KR20130000693A - 곤충병원세균 유래 생물농약 조성물과 이를 이용한 방제 방법 - Google Patents

곤충병원세균 유래 생물농약 조성물과 이를 이용한 방제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 곤충병원세균 유래 생물농약 조성물과 이를 이용한 방제 방법에 관한 것으로, 특히 비티의 살충력을 높인 나비목 해충 방제제 조성물과 방제 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 비티에 제노랍두스 네마토필라(Xn), 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타(Ptt), Xn의 대사산물을 혼합하여 배추좀나방과 파밤나방의 종령 유충에 대한 살충력을 검정하였으며, 제제화한 복합 미생물제제로 시설재배지에서의 포장 효과를 검정하였다. 이러한 결과를 토대로 본 발명에서는, 비티와 함께 Xn, Ptt 또는 Xn의 대사산물을 유효성분으로 포함하며, 파밤나방 또는 배추좀나방의 종령기 유충을 방제 대상으로 하는 나비목 해충 방제제 조성물과 방제방법을 제공한다. 본 발명의 방제제 조성물은 파밤나방과 배추좀나방 종령 유충에 대한 비티의 살충력을 100% 또는 100%에 가깝게 크게 증가시킴으로써 종래 종령기 유충에 대한 낮은 감수성으로 사용에 제약이 있던 비티의 적용을 크게 확장시킬 수 있다.

Description

곤충병원세균 유래 생물농약 조성물과 이를 이용한 방제 방법 {Biopesticide Composition Derived Entomopathogenic bacteria and the method using it}
본 발명은 곤충병원세균 유래 생물농약에 관한 것으로, 특히 비티의 살충력을 높인 생물농약 조성물과 이를 이용한 방제 방법에 관한 것이다.
비티(Bacillus thuringiensis (Bt))는 국내외적으로 가장 많이 사용되는 미생물농약이다. 비티는 그람양성 간균으로 내생포자를 형성하며, 내독소로 이루어진 살충성 단백질을 생성한다(Tanada and Kaya, 1993). 비티의 주요 작용기작이 특이적 병원성 단백질에 기인하기 때문에, 비티는 비표적 생명체에 대하여는 비교적 안전하여 친환경 농자재로 널리 이용되고 있다. 현재까지 비티 생물농약은 나비목, 파리목 등에 활성을 나타내며 기주 범위를 확대시키고 있다(Schnepf et al., 1998). 살충성 단백질의 작용기작은, 비티가 경구를 통해 장내로 들어가면 중장의 분해효소에 의해 내독소 단백질이 활성화되어 중장세포막에 존재하는 수용체와 결합함으로써 중장세포에 손상을 입히고 중장 내강과 혈강을 직접 연결시켜 궁극적으로 패혈증을 일으켜 치사시키는 것으로 알려져 있다(Gill et al., 1992). 그러나 비티의 독소 단백질의 기주 특이성은, 적용 해충의 범위를 좁히고, 화학농약에 비해 비교적 약효가 느리며, 저항성의 발달로 인해 보다 넓은 적용 확대를 어렵게 하고 있다(Tabashink et al., 2009).
한편, 곤충병원세균인 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타(Photorhabdus temperata ssp. temperata (Ptt))는 국내에서 채집된 헤테로랍디티스 메기디스(Heterorhabditis megidis)의 곤충병원선충에서 분리되었다(Kang et al., 2004). 유사한 곤충병원선충으로 슈타이너네마 카르포캅사에(Steinernema carpocapsae)에서는 공생세균인 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophila (Xn))가 분리되었다(Park et al., 1999). 헤테로랍디티스와 슈타이너네마는 상이한 발생 기원을 가지지만, 이들의 기생 생활사는 유사한 패턴을 보이는 것으로 추정된다(Akhurst, 1980; Adams and Nguyen, 2002). 즉, 이들 세균은 각 선충 기주의 장내에 서식하면서 종 특이적 공생 생활환을 보인다(Kaya and Gaugler, 1993). 일단 감염태 선충이 대상 곤충의 개구부를 지나 혈강으로 침입하면 선충의 장내에 공생하는 곤충병원세균을 배출시킨다(Herbert and Goodrich-Blair, 2007). 혈강으로 배출된 세균은 자신과 기주 선충을 보호하기 위해 대상 곤충의 면역을 억제시킨다(Park and Kim, 2000). 면역기능이 억제된 기주는 체내에서 세균증식이 이루어지면서 발생하는 독소단백질과 패혈증으로 인해 치사에 이르게 된다(Dunphy and Webster, 1991, 1994; ffrench-Constant et al., 2005).
Xn 곤충병원세균의 배양액으로부터 곤충의 면역억제를 유도하는 유효성분이 분리되었다. 벤질리덴아세톤, PY(proline-tyrosine), Ac-FGV(acetylated phenylalanine-glycine-valine)은 Xn 곤충병원세균의 배양액에서 유기용매추출법을 통하여 분리된 물질로, 아이코사노이드 생합성을 억제하며 곤충의 면역억제를 유도하는 것으로 알려져 있다(Ji et al., 2004; Kwon and Kim, 2008; Shrestha and Kim, 2009). 아이코사노이드는 20개 탄소로 구성된 불포화지방산 유도체로서 다양한 병원체에 대한 혈구세포의 포식작용 및 소낭형성과 같은 세포성 면역 반응과 다양한 항생펩타이드의 작용으로 비롯되는 체액성 면역반응을 매개하는 면역 중개물질로 알려져 있다(Stanley and Miller, 2006; Shrestha and Kim, 2009). 세포성 면역반응의 대부분은 혈장의 페놀옥시데이즈 활성에 의한 멜라닌형성 반응에 의존한다(Kanost et al., 2004). 즉, 아이코사노이드 생합성 억제제는 이러한 다양한 세포성 면역반응 및 체액성 면역반응을 억제하여 대상 곤충의 면역저하를 유발함으로써 혼합 처리시 비티와 같은 곤충병원세균의 살충력을 높일 수 있는 것으로 보고되었다(Seo and Kim, 2010).
특허 제10-0522667호는 국내에서 채집된 헤테로랍디티스 메기디스(Heterorhabditis megidis)로부터 분리한 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타(Photorhabdus temperata ssp. temperata (Ptt))와 이를 이용한 해충 방제제에 대해 기술하고 있으며, 특허 제10-0696185호는 슈타이너네마 카르포캅사에(Steinernema carpocapsae)로부터 분리한 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophila (Xn))와 이를 이용한 살충제에 대해 기술하고 있으며, 특허 제10-0691512호에서는 벤질리덴아세톤 및/또는 PY를 함께 사용하여 비티의 살충력을 높이는 살충제에 관해 기술하고 있다.
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Tanada, Y. and H.K. Kaya. 1993. Insect pathology, Academic Press, San Diego.
나비목 해충에 대한 비티의 살충력은 잘 알려져 있고, 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타(Ptt)와 제노랍두스 네마토필라(Xn)의 살충작용도 알려져 있다. 그리고 곤충의 면역반응을 억제하는 물질과의 병용으로 비티의 살충력을 높일 수 있다는 것도 알려져 있다. 그러나 어린 유충기에는 비교적 높은 살충력을 보이던 비티가, 유충의 영기가 진행함에 따라 감수성이 낮아져 난 방제 해충인 배추좀나방과 파밤나방의 경우 최종령에 이르면 배추좀나방에서 약 40%, 파밤나방에서 약 60% 정도의 최대 살충력을 나타내는데 불과한데, 이렇게 파밤나방과 배추좀 나방에서 종령기에 비티의 감수성이 현격하게 떨어지는 문제는 아직까지 해결되지 못하고 있다.
본 발명은 종령기에 접어든 파밤나방과 배추좀 나방에서 비티의 감수성 저하 문제를 해결할 수 있는, 곤충병원세균 유래 생물농약 조성물과 이를 이용한 방제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명에서는 상기 조성물을 효과적인 제형으로 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서는 종령기의 파밤나방과 배추좀나방에 대해서도 높은 살충력을 유지할 수 있도록 비티의 살충력을 증가시킨 새로운 생물농약 복합제를 개발하고자, 비티에 Xn, Ptt, Xn의 대사산물을 혼합하여 배추좀나방과 파밤나방의 종령 유충에 대한 살충력을 검정하였다. 그리고 제제화한 복합 미생물제로 시설재배지에서의 포장 효과를 검정하였다.
이러한 결과를 토대로 본 발명에서는,
파밤나방 또는 배추좀나방의 종령기 유충에 대한 살충 유효성분으로 비티(Bacillus thuringiensis)와 하기 A 또는 B를 포함하는 것을 특징으로 하는 나비목 해충 방제제 조성물을 제공한다.
A : 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타 또는 제노랍두스 네마토필라
B : BZA(benzylideneacetone); PY(proline-tyrosine); Ac-FGV(acetylated phenylalanine-glycine-valine); cPY(cyclic PY); 인돌(indole); 및 옥신돌(oxindole)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물.
또한, 본 발명에서는,
파밤나방 또는 배추좀나방의 종령기 유충을 방제하기 위해 비티(Bacillus thuringiensis)와 상기 A 또는 B를 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 나비목 해충의 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 방제제 조성물은 파밤나방과 배추좀나방 종령 유충에 대한 비티의 살충력을 100% 또는 100%에 가깝게 현격하게 증가시킨다. 본 발명에 따르면, 종래 비교적 안전한 친환경 농자재임에도 불구하고 난 방제 해충인 파밤나방과 배추좀나방의 종령기 유충에 대한 낮은 감수성으로 사용에 제약이 있던 비티의 적용을 크게 확장할 수 있다.
도 1a 및 1b는 세 가지 비티 균주(Bt1, Bt2, Bt3)를 각각 세균배양액과 동결 제형화로 나누어 파밤나방과 배추좀나방에 대한 살충력을 비교한 결과로, 도 1a는 파밤나방 4 령충에 대한 결과이며, 도 1b는 배추좀나방 3 령충에 대한 결과이다.
도 2a 및 2b는 해충의 발육 단계별 비티 살충제의 감수성을 확인하기 위해 비티를 1,000 ppm으로 조제하여 모든 유충기에 섭식 처리한 결과로, 도 2a는 파밤나방에 대한 결과이며, 도 2b는 배추좀나방에 대한 결과이다.
도 3a 및 3b는 비티 제제에 동일한 Xn 또는 Ptt 배양액 제형을 다양한 비율로 혼합한 후 현탁액으로 조제하여 배추좀나방 종령 유충에 대한 살충력을 검정한 결과로, 도 3a는 Xn을 혼합한 결과이며, 도 3b는 Ptt를 혼합한 결과이다.
도 4a 및 4b는 비티 제제에 동일한 Xn 또는 Ptt 배양액 제형을 다양한 비율로 혼합한 후 현탁액으로 조제하여 파밤나방 종령 유충에 대한 살충력을 검정한 결과로, 도 4a는 Xn을 혼합한 결과이며, 도 4b는 Ptt를 혼합한 결과이다.
도 5a 및 5b는 Xn 대사 물질인 BZA, PY, Ac-FGV, cPY, 인돌 그리고 옥신돌을 비티와 혼합하여 배추좀나방 종령 유충에 섭식 처리한 결과로, 도 5a는 비티에 대사 화합물을 각각 혼합한 결과이며, 도 5b는 효과가 가장 좋은 BZA에 다른 화합물을 조합하여 비티에 혼합한 결과이다.
도 6a 및 6b는 Xn 대사 물질인 BZA, PY, Ac-FGV, cPY, 인돌 그리고 옥신돌을 비티와 혼합하여 파밤나방 종령 유충에 섭식 처리한 결과로, 도 6a는 비티에 대사 화합물을 각각 혼합한 결과이며, 도 6b는 효과가 가장 좋은 BZA에 다른 화합물을 조합하여 비티에 혼합한 결과이다.
도 7a 및 7 b는 비티, 그리고 비티에 Xn 배양액/Ptt 배양액/대사화합물을 각각 혼합한 약제를 얼갈이배추가 재배된 포장에서 처리한 결과로, 도 7a는 배추좀나방에 대한 결과이며, 도 7b는 파밤나방에 대한 결과이다.
본 발명의 나비목 해충 방제제 조성물은 파밤나방 또는 배추좀나방의 종령기 유충에 대한 살충 유효성분으로 비티(Bacillus thuringiensis)와 하기 A 또는 B를 포함한다.
A : 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타 또는 제노랍두스 네마토필라
B : BZA(benzylideneacetone); PY(proline-tyrosine); Ac-FGV(acetylated phenylalanine-glycine-valine); cPY(cyclic PY); 인돌(indole); 및 옥신돌(oxindole)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물.
파밤나방의 종령기 유충을 방제 대상으로 할 경우 상기 살충 유효성분은, 바람직하게는 비티와 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타 또는 제노랍두스 네마토필라를 6:4 내지 7:3의 비율로 포함한다.
배추좀나방의 종령기 유충을 방제 대상으로 할 경우 상기 살충 유효성분은, 바람직하게는 비티와 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타를 5:5 내지 7:3의 비율로 포함하거나, 비티와 제노랍두스 네마토필라를 5:5 내지 6:4의 비율로 포함한다.
상기 B의 화합물은 바람직하게는, BZA; cPY; 인돌; 및 옥신돌로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물이며, 특히 바람직하게는 BZA, cPY 및 옥신돌을 2:1:1의 비율로 포함한다.
상기 미생물제들, 즉 비티, 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타 및 제노랍두스는, 세균배양액 형태 그대로 사용될 수도 있으나, 보다 바람직하게는 살충력의 감소 없이 효과적으로 제형화되어 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 비티, 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타 및 제노랍두스 네마토필라는,
단일 균총을 채취하여 배양한 후 글리세롤을 20~40%의 농도로 첨가하고 동결 분획하는 단계;
상기 동결된 시료를 다시 배양한 후 함수량 15% 이하가 되도록 동결 건조하는 단계; 및
동결 건조된 시료에 규조토를 4:6 내지 2:8의 중량비로 첨가하여 제제화하는 단계를 포함하는 방법으로 각각 제제화된 것을 사용한다.
본 발명의 나비목 해충의 방제 방법은, 파밤나방 또는 배추좀나방의 종령기 유충을 방제하기 위해 비티(Bacillus thuringiensis)와 상기 A 또는 B를 함께 사용하며, 구성요소 각각에 대한 설명은 위와 동일하다.
본 발명의 실시예를 통해 확인되는 바와 같이, 비티 미생물제는 유충의 영기가 진행함에 따라 감수성이 낮아진다. 즉, 분석된 Bt kurstaki와 Bt aizawai 모두는 비록 어린 유충기에는 100% 살충률을 보일 수 있으나 최종령에 이르면 병원력이 떨어져 배추좀나방의 경우 약 40%의 최대 살충률을 나타내었고, 파밤나방의 경우는 약 60%의 최대 살충력을 나타내었다. 이러한 비티의 영기별 감수성 변화는 나비목 해충에서 이미 보고되었다(Rausell et al., 2000). 이러한 이유로, 유충의 영기가 진행함에 따라 비티의 독소 단백질인 Cry 1δ에 대한 수용체로서 아미노펩티다제 N(aminopeptidase N, APN)의 발현량이 역비례한다고 보고되어 있다(Gilliland et al., 2002). 따라서 본 발명에서 확인된 유충 영기별 비티의 감수성 변이는 중장에 존재하는 비티 내독소 수용체의 밀도 변화와 관련이 있을 것으로 추정된다.
광범위한 비티 사용은 해충들의 저항성을 유발시켰다(Tabashnik et al., 2000). 이러한 비티 저항성은 중장 상피세포 막에 존재하는 비티 내독소 단백질 수용체의 구조 변화(Gahan et al., 2001; Ferre and Van Rie, 2002), 이 독소 단백질의 가수 분해력 저하(Oppert et al., 1997) 그리고 손상된 상피 세포들의 빠른 회복능력(Forcada et al., 1999)을 포함한다. 따라서 본 발명에서는 아이코사노이드 생합성억제 물질을 생성하는 Xn 또는 Ptt 배양액을 이용하여 나비목 해충의 종령에 대한 비티의 살충력을 높이고자 하였다.
본 발명의 실시예에서, 곤충병원세균(Xenorhabdus nematophila (Xn) 또는 Photorhabdus temperata ssp. temperata (Ptt))의 배양액을 다양한 농도로 비티에 혼합하여 파밤나방과 배추좀나방 종령 유충에 처리하였을 때 비티의 병원력이 현격하게 증가되었다. 이러한 살충력 증가 효과는 Xn 또는 Ptt와 비티의 상대 비율에 따라 차이가 있었다. 또한, 세균 배양액으로부터 동정한 다섯 가지의 화합물을 비티와 혼합하여 처리한 경우도 비티의 병원력을 증가시켰다. 세균 대사물질의 첨가 효과는 세균 배양액의 첨가 효과에는 미치지 못하였는데, 이는 세균 배양액에 비티의 살충력을 증가시킬 수 있는 또 다른 물질이 포함되어 있는 것으로 해석될 수 있다. 최적의 방제 효과를 나타낼 수 있는 비티와 세균배양액 또는 대사물질의 혼합비율과 살포량을 결정한 후 배추 포장에 발생한 배추좀나방과 파밤나방 종령 유충에 대해 처리한 결과, Bt와 Xn 배양액을 2 회 이상 살포하면 배추좀나방과 파밤나방에 대해 100%의 방제효과를 나타냈으나, Bt 단독으로 처리하면 각각 약 80%와 60% 이하의 방제효과를 나타내었다. Ptt 배양액 및 세균 대사물질을 포함한 다른 Bt 혼합제들 또한 뚜렷한 병원력 증가를 간이포장실험에서 보여주었다. 본 발명의 결과는, Xn와 Ptt의 배양액에 면역억제 물질이 포함되어 있으며, 이 물질이 배추좀나방과 파밤나방의 아이코사노이드 생합성 반응을 억제시키고, 궁극적으로 Bt의 병원력을 제고시켜 Bt에 대해 감수성이 낮은 종령 유충을 방제할 수 있다는 것을 보여준다.
[ 실시예 ]
이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 배추좀나방 사육
시험곤충은 안동시 송천동에 소재한 배추밭에서 채집한 유충을 약제 처리하지 않고 실내에서 누대 사육한 것을 사용하였다. 유충은 온도 25 ± 1℃, 광주기 16:8 h (L:D), 상대습도 40~60%의 배양기에서 배추를 먹이로 사육했다. 성충은 10% 설탕물을 먹이로 제공하고 배추 잎을 이용하여 산란을 유도하였다.
2. Bt 살충제 선발
B. thuringiensis 균주는 (주)고려바이오(Hwasung, Korea)로부터 제공받았다. B. thuringiensis var. kurstaki serotype a (Bt1), B. thuringiensis var. kurstaki serotype b (Bt2) 그리고 B. thuringiensis ssp. aizawai NT423 (Bt3)을 사용하였다. 각각의 균주에 멸균수 1 mL을 혼합하여 현탁액을 만든 후 loop를 이용하여 Luria-Bertani (LB) 사면배지(1 L 제조시 bacto trypton 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 10 g, Agar 15 g)에 세균을 도말하고 28℃에서 48 시간 배양하였다. 평판배지에서 배양된 세균은 단일 콜로니를 채집하고 채집된 세균(1×109 cfu/㎕)은 멸균수로 희석하여 2 mL의 LB 액체배지에서 28℃에서 48 시간 배양하였다.
3. Xn 과 Ptt 세균 배양액 및 제제화
곤충병원세균인 X. nematophila K1(KACC 91136)과 P. temperata ssp. temperata ANU101(KACC 91042)은 기주 선충에서 분리된 후(Park et al., 1999; Kang et al., 2004) 동결보관된 것을 이용하였다. 이들 균주는 LB 평판배지를 이용하여 28℃에서 12 시간동안 배양하여 단일 균총을 채취하였다. 채취된 단일 균총을 2 mL의 LB 액체배지를 이용하여 28℃에서 12 시간 동안 200 rpm의 속도로 교반 배양한 후, 글리세롤을 30%의 농도가 되도록 첨가한 후 동결 분획시료를 만들었다. 이 동결시료가 추후 반복되는 세균 배양의 원시료로 이용되어 계대배양에 따른 세균 변이 가능성을 줄였다. 글리세롤 동결 세균시료 250 μL를 1 L의 LB 액체배지에 첨가하고 28℃에서 200 rpm의 속도로 48 시간동안 교반 배양하였다. 배양된 세균은 분광광도계(Uvikon 930, Kontron, Ales, France)를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 2.4 이상이 되면 동결건조기(PVTFD 100R, Ilshin BioBase, Yangju, Korea)를 이용하여 함수량 14.7% 조건이 되게 72 시간 동결 건조하였으며, 동결 건조된 시료에 규조토(Duksan, Seoul, Korea)를 3:7의 중량비율로 첨가하여 제제화 하였다.
4. Bt 혼합제의 제제화
선발 Bt3을 이용하여 혼합제를 제제화했다. Bt3 균주는 tryptic soy agar (TSA, 24 g/L, Bectondickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA) 배지를 이용하여 30℃에서 24 시간 동안 배양하여 단일 균총을 채취하였다. 채취된 단일 균총을 2 mL의 TSB 액체배지를 이용하여 30℃에서 24 시간 동안 200 rpm의 속도로 교반 배양한 후, 글리세롤을 30%의 농도가 되도록 첨가한 후 동결 분획시료를 만들었다. 이후 제제화 과정은 앞에서 기술한 Xn/Ptt 세균배양액과 동일하게 처리하였다.
5. 대사 화합물의 조제
X. nematophila 유래 물질인 BZA(benzylideneacetone, (E)-4-phenylbut-3-en-2-one, Sigma-Aldrich Korea), PY(proline-tyrosine , 3-(4-hydroxybenzyl)-hexahydropyrrolo[1,2-α]pyrazine-1,4-dione, Peptron, Daejon, Korea), Ac-FGV(acetylated phenylalanine-glycine-valine, 2-(2-(2-benzyl-3-oxobutanamido) acetamido)-3-methyl butanoic acid, Peptron) 그리고 cPY(cyclic PY, 3-(4-hydroxyphenyl)-2-(pyrrolidine-2-carboxamido)propanoic acid)는 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich Korea)를 이용하여 1,000 ppm의 농도로 조제였으며 인돌(indole)(2,3-benzopyrrole, Sigma-Aldrich Korea)과 옥신돌(oxindole)(2,3-dihydro-1H-indol-2-one, Sigma-Aldrich Korea)은 증류수를 이용하여 1,000 ppm의 농도로 조제한 시료에 Bt를 혼합하였다. 대사화합물 혼합의 경우는 BZA을 기준으로 동일한 양으로 기타 화합물 복합체를 첨가했다. 이때 기타 화합물 복합체는 각 화합물을 동일한 양으로 혼합했다.
6. Bt 혼합제의 조성비율 결정
앞에서 기술한 방법과 같이 동결 건조하여 제제화한 Bt, Xn 그리고 Ptt의 세균배양액을 Bt:Xn 그리고 Bt:Ptt를 0:1000 - 1000:0의 질량 비율로 혼합하여 증류수를 이용하여 각각 1,000 ppm의 현탁액으로 조제하였다. 배추 잎(3 ㎠)을 조제된 Bt 혼합액에 10분간 침지시킨 후 여과지가 깔려진 용기(직경 9 cm)에서 5분간 음건하였다. 각각의 배추 잎에 배추좀나방 4령충과 파밤나방 5령충을 10 마리씩 3 반복으로 처리하였다. 대조구는 증류수로 상기와 동일하게 처리하였다. 대사화합물은 Bt와 1:1 또는 3:7의 질량비율로 혼합하였다. 이들 혼합물을 1,000 ppm으로 조제하여 배추좀나방 4 령충과 파밤나방 5 령충에 처리하였다.
7. 살포약량 측정을 위한 간이 포장실험
실험에 사용된 얼갈이배추(Danong, Namyangju, Korea)는 30 일간 온도 28 ± 1℃, 광조건 16:8 h (L:D) 그리고 상대습도 40~60%의 온실에서 재배하였다. 약제 처리하기 전 발생한 배추좀나방과 파밤나방 가운데 4령 또는 5령의 개체만 계수하여 처리하기 전 밀도로 산출하였다. 이후 약제를 처리하였으며, 다중 처리는 24 시간 및 48 시간 이후에 각각 추가 처리하였다. 생존 수는 최초 살포 24 시간 이후부터 계수하여 120 시간까지 실시하였다.
결과
1. Bt 제형화와 영기별 감수성 변이
동결 건조에 따른 Bt 제형화가 파밤나방과 배추좀나방의 살충력에 미치는 효과가 검정되었다(도 1a 및 b). 이를 위해 세 가지 Bt 균주(Bt1, Bt2, Bt3)를 TSB 액체배지에서 배양하여 각각 세균배양액과 동결 제형화로 나누어 각각 배추좀나방 3 령충과 파밤나방 4 령충에 대해 살충력을 비교하였다. 세균배양액 상태의 3개 균주는 물론이고 동결 건조한 제제에서도 모두 뚜렷한 차이 없이 유사한 살충력을 나타냈다(배추좀나방: F = 0.54, df = 1, P = 0.4746; 파밤나방: F = 0.06, df = 1, P = 0.8053). 그러나 살충률이 배추좀나방에서 최대 80% 그리고 파밤나방에서 최대 약 60% 이상을 넘지 못했다.
해충의 발육 단계별 Bt 살충제의 감수성을 확인하기 위해 Bt를 1,000 ppm으로 조제하여 모든 유충기에 섭식 처리하였다(도 2a 및 b). 배추좀나방의 경우 1~3 령충은 살충률이 100%로 나타났지만 4 령충은 살충력이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 파밤나방은 4령과 5령 모두에서 감수성이 현격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이후의 Bt 처리는 모두 Bt3을 이용한 동결 건조 제형을 이용하였다.
2. Bt 미생물 혼합제의 혼합비율 결정
선발된 Bt 제제에 동일한 동결건조 방법으로 준비된 Xn 또는 Ptt 배양액 제형을 서로 다른 질량 비율로 혼합하였다. 이 혼합제를 1,000 ppm이 되도록 증류수를 이용하여 현탁액으로 조제하여 배추좀나방 종령 유충에 대한 살충력을 검정하였다. 결과는 도 3a 및 3b와 같다. Bt와 Xn 혼합 처리구에서는 5:5와 6:4 비율에서 살충률이 가장 높게 나타났다(도 3a). Bt와 Ptt 혼합 처리구에서는 5:5 내지 7:3 비율에서 살충률이 100%로 나타났다(도 3b).
동일한 처리방법으로 파밤나방 종령 유충에 대해 살충력을 검정한 결과는 도 4a 및 4b와 같다. Bt와 Xn 혼합제는 6:4 내지 7:3 비율에서 최대 살충률을 나타냈다(도 4a). Bt와 Ptt 혼합제 처리는 파밤나방 종령 유충에 대해 6:4 내지 7:3 비율에서 최대 살충률을 나타냈다(도 4b).
따라서 Bt 혼합제는 대상 해충에 따라 다르게 결정되어, 배추좀나방의 경우는 5:5 (Bt:세균배양액, g/g), 그리고 파밤나방의 경우는 7:3 (Bt:세균배양액, g/g)의 비율로 혼합하는 것이 가장 이상적 비율로 나타났다.
또한, Xn 대사 물질인 BZA, PY, Ac-FGV, cPY, indole 그리고 oxindole을 Bt와 1:1 또는 3:7의 질량비율로 혼합하여 모두 1000 ppm의 농도로 배추좀나방과 파밤나방 종령 유충에 섭식 처리한 결과는 도 5 및 6과 같다. 배추좀나방의 경우 500 ppm의 Bt는 불과 40%의 살충률을 나타나는 반면 BZA, cPY, indole 또는 oxindole을 각각 혼합하면 살충률을 현격하게 증가시키는 것으로 나타났다(도 5a). 이 가운데 BZA이 가장 높은 상승효과를 가져오는 것으로 나타났다. 다시 BZA를 기준으로 다른 화합물의 조합을 이뤄 Bt 상승효과를 검정한 결과는 도 5b와 같다. 이때 가장 높은 상승효과는 BZA와 인돌 및 옥신돌을 혼합한 조합에서 나타났다. 그러나 배양액에서 보듯 100%의 살충력은 조사된 모든 혼합 비율에서 나타나지 않았다. 파밤나방의 경우도, 화합물 단독으로 Bt와 혼합하였을 때 BZA가 가장 높은 상승효과를 가져오는 것으로 나타났다(도 6a). 다시 BZA를 기준으로 다른 화합물을 첨가한 복합 제형을 만들어 분석하였을 때 배추좀나방과 마찬가지로 BZA와 indole 및 oxindole을 혼합한 조합에서 가장 높게 상승효과가 나타났다(도 6b). 따라서 대사화합물은 효과가 가장 높은 BZA, 인돌 및 옥신돌을 2:1:1의 질량비로 혼합한 조성을 아래의 포장 실험에 적용했다.
3. 간이 포장실험을 통한 살포약량 결정
Bt와 Bt에 Xn 배양액/Ptt 배양액/세균 대사 화합물을 앞의 실험에서 확인한 최적 비율에 따라 혼합하여 얼갈이배추가 재배된 포장에서 발생한 배추좀나방 종령 유충을 대상으로 약제를 처리한 결과는 도 7a와 같다. 살포량을 결정하기 위해 최초 1 회 살포 후 24 시간 주기로 최대 3 회까지 살포하였다. 배추좀나방에 1 회 살포시 Bt와 Xn 배양액을 혼합하여 처리한 시험구에서 살충률이 약 80%로 나타났으며, 1 회 추가 살포한 경우 두 세균 배양액 모두 100%의 살충력을 나타냈다. 그러나 대사화합물의 경우는 3 회 처리하여도 100%의 방제 효과를 나타내지 못했다. 동일한 방법으로 파밤나방 종령 유충을 대상으로 실시한 결과는 도 7b와 같다. 파밤나방에 1 회 살포시 Bt와 Xn 배양액을 혼합한 처리구에서 살충률이 약 80%로 나타났으나, 2 회 이상 살포한 경우 살충력이 100%로 나타났다. Ptt 배양액의 경우는 3회 처리에서 100% 처리 효과가 나타났다. 그러나 대사화합물의 경우는 3회 처리하여도 최대 80%의 살충률을 넘지 못했다.

Claims (9)

  1. 파밤나방 또는 배추좀나방의 종령기 유충에 대한 살충 유효성분으로 비티(Bacillus thuringiensis)와 하기 A 또는 B를 포함하는 것을 특징으로 하는 나비목 해충 방제제 조성물.
    A : 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타 또는 제노랍두스 네마토필라
    B : BZA(benzylideneacetone); PY(proline-tyrosine); Ac-FGV(acetylated phenylalanine-glycine-valine); cPY(cyclic PY); 인돌(indole); 및 옥신돌(oxindole)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물
  2. 제1항에 있어서, 파밤나방의 종령기 유충에 대한 살충 유효성분으로 비티와 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타를 6:4 내지 7:3의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 나비목 해충 방제제 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 파밤나방의 종령기 유충에 대한 살충 유효성분으로 비티와 제노랍두스 네마토필라를 6:4 내지 7:3의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 나비목 해충 방제제 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 배추좀나방의 종령기 유충에 대한 살충 유효성분으로 비티와 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타를 5:5 내지 7:3의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 나비목 해충 방제제 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 배추좀나방의 종령기 유충에 대한 살충 유효성분으로 비티와 제노랍두스 네마토필라를 5:5 내지 6:4의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 나비목 해충 방제제 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 비티와 상기 B의 화합물을 유효성분으로 포함하며, 상기 화합물은 BZA; cPY; 인돌; 및 옥신돌로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 나비목 해충 방제제 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 BZA, cPY 및 옥신돌을 2:1:1의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 나비목 해충 방제제 조성물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비티, 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타 및 제노랍두스 네마토필라는,
    단일 균총을 채취하여 배양한 후 글리세롤을 20~40%의 농도로 첨가하고 동결 분획하는 단계;
    상기 동결된 시료를 다시 배양한 후 함수량 15% 이하가 되도록 동결 건조하는 단계; 및
    동결 건조된 시료에 규조토를 4:6 내지 2:8의 중량비로 첨가하여 제제화하는 단계를 포함하는 방법으로 제제화된 것임을 특징으로 하는 나비목 해충 방제제 조성물.
  9. 파밤나방 또는 배추좀나방의 종령기 유충을 방제하기 위해 비티(Bacillus thuringiensis)와 하기 A 또는 B를 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 나비목 해충의 방제 방법.
    A : 포토랍두스 템페라타 ssp. 템페라타 또는 제노랍두스 네마토필라
    B : BZA(benzylideneacetone); PY(proline-tyrosine); Ac-FGV(acetylated phenylalanine-glycine-valine); cPY(cyclic PY); 인돌(indole); 및 옥신돌(oxindole)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물
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