KR20130022500A - 표적 세포를 분별하는 장치 및 방법 - Google Patents

표적 세포를 분별하는 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

세포 표면의 탄성 변화를 측정하여 다수의 세포 집단 중에서 단일 세포를 분별하는 장치 및 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 표적 세포 분별 장치 및 이를 이용한 표적 세포 분별 방법에 의하면 생물학적 시료 중에서 표적 세포를 효율적으로 분별할 수 있다.

Description

표적 세포를 분별하는 장치 및 방법{The device and method for differentiating target cell}
세포 표면의 탄성 변화를 측정하여 다수의 세포 집단 중에서 단일 세포를 분별하는 장치 및 방법에 관한 것이다.
일반적으로 세포를 분별하기 위해서는 눈에 보이는 염료를 결합시켜 염료의 색을 통하여 세포의 구조를 알아보는 세포 염색법을 많이 사용한다. 그 중에서도 생체 유래 시료는, 다양한 크기를 갖고 다른 성상을 나타내는 다량의 성분이 함유되어 있는 경우가 많아, 전처리를 적절하게 실시하여야만 세포 분별의 정밀도 및 효율을 향상시킬 수 있게 된다. 특히, 지방을 포함하는 세포의 경우, 지방 염색에서 염료가 용매에 녹을 수 있는 한계보다 지방질과 접촉되면 더 많이 분산되어 용해되는 성질을 이용한 염색법을 사용하게 되는데, 이는 시료를 준비하는 과정에서 화재 위험이 있고, 인체에 유해한 염료가 노출될 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 기존의 염색법은 염료의 용출로 인해 검정색 입자가 세포 주변에 나타나는 현상이 빈번한데, 이는 분화되는 세포를 관찰할 때, 분화 정도를 판별하는데 노이즈로 작용할 수 있다.
따라서, 기존의 염색 방법의 문제점을 해결할 수 있는 새로운 세포 분별 방법의 개발이 요구된다.
일 구체예는 표적 세포 분별 장치 및 이를 이용한 표적 세포 분별 방법에 관한 것이다.
일 양상은 일 축선 상에 고정말단과 자유말단을 갖는 탄성 변형가능한 캔틸레버(cantilever); 상기 캔틸레버의 자유말단에 배치되어 세포의 표면과 접하는 팁(tip); 상기 캔틸레버의 고정말단과 연결되어 있으며, 상기 캔틸레버의 탄성변형에 따른 반발력(repulsive force)의 정도를 측정하는 측정부; 및 상기 측정부로부터 측정된 반발력을 세포의 표면으로부터 유래하는 탄성값으로 변환하는 변환부를 포함하는 표적 세포 분별 장치를 제공한다.
일 구체예에 따르면, 상기 장치는 상기 캔틸레버를 상하 좌우로 이동시킬 수 있는 이동부를 더 포함할 수 있다. 상기 이동부는 캔틸레버의 고정말단과 연결되어 있으며, 캔틸레버를 자동 또는 수동으로 이동시켜 표적 세포에 팁이 접촉 및 분리되도록 하는 기능을 한다.
일 구체예에 따르면, 상기 장치는 상기 팁의 하부에 배치되는 것으로, 생물학적 시료를 제공하는 시료 제공부를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 장치는 상기 변환부로부터 변환된 세포의 표면으로부터 유래하는 탄성값을 사용자에게 출력하는 출력부를 더 포함할 수 있다.
상기 캔틸레버는 자유말단 및 고정말단을 포함하며, 상기 자유 말단에는 생물학적 시료, 특히, 표적 세포와 접촉할 수 있는 팁이 연결되어 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 캔틸레버는 예를 들어, 0.001 내지 1 N/m, 또는 0.001 내지 0.5 N/m 또는 0.001 내지 0.3 N/m의 스프링 상수를 갖는 것일 수 있다. 상기 스프링 상수를 갖는 동일한 캔틸레버를 이용하여 생물학적 시료 중의 여러 세포들의 힘-거리(force distance)를 측정함으로써, 세포 표면의 탄성 정도를 확인할 수 있다. 이때, 세포가 받는 힘을 줄이기 위해 캔틸레버의 스프링 상수(k)는 1 N/m 이하인 것이 바람직하다. 따라서, 캔틸레버의 스프링 상수를 매우 작은 값을 선택한다면, 팁이 시료 표면을 지나갈 때 팁이 받는 힘의 대부분이 캔틸레버가 휘어짐으로 나타나게 되므로, 세포의 변형을 상대적으로 줄일 수 있다. 일반적으로, 당업계에 알려진 원자힘 현미경(atomic force microscopy, AFM)에서 원자 단위의 미세한 구조를 형상화 할 때는 스프링 상수가 0.01 내지 0.05 N/m인 마이크로 캔틸레버를 사용하는 것으로 알려져 있다. 상기 캔틸레버를 구성하는 물질은 탄성을 발생시킬 수 있는 물질이라면 어떠한 것이라도 가능하며, 예를 들어, 실리콘 또는 탄소나노튜브 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 상기 물질에 Al 또는 Pt/Ir이 추가적으로 코팅된 물질이 사용될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 팁은 표적 세포의 크기에 따라 다양하게 제작될 수 있으며, 예를 들어, 1 nm 내지 100 nm, 또는 1 nm 내지 50 nm, 또는 1 nm 내지 10 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 상기 캔틸레버의 팁은 생물학적 시료 중의 세포 표면에 접촉하였을 때의 접촉면의 직경이 10 nm 정도가 되는 팁인 것이 가장 바람직하며, 이는 세포 표면을 형상화 할 때 이미지 해상도와 직접적으로 연관성이 있다. 즉, 상기 접촉면의 직경이 작을수록 이미지의 해상도가 좋아진다. 상기 팁의 모양은 측면에서 보았을 때, 삼각형 또는 콘(corn) 모양일 수 있으며, 상기 직경은 생물학적 시료와 접촉하는 가장 말단 부분의 직경을 의미한다.
상기 장치에서 측정부는 상기 캔틸레버의 고정말단과 연결되어 있으며, 상기 캔틸레버의 탄성변형 정도에 따른 반발력(repulsive force)의 크기를 측정할 수 있다. 캔틸레버는 탄성변형이 가능하므로, 상기 캔틸레버의 반발력은 표적 세포와 팁이 접촉되었다가 분리될 때, 즉, 캔틸레버의 휘는 정도에 따라 결정될 수 있다.
상기 장치에서 변환부는 상기 측정부로부터 측정된 반발력을 세포의 표면으로부터 유래하는 탄성값으로 변환할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 탄성 정보는 탄성 계수를 의미하는 것으로, 상기 팁이 표적 세포와 가까이 접촉하면서 나타나는 즉, 팁과 표적 세포 표면 사이의 거리가 가까워지면서 나타나는 표적 세포 표면의 고유의 탄성 계수를 캔틸레버의 휘어지는 정도, 즉, 반발력으로 비교 평가할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 탄성 정보는 상기 출력부에 의해 사용자에게 출력될 수 있다.
다른 양상은 생물학적 시료 내에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 세포 표면의 반발력을 측정하는 단계; 및 상기 하나 이상의 세포로부터 측정된 반발력으로부터 표적 세포를 분별하는 단계를 포함하는 표적 세포의 분별 방법을 제공한다.
상기 표적 세포의 분별 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
상기 방법은, 생물학적 시료 내에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 세포 표면으로부터 반발력을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 분별하는 단계는 2 이상의 세포로부터 측정된 반발력을 서로 비교하여 표적 세포를 분별하는 것일 수 있다. 즉, 생물학적 시료 중에 포함된 2 이상의 세포의 반발력을 각각 측정하여, 이를 비교함으로써 표적 세포를 분별할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 분별하는 단계는 하나의 세포로부터 측정된 반발력과 기존 측정된 세포들의 반발력을 서로 비교하여 세포를 분별할 수 있다. 이는 여러 종류의 서로 다른 세포들의 반발력을 미리 측정하여 데이터베이스화 하고, 상기 방법에 의해 생물학적 시료 중의 하나의 세포로부터 반발력을 측정하여 상기 측정된 반발력과 상기 데이터베이스에 저장된 기존 세포들의 반발력을 비교하여 생물학적 시료 중에 존재하는 하나의 표적 세포를 분별하는 것이다.
일 구체예에 따르면, 상기 반발력의 측정은 하나 이상의 세포를 상기 장치의 팁과 접촉시키는 단계; 및 상기 접촉된 팁을 세포로부터 분리시켜 발생되는 캔틸레버의 반발력을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 장치의 팁은 상기 장치 내에 포함된 이동부를 통해 자동 또는 수동으로 상기 표적 세포에 접촉시킬 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 상기 표적 세포가 존재할 수 있는 어떠한 생물학적 시료라도 가능하며, 예를 들어, 생검시료, 조직시료, 분리된 세포를 액체 매질에 현탁시킨 세포 현탁물, 세포 배양물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 동물의 체액일 수 있으며, 상기 체액은 혈액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 뇨, 점막액, 양수 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 분화 중인 지방세포 집단일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 2 이상의 세포는 서로 다른 크기를 갖는 세포일 수 있으며, 상기 표적 세포는 골아세포(osteoblast), 연골세포(chondrocyte), 지방세포(adipocyte), 혈중종양세포(circulating tumor cell), 암줄기세포(cancer stem cell), 면역세포(immunocyte), 태아줄기세포(fetal stem cell), 태아세포(fetal cell), 암세포(cancer cell), 종양세포(tumor cell), 근아세포(myoblast), 섬유아세포(fibroblast), 위성세포(satellite cell) 및 역분화줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 한편, 일 구체예에 따르면, 상기 표적 세포는 단일 세포(single cell)일 수 있다.
이후, 상기 방법은 상기 2 이상의 세포로부터 측정된 반발력을 비교하여 표적 세포를 분별하는 단계를 포함할 수 있다.
이동부에 의해 접촉된 팁은 상기 동일한 이동부에 의해 생물학적 시료로부터 분리시킬 수 있으며, 이때, 일정한 스프링 상수를 갖는 캔틸레버는 반발력이 발생하게 된다. 상기 발생된 반발력은 상기 장치의 측정부에 의해 측정될 수 있다.
상기 탄성값에 대한 설명은 상기 장치에서 설명한 바와 동일하다. 한편, 상기 탄성값은 상기 생물학적 시료 중에 존재하는 세포로부터 유래하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 탄성값은 시료 중에 존재하는 세포의 종류 및 물리적 특성(예를 들어, 세포의 크기)에 따라 차이가 있으므로, 상기 탄성값에 의해 생물학적 시료 내에 존재하는 표적 세포를 분별할 수 있다.
일 구체예에 따른 표적 세포 분별 장치 및 이를 이용한 표적 세포 분별 방법에 의하면 생물학적 시료 중에서 표적 세포를 효율적으로 분별할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 표적 세포 분별 장치의 모식도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 표적 세포 분별 장치를 이용하여 표적 세포를 분별하는 방법을 나타낸다.
도 3은 일 구체예에 따른 표적 세포 분별 장치에 의해 평가되는 세포의 탄성 정보를 그래프로 나타낸 일 구체예이다.
도 4는 분화 전의 지방 세포와 10일 동안 분화시킨 지방 세포를 현미경을 통해 관찰한 결과 및 이를 일 구체예에 따른 표적 세포 분리 장치를 이용하여 분별한 결과를 나타낸다.
도 5는 일 구체예에 따른 세포 분별 장치를 이용하여 지방 세포의 분화 정도에 따른 시료 내의 분화된 지방 세포의 분포를 확인한 것이다.
도 6a 및 도 6b는 분화 전의 지방 세포와 10일 동안 분화시킨 지방 세포를 일 구체예에 따른 표적 세포 분리 장치 및 유세포 분석 장치로 분별한 결과를 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 일 구체예에 따른 표적 세포 분별 장치의 모식도를 나타낸 것으로, 캔틸레버(cantilever)(100), 상기 캔틸레버(100)의 자유 말단에 연결된 팁(110), 상기 캔틸레버(100)의 고정 말단과 연결되어 있으며, 상기 캔틸레버(100)의 반발력(repulsive force)을 측정하는 측정부(120) 및 상기 측정부(120)로부터 측정된 반발력을 세포의 표면으로부터 유래하는 탄성 정보로 변환하는 변환부(130)가 도시되어 있다. 또한, 상기 장치는 변환부(130)로부터 생성되는 정보를 사용자에게 출력하기 위한 출력부(140)를 더 포함할 수 있으며, 캔틸레버(100)를 상하 좌우로 이동시킬 수 있는, 자동 또는 수동으로 조작이 가능한 이동부(150)를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 팁(110)이 아랫 부분에는 대상이 되는 생물학적 시료를 제공할 수 있는 시료 제공부(160)가 배치될 수 있다.
도 2는 일 구체예에 따른 표적 세포 분별 장치를 이용하여 표적 세포를 분별하는 방법을 나타낸 것이다. 상기 세포 분별 장치에 고정되어 있는 캔틸레버(100)를 이동부(150)로 적절하게 이동시켜 상기 캔틸레버(100)의 자유 말단에 연결된 팁(110)이 표적 세포에 접촉하도록 한다. 상기 캔틸레버(100)는 일정한 스프링 상수를 가지고 있으므로, 상기 팁(110)이 표적 세포에 접촉되었다가 떨어질 때, 상기 팁(110)이 연결된 캔틸레버(100)에 반발력이 발생하게 되고, 캔틸레버(100)의 고정 말단에 연결된 측정부(120)에서 상기 반발력을 측정하게 된다. 즉, 도 3의 그래프에서 보는 바와 같이, 표적 세포와 팁(110) 사이의 거리에 대한 캔틸레버(100)의 휘는 정도(deflection)를 측정하고, 이러한 반발력을 변환부(130)에서 세포의 표면으로부터 유래하는 탄성 정보로 변환하여 각각의 세포에 대한 물리적 특성을 평가함으로써, 표적 세포를 분별할 수 있게 된다.
실시예 1: 표적 세포 분별 장치를 이용한 인간 지방 세포의 분별 실험
지방 세포로 분화된 세포는 액포(lipid droplet)를 세포 내에 다량 포함하고 있으며, 세포의 크기도 분화되기 전 세포 대비 최대 200배 이상 크기 때문에 세포의 물리적 특성의 차이가 발생하므로, 일 구체예에 따른 표적 세포 분별 장치를 이용하여 상기 두 종류의 세포를 분별하는 실험을 수행하였다.
도 4는 분화 전의 지방 세포(왼쪽 패널)와 10일 동안 분화시킨 지방 세포(오른쪽 패널)를 현미경(1000배 확대 현미경으로 관찰한 CCD 사진)을 통해 관찰한 결과 및 이를 일 구체예에 따른 표적 세포 분리 장치를 이용하여 분별한 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 그래프에서 x축은 생물학적 시료가 제공되는 슬라이드의 표면과 캔틸레버 사이의 높이를 나타내고, y축은 캔틸레버의 상태, 즉 캔틸레버의 휘는 정도를 나타낸 것이다. 도 4의 사진 및 그래프에서 보는 바와 같이, 분화 전의 지방 세포와 10일 동안 분화시킨 지방 세포는 일 구체예에 따른 장치의 캔틸레버에 연결된 팁이 세포와 접촉하고, 분리되면서 발생하는 반발력에 차이가 발생하기 때문에, 상기 그래프의 기울기가 다르며, 이러한 기울기를 측정함으로써 상기 세포의 물리적 특성(세포의 크기)을 파악할 수 있다. 상기 기울기는 물리적으로 탄성 계수 ("Modulus of Elasticity" 또는 "Young's Modulus")와 동일한 의미가 된다. 이러한 측정 결과를 데이터베이스화하여, 통계 처리하면, 특정 세포에 대한 기울기 정보를 정량화할 수 있으며, 이러한 정보를 상기 장치 내에 저장하여, 상기 장치로부터 측정되는 표적 세포의 종류를 분별할 수 있게 된다.
실시예 2: 표적 세포 분별 장치를 이용한 인간의 지방 세포 분별과 유세포 분석 장치( FACS )를 이용한 세포 분별의 비교 실험
도 5는 일 구체예에 따른 세포 분별 장치를 이용하여 지방 세포의 분화 정도에 따른 시료 내의 분화된 지방 세포의 분포를 확인한 것이다. 분화 전의 지방 세포 및 10일 동안 분화시킨 지방 세포를 포함하는 시료를 준비하고, 일 구체예에 따른 표적 세포 분별 장치에 각각 100회씩 접촉과 분리를 반복하여, 상기 각각의 시료 중에 존재하는 지방 세포들을 분별하였다. 그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 10일 동안 분화시킨 지방 세포는 탄성 계수 값이 -1~-8까지 다양하게 검출되었으며, 이에 비해 분화 전의 지방 세포는 주로 -5~-8의 탄성 계수를 갖는 것으로 나타났다. 상기 동일한 시료를 유세포 분석 장치를 통해 세포의 크기 분포를 확인하였다. 도 6a에서 보는 바와 같이, 분화 전의 지방 세포와 비교하여 10일 동안 분화된 지방 세포는 그 크기가 다양하게 검출되었음을 확인할 수 있었으며, 도 6b의 현미경 사진에서 보는 바와 같이, 실제로 10일 동안 분화된 지방 세포 중에는 액포를 포함하는 세포가 다수 존재함을 확인할 수 있었다.
상기 결과로 볼 때, 일 구체예에 따른 표적 세포 분별 장치를 이용한 지방 세포의 분별 결과는 유세포 분석 장치의 결과와 동일함을 확인할 수 있었다.
100: 캔틸레버
110: 팁
120: 측정부
130: 변환부
140: 출력부
150: 이동부
160: 시료 제공부

Claims (13)

  1. 일 축선 상에 고정말단과 자유말단을 갖는 탄성 변형가능한 캔틸레버(cantilever);
    상기 캔틸레버의 자유말단에 배치되어 세포의 표면과 접하는 팁(tip);
    상기 캔틸레버의 고정말단과 연결되어 있으며, 상기 캔틸레버의 탄성변형에 따른 반발력(repulsive force)의 정도를 측정하는 측정부; 및
    상기 측정부로부터 측정된 반발력을 세포의 표면으로부터 유래하는 탄성값으로 변환하는 변환부를 포함하는 표적 세포 분별 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 장치는 상기 캔틸레버를 상하 좌우로 이동시킬 수 있는 이동부를 더 포함하는 것인 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 캔틸레버는 0.001 내지 1 N/m의 스프링 상수를 갖는 것인 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 장치는 상기 변환부로부터 변환된 세포의 표면으로부터 유래하는 탄성값을 사용자에게 출력하는 출력부를 더 포함하는 것인 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 팁은 1 nm 내지 100 nm의 직경을 갖는 것인 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 장치는 상기 팁의 하부에 배치되는 것으로, 생물학적 시료를 제공하는 시료 제공부를 더 포함하는 것인 장치.
  7. 생물학적 시료 내에 존재하는 하나 이상의 세포로부터 세포 표면의 반발력을 측정하는 단계; 및
    상기 하나 이상의 세포로부터 측정된 반발력으로부터 표적 세포를 분별하는 단계를 포함하는 표적 세포의 분별 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 분별하는 단계는 2 이상의 세포로부터 측정된 반발력을 서로 비교하여 표적 세포를 분별하는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 분별하는 단계는 하나의 세포로부터 측정된 반발력과 기존 측정된 세포들의 반발력을 서로 비교하여 세포를 분별하는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 하나 이상의 세포를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 장치의 팁과 접촉시키는 단계; 및 상기 접촉된 팁을 세포로부터 분리시켜 발생되는 캔틸레버의 반발력을 측정하는 단계를 포함하는 것인 표적 세포의 분별 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 표적 세포는 골아세포(osteoblast), 연골세포(chondrocyte), 지방세포(adipocyte), 혈중종양세포(circulating tumor cell), 암줄기세포(cancer stem cell), 면역세포(immunocyte), 태아줄기세포(fetal stem cell), 태아세포(fetal cell), 암세포(cancer cell), 종양세포(tumor cell), 근아세포(myoblast), 섬유아세포(fibroblast), 위성세포(satellite cell) 및 역분화줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 표적 세포는 단일 세포(single cell)인 것인 방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 분화 중인 지방세포 집단인 것인 방법.
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