KR20130004794A

KR20130004794A - 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 분리막, 그 제조방법 및 이를 이용한 수처리 공정

Info

Publication number: KR20130004794A
Application number: KR1020110066073A
Authority: KR
Inventors: 이정학; 김재혁
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-07-04
Filing date: 2011-07-04
Publication date: 2013-01-14
Also published as: KR101246117B1

Abstract

본 발명은 생물막 형성을 억제할 수 있는 생물막 형성 억제 효소를 피처리수측의 표면에 고정화시킨 분리막을 이용하여 효소의 유실 내지는 비활성화 없이 안정적으로 분리막 수처리 공정을 운전하기 위한 기술에 관한 것이다.
본 발명은 피처리수와 접촉하는 표면에 생물막 형성 억제 효소 및 상기 효소의 고정용의 수용성 고분자의 결합체가 형성되어 있는 수처리용 분리막을 제공하고, 또한 상기 분리막의 제조방법으로서 수용성 고분자의 수용액을 제조하는 단계; 상기 수용성 고분자의 수용액에 생물막 형성 억제 효소를 혼합하여 생물막 형성 억제 효소와 수용성 고분자의 응집체를 형성하는 단계; 분리막에 상기 응집체를 포함하는 수용액을 여과시켜서 분리막의 피처리수측의 표면에 생물막 형성 억제 효소와 수용성 고분자의 응집체를 배치시키는 단계; 및 상기 응집체가 배치된 분리막 표면에 가교제를 반응시켜서 상기 생물막 형성 억제 효소와 상기 수용성 고분자를 화학적으로 결합시키는 단계를 포함하는 수처리용 분리막의 제조방법을 제공하며, 또한 상기 분리막을 이용한 수처리 공정을 제공한다.

Description

생물막 형성 억제 효소가 고정화된 분리막, 그 제조방법 및 이를 이용한 수처리 공정 {Membrane with immobilized enzyme for inhibiting biofilm formation, process for preparing the same and water treatment process using the same}

본 발명은 분리막을 이용한 수처리 공정의 운전 중에 분리막 표면에서 성장하여 생물막오염 (membrane biofouling) 문제를 일으키는 생물막 (biofilm) 형성을 억제하는 기술에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생물막 형성을 억제할 수 있는 생물막 형성 억제 효소 (예컨대, 정족수 감지 억제 효소)를 피처리수측의 표면에 고정화시킨 분리막을 이용하여 효소의 유실 내지는 비활성화 없이 안정적으로 분리막 수처리 공정을 운전하기 위한 기술에 관한 것이다.

최근 수자원 부족 및 수질 악화가 심화됨에 따라 수처리 기술에 대한 수요는 세계적으로 급증하고 있다. 이러한 기대에 부응하는 수처리 기술의 하나로서, 해수담수화 및 정수처리에 이용되는 역삼투/나노여과 공정과 하폐수 처리에 이용되는 분리막 생물반응조(Membrane bioreactor, MBR) 공정을 포함하는 분리막 여과 공정은 처리의 연속성과 공정의 간편성, 높은 처리효율 등의 장점들 때문에 특별히 많은 관심과 연구의 대상이 되고 있다. 실제로 McIlvaine 사에서 2008 년에 발표한 바에 의하면, 세계 역삼투막 시장규모는 2008년 38억 달러에서 2012년 56억 달러까지 증가할 것이라 예상하고 있으며, 국제 MBR 시장규모 또한 2008년 2억 9600만 달러에서 2013년에는 4억 8800만 달러까지 증가할 것으로 내다보고 있다 (BCC research, 2008).

그러나, 해수, 정수, 하폐수 등을 대상으로 하는 모든 분리막 수처리 공정에 있어서는, 분리막 표면에 미생물이 부착 성장하여서 생물막(biofilm)이 형성되고 이로 인하여 막오염(membrane fouling)이 유발되어 투수도를 감소시키고, 분리막의 세정·교체 시기를 단축시키며 이로 인해 운전 및 유지 비용을 증가시킨다는 등의 문제점이 있다 (도 1 참조).

이와 같은 고질적인 생물막오염 문제의 해결을 위해 다양한 물리적인 방법(예컨대, 폭기 등을 통한 전단력 증가에 의한 생물막 탈리유도 혹은 역세척)이나 화학적 방법(예컨대, 고분자 응집제의 주입에 의한 입자크기 증가 혹은 분리막 표면의 개질을 통한 친수성 증가)들이 연구되어 왔지만, 미생물의 생장에 필요한 수분과 양분이 어디에나 존재하는 수처리 공정의 특성과 분리막의 여과 방향으로 구동력(driving force)이 존재하는 분리막 공정의 특성과, 일단 형성되면 외부의 물리/화학적 충격에 높은 내성을 가지는 생물막 자체의 특성상 지금까지 만족할 만한 수준의 해결책이 제시되고 있지 않다. 이는, 미생물이 기본이 되는 생물막이라는 복잡한 생물학적 구조를 스케일링이나 유기물 흡착과 같이 단순한 하나의 오염물질로 간주하고 물리/화학적인 방법론에서 해결하고자 접근하였기 때문이며, 생물막오염 현상의 근본적인 해결을 위해서는 미생물의 특성에 대한 이해와 이를 바탕으로 한 생물학적 접근법이 절실한 실정이다.

미생물들은 온도, pH, 양분 등 여러 가지 주위 환경의 변화에 반응하여 특정 신호분자를 합성하고 이를 세포 외로 배출/흡수하는 방법으로 주변의 세포 밀도를 인지한다. 세포의 증식에 의해 세포 밀도가 증가하여 외부의 신호분자의 농도가 일정수준에 이르게 되면 특정 유전자의 발현이 시작되고 그 결과 미생물 집단의 표현형(phenotype)이 조절(group behavior regulation) 되는데, 이를 "정족수 감지 혀상(quorum sensing phenomena)"이라고 하며, 일반적으로 세포의 밀도가 높은 환경 하에서 발생한다. 이러한 정족수 감지 현상의 대표적인 예로는, 공생(symbiosis), 감염(virulence), 경쟁(competition), 접합(conjugation), 항생제 생산(antibiotic production), 운동성(motility), 포자형성(sporulation), 생물막 형성(biofilm formation) 등이 보고되고 있다(Fuqua et al., Ann. Rev. Microbiol., 2001, Vol. 50, pp.725~751).

특히, 부유상에 비해 세포 밀도가 월등히 높은 생물막 조건에서 미생물의 정족수 감지 기작은 보다 쉽고 활발하게 발생할 수 있다. 1998년 Davies등(Science, Vol. 280, pp.295~298)에 의해 이러한 미생물 정족수 감지 기작이 병원성 미생물인 Pseudomonas aeruginosa의 생물막 형성의 진행 정도, 두께 및 형상(morphology)과 같은 물리적 구조 특성, 항생제 내성 등과 같은 생물막의 다양한 특성과 밀접한 관련성을 나타낸다고 보고된 이래 정족수 감지 기작의 인위적인 조절을 통하여 생물막 형성을 억제하는 연구가 최근에 의료 및 농업 등과　 같은 일부 분야에서 의료기기의 오염방지(Baveja et al., Biomaterials, 2004, Vol.50, pp.5003~5012)., 식물병(植物病) (Dong et al., Nature, 2001, Vol.411, pp.813~817)의 억제 등을 목적으로 이루어지고 있을 뿐이다.

미생물 정족수 감지 기작을 조절하여 생물막 형성을 억제하는 종래의 방법은 크게 다음의 두 가지로 분류된다. 첫째로, 정족수 감지 기작에 사용되는 신호분자와 비슷한 구조를 가지며 신호분자와 유전자 발현 부위를 놓고 경쟁관계에 있는 것으로 알려진 길항제(antagonist)를 투입하여 생물막 형성을 억제할 수 있는데, 가장 대표적인 길항제로는 적조류의 일종인 Delisea pulchra가 분비하는 푸라논(furanone) 및 그 할로겐화 유도체들이 보고되고 있다(Henzer et al., EMBO Journal, Vol.22, 3803~3815). 그렇지만 길항제의 특성상 이러한 분자들은 기작의 발현을 위해 세포 내부로의 침투가 필수적이며 이에 따라 용매에 용해된 상태로밖에 이용할 수 없어 회수 및 재이용이 불가능한 일회성 방법에 그친다는 단점이 있으며 또한 할로겐화 된 유도체들은 2차 오염물질로서 작용할 수 있다는 문제점이 있다. 둘째로, 정족수 감지 기작에 사용되는 신호분자를 분해하는 효소 (미생물 정족수 감지 억제 효소와 같은 생물막 형성 억제 효소) 내지는 그 효소를 생산하는 미생물 자체를 이용하여 생물막 형성을 억제할 수 있다. 예컨대, Xu 등(2004)은 그람 음성균의 신호분자인 아실-호모세린 락톤(acyl-homoserine lactone: AHL)을 분해하는 효소인 아실라제 용액을 주입하여 다양한 표면에서의 생물막 형성을 억제하는 방법을 개발한 바 있다(미국특허 제6,777,223호 공보). 그렇지만 상기 아실라제 효소용액을 직접 주입하여 생물막 형성을 억제할 경우 효소의 유실이 극심할 뿐 아니라 효소의 변성(Denaturation)에 의해 비활성화가 빠르게 진행되는 등 실용적인 측면에서 바람직하지 않다.

최근에는 자성을 띤 담체에 아실라제 효소를 적층법(Layer-by-layer)으로 고정화함으로써 효소의 변성에 의한 비활성화를 막는 동시에 자기장을 이용한 효소-고정화 자성 담체의 분리 및 회수를 용이하게 하여 침지형 분리막 생물 반응조(Submerged membrane bioreactor, sMBR)에 적용함으로써 분리막 표면의 생물막오염을 억제한 결과가 보고되었다 (등록특허 제981519호). 그러나 고농도의 미생물 플록이 존재하고, 또 이러한 플록들이 슬러지 체류시간(Sludge retention time)을 유지하기 위해 지속적으로 취출되는 MBR공정의 특성상, 자성을 띠고 있는 담체라 하더라도 플록에 섞여 있는 담체를 자기장으로만 전량 회수하는 데에는 실질적인 한계가 있다. 또한 이러한 자성 담체의 회수율을 극대화하기 위해서는 담체가 시스템 내부 (예컨대, 튜빙, 밸브, 피팅 등)를 순환하지 않고 반응조 내에서만 존재하는 침지형 반응조여야 하는데, 나노여과공정이나 역삼투막 공정과 같이 고압을 이용해야 하는 분리막 공정의 경우 대부분이 외부 가압형이기 때문에 효소 고정화 자성 담체를 적용하기가 곤란하다는 문제점이 있다.

본 발명의 목적은, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 분리막 수처리 공정에 있어서 생물막 형성 기작을 이해하여서 분자생물학적 관점에서 생물막 형성에 의한 막오염 현상을 완화시키기 위한 것이며, 생물막 형성 억제 효소를 분리막 표면에 고정화시켜서 생물막 형성 억제 효소의 유실 및 비활성화를 최소화하면서 분리막 표면에서의 생물막 형성에 따른 생물막 오염을 억제함으로써 분리막 수처리 공정을 향상된 여과 성능으로 장기간 안정적으로 운전할 수 있는 기술을 제공하기 위한 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 생물막 형성 억제 효소를 분리막 표면에 고정화시키는 접근법을 채택하기로 하고, 이와 관련된 연구를 수행하였다.

종래에 효소를 특정 지지체 (예컨대, 자성담체, 탄소섬유 등)에 고정화시키는 방법에는 물리적 흡착법, 적층법, 공유결합 형성 등의 방법이 있으나 이러한 방법들은 지지체의 비표면적이 비교적 넓은 다공성 담체이거나 지지체의 표면에 작용기가 높은 농도로 존재하는 경우, 또는 그 표면이 매우 소수성인 경우에 적용 가능한 방법인데, 분리막의 경우는 효소가 고정화될 수 있는 표면적이 한정되어 있고 작용기의 농도 또한 높지 않으며 효소 자체를 고농도로 비가역 흡착시킬 수 있을 정도로 소수성을 띠지는 않으므로 상기 방법들을 적용하기가 곤란하다. 가사, 상기 방법들을 적용하여 효소를 분리막 표면에 고정시키더라도 표면에 고정화되는 효소의 농도가 매우 낮아 효과적인 효소 활성을 기대하기 어렵다. 따라서 분리막과 같은 평면 형태의 지지체의 표면에 고농도의 효소를 고정화시키고자 할 경우에는, 효소들끼리 가교할 수 있는 불용성 고분자 물질을 유기용매 중에서 혼합하여 도포한 후 지지체의 표면에서 유기용매를 증발 등의 방법으로 제거함으로써 지지체 표면에 효소를 고정화하는 방법이 주로 이용된다. 그런데, 분리막은 대부분 유기 고분자 물질로 이루어져 있으므로 유기용매와의 접촉 시에 유기용매와의 반응에 의해 불안정성이 증가되며 효소 또한 유기용매와의 접촉 시에 비활성화가 되는 경향이 있으므로 상기 방법을 그대로 적용시키기는 곤란하다.

이에 본 발명자들은 분리막 표면에 생물막 형성 억제 효소를 고정화시키기 위한 새로운 연구를 거듭하였고, 그 결과 pH에 따라 용해도가 달라지는 수용성 고분자와 효소를 혼합하여 응집시킨 효소-고분자 응집체(aggregate) 혼합물의 수용액을 제조한 후에 효소를 고정화시키고자 하는 분리막을 통하여 상기 수용액을 여과시켜서 분리막의 표면에 효소-고분자 응집체 층을 형성시키고 상기 효소-고분자 응집체 층에 가교제를 반응시켜서 효소와 고분자 사이를 화학적으로 가교시켜서 효소-고분자 결합체를 형성시킴으로써 효소를 분리막 표면에 강고하게 고정화시킬 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 분리막 수처리 공정에서 분리막 표면의 생물막 오염을 억제하기 위하여 분리막에 직접 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 분리막, 상기 분리막을 제조하는 방법 및 상기 분리막을 이용한 수처리 공정을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 피처리수와 접촉하는 표면에 생물막 형성 억제 효소 및 상기 효소의 고정용의 수용성 고분자의 결합체가 형성되어 있는 수처리용 분리막에 관한 것이다.

본 발명에서 효소-고분자 결합체란, 생물막 형성 억제 효소의 작용기가 수용성 고분자 사슬에 존재하는 작용기와 화학적 결합으로 연결되어서 수용성 고분자 사이에 생물막 형성 억제 효소가 포획된 상태의 물질을 의미한다.

상기 생물막 형성 억제 효소로서는 생물막 형성을 억제하는 효소라면 특별한 제한은 없으며, 미생물의 정족수 감지 기작에 사용되는 신호분자를 제거하는 역할을 수행하는 정족수 감지 억제 효소로서 그람 음성세균의 신호분자의 일종인 아실-호모세린 락톤(Acyl-homoserine lactone, AHL)을 분해하는 아실라제(Acylase), 락토나제(Lactonase) 등의 효소를 사용할 수 있다.

생물막 형성 억제 효소를 수용성 고분자에 강하게 포획하여 고정화시키기 위해서는, 분리막 표면에 배치된 생물막 형성 억제 효소와 수용성 고분자가 가교제를 이용하여 서로 화학적으로 결합되어 있는 것이 바람직하다.

상기 수용성 고분자는 분자 내부에 효소 또는 가교제와의 화학적인 결합을 형성할 수 있는 작용기 (예컨대, 아민기 또는 카르복실기)를 가질 수 있는 것을 사용할 수 있다. 예컨대, 키토산, 3-아미노프로필트리에톡시실란 및 수용성 덴드리머 (dendrimer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 이루어진 아민기 함유 양이온성 화합물을 사용할 수 있으며, 키토산은 가격이 저렴하고 인체에 무해하다는 점에서도 바람직하다.

수용성 고분자로서 아민기 함유 양이온성 화합물을 사용하는 경우, 수용성 고분자 중의 아민기와 효소의 아민기와의 사이에 화학적인 결합을 형성할 수 있는 가교제를 사용할 수 있는데, 예컨대 글루타르알데히드 가교제는 수용성 고분자와 효소와의 사이에 이민 결합(-CH=N-)을 형성하여서 분리막 표면에 생물막 형성 억제 효소를 더욱 더 강고하게 고정시킬 수 있다는 점에서 바람직하다. 한편, 수용성 고분자로서 카르복실기 함유 화합물을 사용하는 경우에는, 수용성 카르보디이미드 (WSC), 수용성 카르보디이미드 (WSC) / N-히드록시숙신이미드(NHS) 등과 같이 수용성 고분자 중의 카르복실기와 효소의 아민기 사이에 개재되지 않고 이들을 직접 연결(커플링)시키기 위한 가교제를 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 수용성 고분자의 수용액을 제조하는 단계; 상기 수용성 고분자의 수용액에 생물막 형성 억제 효소를 혼합하여 생물막 형성 억제 효소와 수용성 고분자의 응집체를 형성하는 단계; 분리막에 상기 응집체를 포함하는 수용액을 여과시켜서 분리막의 피처리수측의 표면에 생물막 형성 억제 효소와 수용성 고분자의 응집체를 배치시키는 단계; 및 상기 응집체가 배치된 분리막 표면에 가교제를 반응시켜서 상기 생물막 형성 억제 효소와 상기 수용성 고분자를 화학적으로 결합시키는 단계를 포함하는 수처리용 분리막의 제조방법을 제공한다.

여기서, 수용성 고분자로서 양이온성 화합물을 사용하는 경우에는 수용성 고분자의 수용액에 알칼리를 투입하여 수용성 고분자의 전하를 중성으로 만들어서 수용성 고분자의 응집체를 형성하고 난 후에 생물막 형성 억제 효소를 혼합시킴으로써 생물막 형성 억제 효소와 수용성 고분자의 응집체를 보다 용이하게 제조할 수 있다. 알칼리 성분으로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 등의 통상적인 약품을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 분리막은 종래에 수처리용으로 사용되고 있는 외압형 및 침지형 등의 모듈의 모두에 적용할 수 있는 것이며, 역삼투막(RO), 나노여과막(NF), 한외여과막(UF), 정밀여과막(MF) 등 다양한 공경의 분리막에도 적용할 수 있다. 분리막의 재질에도 특별한 제한은 없으며, 효소-고분자 결합체가 효과적으로 형성될 수 있는 고분자 (예컨대, 폴리아미드 혹은 폴리술폰) 재질을 사용할 수 있다.

본 발명에 의하면, 생물막 형성 억제 효소가 피처리수측의 표면에 강고하게 고정화된 분리막을 용이하게 제조할 수 있으며, 이러한 분리막을 수처리 공정에 적용하면 분리막의 표면에서의 생물막 형성을 분자생물학적인 방법으로 억제하여서 투수율의 저하를 완화하는 동시에 기존의 분리막에 비하여 막세척 주기가 길어지고 세척약품의 소모량을 줄일 수 있고 장시간에 걸쳐서 여과 공정을 안정적으로 수행할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 종래의 고도 수처리용 분리막 공정 (외부 가압형 모듈)에 있어서 생물막 형성에 의한 막오염(biofouling) 문제를 나타낸 개념도이다.
도 2a는 종래의 수처리용 분리막의 표면에서 정족수 감지 기작에 의해서 체외 고분자 물질이 분출되고 생물막이 성장하는 것을 나타낸 개념도이다.
도 2b는 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 수처리용 분리막의 표면에서 정족수 감지 기작과 관련된 신호분자가 정족수 감지 억제 효소(생물막 형성 억제 효소)에 의해 분해되어 조절됨으로써 생물막 형성이 억제되는 것을 나타내는 개념도이다.
도 3은 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 수처리용 분리막의 제조방법의 실시형태를 나타내는 개념도이다.
도 4a 및 4b는 생물막 형성 억제 효소를 고정화하기 전후의 상용화된 폴리아미드(스킨) 재질의 나노여과막의 ATR-FTIR 측정 결과이다.
도 5는 종래의 나노여과막과 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막의 효소 활성도를 대표기질(N-acetyl-L-methionine)의 분해 속도로 살펴본 그래프이다.
도 6은 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막의 효소 활성의 안정성을 21회의 반복 활성 실험을 통하여 살펴본 그래프이다.
도 7은 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 분리막에 대하여 비가압 상태에서 분리막 표면에 형성되는 생물막의 구조와 구성을 살펴보기 위해 사용된 플로우 셀의 개략도이다.
도 8a 및 8b는 플로우 셀에서 5일간 운전 후 종래의 나노여과막과 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막의 표면에 형성된 PAO1 생물막의 3차원 이미지이다.
도 9a 및 9b는 플로우 셀 5일 운전 후 종래의 나노여과막과 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막의 표면에 형성된 PAO1 생물막의 세포와 체외 고분자 물질(EPS)의 높이에 따른 공극률 분포를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막의 생물막 오염 정도를 평가하기 위해 구성된 실험실 규모의 나노여과 수처리 공정의 개략도이다.
도 11은 종래의 나노여과막과 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막을 나노여과 수처리 공정에 적용한 결과, 운전시간에 따른 투수율의 경향를 나타내는 그래프이다.
도 12a 및 12b는 각각 종래의 나노여과막과 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막을 나노여과 수처리 공정에 적용하여 38시간의 운전 후 나노여과막의 표면에 형성된 PAO1 생물막의 3차원 이미지이다.

제조예 1 - 효소가 고정화된 분리막의 제작 및 물성 평가

도 3에는 수처리용 분리막의 일종인 나노여과막의 표면에 생물막 형성 억제 효소를 고정화시킨 본 발명의 수처리용 분리막의 제조방법의 실시형태가 나타나 있다. 보다 구체적으로, 1 중량% 아세트산 수용액에 키토산을 용해시켜서 얻은 키토산 수용액(키토산: 1 중량%) 400 μL를 30 mL의 초순수에 첨가한 후에 수산화나트륨(NaOH, 0.1 N)를 조금씩 첨가하며 pH를 10까지 올렸다. 이 때, 양이온성 고분자인 키토산 분자는 표면에 있는 수소이온이 떨어져 나가며 전하가 중성으로 변해서 키토산 분자들끼리 응집이 일어나게 되었다. 그 후 정족수 감지 억제 효소인 아실라제 용액(1000 mg/L) 2 mL를 첨가하고 5분간 교반하여 아실라제와 키토산 사이에 물리적인 응집이 일어나도록 하였다. 이렇게 형성된 용액을 나노여과막(NE4040-90 폴리아미드-폴리술폰 복합 분리막, Woongjin Co. Ltd.) 이 내부에 설치된 가압형 셀에 넣고 질소가스로 4 bar에서 완전히 여과시켜서 아실라제-키토산 응집체가 나노여과막의 표면에 물리적으로 부착되었다. 이어서, 가교제로서 글루타르알데히드(0.2 중량%) 용액 5 mL를 첨가하여 30분 동안 반응시킴으로써 키토산의 아민기와 아실라제의 아민기의 사이에 이민 결합이 형성되고 이에 따라 나노여과막 표면에는 아실라제와 키토산이 가교결합된 효소-고분자 결합체가 강고하게 고정화되었다.

위와 같은 방법으로 얻어진, 수처리용 분리막 자체의 투수율을 알아보기 위하여 초순수를 대상으로 하여 여과 실험을 수행하였는데, 분리막 자체의 투수율은 생물막 형성 억제 효소가 고정화되지 않은 종래의 분리막 대비 약 70~80% 수준으로 감소하였으며, 표면 전하는 종래의 분리막 (약 -80 mV)에 비하여 음전하가 감소되는 결과(약 -20 mV)를 나타내었다. 이것은, 효소-고분자 결합체가 분리막의 표면에 형성됨에 따라 분리막의 유효 공경 크기가 다소 감소되고 분리막 표면의 물리화학적 성질 또한 변화하기 때문인 것으로 사료된다.

또한 Attenuated Total Reflective Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) 분석 결과(도 4a 및 4b)를 보면 효소-고분자의 결합체의 형성 후에는 기존의 나노여과막에서의 특징적인 피크의 강도가 현저히 감소하는 대신 키토산의 특징적인 피크(950∼1200 cm^-1)와 아실라제의 펩티드 결합에 의한 아미드 I 피크 (C=O) 및 아미드 II 피크 (N-H)의 강도가 현저히 증가하였음을 확인할 수 있었으며 (도 4a), 2500~4000 cm^-1 영역에서는 키토산과 아실라제의 작용기에 해당하는 아민기, 히드록시기, 알칸기 등이 확인되었다 (도 4b).

실험예 1 - 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 수처리용 분리막의 효소 활성 및 안정성

생물막 형성 억제 효소가 고정화된 수처리용 분리막의 효소 활성과 안정성을 평가하기 위하여, 미생물의 신호분자인 AHL을 대신하는 대표기질로서 AHL과 그 분자구조가 매우 유사한 N-acetyl-L-methionine의 분해 속도와 반복실험에 따른 효소 활성의 저하도를 측정하였다. 도 5에서 보면, 아실라제가 고정화된 나노여과막은 기질을 빠른 속도(0.39 μM/min per cm² of membrane)로 분해하여서 높은 효소 활성을 나타내었다. 또한, 21회의 반복된 효소활성 평가실험과 세척과정에도 불구하고 제조된 분리막의 효소활성은 90%이상으로 유지되어 효소 활성의 안정성도 높게 나타났다 (도 6).

실시예 1 - 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 수처리용 분리막의 표면에 형성된 생물막의 구조와 구성 성분 분석

실제 분리막 공정에 적용하기에 앞서, 플로우 셀(Flow cell)을 이용하여 비가압 상태에서 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 수처리용 분리막의 표면에 생물막을 형성시킨 후 생물막의 구조와 구성성분을 분석함으로써 본 발명의 수처리용 분리막의 생물막 형성 억제 효과를 평가하였다.

도 7은 플로우 셀의 운전 개략도를 나타내고 있다. 플로우 셀의 두 채널 하부에 각각 74 mm × 24 mm 크기의 효소 고정화 전, 후의 나노여과막 {NE4040-90 폴리아미드(스킨)-폴리술폰(지지체) 복합 분리막, Woongjin Co. Ltd.}을 설치하였으며 멸균된 영양분 (20 L, tryptic soy broth 60 mg/L)을 연동(peristaltic) 펌프를 이용하여 1.5 mL/min의 유량으로 플로우 셀의 내부로 공급하였다. 미생물로서는 AHL을 신호분자로 이용하는 대표적인 그람 음성균 중 하나인 Pseudomonas aeruginosa PAO1을 선정하였다. PAO1은 플로우 셀 접종 전 18시간 동안 3 g/L의 tryptic soy broth에서 배양되었으며 약 7 × 10⁵ CFU/mL 농도로 희석되어 플로우 셀에 접종되었다. 접종 후 1시간 동안 미생물이 분리막에 부착되도록 한 후 상기 영양분을 지속적으로 공급하였다. 5일간의 플로우 셀 운전 후, 각 분리막의 표면에 형성된 PAO1 생물막을, 셀을 염색하는 SYTO 9과 미생물의 체외 고분자 물질(EPS) 중 다당류(Polysaccharide)를 염색하는 ConA를 이용하여 염색한 후 공초점 주사 현미경 (Confocal laser scanning microscopy, CLSM)을 이용하여 관측하였다. CLSM을 통해 얻어진 생물막의 단층 이미지들은 IMARIS 프로그램을 이용하여 3차원 이미지로 재구성 하였으며 ISA-2D프로그램을 이용하여 분리막 표면에 형성된 생물막의 공극률, 두께, 부피 등을 정량화하였다.

도 8b는 플로우 셀 5일 운전 후 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막의 표면에 형성된 PAO1의 생물막 이미지를 나타내는 것이다. 성숙한 PAO1생물막에서 흔히 관측되는 버섯모양의 생물막 패턴은 관측되지 않았으며 상대적으로 평평한 구조를 보였다. 형성된 생물막의 구성성분 중 세포(cell)의 부피는 분리막 단위 면적(μm²)당 0.9 μm³, 체외 고분자 물질의 부피(EPS)는 단위 면적당 0.7 μm³이었다. 생물막의 두께는 20 μm 미만이었으며 공극률은 생물막의 높이가 높아질수록 지속적으로 감소하는 경향을 보였다 (도 9a 및 9b).

비교예 1

생물막 형성 억제효소가 고정화되지 않은 종래의 나노여과막을 대상으로 실시예 1의 절차를 동일하게 반복하였다. 그 결과, 분리막 표면에 형성된 PAO1 생물막은 신호분자가 제거되지 못하므로 미생물의 정족수 감지 기작이 발현됨에 따라 성숙한 PAO1생물막이 가지는 뚜렷한 버섯모양을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 8a). 세포의 부피는 단위 분리막 면적당 3.7 μm³, 체외 고분자 물질의 부피는 2.1 μm³로 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막의 표면에 형성된 생물막의 그것보다 현저히 높은 수치를 보였다. 또한 생물막의 두께는 40 μm 이상이었으며 공극률은 실시예 1의 결과와 달리 높이에 따라 다양하게 변화하는 경향을 나타내었다 (도 9a 및 9b).

이러한 일련의 결과는 미생물의 정족수 감지 기작에 의해 조절되는 생물막의 성장 및 성숙과 체외 고분자 물질의 분출이 본 발명에서와 같이 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막에서 현저히 저하됨을 의미하며, 생물막의 성장과 체외 고분자 물질이 생물막오염 현상의 주된 요인임을 감안해 볼 때 비가압 상태에서도 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 분리막이 기존의 분리막에 비하여 생물막오염 현상을 크게 완화시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 2 - 가압형 연속식 분리막 수처리 공정에의 적용

상기 '제조예 1'에서 제조한 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막을 실험실 규모의 연속식 나노여과 수처리 공정에 적용하였다 (도 10). 본 실시예는 유입수의 투입 및 처리수의 취출이 연속적으로 이루어지는 실제 나노여과 수처리 공정을 모사한 것으로서, 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 분리막의 생물막오염 억제 효과를 검증하기 위하여 수행된 것이다.

구체적으로, 본 실시예에 사용된 나노여과공정은 크게 영양분이 존재하는 유입수 (60 mg/L TSB, 1 mM trisodium citrate, in 2 mM PB), 운전부피 1.2 L의 반응기 (유입수와 동일한 조성), 2 bar의 정압에서 평행하게 운전되는 두 개의 피스톤 펌프와 나노여과 모듈(평판형)로 구성되어 있다. 사용된 나노여과막의 유효 막면적은 각 14.2 cm²이고 처리수는 지속적으로 취출되었으며 농축수는 반응기로 재순환되었다. 운전 시작 전, 시스템 내부를 1% 차아염소산나트륨(NaOCl)과 75% 에탄올로 세척 및 멸균시켰다. 1시간의 안정화 후 PAO1 을 약 10² CFU/mL의 농도로 반응기 내에 접종하였으며 이 때부터 2 bar의 정압으로 나노여과공정을 운전하기 시작하였다. 나노여과공정이 정압으로 운전되는 경우, 막오염이 발생함에 따라 분리막의 투수율(Flux)이 감소하게 되는데, 본 실시예에서는 이러한 투수율의 변화를 실시간으로 측정하여 기록함으로써 분리막의 생물막오염 정도를 평가하였다. 운전종료 후 (38시간 경과시) 분리막을 모듈에서 분리하였으며 '실시예 1'과 동일한 방법으로 분리막 표면의 생물막을 염색한 후 CLSM을 이용하여 관찰하였다.

도 11은 나노여과공정의 운전시간에 따른 투수율의 변화를 보여주고 있다. 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막의 경우 38시간의 운전시간 후에도 투수율이 초기 투수율의 90% 이상으로 유지되고 있어서 생물막오염 현상이 심하게 일어나지 않았음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 도 12b의 3차원 이미지로도 확인할 수 있는데, 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 나노여과막의 표면에는 PAO1단일 개체나 마이크로콜로니(Microcolony) 정도만이 관찰되었지만 체외 고분자 물질과 세포들로 구성된 두껍고 고밀도의 생물막의 구조는 관측되지 않았다.

비교예 2

생물막 형성 억제효소가 고정화되지 않은 종래의 나노여과막을 대상으로 실시예 2의 절차를 동일하게 반복하였다. 그 결과, 투수율은 미생물 성장이 급격히 일어나는 약 12시간 정도부터 뚜렷한 감소되는 경향을 보이기 시작하여 38시간 운전종료 시점에는 초기 투수율의 60%까지 감소하였다 (도 11). 이는 종래의 나노여과막의 표면에서 생물막 오염 현상이 현저하게 발생된다는 것을 나타내고 있다. 또한 종래의 나노여과막의 표면에는 다량의 세포와 체외 고분자 물질로 구성된 성숙한 생물막이 형성되어 있음을 확인할 수 있었다 (도 12a).

상기 실시예 2와 비교예 2의 결과를 정량적으로 분석하여 보면, 본 발명의 생물막 형성 억제효소가 고정화된 나노여과막의 표면에 형성된 생물막의 부피(세포와 체외 고분자 물질의 합)는 단위 분리막 면적 (μm²) 당 0.06 (±0.02) μm³로서 종래의 나노여과막의 표면에 형성된 생물막의 부피 (1.15 (± 0.18) μm³) 의 6% 수준에 불과하였다.

위와 같은 실험 결과들로부터, 본 발명의 생물막 형성 억제 효소가 고정화된 분리막은 그 표면에 고정화된 생물막 형성 억제 효소(정족수 감지 억제 효소)의 활성에 의해 생물막 형성(정족수 감지)의 기작이 억제되면서 생물막의 성숙과 체외 고분자 물질의 분출이 감소되어 생물막오염이 현저히 완화되는 것을 알 수 있다.

Claims

피처리수와 접촉하는 표면에 생물막 형성 억제 효소 및 상기 효소의 고정용의 수용성 고분자의 결합체가 형성되어 있는 수처리용 분리막.
청구항 1에 있어서,
상기 생물막 형성 억제 효소는 정족수 감지 억제 효소인 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막.
청구항 2에 있어서,
상기 정족수 감지 억제 효소는 아실라제 또는 락토나제인 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막.
청구항 1에 있어서,
상기 생물막 형성 억제 효소와 상기 수용성 고분자는 가교제를 이용하여 화학적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막.
청구항 4에 있어서,
상기 수용성 고분자는 분자 내부에 상기 생물막 형성 억제 효소 또는 가교제와 화학적인 결합을 형성할 수 있는 작용기를 갖는 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막.
청구항 5에 있어서,
상기 수용성 고분자는 분자 내부에 아민기 또는 카르복실기를 갖는 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막.
청구항 6에 있어서,
상기 수용성 고분자는 키토산, 3-아미노프로필트리에톡시실란 및 수용성 덴드리머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 이루어진 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막.
청구항 4에 있어서,
상기 가교제는 글루타르알데히드인 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막.
수용성 고분자의 수용액을 제조하는 단계;
상기 수용성 고분자의 수용액에 생물막 형성 억제 효소를 혼합하여 생물막 형성 억제 효소와 수용성 고분자의 응집체를 형성하는 단계;
분리막에 상기 응집체를 포함하는 수용액을 여과시켜서 분리막의 피처리수측의 표면에 생물막 형성 억제 효소와 수용성 고분자의 응집체를 배치시키는 단계; 및
상기 응집체가 배치된 분리막 표면에 가교제를 반응시켜서 상기 생물막 형성 억제 효소와 상기 수용성 고분자를 화학적으로 결합시키는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막의 제조방법.
청구항 9에 있어서,
상기 생물막 형성 억제 효소는 정족수 감지 억제 효소인 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막의 제조방법.
청구항 9에 있어서,
상기 수용성 고분자는 분자 내부에 아민기 또는 카르복실기를 갖는 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막의 제조방법.
청구항 9에 있어서,
상기 수용성 고분자는 양이온성 화합물이며, 상기 수용성 고분자의 수용액에 알칼리를 혼합하고 나서 생물막 형성 억제 효소를 혼합하여 생물막 형성 억제 효소와 수용성 고분자의 응집체를 형성하는 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막의 제조방법.
청구항 9에 있어서,
상기 가교제는 글루타르알데히드인 것을 특징으로 하는 수처리용 분리막.
청구항 1 내지 8의 분리막을 이용하여 피처리수를 여과하는 것을 특징으로 하는 수처리 공정.