제1단계, 상기 준비된 누에를 동결건조하여 실샘을 분리하고, 분리된 실샘을 물로 용해하여 제1 용해물을 제조하는 제2단계, 상기 제1 용해물을 원심분리한 후 상등액을 취하는 제3단계, 상기 상등액에 알칼리를 첨가한 후 가수분해하여 제2 용해물을 제조하는 제4단계, 상기 제2 용해물에 산을 넣고 중화하여 중화액을 제조하는 제5단계, 상기 중화액을 탈염하여 가수분해물을 수득하는 제6단계 및, 상기 수득된 가수분해물을 동결건조하는 제7단계를 포함하여 구성된다.In order to achieve the above object, a method for obtaining silkworm-derived hydrolyzate of the present invention comprises a first step of preparing silkworms, lyophilizing the prepared silkworms to separate the silk glands, and dissolving the separated glands with water to dissolve the first lysate. A second step of preparing a third step of taking a supernatant after centrifuging the first lysate, a fourth step of preparing a second lysate by adding an alkali to the supernatant and then hydrolyzing the second lysate And a fifth step of neutralizing the acid by adding acid to the seafood, a sixth step of desalting the neutralizing solution to obtain a hydrolyzate, and a seventh step of lyophilizing the obtained hydrolyzate.
상기 제2단계의 제1 용해물 제조시, 분리된 실샘을 미세분말로 제조한 후 물로 용해한다.In the preparation of the first lysate of the second step, the separated gland is prepared into fine powder and then dissolved in water.
또한, 상기 제2 용해물 제조시, 알칼리로 NaOH를 사용하며, 상등액을 15~30℃에서 가수분해하는 것이 특징이다.In addition, during the preparation of the second melt, it is characterized by using NaOH as an alkali, and hydrolyzing the supernatant at 15 ~ 30 ℃.
또한, 상기 중화액 제조시, 산으로 인산을 사용하는 것이 특징이다.In addition, when the neutralizing solution is prepared, it is characterized by using phosphoric acid as an acid.
본 발명의 가수분해물은 상기와 같은 수득방법을 통해 수득되는 것이 특징이며, 특히 상기 가수분해물의 전체 아미노산을 기준으로 25~35%의 글리신과 10~25%의 알라닌을 함유하는 것이 특징이다.The hydrolyzate of the present invention is characterized in that it is obtained through the above obtaining method, and in particular, it contains 25 to 35% glycine and 10 to 25% alanine based on the total amino acid of the hydrolyzate.
또한, 상기 가수분해물은 수용성인 것이 특징이다.
In addition, the hydrolyzate is characterized in that it is water-soluble.
본 발명에 의해, 유해한 용매를 사용하지 않으면서, 상온추출로 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득이 가능하여 기존의 누에 유래 실크 단백질을 수득하는 공정 및 기간을 단축시킬수 있다.According to the present invention, it is possible to obtain a silkworm-derived hydrolyzate by room temperature extraction without using harmful solvents, thereby shortening the process and time period of obtaining silkworm-derived silk protein.
또한, 누에 실샘 분말에서 가수분해물을 수득함으로써 가수분해물의 회수율 및 순도를 증대할 수 있으며, 아울러, 제조과정에서 생기는 결정화 성질로 인하여 물에 완전히 녹지 않는 형태의 분말을 완전히 물에 녹는 형태의 가수분해물로 수득이 가능하다.In addition, by obtaining the hydrolyzate from the silkworm silk powder, the recovery and purity of the hydrolyzate can be increased, and the hydrolyzate in the form of completely dissolving the powder in the form that is not completely soluble in water due to the crystallization property generated during the manufacturing process. It is possible to obtain.
이러한 본 발명의 누에 유래 가수분해물은 무혈청 첨가효과가 우수하며, 세포증식효과가 우수하여 혈청대체제로 사용가능하며 피부코팅효과, 보습, 항산화능, 피부친화력 등의 물성이 우수한 소재로도 사용가능하다.
The silkworm-derived hydrolyzate of the present invention has an excellent serum-free additive effect and excellent cell proliferation effect and can be used as a substitute for serum, and can also be used as a material having excellent physical properties such as skin coating effect, moisturizing, antioxidant activity, and skin affinity. Do.
도 1은 본 발명의 수용성 가수분해물의 수득공정의 일예시도.
도 2는 누에로부터 분리한 실샘을 초미세분말로 가공 후 SEM(주사형 전자 현미경)을 통해 나타낸 도면.
도 3은 누에 원료별로 수득한 수용성 가수분해물의 각 단백질 분자량 분포정도를 나타낸 도면.
1: 대조군
2: 실시예 1(누에 숙잠) 3: 실시예 2(세리신 잠)
도 4는 수용성 가수분해물의 FTI-IR 분석을 나타낸 그래프.
SGH: 누에 실샘 가수분해물(silkworm gland hydrolysate)
CSH: 누에고치 세리신 가수분해물(Cocoon sericin hydrolysate)
도 5는 가수분해물 첨가 농도에 따른 세포 독성시험결과를 나타낸 그래프.
도 6a는 대조군인 고치(cocoon) 유래 가수분해물에 대한 무혈청 배지에서 가수분해물 첨가 농도에 따른 세포 증식 효과를 나타낸 그래프.
Basal media: 기본 배지
0.01mg/㎖, 0.1mg/㎖, 0.5mg/㎖, 1mg/㎖ : 대조군 가수분해물 시약 농도
10% FBS(fetalbovine serum): 우(牛)태아 혈청
도 6b는 본 발명의 실시예 2의 가수분해물에 대한 무혈청 배지에서 가수분해물 첨가 농도에 따른 세포 증식 효과를 나타낸 그래프.
Basal media: 기본 배지
0.01mg/㎖, 0.1mg/㎖, 0.5mg/㎖, 1mg/㎖ : 본 발명의 실시예 2의 가수분해물 농도
10% FBS(fetalbovine serum): 우(牛)태아 혈청
도 7은 세포배양 접시에 가수분해물 코팅 농도에 따른 세포 부착정도(Fold change in cell number) 및 증식효과를 나타낸 그래프.
도 8은 수용성 가수분해물의 활성산소 억제 효과를 나타낸 그래프.
SGH: 누에 실샘 가수분해물(silkworm gland hydrolysate)
CSH: 누에고치 세리신 가수분해물(Cocoon sericin hydrolysate)1 is an exemplary view of a step of obtaining a water-soluble hydrolyzate of the present invention.
Figure 2 is a diagram showing through a scanning electron microscope (SEM) after processing the silk glands separated from silkworms into ultra-fine powder.
3 is a diagram showing the distribution of molecular weight of each protein of the water-soluble hydrolyzate obtained for each silkworm material.
1: control group
2: Example 1 (silk silkworm) 3: Example 2 (sericin sleep)
4 is a graph showing an FTI-IR analysis of a water soluble hydrolyzate.
SGH: silkworm gland hydrolysate
CSH: Cocoon sericin hydrolysate
Figure 5 is a graph showing the cytotoxicity test results according to the concentration of hydrolyzate.
Figure 6a is a graph showing the effect of cell proliferation according to the concentration of hydrolyzate in serum-free medium for cocoon-derived hydrolyzate as a control.
Basal media: basic badge
0.01 mg / ml, 0.1 mg / ml, 0.5 mg / ml, 1 mg / ml: control hydrolyzate reagent concentration
10% FBS (fetalbovine serum): fetal bovine serum
Figure 6b is a graph showing the cell proliferation effect according to the concentration of hydrolyzate in serum-free medium for the hydrolyzate of Example 2 of the present invention.
Basal media: basic badge
Hydrolyzate concentration of Example 2 of the present invention: 0.01 mg / ml, 0.1 mg / ml, 0.5 mg / ml, 1 mg / ml
10% FBS (fetalbovine serum): fetal bovine serum
7 is a graph showing the degree of cell adhesion (Fold change in cell number) and the proliferation effect according to the hydrolyzate coating concentration in the cell culture dish.
8 is a graph showing the active oxygen inhibition effect of the water-soluble hydrolyzate.
SGH: silkworm gland hydrolysate
CSH: Cocoon sericin hydrolysate
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.The terms, techniques, and the like described in this specification are used in the meaning commonly used in the technical field to which the present invention belongs, unless otherwise specified.
이하, 본 발명의 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, a method for obtaining silkworm-derived hydrolyzate of the present invention will be described in detail.
1. 제1단계: 누에 준비Step 1: Prepare silkworms
실크원료로 누에를 사용하며, 본 발명에서 누에의 종으로 Bombix mori 종을 사용하나, 이에 국한한 것은 아니며 일반적으로 실샘을 수득할 수 있는 누에로 여겨지는 모든 종은 사용가능하다. Silkworm is used as a silk raw material and Bombix is a species of silkworm in the present invention. mori Species are used, but are not limited to, any species generally considered to be silkworms capable of obtaining glands.
특히, 세포증식효과가 우수하며 사육시간 및 인건비를 감소시켜 가수분해물을 수득하기 위해 상기 누에는 숙잠을 사용하는 것이 바람직하다.
In particular, it is preferable to use the silkworm snooze in order to obtain a hydrolyzate with excellent cell proliferation effect and to reduce breeding time and labor costs.
2. 제2단계: 제1 용해물 제조2. Second step: preparing first melt
상기 준비된 누에를 동결건조하여 실샘을 분리하고, 물로 용해하여 제1 용해물을 제조한다.The silkworms are lyophilized to separate the silk glands, and dissolved with water to prepare a first lysate.
동결건조는 실샘과 혈림프의 분리를 용이하게 해주는 역할을 한다.Lyophilization facilitates the separation of blood glands and blood glands.
상기 실샘은 초미세분말 상태일 경우 성분변화를 최소화할 수 있도록 상온(15~30℃)에서 용이하게 용해가 이루어질 수 있다.The seal gland may be easily dissolved at room temperature (15 to 30 ° C.) so as to minimize component changes in the ultra fine powder state.
또한, 상기 실샘은 초미세분말로 제조하여 물로 용해하는 것이 바람직하다. 이는, 용해시 물분자와 접촉면적이 최대화되어 용해가 잘 이루어지며, 실온에서 용해된 실샘 단백질만을 분리할 수 있기 때문이다. 더욱 바람직하게는 상기 실샘 미세분말의 입자 크기는 600~800mesh 인 것이 좋다. In addition, the seal glands are preferably made of ultra fine powder and dissolved in water. This is because dissolution is well achieved by maximizing the contact area with the water molecule during dissolution, and it is possible to separate only the dissociated real protein at room temperature. More preferably, the particle size of the silk fine powder is preferably 600 to 800 mesh.
상기 물은 증류된 증류수를 사용하는 것이 좋으며, 그 함량은 상기 제1 용해물이 완전 용해되도록 제1 용해물에 제1 용해물이 완전 용해가능할 정도의 물을 넣고 용해한다.It is preferable to use distilled distilled water for the water, and the content of the first melt is completely dissolved so that the first melt is completely dissolved in the first melt so that the first melt is completely dissolved.
상기 실샘 분말은 하기와 같은 방법들 중 어느 하나의 방법으로 분리된다.The seal powder is separated by any one of the following methods.
1) 수작업으로 가로×세로 0.5mm 씩 그물코를 갖는 체 또는 망을 이용하여 분리한다. 1) Separate by hand with a sieve or net with a net width of 0.5mm in width x length by hand.
2) 볼밀을 이용하여 실샘을 분리한다(볼밀 직경 1~5cm, 회전수 80~120분) 2) Use a ball mill to separate the seal gland (ball mill diameter 1-5cm, rotation speed 80-120 minutes)
3) 물리적으로 파쇄 후 바람을 이용하여 분리한다.
3) After crushing physically, use wind to separate.
3. 제3단계: 상등액 획득3. Stage 3: Acquisition of Supernatant
상기 제1 용해물을 원심분리한 후, 가라앉은 침전물을 제외한 나머지 상등액만을 회수한다.
After centrifugation of the first lysate, only the supernatant except for the settled precipitate is recovered.
4. 제4단계: 제2 용해물 제조4. Step 4: Preparation of Second Melt
상기 상등액에 알칼리를 첨가한 후 가수분해하여 제2 용해물을 제조한다.The alkali is added to the supernatant and then hydrolyzed to prepare a second melt.
상기 알칼리로는 수산화나트륨(NaOH)을 사용하는 것이 좋다. 이는, 수산화나트륨(NaOH)으로 인해 상기 상등액이 분자량이 작은 펩타이드(peptide)로 분해가 이루어지도록 해주기 때문이다.As the alkali, it is preferable to use sodium hydroxide (NaOH). This is because the sodium hydroxide (NaOH) causes the supernatant to be decomposed into small peptides.
바람직하게는 NaOH를 사용하되 최종 농도가 0.2~1M이 되도록, 더욱 바람직하게는 1M 이 되도록 첨가한 후, 상온(15~30℃)에서 0.5~1시간 정도, 더더욱 바람직하게는 30분간 가열하여 가수분해한다. Preferably NaOH is added but the final concentration is 0.2-1 M, more preferably 1 M, and then heated at room temperature (15-30 ° C.) for 0.5-1 hour, even more preferably for 30 minutes. Disassemble.
즉, 상기 상온에서도 모두 분해가 가능하므로, 기존에 고온 처리시 수득된 가수분해물의 특성이 일부 변형되는 것을 방지할 수 있으면서, LiBr과 같은 유해한 용매를 사용하지 않아도 가수분해물의 분리가 가능하다.
That is, since all of the decomposition is possible at room temperature, it is possible to prevent the deformation of the properties of the hydrolyzate obtained during the high temperature treatment in the past, and it is possible to separate the hydrolyzate without using a harmful solvent such as LiBr.
5. 제5단계: 중화액 제조5. Step 5: Prepare Neutralizing Solution
상기 제2 용해물에 산을 넣고 중화하여 중화액을 제조한다.An acid is added to the second lysate and neutralized to prepare a neutralized liquid.
이때, 산으로는 인산을 사용하는 것이 바람직하며, 이때 다른 종류의 산을 사용할 수는 있으나, 다른 종류의 산을 사용하는 경우에는 하기의 탈염과정이 어려운 문제점이 있다. In this case, it is preferable to use phosphoric acid as an acid, and in this case, although a different type of acid may be used, there is a problem in that the following desalting process is difficult.
이에 상기 인산으로 2N 인산을 사용하는 것이 좋으며, 이는 중화점인 종말점을 맞추기 쉽고, 또한 작업시 취급이 용이하고 안전하기 때문이다.Therefore, it is preferable to use 2N phosphoric acid as the phosphoric acid, because it is easy to meet the end point of the neutralization point, and also easy to handle and safe during operation.
상기 인산은 pH가 7.0~7.5 정도가 될 때까지 첨가하여 중화액을 제조한다.
The phosphoric acid is added until the pH is about 7.0 ~ 7.5 to prepare a neutralized liquid.
6. 제6단계: 탈염6. Step 6: Desalting
탈염은 시료에 포함되어 있는 염류를 제외하는 조작으로 순수(純水) 가수분해물을 얻을 목적으로의 시행되는 것이다. Desalting is carried out for the purpose of obtaining pure hydrolyzate by an operation to remove salts contained in a sample.
이에 탈염 방법으로는 통상적인 탈염 방법으로 모두 사용가능하나, 물질이 분자량 수천 이상인 고분자의 경우는 염류와의 분자크기 차이를 이용하는 여러 가지 방법, 즉 겔여과, 한외여과, 투석 등으로 사용하는 투석용 막의 분자량은 5K 이하의 것, 바람직하게는 3.5K 이하의 것을 사용하도록 한다.
The desalination method can be used as a conventional desalination method, but for polymers having a molecular weight of thousands or more, for dialysis used in various methods using molecular size differences from salts, that is, gel filtration, ultrafiltration, and dialysis. The molecular weight of the membrane is to be 5K or less, preferably 3.5K or less.
7. 제7단계: 가수분해물 수득 7. Step 7: Obtain hydrolyzate
상기 탈염 후 이를 동결건조하여 가수분해물을 수득한다. After the desalting it is lyophilized to obtain the hydrolyzate.
다시말해, 상기 수득된 물질은 피브로인(fibroin)과 세리신(sericin)이 혼합된 상태의 실샘이 상온에서 용해가 되는 실크 단백질을 가수 분해하여 얻은 것이므로 피브로인과 세리신 모두 혼합된 상태이다. 이에 상기 수득된 물질을 본 발명에서는 "가수분해물"이라고 명명한다.In other words, the obtained material is obtained by hydrolyzing the silk protein in which the fibroin and the sericin are mixed at room temperature, so that both fibroin and sericin are mixed. The material thus obtained is termed "hydrolyzate" in the present invention.
특히 상기 가수분해물은 물에 용이하게 용해되기 위해 수용성인 것이 특징이다.In particular, the hydrolyzate is characterized by being water-soluble in order to be easily dissolved in water.
상기 가수분해물은 동결건조 후 분말형태로 분쇄하여 하기와 같이 사용하기도 한다.The hydrolyzate may be pulverized into powder form after lyophilization and used as follows.
이와 같이 상기의 과정을 통해 유해한 용매를 사용하지 않으면서, 상온추출만으로 가수분해물 수득이 가능하여 기존 누에고치에서 가수분해물을 수득하는 공정 및 기간을 단축시킬 수 있다.Thus, without using a harmful solvent through the above process, it is possible to obtain a hydrolyzate only by extracting at room temperature, it is possible to shorten the process and period of obtaining a hydrolyzate from the existing cocoon.
또한, 실샘분말에서 가수분해물을 추출하여 물 분자와의 접촉하는 표면적 증대로 회수율 및 순도를 증대할 수 있으며, 또한, 제조과정에서 생기는 가수분해물의 결정화 성질로 인하여 물에 완전히 녹지 않는 형태의 분말을 완전히 물에 녹는 형태로 수득 가능하다.In addition, it is possible to increase the recovery and purity by increasing the surface area in contact with the water molecules by extracting the hydrolyzate from the real powder, and also due to the crystallization properties of the hydrolyzate produced in the manufacturing process Obtained in the form of completely soluble in water.
이렇게 수득된 가수분해물은 상기 가수분해물의 전체 아미노산을 기준으로 25~35%의 글리신과 10~25%의 알라닌을 함유한다. 이는 현재 타 회사에서 판매중인 가수분해물보다 더 많이 함유되어 있는 것이다. The hydrolyzate thus obtained contains 25-35% glycine and 10-25% alanine based on the total amino acids of the hydrolyzate. This is more than any hydrolyzate currently sold by other companies.
또한, 상기 수득된 가수분해물은 세포독성이 없어 무혈청 배지에 첨가하여 사용이 가능하며, 10% FBS가 첨가된 배양액에서 배양한 세포증식 효과보다 더 우수하여 혈청대체제로 상품화도 가능함을 알 수 있다.In addition, the obtained hydrolyzate has no cytotoxicity and can be used in serum-free medium. The hydrolyzate obtained above can be commercialized as a serum substitute because it is superior to the cell proliferation effect of cultured in a culture medium containing 10% FBS. .
이에, 고가수입의 대체효과를 누릴 수 있으며, 이로 인해 양잠농가의 부가소득원으로 사용가능하며, 항산화능, ROS 억제능, 세포사멸억제능이 높아 피부친화력 등의 물성이 우수한 소재로 개발 가능하며 배양첨가물, 코팅제, 화장품 첨가제의 원료소재로도 사용가능하다.
Therefore, it is possible to enjoy the substitution effect of high-income income, which can be used as a supplementary income source for sheep farmers, and it can be developed as a material having excellent physical properties such as skin affinity due to its high antioxidant capacity, ROS inhibitory ability, and cell death suppressing ability. It can also be used as a raw material for coating and cosmetic additives.
하기 실시예 및 실험예에 의해서 보다 구체적으로 설명하지만 보호범위가 하기 실시예 및 실험예에 국한되는 것은 아니다. The present invention will be described in more detail with reference to the following examples and experimental examples, but the scope of protection is not limited to the following examples and experimental examples.
<실시예 1> 본 발명의 수용성 가수분해물1 수득Example 1 Obtaining a water-
도 1에 도시되어 있듯이, 먼저 실크 원료로 누에 숙잠을 준비하고 이를 동결건조하였다.As shown in Figure 1, first prepared silkworm snooze as a silk material and it was lyophilized.
상기 동결 건조물을 통해 실샘을 분리하고 이 분리된 실샘을 초저온 분쇄기 (cryogenic mill)에 투여하여 초미세분말로 가공하였으며, 이를 SEM(주사형 전자 현미경)을 통해 확인한 바 도 2와 같이 나타났다. The gland was separated through the freeze-dried material, and the separated gland was administered to a cryogenic mill and processed into an ultrafine powder, which was confirmed by SEM (scanning electron microscope), as shown in FIG. 2.
이렇게 가공된 누에실샘 초미세분말을 상온(15~30℃)에서 30분간 교반하면서 용해하여 제1 용해물을 제조하였다.The processed silkworm gland ultrafine powder was dissolved by stirring at room temperature (15-30 ° C.) for 30 minutes to prepare a first lysate.
상기 제1 용해물을 원심분리한 후 상등액만을 취하고 여기에 NaOH를 첨가하되, 최종 1M이 되도록 상기 상등액에 첨가하여 24℃에서 30분간 교반하여 제2 용해물을 제조하였다.After centrifuging the first lysate, only the supernatant was taken and NaOH was added thereto, but the second lysate was prepared by adding the supernatant to the supernatant so that the final 1 M was stirred at 24 ° C. for 30 minutes.
상기 제2 용해물을 인산을 이용하여 pH가 7이 되도록 중화하여 중화액을 제조하였다.The second lysate was neutralized to
상기 중화액을 한외여과(ultrafiltration) 방법으로 탈염하였다. The neutralized solution was desalted by ultrafiltration.
그 후 다시 동결건조하여 최종 물질인 수용성 가수분해물1을 수득하였다.
After lyophilization again to obtain a water-
<실시예 2> 본 발명의 수용성 가수분해물2 수득Example 2 Obtaining Water-
상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하되, 숙잠 대신 세리신 잠을 사용하여 최종 물질인 수용성 가수분해물2를 수득하였다.
Prepared in the same manner as in Example 1, using sericin jam instead of slumber to obtain the final material water-
<실험예 1> 실크 원료에 따른 가수분해물의 함량 비교Experimental Example 1 Comparison of Hydrolysates According to Silk Raw Materials
상기 실시예 1과 2에 제시된 본 발명의 특징적인 가수분해물을 수득해 내되, 실크원료별로 제조된 가수분해물에 대해 최종적으로 회수된 가수분해 분말의 함량을 확인하였다.The characteristic hydrolyzate of the present invention shown in Examples 1 and 2 was obtained, but the content of the hydrolyzed powder finally recovered was confirmed for the hydrolyzate prepared for each silk material.
그 결과, 아래의 표 1과 같이 나타났다.As a result, it is shown in Table 1 below.
실샘 미세분말 '실시예1'Common silkworm
Silsam fine powder 'Example 1'
실샘 미세분말 '실시예2'Sericinjam
Silsam fine powder 'Example 2'
상기 표 1에 나타나 있듯이, 실시예2의 세리신잠의 실샘에는 피브로인이 없고 거의 100%가 세리신만으로 구성되어 있는 것으로 일반 누에(실시예1)보다 높은 가수분해물의 회수율을 얻음을 알 수 있었다.
As shown in Table 1, it was found that the silicea of sericin-zam of Example 2 was free of fibroin and almost 100% of sericin contained only a higher recovery rate of hydrolyzate than ordinary silkworm (Example 1).
<실험예 2> 수용성 가수분해물 단백질의 분자량 측정Experimental Example 2 Measurement of Molecular Weight of Water-soluble Hydrolyzate Protein
실시예1과 실시예2에서 수득된 분말형태의 가수분해물들의 각 단백질 분자량 패턴을 확인하기 위하여, 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하였다.In order to confirm the protein molecular weight patterns of the hydrolyzates in powder form obtained in Example 1 and Example 2, electrophoresis (SDS-PAGE) was performed.
이때, 대조군으로는 고치(cocoon) 유래 가수분해물을 사용하였다.At this time, the cocoon-derived hydrolyzate was used as a control.
상기 실험결과, 도 3에 나타나 있듯이, 본 발명의 제조공정으로 제조된 가수분해 분말들(실시예1, 실시예2)의 경우 대조군보다 분자량이 작아, 대다수의 단백질이 50kDa 이하에서 넓게 분포됨을 확인하였다.As a result of the experiment, as shown in Figure 3, the hydrolyzed powders prepared in the manufacturing process of the present invention (Example 1, Example 2) is less molecular weight than the control, confirming that the majority of the protein is widely distributed in less than 50kDa It was.
즉, 본 발명의 제조공정으로 제조된 가수분해 분말들(실시예1, 실시예2)은 분자량이 작고 수용성임을 알 수 있었다.
That is, it can be seen that the hydrolyzed powders (Examples 1 and 2) prepared by the manufacturing process of the present invention have a small molecular weight and are water-soluble.
<실험예 3> 가수분해물의 아미노산 분석Experimental Example 3 Amino Acid Analysis of Hydrolyzate
일반누에 숙잠의 미세분말을 이용해서 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 아미노산 분석을 실시하였다. Amino acid analysis was carried out on the actual hydrolyzate produced using fine powder of silkworm silkworm.
아미노산 분석을 위한 가수분해 분말을 6N 염산(Hydrochloric acid)을 이용하여 120℃, 24시간 동안 진공상태에서 반응하였다. The hydrolyzed powder for amino acid analysis was reacted under vacuum at 120 ° C. for 24 hours using 6N hydrochloric acid.
반응이 완료된 샘플은 아미노산 자동 분석기를 이용하여 분석하였다. The reaction was completed samples were analyzed using an amino acid automatic analyzer.
그 결과, 표 2와 같이 나타났다.As a result, it was shown in Table 2.
상기 표 2에 나타나 있듯이 대조군인 고치 유래 가수분해물에 비해 주요 아미노산인 알라닌(ala)과 글라신(gly)의 함량이 더 높게 나타난 것을 확인하였다. As shown in Table 2, it was confirmed that the contents of the major amino acids alanine (ala) and glassine (gly) were higher than those of the control cocoon-derived hydrolyzate.
상기 알라닌과 글리신의 성분은 세포의 당대사에 중요한 역할을 하는 것으로써 궁극적으로는 세포의 에너지원으로 사용되어 세포의 증식을 증가시키는 역할을 한다.
The components of alanine and glycine play an important role in cell metabolism and ultimately serve as a cell energy source to increase cell proliferation.
<실험예 4> 가수분해물의 FT-IR 분석Experimental Example 4 FT-IR Analysis of the Hydrolyzate
일반누에 숙잠의 미세분말을 이용해서 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 적외선 분광 광도계를 이용하여 구조적 특성을 확인하였다. Structural characteristics were confirmed using an infrared spectrophotometer for the real-spring hydrolyzate prepared using fine powder of silkworm silkworm.
적외선 분광 광도계를 이용하여 4000~300cm-1의 스펙트럼 범위에서 ATR-FTIR을 측정하였다. ATR-FTIR was measured in the spectral range of 4000-300 cm <-1> using the infrared spectrophotometer.
그 결과, 도 4에 나타나 있듯이, 수용성 가수분해물의 IR-스펙트럼 패턴은 1625~1655cm-1와 3420~3440cm-1 부근에서 최고점(peak)을 나타냈으며, 대조군인 고치 유래 가수분해물에 비해 낮은 β-구조(sheet)와 랜덤코일(random coil)의 흡열 최고점(peak)를 나타내었다. As a result, as shown in FIG. 4, the IR-spectrum pattern of the water-soluble hydrolyzate showed a peak around 1625-1655 cm −1 and 3420-3440 cm −1 , which was lower than that of the control cocoon-derived hydrolyzate. The endothermic peak of the sheet and the random coil is shown.
상기 β-구조는 실샘에 존재하는 실크 단백질이 체외에 나오면서 비가역적인 반응으로 수소결합에 의한 크리스탈화(crystalizaion)가 일어나면서 생성되며 이로 인해 용해도를 떨어뜨리게 되는 것이다. 이에 β-구조가 적게 존재한다는 것은 높은 용해도를 갖는다는 것이므로 본 발명의 수용성 가수분해물은 상기 대조군보다 수용성 성질이 더 우수하다는 것을 알 수 있다.
The β-structure is generated by crystallizing by hydrogen bonds as an irreversible reaction as silk proteins present in the silk gland are released from the outside of the body, thereby decreasing the solubility. Since the presence of less β-structure has a higher solubility, it can be seen that the water-soluble hydrolyzate of the present invention has better water solubility than the control.
<실험예 5> 가수분해물의 세포 독성확인Experimental Example 5 Confirmation of Cytotoxicity of Hydrolyzate
일반누에 숙잠의 미세분말을 이용하여 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 세포 독성시험을 하였다.Cytotoxicity test was performed on the silk gland hydrolyzate prepared using fine powder of silkworm silkworm.
일단 DPBS(Welgene. cat. LB 001-02)에 20 mg/㎖의 농도로 용해한 후, 배양중인 세포에 최종 0~5 mg/㎖의 농도로 가수분해물을 처리하였을 때 세포에 미치는 독성을 확인하기 위하여 CCK-8 분석(assay)을 수행하였다.Once dissolved in DPBS (Welgene. Cat. LB 001-02) at a concentration of 20 mg / ml, and then to determine the toxicity to the cells when the hydrolyzate was treated to a final concentration of 0 ~ 5 mg / ml to the cells in culture CCK-8 assay was performed.
이때, 상기 가수분해물을 세포에 처리하고 2일간 배양한 후 CCK-8 분석을 수행하였다.At this time, the hydrolyzate was treated to cells and cultured for 2 days, followed by CCK-8 analysis.
그 결과, 도 5에 나타나 있듯이, 농도가 증가됨에 따라 세포증식 억제가 일어나지 않는 것으로 보아 독성이 없는 것으로 확인되었다.
As a result, as shown in Figure 5, it was confirmed that there is no toxicity because the inhibition of cell proliferation does not occur as the concentration is increased.
<실험예 6> 무혈청 배지를 통한 세포증식 효과 확인Experimental Example 6 Confirmation of Cell Proliferation Effect Through Serum-free Medium
일반누에 숙잠의 미세분말을 이용하여 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 무혈청 배지를 통한 세포증식 효과를 측정하였다.The effect of cell proliferation through serum-free medium was measured on the silk gland hydrolyzate prepared using fine powder of silkworm silkworm.
이때, 대조군로는 누에고치 유래 가수분해물을 사용하였다.In this case, a cocoon-derived hydrolyzate was used as a control.
즉, 실시예 1의 가수분해물을 DPBS(WelGENE, cat. LB 001-02)에 20㎎/㎖ 의 농도로 용해한 후 혈청이 제거된 배지에 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1㎎/㎖의 농도로 각각 처리하였다.That is, the hydrolyzate of Example 1 was dissolved in DPBS (WelGENE, cat. LB 001-02) at a concentration of 20 mg / ml, and then the concentration of 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1 mg / ml in serum-free medium. Respectively.
10% FBS가 첨가된 배지를 이용하여 배양한 세포와 비교하기 위하여 WST-1 분석을 하루 간격으로 총 4일간 측정하였다.The WST-1 assay was measured for a total of four days at daily intervals for comparison with cells incubated with medium supplemented with 10% FBS.
WST-1 분석시약을 배지의 10%가 되게 첨가하고 배양 조건과 동일하게 약 3시간 정도 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.WST-1 assay reagent was added to 10% of the medium, and reacted for about 3 hours under the same conditions as the culture conditions, and the absorbance was measured at 450 nm.
그 결과, 도 6에 나타나 있듯이, 무혈청 배지에 1% 가수분해물을 첨가한 경우(도 6b) 10% FBS를 첨가한 배지와 동등 이상의 세포증식 효과를 확인할 수 있었으며 대조군인 누에고치 유래 가수분해물(도 6a)보다 세포증식 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
As a result, as shown in FIG. 6, when 1% hydrolyzate was added to the serum-free medium (FIG. 6B), a cell proliferation effect equivalent to or higher than that of the medium to which 10% FBS was added was confirmed. It was confirmed that the cell proliferation effect is superior to Figure 6a).
<실험예 7> 증식된 세포수 측정Experimental Example 7 Measurement of Proliferated Cell Number
일반누에 숙잠의 미세분말을 이용하여 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 세포 부착 정도를 측정하여 증식된 세포수를 확인하였다.The number of proliferated cells was confirmed by measuring the degree of cell adhesion of the silk gland hydrolyzate prepared using fine powder of silkworm snooze.
즉, 실시예 1에서 제조된 가수분해 분말을 DPBS (WelGENE, cat. LB 001-02)에 20 ㎎/㎖ 의 농도로 용해한 후 배양 접시 표면에 처리하고 1시간 동안 37℃ 배양기에 정치해 두었다.That is, the hydrolyzed powder prepared in Example 1 was dissolved in DPBS (WelGENE, cat. LB 001-02) at a concentration of 20 mg / ml, treated on the surface of the culture dish, and left to stand at 37 ° C incubator for 1 hour.
그 다음, 가수분해 단백질 용액을 제거한 후 포스페이트 완충용액으로 2회 세척하고 상온에서 완전히 건조시켰다Then, the hydrolyzed protein solution was removed, washed twice with phosphate buffer, and dried completely at room temperature.
세포 부착성 시험은 가수분해물의 코팅 농도별로 세포 접종 후 2일간 배양하여 증식한 세포 수를 직접 측정하였다. The cell adhesion test directly measured the number of cells proliferated by incubating for 2 days after cell inoculation for each coating concentration of the hydrolyzate.
그 결과, 도 7에 나타나 있듯이, 가수분해물 0.5 mg/㎖의 코팅 농도에서 대조군 (sericin 0 ㎍/㎖)에 비해 약 4배의 세포 증식 증대효과를 확인하였다.
As a result, as shown in Figure 7, the hydrolyzate of 0.5 mg / ㎖ at a coating concentration of about 4 times compared to the control (sericin 0 ㎍ / ㎖) confirmed a cell proliferation effect.
<실험예 8> 가수분해물의 ROS 억제 효과Experimental Example 8 ROS Inhibition Effect of Hydrolyzate
일반 누에 숙잠의 미세분말을 이용해서 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 활성산소 억제 효과를 측정하였다. The active oxygen inhibitory effect was measured on the silk gland hydrolyzate prepared using fine silkworm silkworms.
배양 중인 섬유아 세포에 H2O2 1 mM과 실샘 가수분해물 1 mg/ml을 30분간 처리하였다. Fibroblasts in culture were treated with 1 mM of H 2 O 2 and 1 mg / ml of the gland hydrolyzate for 30 minutes.
세포를 트립신/EDTA(trypsin 0.25%/EDTA 1 mM)을 사용해 배양접시에서 떼어낸 뒤 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)로 현탁시킨후 270 x g에서 3분 동안 원심분리 하였다. Cells were removed from the culture dish using trypsin / EDTA (trypsin 0.25% /
세포 현탁액에 5M의 CM-H2DCFDA 염료(Invitrogen)를 가하고 차광하여, 37℃, 5% CO2조건의 배양기에서 30분 동안 반응시켰으며 발생되는 형광을 유세포 분석기(Becton Dickinson)의 FL-1 채널을 통해 측정하였다.5M of CM-H 2 DCFDA dye (Invitrogen) was added to the cell suspension, and the cells were reacted for 30 minutes in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2. The resulting fluorescence was measured by FL-1 of a flow cytometer (Becton Dickinson). Measured through the channel.
그 결과, 도 8에 나타났듯이 고치 유래 가수분해물 보다 실샘 유래 가수분해물의 활성산소 억제 효과가 약 2배 정도 더 높게 나타났다.
As a result, as shown in FIG. 8, the active oxygen inhibitory effect of the silam-derived hydrolyzate was about 2 times higher than that of the cocoon-derived hydrolyzate.
이와 같이 상기 수득된 가수분해물은 세포독성이 없어 무혈청 배지에 첨가하여 사용이 가능하며, 10% FBS가 첨가된 배양액에서 배양한 세포증식 효과보다 더 우수하여 혈청대체제로 상품화도 가능하며, 항산화능, ROS억제능, 세포사멸억제능이 높아 배양첨가물, 코팅제, 화장품 첨가제의 원료소재로 사용가능하다.
Thus, the obtained hydrolyzate is not cytotoxic and can be used in serum-free medium. The hydrolyzate is superior to the cell proliferation effect cultured in a culture medium containing 10% FBS. It can be used as a raw material for culture additives, coatings, and cosmetic additives due to its high ability to inhibit ROS and apoptosis.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to preferred embodiments and experimental examples, and those skilled in the art to which the present invention pertains, within the essential technical scope of the present invention and other forms of implementation of the present invention You can implement examples. The scope of the present invention is defined by the appended claims, and all differences within the scope of the claims are to be construed as being included in the present invention.
Claims (8)
상기 준비된 누에를 동결건조하여 실샘을 분리하고, 분리된 실샘을 물로 용해하여 제1 용해물을 제조하는 제2단계;
상기 제1 용해물을 원심분리한 후 상등액을 취하는 제3단계;
상기 상등액에 알칼리를 첨가한 후 가수분해하여 제2 용해물을 제조하는 제4단계;
상기 제2 용해물에 산을 넣고 중화하여 중화액을 제조하는 제5단계;
상기 중화액을 탈염하여 가수분해물을 수득하는 제6단계 및,
상기 수득된 가수분해물을 동결건조하는 제7단계;를 포함하는,
누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법.
A first step of preparing silkworms;
A second step of preparing a first lysate by lyophilizing the prepared silkworm to separate the silk glands and dissolving the separated silk glands with water;
A third step of taking the supernatant after centrifuging the first lysate;
Adding a alkali to the supernatant and then hydrolyzing to prepare a second melt;
A fifth step of preparing an neutralizing liquid by adding acid to the second melt and neutralizing the acid;
A sixth step of desalting the neutralizing solution to obtain a hydrolyzate, and
A seventh step of lyophilizing the obtained hydrolyzate; comprising,
Method for obtaining silkworm-derived hydrolyzate.
상기 제2단계의 제1 용해물 제조시, 분리된 실샘을 초미세분말로 제조한 후 물로 용해하는,
누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법.
The method of claim 1,
In preparing the first lysate of the second step, the separated gland is made of ultra fine powder and then dissolved in water.
Method for obtaining silkworm-derived hydrolyzate.
상기 제2 용해물 제조시, 알칼리로 수산화나트륨(NaOH)을 사용하는,
누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법.
The method of claim 1,
In preparing the second melt, using sodium hydroxide (NaOH) as the alkali,
Method for obtaining silkworm-derived hydrolyzate.
상기 제2 용해물 제조시, 상등액을 15~30℃에서 가수분해하는,
누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법.
The method of claim 1,
In the preparation of the second melt, the supernatant is hydrolyzed at 15 ~ 30 ℃,
Method for obtaining silkworm-derived hydrolyzate.
상기 중화액 제조시, 산으로 인산을 사용하는,
누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법.
The method of claim 1,
In the preparation of the neutralizing solution, using phosphoric acid as an acid,
Method for obtaining silkworm-derived hydrolyzate.
누에 실샘 유래 가수분해물.
Obtained by the method of obtaining any one of claims 1 to 5,
Silkworm-derived hydrolyzate.
상기 가수분해물의 전체 아미노산을 기준으로 25~35%의 글리신과 10~25%의 알라닌을 함유하는,
누에 실샘 유래 가수분해물.
The method according to claim 6,
It contains 25 to 35% glycine and 10 to 25% alanine based on the total amino acid of the hydrolyzate,
Silkworm-derived hydrolyzate.
상기 가수분해물은 수용성인,
누에 실샘 유래 가수분해물.
The method according to claim 6,
The hydrolyzate is water soluble,
Silkworm-derived hydrolyzate.
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2012
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| WO2023249363A1 (en) * | 2022-06-21 | 2023-12-28 | 계명대학교 산학협력단 | Fetal bovine serum (fbs) substitute composition |
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