KR20130018382A - High efficiency conversion of carbon dioxide to bicarbonate using immobilized carbonic anhydrase and method for improving the production of physiologically active materials with photosynthetic microorganisms by using the same - Google Patents

High efficiency conversion of carbon dioxide to bicarbonate using immobilized carbonic anhydrase and method for improving the production of physiologically active materials with photosynthetic microorganisms by using the same Download PDF

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김양훈
박재민
민지호
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

PURPOSE: A method for fixing carbonic anhydrase to polystyrene/poly(styrene-co-maleic anhydride)(PS/PSMA) nanofibers is provided to efficiently prepare a carbonic anhydrase-PS/PSMA nanofiber complex and to ensure excellent pH stability, temperature stability, and storage stability. CONSTITUTION: A method for fixing carbonic anhydrase to polystyrene/poly(styrene-co-maleic anhydride)(PS/PSMA) nanofibers comprises: a step of adding polystyrene and poly(styrene-co-maleic anhydride) into a solvent and preparing a polymer solution; a step of preparing the PS/PSMA nanofibers through electrospinning of the polymer solution; and a step of fixing the carbonic anhydrase to the PS/PSMA nanofibers through a crosslinked-enzyme aggregation(CLEA) method. The solvent includes dimethyl sulfoxide(DMSO), dichloromethane, tetrahydrofurane(THF), chloroform, hexane, toluene, or dimethyl acetamide. The carbonic anhydrase is beta-carbonic anhydrase derived from Rhodobacter sphaeroides.

Description

고정화 탄산무수화 효소를 이용한 고효율 이산화탄소 전환 및 이를 활용한 광합성 미생물의 생리활성물질 생산성 향상 방법 {High Efficiency Conversion of Carbon Dioxide to Bicarbonate Using Immobilized Carbonic Anhydrase and Method for Improving the Production of Physiologically Active Materials with Photosynthetic Microorganisms by Using the Same} High efficiency conversion of carbon dioxide to bicarbonate using immobilized carbonic anhydrase and method for improving the production of physiologically active materials with photosynthetic microorganisms by immobilized carbonic anhydrase Using the Same}

본 발명은 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 산무수화 효소를 고정화시키는 방법, 이 방법에 의해 제조된 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체, 이 복합체를 사용하여 광합성 세균을 배양하는 방법, 광합성 세균 유래 생리활성물질의 생산량을 증가시키는 방법, 및 이산화탄소를 제거 또는 전환하는 방법에 관한 것이다.
The present invention provides a method for immobilizing an acid anhydride enzyme on a polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofiber, a carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber composite prepared by the method, and A method of culturing photosynthetic bacteria using a complex, a method of increasing the production of photosynthetic bacteria-derived bioactive substances, and a method of removing or converting carbon dioxide.

지속적인 경제 발전을 위한 산업화 시대의 화석연료 사용 확대에 따라 대기 중의 온실가스 농도가 빠르게 증가하고 있으며, 온실효과에 따른 기후 변화가 빠르게 진행되고 있다. 이에 따라 지구온난화 방지를 위하여 화석연료의 연소에 의해 발생하는 이산화탄소 저감을 위한 연구개발이 시급한 실정이다. 현재까지 이산화탄소의 포집 및 흡수를 위해 주로 사용하는 기술로는 화학적 흡수법이 있다. 화학적 흡수제로 주로 모노에탄올아민(monoehtnaol amine, MEA), 디이글리콜아민(diglycolamine, DGA)를 포함한 1차 아민, 디이에탄올아민(diethanolamine, DEA), 디이소프로필아민(diisopropylamine, DIPA)를 포함하는 2차 아민, 트리에탄올아민(triethanolamine, TEA), 메틸 디이에탄올아민 (methyl diethanolamine, MDEA)을 포함하는 3차 아민등의 알카놀 아민(alkanoamine)이 사용되었다. As the use of fossil fuels in the age of industrialization for the continuous economic development is increasing, the concentration of greenhouse gases in the atmosphere is increasing rapidly, and the climate change due to the greenhouse effect is rapidly progressing. Accordingly, in order to prevent global warming, research and development for reducing carbon dioxide generated by the burning of fossil fuels is urgent. To date, the main technique used for the capture and absorption of carbon dioxide is chemical absorption. Primary chemical amines, including monoethanolamine (MEA), diglycolamine (diglycolamine (DGA)), diethanolamine (DEA), diisopropylamine (DIPA) Alkanoamines such as tertiary amines including tertiary amine, triethanolamine (TEA) and methyl diethanolamine (MDEA) were used.

그러나, 상기 알카놀 아민 흡수제의 경우 이산화탄소 흡수 후 재생되는 과정에서 열, 산소 등에 의한 열화물(heat stable salt) 형성 및 증발문제로 인한 손실 문제로 인하여 일정 비율의 흡수제를 재공급해야 하므로 이에 따른 비용 문제가 발생한다. 또한 재생 반응 시 흡수제와 흡수된 이산화탄소와의 화학적 결합을 끊기 위해 높은 재생열을 필요로 하며, 이산화탄소 흡수량 증대를 위한 높은 농도의 알카놀 아민 처리시 장치 부식 문제로 인해 첨가되는 알카놀 아민의 농도를 낮추거나 부식방지제를 첨가해야 하는 단점을 지닌다. 이에 따라 종래 알카놀 아민 사용으로 대표되는 이산화탄소 흡수법의 단점을 보완하고 보다 환경 친화적이며 재생 가능성이 높은 이산화탄소 흡수 및 전환 기술 개발이 필요하며, 전환된 이산화탄소를 활용한 유용 물질 생산을 통한 이산화탄소의 바이오매스로 전환 기술 개발이 절실히 요구된다. However, in the case of the alkanol amine absorbent, the cost of the alkanol amine absorbent needs to be resupply due to a loss ratio due to heat stable salt formation and evaporation due to heat, oxygen, etc. A problem arises. In addition, high regeneration heat is required to break the chemical bond between absorber and absorbed carbon dioxide during the regeneration reaction, and the concentration of alkanol amine added due to device corrosion problems in the treatment of high concentration of alkanol amine to increase carbon dioxide absorption is also required. It has the disadvantage of having to lower or add a preservative. Accordingly, it is necessary to supplement the shortcomings of the carbon dioxide absorption method represented by the conventional alkanol amine, and to develop more environmentally friendly and renewable carbon dioxide absorption and conversion technology, and to produce carbon dioxide bio by producing useful materials using the converted carbon dioxide. There is an urgent need to develop conversion technology to mass.

상기한 바와 같이 종래의 이산화탄소 흡수 방법의 문제점을 개선하고 환경친화적이며 반복사용이 가능하고 단순한 이산화탄소의 흡수 뿐만 아니라 이산화탄소의 흡수 및 전환을 통한 유용 물질 생산을 목적으로 효소(enzyme)를 활용할 수 있다. 효소는 생체 내에서 화학 반응을 가속화시키는 단백질인 생물학적 촉매(biocatalyst)로서 산업 분야는 물론이고, 최근에는 화장품, 제약, 바이오센서 등 다양한 분야에서 널리 응용되고 있다. 이산화탄소 흡수 및 전환을 위해 이용될 수 있는 효소로는 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)가 있다. 탄산무수화 효소는 지구상에서 가장 빠른 반응을 촉진하는 효소로 알려져 있으며, 이산화탄소 분자를 수화시킨다. 수화된 이산화탄소 분자는 중탄산염(bicarbonate) 형태로 존재하게 되며, 풍부한 양의 중탄산염은 광합성 미생물의 성장을 촉진시켜 광합성 미생물에 의해 생산 가능한 생리활성물질 등 다양한 유기 생산물로 전환 가능하다. 이처럼 이산화탄소 흡수 및 전환을 위해 사용되는 탄산무수화 효소는 장기간 보관하여도 촉매로서 안정적으로 화학적 변환 반응을 유지하는 한편, 회수 및 재사용이 가능하다면 경제적인 면에서나 환경적인 면에서 바람직할 것이다. 이는 효소의 담체 고정화를 통해 해결될 수 있다. 일반적으로 효소의 고정화는 효소가 생물화학공정의 반응혼합물로부터 용이하게 분리될 수 있도록 하기 위하여 특정 담체에 효소를 고정화시키는 것을 의미하여, 효소 고정화를 통해 효소 처리가 편리하며, 최종적으로 얻어진 산물로부터 효소를 분리하기 쉽고, 고가의 효소를 손쉽게 회수하여 재사용 할 수 있으므로 연속적인 공정에서 활용할 수 있다. 고정화 효소 제작을 위한 담체의 중요성이 부각되고 있는 가운데 효소 고정화를 위한 전기방사 기반의 나노섬유는 다른 고정화 담체와 비교하여 높은 부피 대 표면적 비율(surface area-to-volume ratio)을 지니며, 효소 반응액으로부터 회수가 쉽고, 담체 자체의 안정성으로 재사용이 유용한 장점을 지니고 있다.
As described above, it is possible to use an enzyme for the purpose of improving the problems of the conventional carbon dioxide absorption method, and for the purpose of producing useful substances through the absorption and conversion of carbon dioxide as well as the simple absorption of carbon dioxide, which is environmentally friendly and repeatable. Enzymes are biological catalysts (biocatalysts), proteins that accelerate chemical reactions in vivo, and are widely used in various fields such as cosmetics, pharmaceuticals, and biosensors, as well as the industrial field. Enzymes that can be used for carbon dioxide absorption and conversion include carbonic anhydrases. Carbonic anhydrase is known as the enzyme that promotes the fastest reaction on the planet and hydrates carbon dioxide molecules. Hydrated carbon dioxide molecules are present in the form of bicarbonate, and abundant amounts of bicarbonate can be converted into various organic products such as bioactive substances that can be produced by photosynthetic microorganisms by promoting growth of photosynthetic microorganisms. Carbonic anhydrase used for carbon dioxide absorption and conversion as described above, while maintaining a stable chemical conversion reaction as a catalyst even if stored for a long time, it would be preferable economically and environmentally if it can be recovered and reused. This can be solved through carrier immobilization of the enzyme. In general, the immobilization of the enzyme means that the enzyme is immobilized on a specific carrier so that the enzyme can be easily separated from the reaction mixture of the biochemical process. It is easy to separate, and expensive enzymes can be easily recovered and reused, so it can be used in a continuous process. With the importance of carriers for the preparation of immobilized enzymes, electrospinning-based nanofibers for enzyme immobilization have a high surface area-to-volume ratio compared to other immobilized carriers. It is easy to recover from the liquid, and the stability of the carrier itself has the advantage of being useful.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)를 이용하여 이산화탄소를 흡수 및 전환하고 이를 통해 유용물질을 생산하기 위한 고정화 효소시스템을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 탄산무수화 효소를 공유결합 기반 가교효소응집(cross-linked enzyme aggregation, CLEA) 방법을 사용하여 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 고정화시키는데 성공하였고, 이렇게 고정화된 탄산무수화 효소가 pH 안정성, 온도안정성, 저장안정성 및 재사용성이 매우 우수할 뿐만 아니라, 이산화탄소의 전환율이 고정화되지 않은 효소에 비해 훨씬 뛰어나다는 것을 확인하였으며, 광합성 미생물인 로도박터 스페로이드의 성장율 및 이 미생물의 생리활성물질 생산율을 크게 향상시킬 수 있다는 사실을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
The present inventors have tried to develop an immobilized enzyme system for absorbing and converting carbon dioxide using carbonic anhydrase and producing useful materials through the use of carbonic anhydrase. As a result, the carbonic anhydrase was successfully immobilized on polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofibers using a covalent-based cross-linked enzyme aggregation (CLEA) method. In addition, the immobilized carbonic anhydrase was not only excellent in pH stability, temperature stability, storage stability, and reusability, but also the conversion rate of carbon dioxide was much higher than that of an unimmobilized enzyme. The present invention was completed by experimentally confirming that the growth rate of spheroids and the production rate of the bioactive substance of the microorganism can be greatly improved.

따라서, 본 발명의 목적은 PS/PSMA 나노섬유에 탄산무수화 효소를 고정화시키는 방법을 제공하는 것에 있다. It is therefore an object of the present invention to provide a method for immobilizing carbonic anhydrase to PS / PSMA nanofibers.

본 발명의 다른 목적은 탄산무수화 효소가 PS/PSMA 나노섬유에 고정화된 효소-나노섬유 복합체를 제공하는 것에 있다. Another object of the present invention is to provide an enzyme-nanofiber complex in which carbonic anhydrase is immobilized on PS / PSMA nanofibers.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 사용하여 광합성 세균을 배양하는 방법을 제공하는 것에 있다. Still another object of the present invention is to provide a method of culturing photosynthetic bacteria using the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를를 사용하여 로도박터 스페로이드 유래 생리활성물질의 생산량을 증가시키는 방법을 제공하는 것에 있다. Another object of the present invention to provide a method for increasing the production of Rhodobacter spheroid-derived bioactive material using the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를를 사용하여 이산화탄소의 제거 또는 전환하는 방법을 제공하는 것에 있다.
Still another object of the present invention is to provide a method for removing or converting carbon dioxide using the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
The objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물) 나노섬유에 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)를 고정화시키는 방법을 제공한다: According to one aspect of the invention, the invention provides a method of immobilizing carbonic anhydrase on polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) nanofibers comprising the following steps:

(a) 폴리스티렌 및 폴리(스티렌-co-말레산무수물)을 용매에 첨가하여 폴리머 용액을 준비하는 단계; (a) adding polystyrene and poly (styrene-co-maleic anhydride) to a solvent to prepare a polymer solution;

(b) 상기 준비된 폴리머 용액을 전기방사 방법을 통해 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유를 제조하는 단계; 및 (b) preparing polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofibers by electrospinning the prepared polymer solution; And

(c) 상기 제조된 PS/PSMA 나노섬유에 공유결합 기반 가교효소응집(Cross-Linked Enzyme Aggregation, CLEA) 방법을 통해 탄산무수화효소를 고정화시키는 단계. (c) immobilizing the carbonic anhydrase to the PS / PSMA nanofibers prepared by a cross-linked enzyme aggregation (CLEA) method.

본 발명은 탄산무수화 효소를 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물) 나노섬유에 고정화하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for immobilizing carbonic anhydrase to polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) nanofibers.

본 발명에서 "탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)"란 이산화탄소와 물을 탄산수소이온과 수소이온으로 전환하는 것을 촉매하는 효소이다. 탄산무수화 효소에 의한 반응은 다음과 같다. In the present invention, "carbonic anhydrase" is an enzyme that catalyzes the conversion of carbon dioxide and water into hydrogen carbonate and hydrogen ions. The reaction by carbonic anhydrase is as follows.

CO2 + H2O ←----------→ H2CO3 → HCO3 - + H+ CO 2 + H 2 O ← ---------- → H 2 CO 3 → HCO 3 - + H +

이러한 반응은 주로 이산화탄소의 농도가 높은 조직에서 일어나며 속도는 효소에 의해 일어나는 반응 중 가장 빠른 것으로 알려져 있다. 이 반응의 역반응은 빠르지만 촉매를 필요로 하지 않고 이산화탄소 농도가 낮은 폐와 신장(kidney)의 네프론(nephron)이나 식물의 세포에서 일어난다. 이와 같은 탄산무수화 효소는 탄산탈수효소라고도 하며, 자연계에는 α, β, γ, δ, ε형 등 몇 가지 종류의 서로 다른 탄산무수화 효소가 존재하며, 동물에 존재하는 α형 탄산무수화효소, 식물에 존재하는 β형 탄산무수화효소, 규조류(diatoms)에는 아연 대신 카드뮴을 가진 δ형 탄산무수화효소가 존재한다. This reaction occurs mainly in tissues with high concentrations of carbon dioxide, and the rate is known to be the fastest among enzymes. The reverse reaction of this reaction is fast but does not require a catalyst and occurs in the lungs and kidneys of nephron or plant cells with low carbon dioxide levels. Such carbonic anhydrase is also called carbonic anhydrase, and there are several kinds of different carbonic anhydrases such as α, β, γ, δ, and ε in nature, and α-type carbonic anhydrase present in animals In plants, β-type carbonic anhydrase and diatoms present in plants have δ-type carbonic anhydrase with cadmium instead of zinc.

본 발명에서는 바람직하게는 미생물 유래의 β형 탄산무수화 효소이며, 보다 바람직하게는 광합성 미생물 유래의 β형 탄산무수화 효소이며, 가장 바람직하게는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 β형 탄산무수화 효소를 사용한다. In the present invention, it is preferably a β-type carbonic anhydrase derived from microorganisms, more preferably a β-type carbonic anhydrase derived from photosynthetic microorganisms, and most preferably a β-type carbonic acid derived from Rhodobacter sphaeroides . Anhydrous enzymes are used.

상기 탄산무수화 효소를 폴리머 나노섬유에 고정화한다. 상기 폴리머 나노섬유는 바람직하게는 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물) 나노섬유이며, 보다 바람직하게는 전기 방사방법에 의해 제조한 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물) 나노섬유이다. The carbonic anhydrase is immobilized on the polymer nanofibers. The polymer nanofibers are preferably polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) nanofibers, and more preferably polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) nanofibers produced by an electrospinning method. .

본 발명에서 용어 "전기방사"란 액체의 낙하 시 정전기력이 표면장력을 극복할 수 있다는 계산이 과학적 토대가 되어, 정전기적 인력(electrostatic force)에 의해 낮은 점도 상태의 폴리머를 사용하여 순간적으로 섬유형태로 방사하여 생산물을 얻는 방법을 의미한다. 상기 전기방사 방법에 의하면 나노미터 단위의 섬유를 용이하게 제조할 수 있으며, 제조된 나노섬유는 극세 크기의 직경으로 인해 큰 표면적을 갖기 때문에 효소 고정화에 매우 유용하다. 특히, 나노섬유의 표면에 목적하는 작용기를 지니게 되므로, 효소 등의 바이오 물질의 고정화를 위한 담체로서 매우 유용하게 활용된다. The term "electrospinning" in the present invention is the scientific basis that the calculation that the electrostatic force can overcome the surface tension in the drop of the liquid, the instantaneous fiber form using a polymer of low viscosity state by electrostatic force (electrostatic force) It means how to get the product by spinning. According to the electrospinning method, it is possible to easily prepare fibers in nanometers, and the prepared nanofibers are very useful for immobilization of enzymes because they have a large surface area due to their ultra-fine diameters. In particular, since it has a desired functional group on the surface of the nanofibers, it is very useful as a carrier for immobilization of biomaterials such as enzymes.

본 발명에서 전기방사 방법을 이용한 나노섬유의 제조는 다음의 방법을 통해 행한다. 먼저 폴리스티렌 및 폴리(스티렌-co-말레산 무수물)을 적합한 유기용매에 용해시켜 폴리머 용액을 제조한다. 상기 폴리머의 용해에 사용되는 유기용매로는 예를 들어, 디메틸설폭사이드(DMSO, dimethylsulfoxide), 다이클로로메탄, 테트라하이드로퓨란(THF, tetrahydrofuran), 클로로포름, 헥산, 톨루엔 및 디메틸아세트아미드을 들 수 있으며, 가장 바람직하게는 테트라하이드로퓨란이다. In the present invention, the production of nanofibers using the electrospinning method is performed by the following method. The polymer solution is prepared by first dissolving polystyrene and poly (styrene-co-maleic anhydride) in a suitable organic solvent. Examples of the organic solvent used for dissolving the polymer include dimethyl sulfoxide (DMSO, dimethylsulfoxide), dichloromethane, tetrahydrofuran (THF, tetrahydrofuran), chloroform, hexane, toluene and dimethylacetamide. Most preferably tetrahydrofuran.

주사기펌프, 스테인레스스틸 바늘이 장착된 플라스틱 주사기, 고전압 써플라이를 구비한 전기방사 장비에서, 상기 폴리머 용액을 플라스틱 주사기에 주입하고 이를 주사기 펌프에 장착한다. 폴리머 용액이 담긴 주사기 바늘 끝에 고전압 써플라이에 연결된 플러스 전극을 연결하고 나노섬유의 수집기로 사용되는 알루미늄 호일에는 마이너스 전극을 연결한다. 적합한 전압과 유량(flow rate) 및 바늘과 수집기 사이의 거리를 선택한 후 전압을 인가함으로써 전기방사를 행한다. In an electrospinning apparatus having a syringe pump, a plastic syringe equipped with a stainless steel needle, and a high voltage supply, the polymer solution is injected into a plastic syringe and mounted on the syringe pump. Connect the positive electrode connected to the high voltage supply at the tip of the syringe needle containing the polymer solution, and connect the negative electrode to the aluminum foil used as the collector of the nanofibers. Electrospinning is performed by selecting a suitable voltage and flow rate and the distance between the needle and the collector and then applying a voltage.

본 발명에서 전기방사를 통해 제작된 PS/PSMA 나노섬유는 표면에 말레산 무수물 그룹을 다수 보유함으로써 고정화되는 탄산무수화 효소의 아민기와 공유결합에 참여할 수 있다. PS / PSMA nanofibers produced by electrospinning in the present invention can participate in the covalent bonding of the amine group of the carbonic anhydrase which is immobilized by retaining a large number of maleic anhydride groups on the surface.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에서 PS/PSMA 나노섬유로 탄산무수화 효소 고정화를 위해서 공유결합 기반 가교 효소응집(Cross-Linked Enzyme Aggregation, CLEA) 방법을 사용한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the present invention uses a cross-linked enzyme aggregation (CLEA) method for carbonic anhydrase immobilization with PS / PSMA nanofibers.

상기 공유결합 기반 가교 효소응집(Cross-Linked Enzyme Aggregation, CLEA) 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a') 탄산무수화효소가 포함된 용액에 PS/PSMA 나노섬유를 혼합하여 교반하는 단계; 및 (b') 상기 단계 (a')를 행한 반응액에 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액을 첨가한 후 교반하는 단계. The cross-linked enzyme aggregation (CLEA) method includes the following steps: (a ') mixing and stirring PS / PSMA nanofibers in a solution containing carbonic anhydrase; And (b ') adding a glutaraldehyde solution to the reaction solution in which step (a') is carried out, followed by stirring.

상기 공유결합 기반 가교 효소응집(CLEA) 방법은 1차적으로 PS/PSMA 나노섬유의 말레산 무수물 그룹과 탄산무수화 효소의 아민기 사이의 공유결합을 유도하고 2차적으로 글루타르알데히드(glutaraldehyde, GA)를 가교제(cross-linker)로 사용하여 PS/PSMA 나노섬유에 고정화된 탄산무수화 효소의 아민기와 추가적으로 첨가되는 탄산무수화 효소간의 추가적인 공유결합을 이루게 한다. The covalent bond-based cross-linking enzyme aggregation (CLEA) method primarily induces covalent bonds between maleic anhydride groups of PS / PSMA nanofibers and amine groups of carbonic anhydrase and secondly glutaraldehyde (GA). ) Is used as a cross-linker to form additional covalent bonds between the amine groups of the carbonic anhydrase immobilized on the PS / PSMA nanofibers.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 탄산무수화 효소가 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 고정화된 것을 특징으로 하는 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a carbonic anhydrase-PS /, characterized in that the carbonic anhydrase is immobilized to polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofibers. It provides a PSMA nanofiber composite.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체는 상기 효소 고정화 방법에 의해 제조된 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex is prepared by the enzyme immobilization method.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 광합성 세균의 배양 방법을 제공한다: (a'') 탄산무수화 효소가 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 고정화된 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 준비하는 단계; 및 (b'') 상기 준비된 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 광합성세균이 접종된 배지에 첨가하여 배양하는 단계. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for culturing photosynthetic bacteria comprising the following steps: (a '') a carbonic anhydrase is polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) preparing carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complexes immobilized on the nanofibers; And (b '') adding the prepared carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex to a medium inoculated with photosynthetic bacteria and culturing.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 광합성 세균의 배양 방법에서 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체는 상기 본 발명의 효소 고정화 방법에 의해 제조된 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex in the method of culturing photosynthetic bacteria is prepared by the enzyme immobilization method of the present invention.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 광합성 세균은 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)이다. According to another preferred embodiment of the present invention, the photosynthetic bacteria are Rhodobacter sphaeroides .

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래 생리활성물질의 생산량을 증가시키는 방법을 제공한다: (a''') 탄산무수화 효소가 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 고정화된 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 준비하는 단계; 및 (b''') 상기 단계 (a''')의 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)가 접종된 배지에 첨가한 후 배양하는 단계. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for increasing the production of Rhodobacter sphaeroides- derived bioactive substance, comprising the following steps: (a ''' ) Preparing a carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex in which a carbonic anhydrase is immobilized to a polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofiber; And (b ''') adding the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex of step (a''') to a medium in which Rhodobacter sphaeroides is inoculated and then culturing.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 생리활성물질의 생산량을 증가시키는 방법에서, 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체는 상기 본 발명의 효소 고정화 방법에 의해 제조된 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, in the method of increasing the production amount of the bioactive substance, the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex is prepared by the enzyme immobilization method of the present invention.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 생리활성물질은 카로테노이드, 박테리오클로로필, 코엔자임 Q 10 또는 포르피린이다. According to another preferred embodiment of the present invention, the bioactive material is a carotenoid, bacteriochlorophyll, coenzyme Q 10 or porphyrin.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 이산화탄소의 제거 또는 전환 방법을 제공한다: (i) 탄산무수화 효소가 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 고정화된 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 준비하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 단계 (ⅰ)의 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 이산화탄소와 접촉시키는 단계. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for removing or converting carbon dioxide, comprising the following steps: (i) a carbonic anhydrase is polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) ( PS / PSMA) preparing carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complexes immobilized on nanofibers; And (ii) contacting the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex of step (iii) with carbon dioxide.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 이산화탄소의 제거 또는 전환 방법에서 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체는 상기 본 발명의 효소 고정화 방법에 의해 제조된 것이다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex in the method of removing or converting carbon dioxide is prepared by the enzyme immobilization method of the present invention.

본 발명은 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 산무수화 효소를 고정화시키는 방법, 이 방법에 의해 제조된 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체, 이 복합체를 사용하여 광합성 세균을 배양하는 방법, 광합성 세균 유래 생리활성물질의 생산량을 증가시키는 방법, 및 이산화탄소를 제거 또는 전환하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 효소 성능이 우수한 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 매우 효율적으로 제조할 수 있으며, 제조된 탄산무수화 효소-나노섬유 복합체는 pH 안정성, 온도안정성 및 저장 안정성이 매우 뛰어나고, 반복 재사용성 및 이산화탄소 전환율이 현저히 우수하여 광합성 세균의 배양 성장성을 촉진하여 이로부터 얻어지는 다양한 생리활성물질의 생산 수율을 크게 향상시킬 수 있다.
The present invention provides a method for immobilizing an acid anhydride enzyme on a polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofiber, a carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber composite prepared by the method, and A method of culturing photosynthetic bacteria using a complex, a method of increasing the production of photosynthetic bacteria-derived bioactive substances, and a method of removing or converting carbon dioxide. According to the method of the present invention, the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex having excellent enzyme performance can be produced very efficiently, and the prepared carbonic anhydrase-nanofiber complex has high pH stability, temperature stability and storage stability. It is very excellent, repetitive reusability and carbon dioxide conversion is remarkably excellent to promote the culture growth of photosynthetic bacteria can greatly improve the production yield of various bioactive substances obtained therefrom.

도 1은 전기방사 기법을 이용하여 제작된 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유 및 공유결합 기반 가교효소응집을 통해 탄산무수화 효소가 고정화된 PS/PSMA 나노섬유의 전계방사주사현미경으로 관찰한 사진이다. 패널 (a)는 전기방사 기반 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물) (PS/PSMA) 나노섬유의 전계방사주사현미경 분석 결과이고, 패널 (b)는 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유의 전계방사주사현미경 분석 결과이다.
도 2는 비고정화 및 PS/PSMA 나노섬유로의 고정화 탄산무수화 효소의 PNA(Para-Nitrophenyl Acetate)을 기질로 이용한 기질농도 및 효소농도에 따른 Lineweaver-Burk plots 효소반응 속도 분석 결과를 나타낸다. ●: PS/PSMA 나노섬유로의 고정화된 탄산무수화 효소의 Lineweaver-Burk plots 효소반응 속도 분석 결과. ??: 비고정화 탄산무수화 효소의 Lineweaver-Burk plots 효소반응 속도 분석 결과.
도 3은 비고정화 및 PS/PSMA 나노섬유로의 고정화 탄산무수화 효소의 저장 안정성 비교 결과를 나타낸다. □ : 비고정화 탄산무수화 효소의 4℃, 60일간 보관 시의 활성 변화 측정 결과. ■ : PS/PSMA 나노섬유로 고정화된 탄산무수화 효소의 4℃, 60일간 보관 시의 활성 변화 측정 결과. ?? : 비고정화 탄산무수화 효소의 30℃, 60일간 보관 시의 활성 변화 측정 결과. ● :　PS/PSMA 나노섬유로 고정화된 탄산무수화 효소의 30℃, 60일간 보관 시의 활성 변화 측정 결과.
도 4는 PS/PSMA 나노섬유로 고정화된 탄산무수화 효소의 재사용 가능성을 확인하기 위하여 PNA (Para-Nitrophenyl Acetate)를 효소반응 기질로 이용한 분광 광도법을 통해 최초 효소활성을 100％로 정의하고 총 60회의 재사용에 따른 상대적인 효소활성 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 고정화 탄산무수화 효소의 이산화탄소의 중탄산염으로의 전환율 측정하기 위한 간접적인 방법으로 탄산칼슘 친전법을 통한 고정화 효소 농도 별 침전되는 탄산칼슘 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다. ● : PS/PSMA 나노섬유로 고정화 탄산무수화 효소 농도에 따른 탄산칼슘 침전 양. ?? : 순수 PS/PSMA 나노섬유 첨가에 따른 탄산칼슘 침전양.
도 6은 광합성 미생물인 로도박터 스페로이드의 배양에 있어 고정화 탄산무수화 효소 첨가에 따른 로도박터 스페로이드의 성장 증가 확인 결과를 나타낸 것이다. □ : 순수 로도박터 스페로이드 배양 과정에서의 시간에 따른 세포건조중량 측정 결과. ▲ : 로도박터 스페로이드 배양 과정에서 순수 PS/PSMA 나노섬유만을 첨가 후, 시간에 따른 세포건조중량 측정 결과. ◆ : 로도박터 스페로이드 배양 과정에서 50 mg의 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가 후, 시간에 따른 세포건조중량 측정 결과. ● : 로도박터 스페로이드 배양 과정에서 100 mg의 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가 후, 시간에 따른 세포건조중량 측정 결과.
도 7은 로도박터 스페로이드의 성장 증가 유지를 위한 고정화 탄산무수화 효소의 재사용 가능성 평가 결과를 나타낸 것이다. Gray bar, 순수 PS/PSMA 나노섬유 첨가 후, 48 시간의 로도박터 스페로이드 배양 과정 30회 반복에 따른 세포건조중량 측정 결과. Black bar, 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유 첨가 후, 48 시간의 로도박터 스페로이드 배양 과정 30회 반복에 따른 세포건조중량 측정 결과.
도 8은 고정화 탄산무수화 효소 첨가에 따른 배양시간 별 로도박터 스페로이드 유래 생리활성 물질 생산량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
패널 (a): 고정화 탄산무수화 효소 첨가에 따른 배양시간 별 로도박터 스페로이드 유래 카로테노이드 생산량 측정 결과. Black bar, 순수 로도박터 스페로이드 배양을 통한 배양시간별 카로테노이드 생산량 측정 결과. Light gray bar, 순수 PS/PSMA 나노섬유 첨가에 따른 로도박터 스페로이드의 배양시간 별 카로테노이드 생산량 측정 결과. Gray bar, 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유 첨가에 따른 로도박터 스페로이드의 배양시간 별 카로테노이드 생산량 측정 결과.
패널 (b): 고정화 탄산무수화 효소 첨가에 따른 배양시간 별 로도박터 스페로이드 유래 박테리오클로로필 생산량 측정 결과. Black bar, 순수 로도박터 스페로이드 배양을 통한 배양시간별 박테리오클로로필 생산량 측정 결과. Light gray bar, 순수 PS/PSMA 나노섬유 첨가에 따른 로도박터 스페로이드의 배양시간 별 박테리오클로로필 생산량 측정 결과. Gray bar, 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유 첨가에 따른 로도박터 스페로이드의 배양시간 별 박테리오클로로필 생산량 측정 결과.
패널 (c): 고정화 탄산무수화 효소 첨가에 따른 배양시간 별 로도박터 스페로이드 유래 코엔자임 Q10 생산량 측정 결과. Black bar, 순수 로도박터 스페로이드 배양을 통한 배양시간별 코엔자임 Q10 생산량 측정 결과. Light gray bar, 순수 PS/PSMA 나노섬유 첨가에 따른 로도박터 스페로이드의 배양시간 별 코엔자임 Q10 생산량 측정 결과. Gray bar, 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유 첨가에 따른 로도박터 스페로이드의 배양시간 별 코엔자임 Q10 생산량 측정 결과.
패널 (d): 고정화 탄산무수화 효소 첨가에 따른 배양시간 별 로도박터 스페로이드 유래 포르피린 생산량 측정 결과. Black bar, 순수 로도박터 스페로이드 배양을 통한 배양시간별 포르피린 생산량 측정 결과. Light gray bar, 순수 PS/PSMA 나노섬유 첨가에 따른 로도박터 스페로이드의 배양시간 별 포르피린 생산량 측정 결과. Gray bar, 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유 첨가에 따른 로도박터 스페로이드의 배양시간 별 포르피린 생산량 측정 결과. 1 is a polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofiber prepared using an electrospinning technique and PS / PSMA nano-immobilized carbonic anhydrase through covalent-based cross-linking agglutination It is a photograph taken by the field emission scanning microscope of the fiber. Panel (a) shows the results of electric field scanning microscopy analysis of electrospun based polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofibers, and panel (b) shows carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nano Field emission scanning microscope analysis of fibers.
Figure 2 shows the results of the Lineweaver-Burk plots enzyme reaction rate analysis according to substrate concentration and enzyme concentration using PNA (Para-Nitrophenyl Acetate) of the immobilized carbonic anhydrase to the non-immobilized and PS / PSMA nanofibers. ●: Lineweaver-Burk plots enzyme reaction rate analysis of immobilized carbonic anhydrase to PS / PSMA nanofibers. ??: Lineweaver-Burk plots of unimmobilized carbonic anhydrase.
Figure 3 shows the results of comparing the storage stability of immobilized and immobilized carbonic anhydrase to PS / PSMA nanofibers. □: Measurement result of activity change of unfixed carbonic anhydrase at 4 ° C for 60 days. ■: Results of measurement of activity change of carbonic anhydrase immobilized with PS / PSMA nanofibers at 4 ° C. for 60 days. ?? : Measurement result of activity change of unfixed carbonic anhydrase at 30 ° C for 60 days. ●: Measurement result of activity change of carbonic anhydrase immobilized with PS / PSMA nanofibers upon storage at 30 ° C. for 60 days.
FIG. 4 shows the initial enzymatic activity as 100% through spectrophotometry using PNA (Para-Nitrophenyl Acetate) as an enzyme reaction substrate to confirm the reusability of carbonic anhydrase immobilized with PS / PSMA nanofibers. Relative enzymatic activity change resulted from the reuse of meeting.
Figure 5 shows the result of measuring the amount of calcium carbonate precipitated by the concentration of the immobilized enzyme through calcium carbonate electrolysis method as an indirect method for measuring the conversion rate of the immobilized carbonic anhydrase to carbon dioxide bicarbonate. ●: The amount of precipitated calcium carbonate according to the concentration of carbonic anhydrase immobilized with PS / PSMA nanofibers. ?? : Calcium carbonate precipitation according to addition of pure PS / PSMA nanofibers.
Figure 6 shows the results confirmed the growth of Rhodobacter spheroid according to the addition of immobilized carbonic anhydrase in the culture of Rhodobacter spheroid, a photosynthetic microorganism. □: Measurement result of dry cell weight over time in pure Rhodobacter spheroid culture. ▲: after the addition of pure PS / PSMA nanofibers in the Rhodobacter spheroid culture process, the result of measuring the dry weight of the cells over time. ◆: Cell dry weight measurement results over time after addition of 50 mg carbonic anhydrase immobilized PS / PSMA nanofibers during Rhodobacter spheroid culture. ●: After the addition of 100 mg carbonic anhydrase immobilized PS / PSMA nanofibers in the Rhodobacter spheroid culture process, the result of measuring the dry weight of the cells over time.
Figure 7 shows the results of the evaluation of the reusability of the immobilized carbonic anhydrase for maintaining the growth of Rhodobacter spheroids. After the addition of gray bar, pure PS / PSMA nanofibers, cell dry weight measurement according to 30 times of 48 hours Rhodobacter spheroid culture process. After the addition of black bar, carbonic anhydrase-immobilized PS / PSMA nanofibers, the cell dry weight was measured according to 30 times Rhodobacter spheroid culture process for 30 hours.
Figure 8 shows the results of measuring the production of Rhodobacter spheroid-derived physiologically active substance according to the addition of immobilized carbonic anhydrase.
Panel (a): Rhodobacter spheroid-derived carotenoid production results according to incubation time with immobilized carbonic anhydrase. Black bar, carotenoid production measurement results by incubation time through pure Rhodobacter spheroid culture. Measurement results of carotenoids production by Rhodobacter spheroids by light gray bar and pure PS / PSMA nanofibers. Gray bar, Carbonate anhydrase immobilized PS / PSMA Result of measurement of carotenoid production by Rhodobacter spheroid according to incubation time.
Panel (b): Rhodobacter spheroid-derived bacteriochlorophyll production results according to incubation time with immobilized carbonic anhydrase. Black bar, Bacteriochlorophyll production results by incubation time through pure Rhodobacter spheroid culture. Measurement results of bacteriochlorophyll production by Rhodobacter spheroid by light gray bar and pure PS / PSMA nanofibers. Gray bar, carbonated anhydrase immobilized PS / PSMA results of measurement of bacteriochlorophyll production by Rhodobacter spheroid according to the addition of nanofibers.
Panel (c): Rhodobacter spheroid-derived coenzyme Q10 production results by incubation time with immobilized carbonic anhydrase. Black bar, pure Rhodobacter spheroid culture results of measurement of coenzyme Q10 production by incubation time. Measurement results of coenzyme Q10 production by time of incubation of Rhodobacter spheroids by adding light gray bar and pure PS / PSMA nanofibers. Gray bar, carbonic anhydrase immobilized PS / PSMA coenzyme Q10 production of Rhodobacter spheroids according to the addition of nanofibers.
Panel (d): Measurement results of Rhodobacter spheroid-derived porphyrin production by incubation time with immobilized carbonic anhydrase. Black bar, porphyrin production result by incubation time through pure Rhodobacter spheroid culture. Measurement of porphyrin production by time of incubation of Rhodobacter spheroid by adding light gray bar and pure PS / PSMA nanofibers. Gray bar, carbonic anhydrase immobilized PS / PSMA results of measurement of porphyrin production by Rhodobacter spheroid according to the addition of nanofibers.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예 Example

실시예 1:Example 1: 전기방사 기법을 이용한 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물) 나노섬유 제작 Fabrication of Polystyrene / Poly (styrene-co-maleic anhydride) Nanofibers Using Electrospinning Technique

전기방사(electrospinning)에 의한 나노섬유를 제작하기 위하여 0.5 g의 폴리스티렌(Polystyrene, Mw = 860,000) 및 0.25 g의 폴리(스티렌-co-말레산 무수물)[poly(styrene-co-maleic anhydride), Mw = 224,000]을 9 mL의 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran)에 첨가하고 마그네틱 스티어러(magnetic stirrer)를 이용하여 상온에서 12시간 동안 용액이 균질해질때 까지 혼합하여 폴리머 용액을 준비하였다. 일반적인 전기방사를 위한 주요 구성장비로 폴리머 용액의 일정한 분사를 위한 주사기펌프(Model 100, KD Scientific Inc, Holliston, MA, USA) 및 고전압 발생을 위한 고전압 써플라이(high-voltage supply)((ES30P-10W, Gamma High Voltage Research, Ormond Beach, FL, USA)를 이용하였다. 준비된 폴리머 용액을 26 게이지(gauge) 스테인리스스틸 바늘이 장착된 3 mL 플라스틱 주사기에 주입하고 이를 주사기 펌프에 장착하였으며, 전기방사 나노섬유의 수집을 위해 알루미늄 호일을 사용하였다. 폴리머 용액이 담긴 주사기 바늘 끝에 고전압 써플라이에 연결된 플러스 전극을 연결하고 수집기로 사용된 알루미늄 호일에는 마이너스 전극을 연결하여 전기방사를 위한 장비 준비를 완료하였다. PS/PSMA 나노섬유 제작을 위한 전기방사 조건은 전압(voltage) 8 kV, 유량(flow rate) 2 ㎕/min 및 바늘과 수집기 사이의 거리(distance between the needle and collecting foil) 10 cm 조건으로 최적화하였다. 전기방사를 통해 제작된 PS/PSMA 나노섬유는 전계방사주사현미경 (Field emission scanning electron microscope, LEO 1530, LEO, Oberkochen, Germany)을 이용하여 나노섬유 형태의 정상여부 확인 및 직경의 길이 측정을 통해 나노섬유 크기를 측정하였다. 이를 통해 나노섬유 표면에 비드(bead)가 형성되지 않은 정상적인 평균 섬유 직경 150 - 200 nm를 갖는 전기방사 PS/PSMA 나노섬유를 제작하였다(도 1의 패널 (a) 참고).
0.5 g of polystyrene (Mw = 860,000) and 0.25 g of poly (styrene-co-maleic anhydride) [poly (styrene-co-maleic anhydride), Mw to produce nanofibers by electrospinning = 224,000] was added to 9 mL of tetrahydrofuran and mixed with a magnetic stirrer at room temperature for 12 hours until the solution was homogeneous to prepare a polymer solution. Main components for general electrospinning include syringe pumps for constant injection of polymer solutions (Model 100, KD Scientific Inc, Holliston, MA, USA) and high-voltage supplies for high voltage generation (ES30P-10W , Gamma High Voltage Research, Ormond Beach, FL, USA) The prepared polymer solution was injected into a 3 mL plastic syringe equipped with a 26 gauge stainless steel needle, mounted on a syringe pump, and electrospun nanofibers. The aluminum foil was used for the collection of the polymer needle, and the positive electrode connected to the high voltage supply was connected to the tip of the syringe needle containing the polymer solution, and the negative electrode was connected to the aluminum foil used as the collector. Electrospinning conditions for PSMA nanofiber fabrication were 8 kV voltage, 2 μl / min flow rate and needle and collector The distance between the needle and collecting foil was optimized to 10 cm The PS / PSMA nanofibers produced by electrospinning were field emission scanning electron microscopes (LEO 1530, LEO, Oberkochen, Germany). The nanofiber size was measured by checking whether the shape of the nanofibers was normal and measuring the length of the diameter by means of electrospinning having a normal average fiber diameter of 150 to 200 nm without beads formed on the surface of the nanofibers. PS / PSMA nanofibers were prepared (see panel (a) of FIG. 1).

실시예 2: 공유결합 기반 가교효소응집(cross-linked enzyme aggregation, CLEA)법을 활용한 PS/PSMA 나노섬유로의 탄산무수화 효소의 고정화 Example 2: Immobilization of Carbonic Anhydrase to PS / PSMA Nanofibers Using Covalent-Based Cross-linked Enzyme Aggregation (CLEA) Method

2.1 탄산무수화 효소가 고정화된 PS/PSMA 나노섬유 제조2.1 Preparation of PS / PSMA Nanofibers Immobilized with Carbonic Anhydrase

로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래 재조합 탄산무수화 효소의 PS/PSMA 나노섬유로의 고정화를 위해 공유결합 기반 가교효소응집(CLEA, Cross-Linked Enzyme Aggregation)법을 이용하였다. CLEA법은 1차적으로 PS/PSMA 나노섬유의 말레산 무수물 그룹과 탄산무수화 효소의 아민기 사이의 공유결합을 유도하고 2차적으로 글루타르알데히드(glutaraldehyde, GA)를 가교제(cross-linker)로 사용하여 PS/PSMA 나노섬유에 고정화된 탄산무수화 효소의 아민기와 추가적으로 첨가되는 탄산무수화 효소간의 추가적인 공유결합을 이루는 고정화 방법이다. 이를 위해, 10 mM 소디엄 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer)(pH 8.0)에 2 g/L의 농도로 용해되어 있는 탄산무수화 효소 용액 1 mL과 5 mg의 PS/PSMA 나노섬유를 혼합 후 25 ℃에서 30분간 180 rpm 조건으로 교반시켰다. 상기 과정을 마친 반응액을 4 ℃에서 90분간 50 rpm 조건으로 추가 교반하였다. 이후 10 mM 소디엄 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer) (pH 8.0)에 0.5% (v/v)로 용해되어 있는 글루타르알데히드(glutaraldehyde, GA) 용액 1 mL을 첨가 후 4 ℃, 50 rpm 조건으로 12시간 교반시켰다. 반응을 마친 탄산무수화 효소가 고정화된 PS/PSMA 나노섬유를 새로운 반응튜브로 옮기고 남아 있는 탄산무수화 효소와 GA의 제거를 위하여 10 mM 소디엄 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer) (pH 8.0) 1 mL을 이용하여 각각 3회 반복 세척을 하였다. 또한 GA 내 반응하지 않은 알데히드기(aldehyde group)의 제거를 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) 완충액 1 mL을 첨가하고 25 ℃에서 30분간 180 rpm 조건으로 교반시켜 알데히드기를 캐핑 (capping) 하였다. 캐핑을 마친 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유는 각각 10 mM 소디엄 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer) (pH 8.0) 1 mL을 이용하여 3회 세척하였으며 전계방사주사현미경 분석을 통하여 PS/PSMA 나노섬유 표면으로의 탄산무수화 효소 고정화 여부를 확인 하였다. 탄산무수화 효소가 고정화된 PS/PSMA 나노섬유의 전계방사주사현미경 분석 결과, 순수 PS/PSMA 나노섬유와 비교하였을 때, 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유의 표면이 보다 거친 것을 확인 하였다. 이를 통해 CLEA에 의해 응집된 탄산무수화 효소가 PS/PSMA 나노섬유에 고정화되었음 확인하였다 (도 1의 패널 (b) 참고). For immobilization of Rhodobacter sphaeroides- derived recombinant carbonic anhydrase to PS / PSMA nanofibers, a covalent-based cross-linked enzyme aggregation (CLEA) method was used. The CLEA method primarily induces a covalent bond between the maleic anhydride group of the PS / PSMA nanofibers and the amine group of the carbonic anhydrase and secondly the glutaraldehyde (GA) as a cross-linker. It is an immobilization method that forms an additional covalent bond between the amine group of the carbonic anhydrase and the carbonic anhydrase added in addition to the PS / PSMA nanofibers. To this end, after mixing 1 mL of carbonic anhydride solution and 5 mg of PS / PSMA nanofibers dissolved in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) at a concentration of 2 g / L, 25 ° C Stirred at 180 rpm for 30 minutes. After the reaction was completed, the reaction solution was further stirred at 4 rpm for 90 minutes at 50 rpm. Then, 1 mL of a glutaraldehyde (GA) solution dissolved in 0.5% (v / v) in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) was added. Stirred for time. Transfer the reacted PS / PSMA nanofiber with immobilized carbonic anhydrase to a new reaction tube and remove 1 mL of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) to remove remaining carbonic anhydrase and GA. Each wash was repeated three times. In addition, 1 mL of 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) buffer was added to remove unreacted aldehyde groups in GA, and the aldehyde group was capped by stirring at 25 ° C. for 30 minutes at 180 rpm. The capped carbonic anhydrase immobilized PS / PSMA nanofibers were washed three times using 1 mL of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0), respectively, and PS / PSMA nanos were analyzed by field scanning microscope analysis. The immobilization of carbonic anhydrase on the fiber surface was confirmed. Field scanning microscope analysis of PS / PSMA nanofibers immobilized with carbonic anhydrase showed that the surface of the carbonic anhydrase immobilized PS / PSMA nanofibers was more coarse compared to the pure PS / PSMA nanofibers. This confirmed that the carbonic anhydrase aggregated by CLEA was immobilized on the PS / PSMA nanofibers (see panel (b) of Figure 1).

2.2 탄산무수화 효소의 PS/PSMA 나노섬유로의 고정화 분석2.2 Immobilization Analysis of Carbonic Anhydrase to PS / PSMA Nanofibers

PS/PSMA 나노섬유로 고정화된 탄산무수화 효소의 양을 확인하기 위하여 고정화 실험에 최초 이용된 탄산무수화 효소의 양과 고정화를 마친 후 최종 세척단계에 남아 있는 탄산무수화 효소의 양의 차이를 통해 확인하였다. 각 단계의 효소의 양 측정을 위해 일반적인 단백질 농도 측정 방법인 브래드포드 측정법(bradford assay)에 기초한 표준곡선을 제작하여 이용하였으며, 고정화율은 사용한 PS/PSMA 나노섬유 1 g 당 고정화된 탄산무수화 효소의 양(mg)으로 정의하였다. 그 결과 CLEA 방법을 통한 탄산무수화 효소의 PS/PSMA 나노섬유로 고정화율은 56.8 mg/g 임을 확인할 수 있었다.
To determine the amount of carbonic anhydrase immobilized with PS / PSMA nanofibers, the difference between the amount of carbonic anhydrase first used in the immobilization experiment and the amount of carbonic anhydrase remaining in the final washing step after the immobilization was completed Confirmed. A standard curve based on the Bradford assay, which is a general protein concentration measurement method, was used to measure the amount of enzyme at each stage. The immobilization rate was immobilized carbonic anhydrase per 1 g of PS / PSMA nanofibers used. It was defined as the amount of mg. As a result, it was confirmed that the immobilization rate of PS / PSMA nanofibers of carbonic anhydrase through CLEA method was 56.8 mg / g.

실시예 3: 고정화 탄산무수화 효소의 활성 측정 및 특성 분석 Example 3 Activity Measurement and Characterization of Immobilized Carbonic Anhydrase

3.1 분광 광도법을 이용한 탄산무수화 효소 활성 측정3.1 Measurement of Carbonic Anhydrase Activity by Spectrophotometry

탄산무수화 효소의 활성은 탄산무수화 효소의 에스터라아제(esterase) 활성에 의한 분광 광도법에 의하여 측정하였다. 비고정화(free) 탄산무수화 효소와 고정화 탄산무수화 효소의 활성 측정은 25 ℃에서 행하였으며, 비고정화 탄산무수화 효소의 활성 측정을 위해 1mL UV 큐벳트(cuvette)를 이용하였다. 0.8 mL의 Tris 완충액(50 mM, pH7.5), 0.1 mL의 기질 용액(para-nitrophenyl acetate dissolved in acetonitrile) 그리고 0.1 mL의 탄산무수화 효소 용액을 혼합 후, 파라-니트로페놀(para-nitrophenol)의 생산량을 흡광도 400 nm에서 5분간 측정하였다. 고정화 탄산무수화 효소의 활성 측정을 위해 9 mL의 Tris 완충액(50 mM, pH7.5), 1 mL의 0.1 mL의 기질 용액(para-NPA dissolved in acetonitrile)을 혼합 후 고정화 탄산무수화 효소를 혼합 용액에 첨가 하여 이로부터 매 1분마다 1mL의 반응액을 취하여 흡광도 400 nm를 측정하였다. 이를 15분간 행하였으며 매분 취해진 1 mL의 시료는 반응액의 부피를 일정하게 유지하기 위하여 흡광도 측정 후 곧바로 다시 반응액으로 합쳤다. 각 조건 별 비고정화와 고정화 탄산무수화 효소의 활성은 최적 상태의 활성을 100％로 하여 각각 상대적 활성 값(residual activity)으로 나타내었다.
The activity of the carbonic anhydrase was measured by spectrophotometry by the esterase activity of the carbonic anhydrase. The activity measurement of free carbonated anhydrase and immobilized carbonic anhydrase was performed at 25 ° C., and 1 mL UV cuvette was used to measure the activity of the non-fixed carbonic anhydrase. 0.8 mL of Tris buffer (50 mM, pH7.5), 0.1 mL of substrate solution (para-nitrophenyl acetate dissolved in acetonitrile) and 0.1 mL of carbonic anhydrase solution were mixed, followed by para-nitrophenol. The yield of was measured for 5 minutes at 400 nm of absorbance. To measure the activity of immobilized carbonic anhydrase, 9 mL of Tris buffer (50 mM, pH7.5) and 1 mL of 0.1 mL substrate solution (para-NPA dissolved in acetonitrile) were mixed, followed by immobilization of carbonated anhydrous enzyme. The solution was added to the solution, and 1 mL of the reaction solution was taken every 1 min, and the absorbance was measured at 400 nm. This was done for 15 minutes, and 1 mL of sample taken every minute was combined with the reaction solution immediately after absorbance measurement in order to maintain a constant volume of the reaction solution. The activity of unimmobilized and immobilized carbonic anhydrase for each condition was expressed as a relative activity value with the optimal activity as 100%.

3.2 Para-NPA를 기질로 이용한 비고정화 및 고정화 탄산무수화 효소의 효소반응 속도(enzyme kinetics) 분석3.2 Enzyme kinetics analysis of unimmobilized and immobilized carbonic anhydrase using Para-NPA as a substrate

상기 실시예 3.1의 비고정화 및 고정화 탄산무수화 효소의 활성 측정 기법을 기반으로 각 효소에 대한 효소반응 속도 분석을 실시하였다. 비고정화 및 고정화 탄산무수화 효소의 효소반응속도 분석을 위해 각각의 효소 활성 측정 반응에 적용한 탄산무수화 효소의 농도를 고정하고, 0.5, 1, 1.5, 2.0 그리고 2.5 mM의 Para-NPA(Para-Nitrophenyl Acetate) 기질 첨가에 따른 효소 활성을 측정하였다. 또한 활성 측정 반응에 첨가한 기질 농도를 고정하고 다양한 농도의 비고정화 및 고정화 탄산무수화 효소를 첨가하여 이에 대한 활성을 측정하였다. 이는 다양한 효소반응 속도론 이론에 의해 계산하였다(도 2 참고). 아래 표 1은 비고정화 및 고정화 효소의 효소반응 속도론에 따른 Vmax 및 Km 값을 나타낸 것이다. Based on the technique of measuring the activity of the non-immobilized and immobilized carbonic anhydrase in Example 3.1, enzyme reaction rate analysis was performed for each enzyme. For the enzyme kinetics analysis of unimmobilized and immobilized carbonic anhydrase, the concentrations of carbonic anhydrase applied to each enzyme activity reaction were fixed, and Para-NPA (Para-, 0.5, 1, 1.5, 2.0 and 2.5 mM) was fixed. Enzyme activity was measured by adding Nitrophenyl Acetate) substrate. In addition, the activity of the substrate was fixed by fixing the substrate concentration added to the reaction and adding various concentrations of unfixed and immobilized carbonic anhydrase. This was calculated by various enzyme kinetics theory (see Figure 2). Table 1 below shows the V max and K m values according to the enzyme kinetics of the immobilized and immobilized enzyme.

비고정화 탄산무수화 효소Unfixed Carbonic Anhydrase 고정화 탄산무수화 효소Immobilized Carbonic Anhydrase Vmax(μM/min/mL)V max (μM / min / mL) 13.6813.68 11.5911.59 Km(mM)K m (mM) 12.7512.75 24.6424.64

실시예 4: pH와 온도에 따른 비고정화 및 고정화 탄산무수화 효소 활성 변화Example 4: Changes in Unfixed and Immobilized Carbonic Anhydrase Activity with pH and Temperature

pH에 따른 비고정화 및 고정화 탄산무수화 효소의 활성변화를 측정하기 위하여 각각의 시료를 pH 6.0-10 범위의 10 mM 소디엄 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer)에 25℃, 1 시간 보관 후 분광 광도법에 의한 활성 측정을 실시하였다. 그 결과 비고정화 탄산무수화 효소는 pH 8.5에서 가장 높은 효소활성을 나타내었으며, 고정화 탄산무수화 효소의 경우 비고정화 탄산무수화 효소에 비해 알칼리 영역으로 1 unit 증가 한 pH 9.5에서 최대 효소활성을 나타냄을 확인하였다. 또한 고정화 탄산무수화 효소는 비고정화 효소에 비해 대부분의 pH 범위에서 높은 활성을 나타냈다. pH 6.0에서 비고정화 효소의 활성이 75ㅁ1.8% 인 것과 비교하여 고정화 탄산무수화 효소는 77.6ㅁ0.8%의 효소 활성을 나타내었으며, pH 10.0에서 비고정화 탄산무수화 효소의 활성이 84.7ㅁ1.4% 인 것과 비교하여 고정화 탄산무수화 효소의 활성은 94.5ㅁ1.5%를 나타내었다. 이를 통해 고정화 탄산무수화 효소는 비고정화 탄산무수화 효소에 비해 pH 안정성이 보다 높음을 확인할 수 있었다 (표 2 참고). In order to measure the change in activity of unimmobilized and immobilized carbonic anhydrase according to pH, each sample was stored in 10 mM sodium phosphate buffer at pH 6.0-10 for 1 hour and then subjected to spectrophotometry. The activity measurement by was performed. As a result, the non-immobilized carbonic anhydrase showed the highest enzymatic activity at pH 8.5, and the immobilized carbonic anhydrase showed the maximum enzyme activity at pH 9.5, which was increased by 1 unit to the alkaline region compared to the non-immobilized carbonic anhydrase. It was confirmed. In addition, immobilized carbonic anhydrase exhibited higher activity in most pH ranges than unimmobilized enzymes. The immobilized carbonic anhydrase exhibited enzymatic activity of 77.6x0.8% compared to that of the non-immobilized enzyme at 75% of pH 6.0 and 84.7 ㅁ 1.4% of the activity of the unimmobilized carbonic anhydrase at pH 10.0. In comparison with that of the immobilized carbonic anhydrase activity was 94.5 W 1.5%. Through this, the immobilized carbonic anhydrase was found to have higher pH stability than the non-immobilized carbonic anhydrase (see Table 2).

pHpH 비고정화 탄산무수화 효소
(free carbonic anhydrase)Unfixed Carbonic Anhydrase
(free carbonic anhydrase) 고정화 탄산무수화 효소
(immobilized carbonic anhydrase)Immobilized Carbonic Anhydrase
(immobilized carbonic anhydrase) 6.06.0 75.0 ± 1.875.0 ± 1.8 77.6 ± 0.877.6 ± 0.8 6.56.5 85.2 ± 1.385.2 ± 1.3 86.4 ± 1.786.4 ± 1.7 7.07.0 89.3 ± 2.189.3 ± 2.1 90.4 ± 0.690.4 ± 0.6 7.57.5 94.0 ± 1.694.0 ± 1.6 93.4 ± 1.193.4 ± 1.1 8.08.0 98.4 ± 1.198.4 ± 1.1 95.7 ± 0.795.7 ± 0.7 8.58.5 100.0 ± 0.8100.0 ± 0.8 96.8 ± 0.496.8 ± 0.4 9.09.0 97.4 ± 1.297.4 ± 1.2 98.7 ± 1.398.7 ± 1.3 9.59.5 90.2 ± 1.790.2 ± 1.7 100.0 ± 0.8100.0 ± 0.8 10.010.0 84.7 ± 1.484.7 ± 1.4 94.5 ± 1.594.5 ± 1.5

또한, 온도에 따른 비고정화 및 고정화 탄산무수화 효소의 활성변화를 측정하기 위하여 10 mM 소디엄 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer)(pH 9.5)에 보관한 각각의 비고정화 및 고정화 탄산무수화 효소를 온도 20 - 60℃에 1 시간 보관 후 분광 광도법에 의한 각각의 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 비고정화와 고정화 탄산무수화 효소의 최적 활성 유지 온도는 각각 40℃와 45℃로 확인되었으며, 전체적으로 고정화 탄산무수화 효소의 온도 안정성이 높음을 확인하였다. 고정화 탄산무수화 효소의 활성이 55℃와 60℃에서 각각 94.7ㅁ1.7％와 91.4ㅁ0.9％를 유지하는 것과 비교하여 동일한 온도조건에서 비고정화 탄산무수화 효소는 90.7ㅁ0.8％와 87.1ㅁ1.3％를 각각 유지하였다(표 3 참고). 높은 온도에서 비고정화 효소는 쉽게 변성(denaturation) 되는 반면 고정화 탄산무수화 효소는 고정화에 의한 단단한 구조 형성을 통해 비고정화 효소보다 변성에 대한 저항성이 높아지는 것을 예측할 수 있다. 이를 통해 공유결합 기반 CLEA 형태로 고정화된 탄산무수화 효소의 pH 및 온도 안정성이 비고정화 탄산무수화 효소에 비해 높게 유지됨을 확인 하였다. In addition, in order to measure the change in activity of unimmobilized and immobilized carbonic anhydrase with temperature, each unimmobilized and immobilized carbonic anhydrase stored in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 9.5) was After storage for 1 hour at 20-60 ° C., each enzyme activity was measured by spectrophotometry. As a result, the optimum activity holding temperature of the non-immobilized and immobilized carbonic anhydrase was confirmed to be 40 ℃ and 45 ℃, respectively, and the overall temperature stability of the immobilized carbonic anhydrase was high. The immobilized carbonic anhydrase was 90.7 ㅁ 0.8% and 87.1 ㅁ 1.3% at the same temperature, compared with the activity of 94.7 W 1.7% and 91.4 W 0.9% at 55 ° C and 60 ° C, respectively. Were maintained respectively (see Table 3). At high temperatures, de-immobilized enzymes are easily denatured, whereas immobilized carbonic anhydrase can be expected to be more resistant to denaturation than un-immobilized enzymes through the formation of rigid structures by immobilization. It was confirmed that the pH and temperature stability of the carbonic anhydrase immobilized in the covalent bond-based CLEA form was maintained higher than that of the non-fixed carbonic anhydrase.

온도(℃) Temperature (℃) 비고정화 탄산무수화 효소
(free carbonic anhydrase)Unfixed Carbonic Anhydrase
(free carbonic anhydrase) 고정화 탄산무수화 효소
(immobilized carbonic anhydrase)Immobilized Carbonic Anhydrase
(immobilized carbonic anhydrase) 2020 86.4 ± 1.786.4 ± 1.7 88.7 ± 1.288.7 ± 1.2 2525 88.5 ± 1.488.5 ± 1.4 91.1 ± 0.991.1 ± 0.9 3030 94.7 ± 1.194.7 ± 1.1 96.2 ± 0.896.2 ± 0.8 3535 96.4 ± 1.396.4 ± 1.3 97.4 ± 0.697.4 ± 0.6 4040 100.0 ± 0.7100.0 ± 0.7 98.7 ± 0.798.7 ± 0.7 4545 96.7 ± 0.996.7 ± 0.9 100.0 ± 1.1100.0 ± 1.1 5050 92.1 ± 1.292.1 ± 1.2 97.5 ± 1.497.5 ± 1.4 5555 90.7 ± 0.890.7 ± 0.8 94.7 ± 1.794.7 ± 1.7 6060 87.1 ± 1.387.1 ± 1.3 91.4 ± 0.991.4 ± 0.9

실시예Example 5: 고정화  5: immobilization 탄산무수화Carbonic anhydride 효소의 저장 안정성 및 재사용 확인  Ensuring Storage Stability and Reuse of Enzymes

비고정화 및 고정화 탄산무수화 효소의 저장 안정성을 확인하기 위하여 각각의 시료를 10 mM 소디엄 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer) (pH 8.0)에 담그고 4℃와 30℃에서 60일간 보관하며 분광 광도법에 의한 상대적 활성을 측정 하였다. 비고정화 및 고정화 탄산무수화 효소의 활성은 각 조건 별 초기 활성을 100％로 하여 시간에 따른 활성변화를 상대적으로 나타내었다. 그 결과, 동일한 보관 조건하에서 고정화 탄산무수화 효소는 비고정화 탄산무수화 효소에 비해 상대적으로 시간에 따른 효소 활성 감소 비율이 낮음을 확인하였다. 고정화 탄산무수화 효소는 4℃와 30℃ 보관 60일 후 초기 활성의 94.7％와 79.4％를 각각 유지하였다. 반면에 비고정화 탄산무수화 효소의 경우 4℃ 보관 60일 후 초기 활성의 약 37.9％을 유지하였으나 30℃ 보관의 경우, 45일 이후 효소활성이 모두 소실됨을 확인하였다. 이와 같은 고정화 탄산무수화 효소의 저장 안정성 증가는 가교효소응집법을 이용한 PS/PSMA 나노섬유 표면으로의 공유결합으로 인한 결과이며, 이에 따라 고정화 효소의 효소활성부위(active site)의 최소 파괴 효과에 의해 높은 저장 안정성이 보장됨을 의미한다. 이를 통해 공유결합기반의 고정화 방법은 효소의 저장 안정성을 향상시킴을 확인하였다(도 3 참고). To confirm the storage stability of unimmobilized and immobilized carbonic anhydrase, each sample was immersed in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0), stored at 4 ° C and 30 ° C for 60 days, and subjected to spectrophotometry. Relative activity was measured. The activity of the non-immobilized and immobilized carbonic anhydrase showed a change in activity over time with the initial activity of each condition as 100%. As a result, the immobilized carbonic anhydrase was found to have a relatively low rate of decrease in enzyme activity over time under the same storage conditions. Immobilized carbonic anhydrase maintained 94.7% and 79.4% of initial activity after 60 days of storage at 4 ° C. and 30 ° C., respectively. On the other hand, in the case of unfixed carbonic anhydrase, about 37.9% of initial activity was maintained after 60 days of storage at 4 ° C., but all enzyme activities were lost after 45 days of storage at 30 ° C. The increased storage stability of the immobilized carbonic anhydrase is a result of covalent bonding to the surface of the PS / PSMA nanofibers using cross-linking enzyme agglomeration, and thus the minimal disruption effect of the active site of the immobilized enzyme. It means that high storage stability is guaranteed. Through this covalent-based immobilization method was confirmed to improve the storage stability of the enzyme (see Figure 3).

PS/PSMA 나노섬유로의 고정화 탄산무수화 효소의 재사용 가능성 확인을 위해 상기 실시예 3.1의 고정화 효소의 활성 측정 방법을 이용하여 1회 활성 측정을 마친 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 회수하고 각각 1 mL의 10 mM 소디엄 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer)(pH 8.0)를 이용하여 3회 세척하였다. 세척을 마친 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유는 동일한 활성측정 방법을 통해 재사용에 따른 활성변화를 관찰하였다. 위와 같은 반복과정을 총 60회 반복하였으며 최초의 효소활성을 100%로 정의하고 반복사용에 따른 효소활성 변화를 상대적으로 나타내었다. 그 결과, 고정화 탄산무수화 효소는 재사용이 반복될수록 효소 활성이 감소되는 것을 확인 하였다. 이와 같은 고정화 효소의 재사용에 따른 효소 활성 감소는 효소의 변성 및 담체로부터의 고정화 효소의 누락(leakage)에 기인한다. PS/PSMA 나노섬유로 고정화된 탄산무수화 효소는 총 60 회의 재사용 결과 최초 활성의 45％ 이상을 유지하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 비고정화 탄산무수화 효소와 비교 시 PS/PSMA 나노섬유로 고정화된 탄산무수화 효소는 높은 내구성(durability)과 재사용 가능성을 가짐을 확인하였다(도 4 참고).
In order to confirm the reusability of the immobilized carbonic anhydrase to PS / PSMA nanofibers, the carbonic anhydrase immobilized PS / PSMA nanofibers having been subjected to one-time activity measurement were recovered using the activity measuring method of the immobilized enzyme of Example 3.1. And washed three times with 1 mL of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0), respectively. After washing, the carbonic anhydrase-immobilized PS / PSMA nanofibers were observed for the change of activity according to reuse through the same activity measurement method. The above repetition process was repeated 60 times and the initial enzyme activity was defined as 100% and the change in enzyme activity according to repeated use was relatively shown. As a result, the immobilized carbonic anhydrase was confirmed that the enzyme activity decreases as the reuse is repeated. The decrease in enzyme activity due to such reuse of immobilized enzymes is due to the denaturation of enzymes and the leakage of immobilized enzymes from the carrier. It was confirmed that the carbonic anhydrase immobilized with PS / PSMA nanofibers retained more than 45% of the initial activity as a result of a total of 60 reuses. Carbonic anhydrase was confirmed to have high durability (durability) and reusability (see Fig. 4).

실시예 6: 탄산칼슘 침전을 통한 고정화 탄산무수화 효소의 이산화탄소 전환률 측정 Example 6 Determination of Carbon Dioxide Conversion of Immobilized Carbonic Anhydrase by Calcium Carbonate Precipitation

고정화 탄산무수화 효소에 의한 이산화탄소 수화 정도, 즉 이산화탄소의 중탄산염으로의 전환율 측정을 위한 간접적인 방법으로 탄산칼슘 침전법을 이용하였다. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10 mg의 고정화 탄산무수화 효소를 100 mL Tris 완충액(0.5 M, pH 6.4)에 각각 현탁하여 고정화 효소 용액을 준비하였다. 준비된 각각의 고정화 효소 용액에 300 mL의 이산화탄소 포화 용액(이산화탄소 포화도: 0.149 wt％)을 첨가하였다. 이와 더불어 각 농도별 탄산무수화 효소가 고정화 된 PS/PSMA 나도섬유와 동일한 양의 순수 PS/PSMA 나노섬유를 대조군으로 사용하였다. 상기 반응액을 25℃에서 10분간 교반 후, Tris 완충액(0.5 M, pH 10.0)에 녹아 있는 2％ 탄산칼슘 용액 50 mL을 첨가하여 탄산칼슘 침전 정도를 확인하였다. 30 분간의 침전 반응 후, 와트만 필터 페이퍼 42(Whatmann filter paper 42)를 이용하여 침전물을 여과한 후 상온에서 12시간 동안 건조하였다. 건조된 탄산칼슘 침전물의 무게를 측정하였으며, 측정된 탄산칼슘의 무게는 수화된 이산화탄소와 평형을 이룬다. 고정화 탄산무수화 효소를 이용한 탄산칼슘 침전 결과 침전 반응에 첨가된 고정화 효소의 양이 많을수록 보다 많은 탄산칼슘 침전이 일어나는 것을 확인 하였다. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7 mg의 고정화 탄산무수화 효소가 이용된 탄산칼슘 침전 반응에서 침전된 탄산칼슘의 양은 각각 0.127 g, 0.270 g, 0.400 g, 0.507 g, 0.630 g, 0.755 g, 0.880 g 이였으며, 8 mg 이상의 고정화 탄산무수화 효소가 첨가된 탄산칼슘 침전 반응에서 약 1 g의 탄산칼슘이 침전됨을 확인하였다. 이는 탄산칼슘 침전 반응에 첨가된 이산화탄소 포화 용액이 고정화 탄산무수화 효소의 양 8 mg 이상에서 100％ 중탄산염으로 전환됨을 의미한다. 반면에 대조군으로 사용된 탄산무수화 효소가 고정화 되지 않은 각 조건별 동일한 무게의 PS/PSMA를 이용한 탄산칼슘 침전 결과 측정된 모든 조건에서 평균 0.080 g의 탄산칼슘을 침전시킴을 확인하였다(도 5 참고).
Calcium carbonate precipitation was used as an indirect method for measuring the degree of carbon dioxide hydration by immobilized carbonic anhydrase, that is, the conversion rate of carbon dioxide to bicarbonate. Prepare immobilized enzyme solution by suspending 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10 mg of immobilized carbonic anhydrase in 100 mL Tris buffer (0.5 M, pH 6.4), respectively. It was. 300 mL of carbon dioxide saturated solution (carbon dioxide saturation: 0.149 wt%) was added to each prepared immobilized enzyme solution. In addition, the same amount of pure PS / PSMA nanofibers as PS / PSMA nanofibers immobilized with carbonic anhydrase for each concentration was used as a control. After stirring the reaction solution at 25 ° C. for 10 minutes, 50 mL of a 2% calcium carbonate solution dissolved in Tris buffer (0.5 M, pH 10.0) was added to confirm the calcium carbonate precipitation. After 30 minutes of precipitation reaction, the precipitate was filtered using Whatman filter paper 42 and dried at room temperature for 12 hours. The dried calcium carbonate precipitate was weighed, and the measured calcium carbonate weight was in equilibrium with the hydrated carbon dioxide. As a result of precipitation of calcium carbonate using immobilized carbonic anhydrase, it was confirmed that more calcium carbonate precipitation occurred as the amount of immobilized enzyme added to the precipitation reaction increased. The amount of calcium carbonate precipitated in the calcium carbonate precipitation reaction using 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 mg of immobilized carbonic anhydrase was 0.127 g, 0.270 g, 0.400 g, 0.507 g, 0.630 g, respectively. , 0.755 g and 0.880 g, and it was confirmed that about 1 g of calcium carbonate precipitated in the calcium carbonate precipitation reaction to which 8 mg or more of immobilized carbonic anhydrase was added. This means that the saturated carbon dioxide solution added to the calcium carbonate precipitation reaction is converted to 100% bicarbonate at an amount of at least 8 mg of immobilized carbonic anhydrase. On the other hand, calcium carbonate anhydrous enzyme used as a control group was found to precipitate 0.080 g of calcium carbonate on average under all measured conditions as a result of calcium carbonate precipitation using the same weight of PS / PSMA for each condition that was not immobilized (see FIG. 5). ).

실시예 7: 고정화 탄산무수화 효소를 활용한 광합성 미생물 로도박터 스페로이드의 성장 증가 확인 Example 7 Confirmation of Increased Growth of Photosynthetic Rhodobacter Spheroid Using Immobilized Carbonic Anhydrase

광합성 미생물 배양과정에서 고정화 탄산무수화 효소를 이용한 이산화탄소의 중탄산염으로의 전환에 따른 미생물 성장 증가를 확인하기 위해, 로도박터 스페로이드 2.4.1 종을 이용하였다. 로도박터 스페로이드 2.4.1 종을 5％ 이산화탄소 공급 및 형광등 조사(15 W/m2) 조건의 이산화탄소 배양기에서 250 mL sistrom's 배지 (표 4 참고)를 이용하여 30℃, 180 rpm 조건으로 60 시간 배양하였다. 또한 로도박터 스페로이드 성장에 고정화 탄산무수화 효소가 미치는 영향을 확인하기 위하여 각각 50 mg 과 100 mg의 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 배양 배지에 첨가 후 이산화탄소 배양기를 이용한 30℃, 180 rpm의 동일한 조건으로 60 시간 배양하였다. 이와 더불어 대조군으로 탄산무수화 효소가 고정되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유을 첨가 후 동일 조건으로 배양하였다. 미생물 세포의 성장(cell growth)은 흡광도 600 nm에서 측정하였으며 흡광도 측정 기반 세포성장 값과 세포건조중량(dry cell weight)간의 기준곡선 작성을 통해 세포건조중량으로 변환하였다. 그 결과, 로도박터 스페로이드 자체 만을 배양한 실험군과 대조군으로 이용된 PS/PSMA 나노섬유 자체만을 넣은 실험군은 동일한 배양시간 별 유사한 세포건조중량을 나타냈다. 그러나 50 mg과 100 mg의 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서의 배양 후 48 시간의 세포건조중량이 각각 1.934 g/L 과 2.070 g/L로 로도박터 스페로이드 자체만을 배양한 실험군과 고정화 탄산무수화 효소에 대한 대조군으로 사용한 순수 PS/PSMA 나노섬유 만을 첨가한 실험군의 세포건조중량이 각각 1.560 g/L와 1.564 g/L인 것과 비교하여 높은 세포건조중량를 나타내었으며, 보다 많은 고정화 탄산무수화 효소를 첨가한 배양조건에서 보다 높은 세포건조중량를 나타냄을 확인하였다(도 6 참고).
Rhodobacter spheroid 2.4.1 species was used to confirm the growth of microorganisms by conversion of carbon dioxide to bicarbonate using immobilized carbonic anhydrase in photosynthetic microbial culture. Rhodobacter spheroid 2.4.1 species was incubated at 250 ° C and 180 rpm for 60 hours using 250 mL sistrom's medium (see Table 4) in a carbon dioxide incubator with 5% CO2 supply and fluorescent light irradiation (15 W / m 2 ). It was. In addition, in order to confirm the effect of immobilized carbonic anhydrase on Rhodobacter spheroid growth, 50 mg and 100 mg of carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nanofibers were added to the culture medium, followed by 30 ° C. and 180 ° C. using a carbon dioxide incubator. Incubated for 60 hours at the same conditions of rpm. In addition, as a control, pure PS / PSMA nanofibers in which carbonic anhydrase was not immobilized were added and then cultured under the same conditions. Microbial cell growth was measured at absorbance at 600 nm and converted to dry cell weight by creating a reference curve between absorbance-based cell growth value and dry cell weight. As a result, the experimental group in which only Rhodobacter spheroid itself was cultured and the experimental group containing only PS / PSMA nanofibers used as a control group showed similar cell dry weight at the same incubation time. However, 48 hours after cultivation in 50 mg and 100 mg carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nanofibers, the cell dry weight was 1.934 g / L and 2.070 g / L, respectively. The cell dry weight of the experimental group to which only pure PS / PSMA nanofibers were added as a control for the cultured experimental group and the immobilized carbonic anhydrase was 1.560 g / L and 1.564 g / L, respectively. It was confirmed that the higher the cell dry weight in the culture conditions to which more immobilized carbonic anhydrase was added (see Fig. 6).

KH2PO4KH2PO4 2.72 g2.72 g (NH4)2SO4(NH4) 2SO4 0.5 g0.5 g Succinic acidSuccinic acid 4 g4 g L-Glutamic acidL-Glutamic acid 0.1 g0.1 g L-Aspartic acidL-Aspartic acid 0.04 g0.04 g NaClNaCl 0.5 g0.5 g Nitrilotriacetic acidNitrilotriacetic acid 0.2 g0.2 g MgSO4 7H2OMgSO4 7H2O 0.3 g0.3 g CaCl2 2H2OCaCl2 2H2O 0.033 g0.033 g FeSO4 7H2OFeSO4 7H2O 0.002 g0.002 g (NH4)6Mo7O24(1%solution)(NH4) 6Mo7O24 (1% solution) 0.02 mL0.02 mL Trace Elements Solution/100 mLTrace Elements Solution / 100 mL EDTAEDTA 1.765 g1.765 g 0.1 mL0.1 mL ZnSO4 7H2OZnSO4 7H2O 10.95 g10.95 g FeSO4 7H2OFeSO4 7H2O 5 g5 g MnSO4 H2OMnSO4 H2O 1.54 g1.54 g CuSO4 5H2OCuSO4 5H2O 0.392 g0.392 g Co(NO3)2 6H2OCo (NO3) 2 6H2O 0.248 g0.248 g H3BO3H3BO3 0.114g 0.114 g Vitamins Solution/100 mLVitamins Solution / 100 mL Nicotinic AcidNicotinic acid 1 g1 g 0.1 mL0.1 mL Thiamine HClThiamine HCl 0.5 g0.5 g BiotinBiotin 0.01 g0.01 g 최종 부피Final volume 1 L1 L

실시예 8: 로도박터 스페로이드의 성장 증가 유지를 위한 고정화 탄산무수화 효소의 재사용 가능성 평가 Example 8 Evaluation of Reusability of Immobilized Carbonic Anhydrase to Maintain Increased Growth of Rhodobacter Spheroid

로도박터 스페로이드 배양액에 첨가한 고정화 탄산무수화 효소의 로도박터 스페로이드 성장 증가를 위한 재사용 가능성을 확인하기 위하여 상기 실시예 7 에서 실시한 로도박터 스페로이드 배양 조건과 동일한 조건에서 100 mg의 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가하고 30℃, 180 rpm 조건으로 48 시간 배양하였다. 또한 고정화 탄산무수화 효소 첨가에 따른 세포성장률의 증가를 확인하기 위해 탄산무수화 효소가 고정화되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건을 대조군으로 이용하였다. 48 시간 배양 후 흡광도 600 nm 측정에 의한 세포건조중량을 측정하였다. 또한 무균실험대(clean bench) 내에서 로도박터 스페로이드 배양액으로부터 사용한 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 회수하고 10 mL의 10 mM 소디엄 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer)(pH 8.0)로 각각 3회 세척하였다. 세척을 마친 탄산무수화 효소 고정화 PS/PSMA 나노섬유는 새로운 배양액에 첨가된 후 48시간 동안 배양하였다. 48 시간 배양을 마친 배양액의 흡광도 600 nm 측정을 통해 세포건조중량으로 변환하였으며, 이와 같은 배양과정을 통한 고정화 탄산무수화 효소의 재사용을 총 30회 반복하였다. 그 결과 PS/PSMA 나노섬유로 고정화된 탄산무수화 효소의 실제 배양액을 대상으로 한 로도박터 스페로이드의 세포건조중량 측정에서 총 30회의 재사용 후에도 최초 로도박터 스페로이드 세포건조중량의 약 86.7%을 유지함을 확인하였다. 이는 고정화 탄산무수화 효소를 첨가한 실험군이 대조군으로 사용된 효소가 고정화되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유만을 첨가한 배양 조건보다 총 30회의 재사용 후에도 약 13％ 이상 로도박터 스페로이드의 성장률을 유지함을 확인하였다(도 7 참고). In order to confirm the reusability of the Rhodobacter spheroid growth of the immobilized carbonic anhydrase added to the Rhodobacter spheroid culture, 100 mg of carbonic anhydride under the same conditions as the Rhodobacter spheroid culture in Example 7 Enzyme immobilized PS / PSMA nanofibers were added and incubated at 30 ° C. and 180 rpm for 48 hours. In addition, in order to confirm the increase in cell growth rate according to the addition of immobilized carbonic anhydrase, the culture conditions in which pure PS / PSMA nanofibers without carbonic anhydrase were immobilized were used as a control. After 48 hours of incubation, the cell dry weight was measured by measuring the absorbance at 600 nm. In addition, the used carbonic anhydrase immobilized PS / PSMA nanofibers were recovered from Rhodobacter spheroid culture in a clean bench, and each of 10 mL of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) was used. Washed twice. The washed carbonic anhydrase immobilized PS / PSMA nanofibers were added to fresh culture and incubated for 48 hours. After 48 hours of incubation, the absorbance of the culture medium was converted to dry cell weight by measuring the absorbance at 600 nm, and the reuse of the immobilized carbonic anhydrase was repeated for 30 times. As a result, the cell dry weight measurement of Rhodobacter spheroid in the actual culture of carbonic anhydrase immobilized with PS / PSMA nanofibers maintained about 86.7% of the original Rhodobacter spheroid cell dry weight after 30 total reuses. It was confirmed. This suggests that the experimental group to which immobilized carbonic anhydrase was added maintained the growth rate of Rhodobacter spheroid after about 30 times of reuse compared to the culture condition to which only the pure PS / PSMA nanofiber without the immobilized enzyme was used as a control. It was confirmed (see FIG. 7).

실시예 9: 고정화 탄산무수화 효소를 활용한 로도박터 스페로이드 유래 생리활성물질 생산량 증가 확인Example 9 Confirmation of Increased Production of Rhodobacter spheroid-derived Bioactive Material Using Immobilized Carbonic Anhydrase

9.1 고정화 탄산무수화 효소를 활용한 로도박터 스페로이드 유래 카로테노이드 생산량 증가 확인9.1 Confirmation of Rhodobacter spheroid-derived carotenoid production using immobilized carbonic anhydrase

광합성 미생물인 로도박터 스페로이드의 배양과정에 고정화 탄산무수화 효소를 첨가하여 이산화탄소의 중탄산염으로의 전환을 통한 미생물 성장 증진 및 이를 통한 로도박터 스페로이드 유래 생리활성 물질인 카로테노이드의 생산량 증가 여부를 확인하였다. 상기 실시예 7의 로도박터 스페로이드 배양과 동일한 조건으로 (i) 로도박터 스페로이드 순수 배양, (ⅱ) 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유 100 mg 첨가, (ⅲ) 탄산무수화 효소가 고정화 되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유 100 mg 첨가, 이상 3개의 실험군을 대상으로 총 60시간 동안 매 12시간 마다 로도박터 스페로이드의 세포건조중량 및 카로테노이드 생산량을 측정하였다. 카로테노이드 생산량 측정을 위해 회수된 각각의 배양액을 13,000 rpm, 20분 동안 원심분리 후 세포를 멸균수로 3회 세척하고 -50℃, 48시간 동안 동결 건조하였다. 건조된 세포에 1 mL의 아세톤 첨가하고 반응 튜브를 28℃ 항온 수조에서 30 분간 방치하였다. 그 후 시료를 회수하고 13,000 rpm, 30분 동안 원심분리하여 상층액만을 회수 하였다. 회수된 상층액은 UV 분광광도계를 통해 480nm에서 흡광도 측정하였으며, 아래의 식에 대입하여 카로테노이드 함량을 확인하였다.
Immobilized carbonic anhydrase was added to the culture process of Rhodobacter spheroid, a photosynthetic microorganism, to increase microbial growth by converting carbon dioxide to bicarbonate and to increase the production of carotenoids, a bioactive substance derived from Rhodobacter spheroid. . Under the same conditions as the Rhodobacter spheroid culture of Example 7, (i) pure Rhodobacter spheroid culture, (ii) 100 mg of carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nanofiber, and (iii) no carbonic anhydrase was immobilized The total dry weight and carotenoid production of Rhodobacter spheroids were measured every 12 hours for a total of 60 hours. Each culture solution recovered for carotenoid production was centrifuged at 13,000 rpm for 20 minutes, and the cells were washed three times with sterile water and lyophilized at -50 ° C for 48 hours. 1 mL of acetone was added to the dried cells, and the reaction tube was allowed to stand for 30 minutes in a 28 ° C constant temperature water bath. After that, the sample was collected and centrifuged for 30 minutes at 13,000 rpm to recover only the supernatant. The recovered supernatant was measured for absorbance at 480 nm through a UV spectrophotometer, and the carotenoid content was confirmed by substituting the following equation.

카로테노이드함량(㎍/g) Carotenoid content (㎍ / g)

= 1000(480nm에서의 흡광도)(희석배율)(아세톤 양)/0.16(세포건조중량)
= 1000 (absorbance at 480 nm) (dilution factor) (acetone amount) / 0.16 (cell dry weight)

그 결과 로도박터 스페로이드 순수 배양과 탄산무수화 효소가 고정화 되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서의 매 측정시간 별 카로테노이드 생산량은 비슷한 경향을 보였으며, 이와 비교하여 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가 배양 조건에서의 카로테노이드 생산량은 측정된 전체 시간에서 로도박터 스페로이드 순수 배양과 순수 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서보다 높은 생산량을 나타냈다. 특히, 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서의 60 시간 째의 카로테노이드 생산량은 동일한 시간의 다른 배양 조건과 비교하여 약 33％ 이상의 카로테노이드 생산량 증가를 나타내었다(도 8의 패널 (a) 참고).
As a result, the carotenoids produced at each measurement time showed similar tendency in Rhodobacter spheroid pure culture and incubated condition in which pure PS / PSMA nanofibers without immobilized carbonic anhydrase were immobilized. The carotenoid yield in the culture conditions with the addition of PS / PSMA nanofibers was higher than the Rhodobacter spheroid cultivation and the culture conditions with the addition of pure PS / PSMA nanofibers at the total time measured. In particular, the carotenoid yield at 60 hours in the culture conditions added with carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nanofibers showed an increase in carotenoid yield of at least about 33% compared to other culture conditions at the same time (Panel of FIG. 8 ( a) Note).

9.2 고정화 탄산무수화 효소를 활용한 로도박터 스페로이드 유래 박테리오클로로필 생산량 증가 확인9.2 Enhancement of Rhodobacter spheroid-derived bacteriochlorophyll production using immobilized carbonic anhydrase

광합성 미생물인 로도박터 스페로이드의 배양과정에 고정화 탄산무수화 효소를 첨가하여 이산화탄소의 중탄산염으로의 전환을 통한 미생물 성장 증진 및 이를 통한 로도박터 스페로이즈 유래 생리활성 물질인 박테리오클로로필의 생산량 증가 여부를 확인하였다. 상기 실시예 7의 로도박터 스페로이드 배양 조건과 동일한 조건으로 (i) 로도박터 스페로이드 순수 배양, (ⅱ) 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유 100 mg 첨가, (ⅲ) 탄산무수화 효소가 고정화 되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유 100 mg 첨가, 이상 3개의 실험군을 대상으로 총 60 시간 동안 매 12시간 마다 로도박터 스페로이드의 세포건조중량 및 박테리오클로로필 생산량을 측정하였다. 박테리오클로로필 생산량 측정을 위해 회수된 각 시료 별 배양액 10 mL을 13,000 rpm, 10 분 동안 원심분리 후 세포만을 회수하고, 아세톤 : 메탄올 : 배지 = 7 : 2 : 1의 비율로 넣어준 뒤 빛을 차단시키고 1 시간 동안 상온에서 반응 후에 770 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도 값을 각 시료별 세포건조중량으로 나누어 환산하였다. 그 결과 로도박터 스페로이드 순수 배양과 탄산무수화 효소가 고정화 되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서의 매 측정 시간 별 박테리오클로로필 생산량은 비슷한 경향을 보였으며, 이와 비교하여 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가 배양 조건에서의 박테리오클로로필 생산량은 측정된 전체 시간에서 로도박터 스페로이드 순수 배양과 순수 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서보다 높은 생산량을 나타냈다. 특히 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가 배양 조건에서의 24 시간째의 박테리오클로로필 생산량은 동일한 시간의 다른 배양 조건과 비교하여 약 48％ 이상의 박테리오클로로필 생산량 증가를 나타내었다 (도 8의 패널 (b) 참고).
Enhancement of microbial growth through the conversion of carbon dioxide to bicarbonate by adding immobilized carbonic anhydrase to the cultivation of Rhodobacter spheroid, a photosynthetic microorganism, and confirming the increase in the production of bacteriochlorophyll, a bioactive substance derived from Rhodobacter spheroids It was. (I) pure Rhodobacter spheroid culture, (ii) 100 mg of carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nanofibers, and (iii) carbonic anhydrase immobilized under the same conditions as the Rhodobacter spheroid culture conditions of Example 7 The total dry weight and bacteriochlorophyll production of Rhodobacter spheroids were measured every 12 hours for a total of 60 hours. In order to measure the production of bacteriochlorophyll, 10 mL of the culture solution for each sample was collected and centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. Only the cells were recovered, and acetone: methanol: medium = 7: 2: 1 was added to block the light. After the reaction at room temperature for 1 hour, the absorbance was measured at 770 nm, and the measured absorbance value was divided by the cell dry weight of each sample. As a result, the production of bacteriochlorophyll was similar for each measurement time in the Rhodobacter spheroid pure culture and the culture condition in which the pure PS / PSMA nanofiber without immobilization of carbonic anhydrase was added. The production of bacteriochlorophyll in the culture conditions with the immobilized PS / PSMA nanofibers was higher than that under the Rhodobacter spheroid pure culture and the culture conditions with the pure PS / PSMA nanofibers. In particular, the production of bacteriochlorophyll at 24 hours under culturing of carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nanofibers showed an increase in the production of bacteriochlorophyll by at least about 48% compared to other culture conditions at the same time (FIG. b) Note).

9.3 고정화 탄산무수화 효소를 활용한 로도박터 스페로이드 유래 코엔자임 Q 10 생산량 증가 확인9.3 Enhancement of Rhodobacter spheroid-derived coenzyme Q 10 production using immobilized carbonic anhydrase

광합성 미생물인 로도박터 스페로이드의 배양 과정에 고정화 탄산무수화 효소를 첨가하여 이산화탄소의 중탄산염으로의 전환을 통한 미생물 성장 증진 및 이를 통한 로도박터 스페로이드 유래 생리활성 물질인 코엔자임 Q 10의 생산량 증가 효과 여부를 확인하였다. 상기 실시예 7의 로도박터 스페로이드 배양과 동일한 조건으로 (ⅰ) 로도박터 스페로이드 순수 배양, (ⅱ) 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유 100 mg 첨가, (ⅲ) 탄산무수화 효소가 고정화 되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유 100 mg 첨가, 이상 3 개의 실험군을 대상으로 총 60 시간 동안 매 12 시간 마다 로도박터 스페로이드의 세포건조중량 및 코엔자임 Q 10 생산량을 측정하였다. 각 시료별 생산된 코엔자임 Q 10의 농도는 고성능액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)분석을 통해 측정하였다. 각 시료별 10 mL의 배양액을 13,000 rpm, 20분 동안 원심분리 후 세포만을 회수하고 클로로폼과 메탄올이 2:1 비율로 혼합된 추출용액 10 mL을 첨가 후 상온에서 180 rpm 조건으로 2 시간 동안 교반하였다. 반응을 마친 각각의 시료는 0.2 ㎛ 필터 막을 이용하여 필터 후 HPLC로 분석하였다. 그 결과 로도박터 스페로이드 순수 배양과 탄산무수화 효소가 고정화 되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서의 매 측정 시간 별 코엔자임 Q 10 생산량은 비슷한 경향을 보였으며, 이와 비교하여 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서의 코엔자임 Q10 생산량은 측정된 전체 시간에서 로도박터 스페로이드 순수 배양과 순수 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서보다 높은 생산량을 나타냈다. 특히 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서의 60 시간째의 코엔자임 Q 10 생산량은 동일한 시간의 다른 배양 조건과 비교하여 약 34％ 이상의 코엔자임 Q 10 생산량 증가를 나타내었다(도 8의 패널 (c) 참고).
Enhancement of microbial growth through the conversion of carbon dioxide to bicarbonate by the addition of immobilized carbonic anhydrase in the culture process of Rhodobacter spheroid, a photosynthetic microorganism, and the effect of increased production of coenzyme Q 10, a bioactive substance derived from Rhodobacter spheroid It was confirmed. Under the same conditions as the Rhodobacter spheroid culture of Example 7, (i) pure Rhodobacter spheroid culture, (ii) adding 100 mg of carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nanofibers, and (iii) no carbonic anhydrase was immobilized The total dry weight of Rhodobacter spheroid and coenzyme Q 10 production were measured every 12 hours for a total of 60 hours. The concentration of coenzyme Q 10 produced for each sample was measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis. Centrifuge 10 mL of each sample for 13,000 rpm for 20 minutes, recover only cells, add 10 mL of an extract solution mixed with chloroform and methanol in a 2: 1 ratio, and stir at 180 rpm at room temperature for 2 hours. It was. Each sample after the reaction was analyzed by HPLC after filtering using a 0.2 μm filter membrane. As a result, the production of coenzyme Q 10 was similar in each measurement time in the Rhodobacter spheroid pure culture and in the culture condition in which the pure PS / PSMA nanofiber without immobilization of carbonic anhydrase was added. Coenzyme Q10 yield in culture conditions with hydration immobilized PS / PSMA nanofibers was higher than in Rhodobacter spheroid cultivation and culture conditions with pure PS / PSMA nanofibers at all times measured. In particular, the production of coenzyme Q 10 at 60 hours in the culture condition to which the carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nanofibers were added showed an increase in coenzyme Q 10 production of about 34% or more compared to other culture conditions at the same time (FIG. 8). See panel (c)).

9.4 고정화 탄산무수화 효소를 활용한 로도박터 스페로이드 유래 포르피린 생산량 증가 확인9.4 Increased Rhodobacter spheroid-derived porphyrin production using immobilized carbonic anhydrase

광합성 미생물인 로도박터 스페로이드의 배양과정에 고정화 탄산무수화 효소를 첨가하여 이산화탄소의 중탄산염으로의 전환을 통한 미생물 성장 증진 및 이를 통한 로도박터 스페로이드 유래 생리활성 물질인 포르피린의 생산량 증가 여부를 확인하였다. 상기 실시예 7의 로도박터 스페로이드 배양조건과 동일한 조건으로 (ⅰ) 로도박터 스페로이드 순수 배양, (ⅱ) 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유 100 mg 첨가, (ⅲ) 탄산무수화 효소가 고정화 되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유 100 mg 첨가, 이상 3 개의 실험군을 대상으로 총 60 시간 동안 매 12 시간 마다 로도박터 스페로이드의 세포건조중량 및 포르피린 생산량을 측정하였다. 각 시료별로 생산된 포르피린의 농도는 고성능액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)분석을 통해 측정하였다. 각각의 조건 별 시료로부터 포르피린 농도 측정을 위해 에틸아세테이트를 사용하여 전체 포르피린을 추출하였으며, 추출된 각 시료별 포르피린 농도를 세포건조중량으로 나누어 환산하였다. 그 결과, 로도박터 스페로이드 순수 배양과 탄산무수화 효소가 고정화 되지 않은 순수 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서의 매 측정 시간 별 포르피린 생산량은 비슷한 경향을 보였으며, 이와 비교하여 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가 배양 조건에서의 포르피린 생산량은 측정된 전체 시간에서 로도박터 스페로이드 순수 배양과 순수 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서보다 높은 생산량을 나타냈다. 특히, 탄산무수화 고정화 PS/PSMA 나노섬유를 첨가한 배양 조건에서의 24 시간째의 포르피린 생산량은 동일한 시간의 다른 배양 조건과 비교하여 약 65％ 이상의 포르피린 생산량 증가를 나타내었다(도 8의 패널 (d) 참고).
Immobilized carbonic anhydrase was added to the culture process of Rhodobacter spheroid, a photosynthetic microorganism, to increase microbial growth by converting carbon dioxide to bicarbonate, and to confirm whether the production of Rhodobacter spheroid-derived physiologically active porphyrin was increased. . (Iii) pure Rhodobacter spheroid culture, (ii) 100 mg of carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nanofibers, and (iii) carbonic anhydrase immobilized under the same conditions as the Rhodobacter spheroid culture conditions of Example 7 The total dry weight and porphyrin production of Rhodobacter spheroids were measured every 12 hours for a total of 60 hours with 100 mg of untreated pure PS / PSMA nanofibers. The concentration of porphyrin produced by each sample was measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis. The total porphyrin was extracted using ethyl acetate to measure the porphyrin concentration from each sample, and the porphyrin concentration for each sample extracted was divided by the dry cell weight. As a result, porphyrin production tended to be similar at each measurement time in Rhodobacter spheroid pure culture and culture condition in which pure PS / PSMA nanofiber without immobilized carbonic anhydrase was added. Porphyrin production in the culture conditions added with immobilized PS / PSMA nanofibers showed higher yields than the Rhodobacter spheroid cultivation and culture conditions with pure PS / PSMA nanofibers at all times measured. In particular, the porphyrin production at 24 hours in the culture conditions added with carbonic anhydride immobilized PS / PSMA nanofibers showed an increase in porphyrin production of at least about 65% compared to other culture conditions at the same time (Panel of FIG. 8 ( d) Note).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

Claims (14)

다음의 단계를 포함하는 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물) 나노섬유에 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)를 고정화시키는 방법:
(a) 폴리스티렌 및 폴리(스티렌-co-말레산무수물)을 용매에 첨가하여 폴리머 용액을 준비하는 단계;
(b) 상기 준비된 폴리머 용액을 전기방사 방법을 통해 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 제조된 PS/PSMA 나노섬유에 공유결합 기반 가교효소응집(Cross-Linked Enzyme Aggregation, CLEA) 방법을 통해 탄산무수화효소를 고정화시키는 단계.
A method of immobilizing carbonic anhydrase on polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) nanofibers comprising the following steps:
(a) adding polystyrene and poly (styrene-co-maleic anhydride) to a solvent to prepare a polymer solution;
(b) preparing polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofibers by electrospinning the prepared polymer solution; And
(c) immobilizing the carbonic anhydrase to the PS / PSMA nanofibers prepared by a cross-linked enzyme aggregation (CLEA) method.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 공유결합 기반 가교효소응집(CLEA) 방법은 다음의 단계를 포함하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a') 탄산무수화효소가 포함된 용액에 PS/PSMA 나노섬유를 혼합하여 교반하는 단계; 및
(b') 상기 단계 (a')를 행한 반응액에 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액을 첨가한 후 교반하는 단계.
The method of claim 1, wherein the covalent bond-based crosslinking enzyme (CLEA) method of step (c) comprises the following steps:
(a ') mixing PS / PSMA nanofibers with a solution containing carbonic anhydrase; And
(b ') adding a glutaraldehyde solution to the reaction solution in which step (a') is carried out and then stirring.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 용매는 디메틸설폭사이드(DMSO, dimethylsulfoxide), 다이클로로메탄, 테트라하이드로퓨란(THF, tetrahydrofuran), 클로로포름, 헥산, 톨루엔 또는 디메틸아세트아미드인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the solvent in step (a) is dimethyl sulfoxide (DMSO, dimethylsulfoxide), dichloromethane, tetrahydrofuran (THF, tetrahydrofuran), chloroform, hexane, toluene or dimethylacetamide, characterized in that How to.
제 1 항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 β형 탄산무수화 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the carbonic anhydrase is a β-type carbonic anhydrase derived from Rhodobacter sphaeroides .
탄산무수화 효소가 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 고정화된 것을 특징으로 하는 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체.
A carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber composite, wherein the carbonic anhydrase is immobilized to a polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofiber.
제 5 항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체는 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항 기재 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 복합체.
The complex according to claim 5, wherein the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex is prepared by the method according to any one of claims 1 to 4.
다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 광합성 미생물의 배양 방법:
(a'') 탄산무수화 효소가 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 고정화된 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 준비하는 단계; 및
(b'') 상기 준비된 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 광합성 미생물이 접종된 배지에 첨가하여 배양하는 단계.
A method for culturing photosynthetic microorganisms, comprising the following steps:
(a '') preparing a carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex in which a carbonic anhydrase is immobilized to a polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofiber; And
(b '') culturing by adding the prepared carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex to the medium inoculated with photosynthetic microorganisms.
제 7 항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체는 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항 기재 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
8. The method of claim 7, wherein the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex is prepared by the method of any one of claims 1-4.
제 7 항에 있어서, 상기 광합성 미생물은 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)인 것을 특징으로 하는 방법.
8. The method of claim 7, wherein said photosynthetic microorganism is Rhodobacter sphaeroides .
다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래 생리활성물질의 생산량을 증가시키는 방법:
(a''') 탄산무수화 효소가 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 고정화된 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 준비하는 단계; 및
(b''') 상기 단계 (a''')의 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 로도박터 스페로이드가 접종된 배지에 첨가한 후 배양하는 단계.
Rhodobacter sphaeroides ( Rhodobacter sphaeroides ) derived from the method for increasing the production of bioactive material comprising the following steps:
(a ''') preparing a carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex in which the carbonic anhydrase is immobilized to a polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofiber; And
(b ''') adding the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex of step (a''') to a medium inoculated with Rhodobacter spheroid and culturing.
제 10 항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체는 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항 기재 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
11. The method of claim 10, wherein the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex is prepared by the method of any one of claims 1-4.
제 10 항에 있어서, 상기 생리활성물질은 카로테노이드, 박테리오클로로필, 코엔자임 Q 10 또는 포르피린인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 10, wherein the bioactive material is a carotenoid, bacteriochlorophyll, coenzyme Q 10 or porphyrin.
다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이산화탄소의 제거 또는 전환 방법:
(i) 탄산무수화 효소가 폴리스티렌/폴리(스티렌-co-말레산 무수물)(PS/PSMA) 나노섬유에 고정화된 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 준비하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 단계 (ⅰ)의 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체를 이산화탄소와 접촉시키는 단계.
Method of removing or converting carbon dioxide, comprising the following steps:
(i) preparing a carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex in which the carbonic anhydrase is immobilized to polystyrene / poly (styrene-co-maleic anhydride) (PS / PSMA) nanofibers; And
(Ii) contacting the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex of step (iii) with carbon dioxide.
제 13 항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소-PS/PSMA 나노섬유 복합체는 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항 기재 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 13, wherein the carbonic anhydrase-PS / PSMA nanofiber complex is prepared by the method according to any one of claims 1 to 4.
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KR20180001046A (en) * 2016-06-24 2018-01-04 고려대학교 산학협력단 Carbon dioxide conversion reactor, series reactors for carbon dioxide conversion and capture, and carbon dioxide conversion process using series reactors
KR20180072646A (en) * 2018-06-21 2018-06-29 고려대학교 산학협력단 Carbon dioxide conversion reactor, series reactors for carbon dioxide conversion and capture, and carbon dioxide conversion process using series reactors

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