KR20120126416A - 짚신 나물 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 짚신 나물 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 짚신 나물 추출물을 포함하는 항염증, 항 앨러지, 천식 억제 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

짚신 나물 추출물을 포함하는 조성물{Composition comprising extract of Agrimonia pilosa}

본 발명은 짚신 나물 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 짚신 나물 추출물을 포함하는 항염증, 항 앨러지, 천식 억제 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증은 병원균 또는 자극에 대한 우리 몸의 면역 시스템의 자가방어 기작이다. 정상적인 생리적 조건에서는 염증은 외상, 감염, 조직 손상으로부터 우리 몸을 보호한다. 그러나 과민 만성 염증은 우리 몸에 심한 손상을 야기할 수 있다. 만성 염증은 천식, 류마티스성 관절염, 동맥경화증 및 아토피성 피부염과 같은 여러 질환의 병인을 야기할 수 있다. 대식세포 및 마스트(mast) 세포는 박테리아 및 바이러스와 같은 침입 병원균에 대한 면역 반응에 대한 중요한 역할을 한다. 박테리아 및 다른 병원균이 우리 몸에 들어갈 때, 대식세포는 감염 부위에 면역 세포를 유도하고 그것들을 제거하기 위하여 세포를 활성화시키는 전구염증 사이토카인, NO, PGE₂ 를 포함하는 염증 매개체를 분비한다. Mast 세포는 혈관확장 및 혈관 수축을 매개하는 히스타민을 분비한다. 혈액, 혈장, 면역 세포 투과는 혈관 확장에 의하여 증가된다.

짚신 나물(Agrimonia pilosa)은 장미과(Rosaceae)의 일종이다.

짚신 나물이 항 종양 활성을 가지고(Koshiura R et al, 1985; Miyamoto K et al, 1987), 항 바이러스 활성을 가지며(Li Y et al, 2004; Shin WJ, 2010), 항 산화 활성을 가진다(Zhu L et al, 2009)는 보고들이 있다.

본 발명에서 본 발명자들은 AP가 대식 세포활성화를 억제하여 항염증 활성을 가지고 있는지 확인하며 mast 세포의 활성화를 저해하는지를 조사하고,또한 OVA-유도된 천식 마우스 모델에 대한 AP의 in vivo 항 천식 효과를 조사하였다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 새로운 항 염증 활성을 가지는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 새로운 항 앨러지 활성을 가지는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 새로운 천식 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 짚신나물 추출물을 포함하는 항 염증용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 추출물은 메탄올 추출물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 NO, PGE₂ 또는 전구염증성 사이토카인 생성을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 전구염증성 사이토카인은 IL-1β 또는 IL-6인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 짚신나물 추출물을 포함하는 항 앨러지용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현에에 있어서, 상기 조성물은 mast 세포 탈과립 또는 IL-4 생성을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 짚신나물 추출물을 포함하는 천식 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 IL-4, IL-5 또는 IgE 생성을 억제하는 것이 바람직하고, 폐 기도 벽으로 세포 침착을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 짚신나물 추출물을 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 혼용가능하게 사용된다. 용어 "대상체(들)"은 동물, 예를 들어 비-영장류 (예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류 (예를 들면, 원숭이, 예를 들어 사이노몰구스 (cynomolgous) 원숭이, 침팬지 및 인간)를 비롯한 포유동물, 및 예를 들어, 인간을 나타낸다. 한 실시양태에서, 대상체는 염증 감염에 대한 현행 처치법에 저항성이거나 반응하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 축산용 동물 (예를 들면, 말, 소, 돼지 등) 또는 애완용 동물 (예를 들면, 개 또는 고양이)이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 용어 "치료제(들) 또는 치료용 조성물"은 장애 또는 그의 1종 이상의 징후를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있는 임의의 물질(들)을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 용어 "치료제"는 본 발명의 추출물을 나타낸다. 한 실시양태에서, 치료제는 장애 또는 그의 1종 이상의 징후를 치료 또는 예방하는 데 유용한 것으로 공지되어있거나, 상기 목적을 위해 사용되어 왔거나, 현재 사용되고 있는 작용제이다.

"치료 유효량"은 질환 치료를 위해 대상체에게 투여되었을 때 상기 질환 치료에 효과를 나타내기에 충분한 화합물, 복합체 또는 조성물의 양을 의미한다. "치료 유효량"은 특히 화합물, 질환 및 그의 중증도, 및 치료 대상의 연령, 체중 등에 따라 달라질 수 있다.

한 실시양태에서, 임의의 질환 또는 장애를 "치료하는" 것 또는 이들의 "치료"는 대상체에 존재하는 질환 또는 장애를 개선시키는 것을 나타낸다. 또다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 하나 이상의 신체 파라미터를 개선시키는 것을 나타내며, 대상체는 이를 인식하지 못할 수도 있다. 또다른 실시양태에서, "치료하는"또는 "치료"는 질환 또는 장애를 신체적으로 조절하는 것 (예를 들면, 인식가능한 징후의 안정화) 또는 생리학적으로 조절하는 것 (예를 들면, 신체 파라미터의 안정화), 또는 이 둘 모두를 나타낸다. 또다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 발병을 지연시키는 것을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "예방제(들)"은 장애 또는 그의 1종 이상의 징후를 예방하는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제(들)을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 용어 "예방제"는 본 발명의 추출물을 나타낸다. 예를 들어, 예방제는 장애의 발병, 발전, 진행 및/또는 심화를 예방 또는 지연시키는데 유용한 것으로 공지되어 있거나, 또는 상기 목적을 위해 사용되어 왔거나 현재 사용되고 있는 작용제이다.

본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 요법제 (예를 들면, 예방제 또는 치료제) 또는 요법제의 조합물 (예를 들면, 예방제 또는 치료제의 조합물)을 투여하여 대상체에서 장애의 1종 이상의 징후가 재발,발병 또는 발전되는 것을 예방하는 것을 나타낸다.

본원에 사용된 어구 "예방 유효량"은 장애와 관련된 1종 이상의 징후의 발전, 재발 또는 발병을 예방하거나, 또는 또다른 요법제 (예를 들면, 또다른 예방제)의 예방 효과(들)을 증대 또는 개선시키기에 충분한 요법제 (예를들면, 예방제)의 양을 나타낸다.

본 발명의 방법에 사용되는 화합물은 바람직하게는 본 발명의 추출물을 단독으로 사용하거나, 또는 1종 이상의 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유하는 제약 조성물을 사용함으로써 제공된다.

임상 실무에서, 본 발명의 조성물은 임의의 통상적인 경로, 특히 경구, 비경구, 직장 경로로 투여되거나, 또는 흡입 (예를 들면, 에어로졸 형태로)에 의해 투여될 수 있다.

경구 투여용 고체 조성물로서, 정제, 환제, 경질 젤라틴 캡슐제, 분제 또는 과립제를 사용할 수 있다. 이들 조성물에서, 본 발명에 따른 화합물은 1종 이상의 불활성 희석제 또는 아주반트, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 전분과 혼합된다.이들 조성물은 희석제 이외에도, 예를 들면 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 또는 제어 방출을 위한 코팅제와 같은 물질을 포함할 수 있다.

경구 투여용 액체 조성물로서, 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 액체 파라핀을 함유하는 제약상 허용되는 용액제, 현탁액제, 에멀젼, 시럽 및 엘릭시르를 사용할 수 있다. 이들 조성물은 또한, 희석제 이외에도, 예를들면 습윤제, 감미제 또는 향미제와 같은 물질을 포함할 수 있다.

비경구 투여용 조성물은 에멀젼 또는 멸균 용액제일 수 있다. 용매 또는 비히클로서, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 특히, 올리브유 또는 주사용 유기 에스테르, 예를 들면 에틸 올레에이트를 사용할수 있다. 이들 조성물은 또한 아주반트, 특히 습윤제, 등장화제, 유화제, 분산제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 멸균은 여러 방식으로 수행할 수 있는데, 예를 들면 박테리아용 필터를 사용하거나, 방사선을 조사하거나, 또는 가열함으로써 수행할 수 있다. 이들은 또한 사용할 때 멸균수 또는 임의의 다른 주사용 멸균 매질에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 제조될 수 있다.

직장 투여용 조성물은 좌제 또는 직장 투여용 캡슐제이며, 이들은 활성 성분 이외에 부형제, 예컨대 코코아 버터, 반합성 글리세리드 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유한다.

조성물은 또한 에어로졸일 수 있다. 액체 에어로졸 형태로 사용하는 경우,조성물은 안정한 멸균용액제이거나, 또는 사용할 때 비발열성 멸균수, 염수 또는 임의의 다른 제약상 허용되는 비히클에 용해되는 고체 조성물일 수 있다. 직접 흡입하기 위한 무수 에어로졸 형태로 사용하는 경우, 활성 성분은 미분되어 수용성 고체 희석제 또는 비히클, 예를 들면 덱스트란, 만니톨 또는 락토스와 함께혼합된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 제약 조성물 또는 단일 단위 투여 형태이다. 본 발명의 제약 조성물 및 단일 단위 투여 형태는 예방상 또는 치료 유효량의 1종 이상의 예방제 또는 치료제 (예를 들면, 본 발명의 화합물, 또는 다른 예방제 또는 치료제), 및 통상적으로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다.

특정 실시양태 및 문맥에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 동물, 보다 구체적으로는 인간에 사용될 수 있는 것으로 정부 또는 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 또는 일반적으로 공인된 약전에 열거되어 있는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아주반트 (예를 들면, 프로인트(Freund) 아주반트 (완전 및 불완전 아주반트)), 부형제 또는 비히클을 나타낸다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물 또는 식물 기원의 오일 또는 합성 오일을 비롯한 오일, 예를 들면 낙화생유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등일 수 있다. 물은 제약 조성물이 정맥내 투여되는 경우에 바람직한 담체이다.

염수 용액, 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액은 또한 액체 담체, 특히 주사용 용액으로 사용될 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다.

통상적인 제약 조성물 및 투여 형태는 1종 이상의 부형제를 포함한다. 적합한 부형제는 제약 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 적합한 부형제의 비제한적 예로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀,밀가루, 호분, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 있다. 특정 부형제가 제약 조성물 또는 투여 형태에 혼입되는 것이 적합한지 여부는 투여 형태가 대상체에게 투여되는 방식 및 투여 형태에 포함된 특정 활성 성분 등을 비롯한 당업계에 공지된 다양한 요소에 좌우된다. 경우에 따라, 조성물 또는 단일 단위 투여 형태는 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 활성 성분을 포함하는 무수 제약 조성물 및 투여 형태를 포함한다. 예를 들면, 물을 첨가하는 것은 시간에 경과함에 따라 제제의 특성 (예컨대,저장 수명 또는 안정성)을 결정하기 위한 모의 장기 보관 수단으로서 제약 업계에 널리 허용되어 있다. 예를들면, 문헌 [Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY,NY, 1995, pp. 379 80]을 참조한다. 실제로, 물 및 열이 몇몇 화합물의 분해를 가속화시킨다. 따라서, 통상적으로 제제를 제조, 취급, 포장, 보관, 운송 및 사용하는 동안에는 수분 및/또는 습기가 발생하므로 물이 제제에 미치는 영향이 매우 중요할 수 있다.

본 발명의 무수 제약 조성물 및 투여 형태는 무수 또는 저수분 성분 및 낮은 수분 또는 낮은 습도 조건을 이용하여 제조할 수 있다. 제조, 포장 및/또는 보관 중에 수분 및/또는 습기와 실질적으로 접촉할 것이 예상된다면, 락토스, 및 1급 또는 2급 아민을 포함하는 1종 이상의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물 및 투여형태는 무수물 형태인 것이 바람직하다.무수 제약 조성물은 그의 무수 특성이 유지되도록 제조하여 보관해야 한다. 따라서, 무수 조성물이 물에 노출되는 것을 방지하고 적합한 규격 키트에 포함될 수 있도록 공지된 물질을 사용하여 포장하는 것이 바람직하다. 적합한 포장의 예로는, 밀봉형 호일, 플라스틱, 단위 투여 용기 (예를 들면, 바이알), 블리스터 팩 및 스트립 팩이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 또한 활성 성분의 분해 속도를 감소시키는 1종 이상의 화합물을 포함하는 제약 조성물 및 투여 형태를 포함한다. 이러한 화합물 (본원에서는 "안정화제"로 지칭함)로는 항산화제 (예컨대, 아스코르브산), pH 완충제 또는 염 완충제가 있으나 이에 한정되지는 않는다.

제약 조성물 및 단일 단위 투여 형태는 용액제, 현탁액제, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 분제, 서방형 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 투여용 제제는 표준 담체, 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 이러한 조성물 및 투여 형태는 예방상 또는 치료 유효량의 예방제 또는 치료제를 바람직하게는 정제된 형태로 적합한 양의 담체와 함께 함유하며, 대상체에 투여하기 적절한 형태로 제공될 것이다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 단일 단위 투여 형태는 멸균 상태이며, 대상체, 바람직하게는 동물 대상체, 보다 바람직하게는 포유동물 대상체, 가장 바람직하게는 인간 대상체에게 투여하기 적합한 형태이다.

본 발명의 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 투여 경로의 예로는 비경구 투여 경로, 예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 피하, 경구, 구강, 설하, 흡입, 비강내, 경피, 국소, 경점막, 종양내, 활액내 및 직장 투여 경로가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 조성물은 통상적인 절차에 따라 인간에게 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비강내 또는 국소 투여되도록 변형된 제약 조성물로 제제화된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 통상적인 절차에 따라 인간에게 피하 투여되는 조성물로 제제화된다.

통상적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우에, 조성물은 또한 가용화제 및 국부 마취제 (예컨대, 리그노카인)를 포함하여 주사 부위의 통증을 진정시킬 수 있다.

투여 형태의 예로는 정제; 캐플릿; 캡슐제, 예컨대 연질 탄성 젤라틴 캡슐제; 카세; 트로키; 로젠지; 분산액제; 좌제; 연고; 습포제 (찜질약);페이스트; 분제; 드레싱; 크림; 고약; 용액제; 패치; 에어로졸 (예를 들면, 비강 스프레이 또는 흡입기); 겔; 현탁액제 (예를 들면, 수성 또는 비수성 액체 현탁액제, 수중유 에멀젼, 또는 유중 수 액체 에멀젼), 용액제 및 엘릭시르를 포함하는 대상체에게 경구 또는 점막 투여하기 적합한 액체 투여 형태; 대상체에게 비경구 투여하기에 적합한 액체 투여 형태; 및 복원되었을 때 대상체에게 비경구 투여하기에 적합한

액체 투여 형태를 제공할 수 있는 멸균 고체 (예를 들면, 결정형 또는 무정형고체)가 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 조성물, 형태 및 투여 형태의 유형은 통상적으로 이들의 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 염증 초기 치료에 사용되는 투여 형태는 본 발명의 추출물을 투여 형태에 포함된 양보다 더 많은 양으로 함유할 수 있다. 이와 유사하게, 비경구 투여 형태는 1종 이상의 활성 성분을 동일한 질환 또는 장애 치료에 사용되는 경구 투여 형태에 포함된 양보다 더 적은 양으로 함유할 수 있다. 상기 방식 및 본 발명에 포함되는 특정 투여 형태를 변형시키는 또 다른 방식은 당업자에게 이미 명백할 것이다. 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990)]을 참조한다.

본 발명 조성물의 성분은 일반적으로, 예를 들면 활성제의 양을 표기한 앰풀 또는 샤세와 같은 밀봉된 용기 중 무수 동결건조된 분말 또는 수분 무함유 농축물로서, 단위 투여 형태 중에 별개로 또는 함께 혼합된 형태로 제공된다. 조성물을 주입에 의해 투여하는 경우, 이 조성물은 멸균된 제약 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 용기에 분배될 수 있다. 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 투여하기 전에 성분을 혼합할 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수 앰풀을 제공할 수 있다.

본 발명의 통상적인 투여 형태는 본 발명의 추출물을 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg/일 범위의 양으로 포함하며, 이는 오전에 1일 1회 단일 투여하거나, 바람직하게는 하루동안 식사와 함께 분할 투여한다. 본 발명의 특정 투여 형태는 본 발명의 추출물 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4,0.5, 1.0, 2.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 100, 200, 250, 500 또는 1000 mg을 갖는다.

경구 투여하기 적합한 본 발명의 제약 조성물은 별개의 투여 형태, 예컨대 정제 (예를 들면, 츄잉 정제), 캐플릿, 캡슐제 및 액체 (예를 들면, 향미 시럽) 등의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 투여 형태는 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유하며, 당업자에게 공지된 조제 방법에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 문헌

[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990)]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 경구 투여 형태는 고체이며, 상기 단락에 상세하게 기재된 바와 같이 무수 성분을 사용하여 무수 조건하에 제조한다.

그러나, 본 발명의 범위는 무수 고체 경구 투여 형태 이외의 것까지 확장된다. 본 발명의 통상적인 경구 투여 형태는 활성 성분(들)을 통상적인 제약 합성 기술에 따라 1종 이상의 부형제와 친밀 혼합물로서 합하여 제조한다. 부형제는 투여하기 바람직한 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 경구 투여용 액체 또는 에어로졸 투여 형태에 사용하기 적합한 부형제로는 물, 글리콜,오일, 알코올, 향미제, 보존제 및 착색제가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 고체 경구 투여 형태 (예를 들면,분제, 정제, 캡슐제 및 캐플릿)에 사용하기 적합한 부형제로는 전분, 당, 미정질 셀룰로스, 희석제, 과립화제,윤활제, 결합제 및 붕해제가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 고체 부형제가 사용되는 경우에는 정제 및 캡슐제가 투여하기 쉽기 때문에 가장 유리한 경구 투여 단위 형태로 나타난다. 바람직한 경우, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 코팅될 수 있다. 이러한 투여 형태는 임의의 조제 방법에 의해 제조될 수 있다.

일반적으로, 제약 조성물 및 투여 형태는 활성 성분을 액체 담체,미분된 고체 담체, 또는 이들 둘 모두와 균일하고 친밀하게 혼합한 후에, 필요한 경우에는 생성물을 원하는 형상으로 성형시켜 제조한다.예를 들면, 정제는 압축 또는 성형에 의해 제조할 수 있다. 압축된 정제는 임의로는 부형제와 혼합된 자유 유동 형태 (예컨대, 분말 또는 과립)의 활성 성분을 적합한 기계에서 압축시켜 제조할 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형하여 제조할 수 있다.

본 발명의 경구 투여 형태에 사용될 수 있는 부형제의 예로는 결합제, 충전제, 붕해제 및 윤활제가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 제약 조성물 및 투여 형태에 사용하기 적합한 결합제로는 옥수수 전분, 감자 전분 또는 다른 전분,젤라틴, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아 검, 나트륨 알기네이트, 알긴산, 다른 알기네이트, 분말 트래거캔스, 구아 검, 셀룰로스 및 그의 유도체 (예를 들면, 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스 칼슘, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스), 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 전호화된 전분, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스, (예를 들면, 번호 2208, 2906, 2910), 미정질 셀룰로스, 및 이들의 혼합물이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본원에 개시된 제약 조성물 및 투여 형태에 사용하기 적합한 충전제의 예로는 활석, 탄산칼슘 (예를 들면, 과립 또는 분말), 미정질 셀룰로스, 분말셀룰로스, 덱스트레이트, 카올린, 만니톨, 규산, 소르비톨, 전분, 전호화된 전분, 및 이들의 혼합물이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 제약 조성물에 포함된 결합제 또는 충전재는 통상적으로 제약 조성물 또는 투여 형태의 약 50 내지 약 99 중량의 양으로 존재한다. 미정질 셀룰로스의 적합한 형태로는 아비셀(AVICEL) PH 101, 아비셀 PH 103, 아비셀 RC 581, 아비셀 PH 105로 시판되는 물질 (에프엠씨 코포레이션, 아메리칸 비스코스 디비젼, 아비셀 세일즈 (FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales; 미국 펜실베니아주 마쿠스 훅 소재)로부터 시판됨), 및 이들의 혼합물이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 구체적인 결합제는 아비셀 RC 581로 시판되는 미정질 셀룰로스와 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스의 혼합물이다. 적합한 무수 또는 저수분 부형제 또는 첨가제로는 아비셀 PH 103(상표명) 및 전분 1500 LM이 있다.

본 발명의 조성물에 붕해제를 사용함으로써 수성 환경에 노출되었을 때 붕해되는 정제를 제공한다. 너무 많은 붕해제를 함유하는 정제는 보관시 붕해될 수 있으며, 너무 적은 붕해제를 함유하는 정제는 원하는 속도로 붕해되지 않거나 원하는 조건하에서 붕해되지 않을 수 있다. 따라서, 너무 많지도 너무 적지도 않아 활성 성분의 방출을 유해하게 변경시키지 않는 충분한 양의 붕해제를 사용하여 본 발명의 고체 경구 투여 형태를 형성해야 한다. 사용되는 붕해제의 양은 제제의 유형에 따라 달라지며, 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 통상적인 제약 조성물은 약 0.5 내지 약 15 중량%, 구체적으로는 약 1 내지 약 5 중량%의 붕해제를 포함한다. 본 발명의 제약 조성물 및 투여 형태에 사용될 수 있는 붕해제로는 한천, 알긴산, 탄산칼슘, 미정질 셀룰로스, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴라크릴린 칼륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 전호화된 전분, 다른 전분, 점토, 다른 알긴, 다른 셀룰로스, 검, 및 이들의 혼합물이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 제약 조성물 및 투여 형태에 사용될 수 있는 윤활제로는 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일, 미네랄 경유, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 글리콜, 스테아르산, 나트륨 라우릴 술페이트, 활석, 수소화된 식물성 오일 (예를 들면, 낙화생유, 면실유, 해바라기씨유, 참깨유,올리브유, 옥수수 오일 및 대두유), 아연 스테아레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 라우레에이트, 한천, 및 이들의 혼합물이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 추가의 윤활제로는, 예를 들면 실로이드 실리카 겔 (AEROSIL 200, 더블유.알. 그레이스 코포레이션 (W.R. Grace Co.; 미국 매릴랜드주 발티모어 소재)에서 제조됨), 합성 실리카의 응고된 에어로졸 (데구사 코포레이션 (Degussa Co.; 미국 텍사스주 피아노 소재)에서 시판됨), CAB O SIL(발열성 이산화규소 제품, 캐봇 코포레이션 (Cabot Co.; 미국 메사추세츠주 보스톤 소재)에서 시판됨), 및 이들의 혼합물이 있다. 사용되는 경우, 윤활제는 통상적으로 이들이 혼입되는 제약 조성물 또는 투여 형태의 약 1 중량% 미만의 양으로 사용된다.

본 발명의 화합물은 예컨대 당업자에게 공지된 제어 방출 수단 또는 전달 장치로 투여할 수 있다. 이들의 예로는 미국 특허 제3,845,770호, 동 제3,916,899호, 동 제3,536,809호, 동 제3,598,123호, 동 제4,008,719호, 동 제5,674,533호, 동 제5,059,595호,동 제5,591,767호, 동 제5,120,548호, 동 제5,073,543호,동 제5,639,476호, 동 제5,354,556호 및 동 제5,733,566호 (이들 문헌은 각각 그 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 것들이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 투여 형태는, 예를 들면 다양한 비율에서 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해 히드로프로필메틸 셀룰로스, 다른 중합체 매트릭스, 겔, 투과가능한 막, 삼투 시스템, 다층 코팅, 미립자, 리포좀, 미소구, 또는 이들의 조합물을 이용하여, 1종 이상의 활성 성분을 지연 방출 또는 제어 방출시킬 때 사용할 수 있다. 본원에 기재된 것들을 비롯하여 당업자에게 공지된 적합한 제어 방출형 제제는 본 발명의 활성 성분과 함께 사용하기 위해 용이하게 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명은 경구 투여에 적합한 단일 단위 투여 형태, 예컨대 제어 방출형으로 변형된 정제,캡슐제, 겔캡 및 캐플릿 등을 포함한다.

모든 제어 방출형 약품은 이들에 상응하는 비-제어 방출형 약품에 의해 달성되는 것보다 개선된 약물 요법을 제공하고자 하는 공통적인 목적을 갖는다. 이상적으로, 의학적 처치에 가장 알맞게 고안된 제어 방출형 제제의 사용은 최소량의 약물 물질을 사용하여 최소 시간 내에 증상을 치유 또는 제어함을 특징으로 한다. 제어 방출형 제제의 이점은 약물의 확장된 활성, 투여 횟수의 감소 및 대상체의 순응성 증가를 포함한다. 또한, 제어 방출형 제제를 사용하여 약물의 작용 개시 시간 또는 다른 특성, 예컨대 약물의 혈중 농도에 영향을 끼칠 수 있으며, 이에 따라 부작용 (역효과) 발생에도 영향을 끼칠 수 있다.

대부분의 제어 방출형 제제는 처음에는 원하는 치료 효과를 즉각적으로 나타내는 양의 약물 (활성 성분)을 방출하고, 연장된 기간에 걸쳐 상기 치료 또는 예방 효과 수준을 지속시키는 양의 약물을 단계적 및 지속적으로 방출하도록 고안되어 있다. 이와 같이 체내에서 일정한 약물 수준을 유지하기 위해, 약물은 대사되어 인체에서 분비되는 약물의 양을 대체하는 속도로 투여 형태로부터 방출되어야 한다. 활성 성분의 제어 방출은 pH, 온도,효소, 물, 또는 다른 생리학적 조건 또는 화합물 등을 비롯한 다양한 조건에 의해 자극될 수 있다.

특정 실시양태에서, 약물은 정맥내 주입, 이식가능한 삼투압 펌프, 경피 팻치, 리포좀, 또는 기타 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (문헌 [Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)]; [Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980)]; [Saudek et al., N. Engl. J. Med.321:574 (1989)] 참조). 다른 실시양태에서, 중합 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제어 방출시스템이 대상체에서 당업자에 의해 결정된 적합한 부위에서 위치할 수 있으며, 즉, 이로써 전신 투여량의 일부 만이 필요하다 (예를 들어, 문헌 [Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol.2, pp. 115-138(1984)] 참조). 기타 제어 방출 시스템은 랑거 (Langer [Science 249:1527-1533 (1990)])에 의해 재검토되어 논의되었다. 활성 성분은 고체 내부 매트릭스, 예를 들어 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리부틸메타크릴레이트,가소화된 또는 비가소화된 폴리비닐클로라이드, 가소화된 나일론, 가소화된 폴리에틸렌테레프탈레이트, 천연 고무, 폴리이소프렌, 폴리이소부틸렌, 폴리부타디엔, 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐아세테이트, 공중합체, 실리콘고무, 폴리디메틸실록산, 실리콘 카르보네이트 공중합체, 친수성 중합체, 예컨대 아크릴산 및 메타크릴산의 에스테르의 히드로겔, 콜라겐, 가교 폴리비닐알코올 및 부분적으로 가수분해된 가교 폴리비닐 아세테이트 중에 분산될 수 있으며, 이는 외부 중합체막, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌/프로필렌 공중합체, 에틸렌/에틸 아크릴레이트 공중합체, 에틸렌/비닐아세테이트 공중합체, 실리콘 고무, 폴리디메틸 실록산, 네오프렌 고무, 염화 폴리에틸렌, 폴리비닐클로라이드; 비닐 아세테이트, 비닐리덴 클로라이드, 에틸렌 및 프로필렌과의 비닐클로라이드 공중합체, 이오노머 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 부틸 고무 에피클로로히드린 고무, 에틸렌/비닐 알코올 공중합체, 에틸렌/비닐 아세테이트/비닐 알코올 삼중중합체, 및 에틸렌/비닐옥시에탄올 공중합체에 의해 둘러싸여 있고, 이는 체액에 불용성이다. 이어서, 활성 성분은 방출 속도 제어 단계에서 외부 중합체막을 통해 확산된다. 그러한 비경구 조성물에서 활성 성분의 비율은 그의 특정 성질 뿐만 아니라 대상체의 필요에 따라 매우 달라진다.

본 발명은 또한 비경구 투여 형태도 제공한다. 비경구 투여 형태는 피하, 정맥내 (볼루스 주사 포함), 근육내 및 동맥내 투여 경로 등을 비롯한 다양한 경로로 대상체에게 투여될수 있다. 이들 비경구 투여 경로는 통상적으로 오염 물질에 대한 대상체의 자연적 방어 경로를 피해가기 때문에, 비경구 투여 형태는 멸균 상태이거나 대상체에 투여하기 전에 멸균시킬 수 있는 것이 바람직하다. 비경구 투여 형태의 예로는 주사용 용액, 제약상 허용되는 주사용 비히클에 용해되거나 현탁시킬 수 있는 무수 제품, 주사용 현탁액, 및 에멀젼이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 비경구 투여 형태를 제공하는 데 사용될 수 있는 적합한 비히클이 당업자에게 공지되어 있다. 이들 의 예로는 주사용수 (USP); 수성 비히클, 예컨대 나트륨 클로라이드 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액,덱스트로스 및 나트륨 클로라이드 주사액 및 락테이트화된 링거 주사액 등; 수혼화성 비히클, 예컨대 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜 등; 및 비수성 비히클, 예컨대 옥수수유, 면실유, 낙화생유, 참깨유, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트 및 벤질 벤조에이트 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다.또한, 본원에 개시된 1종 이상의 활성 성분의 용해도를 증가시키는 화합물도 본 발명의 비경구 투여 형태에 혼입될 수 있다.

본 발명은 또한 경피, 국소 및 점막 투여 형태를 제공한다. 본 발명의 경피, 국소 및 점막 투여 형태로는 안구용 용액, 스프레이, 에어로졸, 크림, 로션, 연고, 겔, 용액, 에멀젼, 현탁액 또는 당업자에 공지된 다른 형태가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th, 18th and 20th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 2000)] 및 [Introduction to Pharmaceutical dose form, 4th ed., Lea Febiger, Philadelphia (1985)]을 참조한다.

구강내 점막 조직을 처치하기 적합한 투여 형태는 구강세정용 용액 또는 경구용 겔 제제로 제제화될 수 있다.또한, 경피 투여 형태는 "저장소형" 또는 "매트릭스형" 패치를 포함하며, 이들은 피부 또는 상처 부위에 특정 기간 동안 적용되어 원하는 양의 활성 성분을 침투시킬 수 있다.

본 발명에 포함되는 적합한 부형제 (예를 들면, 담체 및 희석제), 및 경피, 국소 및 점막 투여 형태를 제공하는데 사용될 수 있는 다른 물질은 제약 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 이들은 주어진 제약 조성물 또는 투여 형태가 적용되는 특정 조직에 따라 달라진다. 이러한 사실을 고려하여, 통상적인 부형제로는 로션, 팅크,크림, 에멀젼, 겔 또는 연고를 형성하는 물, 아세톤, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄 1,3 디올,이소프로필 미리스테이트, 이소프로필팔미테이트, 미네랄 오일, 및 이들의 혼합물 등이 있으며, 이들은 비독성이고 제약상 허용되는 것이다. 바람직한 경우, 보습제 또는 습윤제를 제약 조성물 및 투여 형태에 첨가할 수도 있다. 이러한 부가 성분의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th, 18th and 20th eds.,Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 2000)]를 참조한다.

치료될 특정 조직에 따라, 추가의 성분을 본 발명의 활성 성분으로 처치하기 전에 사용하거나, 본 발명의 활성 성분과 함께 사용하거나, 또는 본 발명의 활성 성분으로 처치한 후에 사용할 수 있다. 예를 들면, 침투 증진제를 사용하여 조직에 활성 성분을 전달시키는 것을 보조할 수 있다. 적합한 침투 증진제로는 아세톤; 다양한 알코올, 예컨대 에탄올, 올레일 및 테트라히드로푸릴; 알킬 술폭시드, 예컨대 디메틸 술폭시드; 디메틸 아세트아미드; 디메틸 포름아미드; 폴리에틸렌 글리콜; 피롤리돈, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 콜리돈 (Kollidon) 등급(포비돈, 폴리비돈); 우레아; 및 다양한 수용성 또는 수불용성 당 에스테르, 예컨대 Tween 80 (폴리소르베이트80) 및 Span 60 (소르비탄 모노스테아레이트)이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

또한, 제약 조성물 또는 투여 형태의 pH, 또는 제약 조성물 또는 투여 형태가 적용되는 조직의 pH를 조정하여 1 종 이상의 활성 성분의 전달을 개선시킬 수 있다. 이와 유사하게, 용매 담체의 극성, 그의 이온 강도 또는 긴장성을 조정하여 상기 전달을 개선시킬 수 있다. 화합물, 예컨대 스테아레이트를 제약 조성물 또는 투여 형태에 첨가하여 1종 이상의 활성 성분의 친수성 또는 친유성을 유리하게 변경시킴으로써 상기 전달을 개선시킬 수도 있다. 이와 관련하여, 스테아레이트는 제제화용 액체 비히클, 유화제 또는 계면활성제, 및 전달 증진제 또는 침투 증진제로서 작용할 수 있다. 활성 성분의 다른 염, 수화물 또는 용매화물을 사용하여 생성된 조성물의 특성을 더 조정할 수 있다.

인간을 치료하는 경우, 의사는 예방 또는 치유적 치료, 및 치료할 대상체의 연령, 체중, 감염 단계 및 이들에게 특이적인 다른 요소에 따라 가장 적절한 것으로 여겨지는 투여 용량을 결정할 것이다. 일반적으로, 성인의 경우, 투여량은 약 1 내지 약 1000 mg/일, 약 5 내지 약 250 mg/일, 또는 약 10 내지 50 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 성인 1인 당 약 5 내지 약 400 mg/일, 보다 바람직하게는 25 내지 200 mg/일이다. 약 50 내지 약 500 mg/일의 투여 속도도 또한 바람직하다.

추가 측면에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 인플루엔자 바이러스에 대해 높은 치료 지수를 갖는 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하여 상기 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 치료 지수는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예컨대 하기 실시예에 기재한 방법에 따라 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료 지수는 인플루엔자 바이러스에 유효한 화합물의 농도에 대한, 독성을 나타내는 화합물의 농도의 비율이다. 독성은 세포독성(예를 들면, IC50 또는 IC90) 및 치사량 (예를 들면, LD50 또는 LD90)을 비롯한 당업자에게 공지된 임의의 기술로측정할 수 있다. 이와 마찬가지로, 유효 농도 (예를 들면, EC50 또는 EC90) 및 유효 투여량 (예를 들면, ED50 또는 ED90)을 비롯한 당업자에게 공지된 임의의 기술을 이용하여 유효 농도를 측정할 수 있다. 바람직하게는, 유사한 측정값을 비율로 비교한다 (예를 들면, IC50/EC50, IC90/EC90, LD50/ED50 또는 LD90/ED90). 특정 실시양태에서, 치료 지수는 2.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 125.0, 150.0 또는 그 이상만큼 높을 수 있다.

장애 또는 그의 1종 이상의 징후를 예방, 치료, 관리 또는 개선시키는데 유효한 본 발명 화합물 또는 조성물의 양은 질환 또는 증상의 특성 및 중증도, 및 활성 성분이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 투여 횟수 및 투여량 또한 투여된 특정 요법제 (예를 들면, 치료제 또는 예방제), 장애, 질환 또는 증상의 중증도, 투여 경로뿐만 아니라 대상체의 연령, 체중, 반응 및 과거 병력에 의존하는 각 대상체에 대한 특이적 요소에 따라 달라질 것이다. 유효 투여량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 투여량-반응 곡선으로부터 외삽법에 의해 추정할 수 있다.

조성물 투여량의 예는, 대상체 또는 샘플 중량 1 kg 당 활성 화합물의 양 (mg 또는 ㎍)으로서, 예를 들면 약 10 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 100 ㎍/kg 내지 약 25 mg/kg, 또는 약 100 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg을 포함한다.

본 발명의 조성물의 경우, 대상체에 투여된 투여량은 통상적으로 활성 화합물의 중량에 기초하여 대상체 체중 1kg 당 0.140 mg 내지 3 mg이다. 바람직하게는, 대상체에 투여된 투여량은 대상체 체중 1 kg 당 0.20 mg 내지 2.00 mg 또는 0.30 mg 내지 1.50 mg이다.

일반적으로, 본원에 기재된 증상에 대해 제안된 본 발명 조성물의 일일 투여량 범위는 약 0.1 내지 약 1000 mg/일이며, 이는 1일 1회 단일 투여되거나 또는 하루 동안 분할 투여된다. 한 실시양태에서, 상기 일일 투여량은 동등한 양으로 분할되어 매일 2회 투여된다. 일일 투여량 범위는, 구체적으로는 약 10 내지 약 200 mg/일, 보다 구체적으로는 약 10 내지 약 150 mg/일, 보다 더 구체적으로는 약 25 내지 약 100 mg/일이어야 한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 몇몇 경우에는 활성 성분을 본원에 개시된 투여량 범위를 벗어난 투여량으로 사용할 필요가 있을 수 있다. 또한, 임상의 또는 치료 담당의는 대상체의 반응과 관련하여 요법을 언제 어떻게 중단,조정 또는 종결해야 할지 알고 있을 것임에 주목한다.

당업자에게 이미 공지된 바와 같이, 상이한 질환 및 증상에 대해 상이한 치료 유효량을 적용할 수 있다. 이와 유사하게, 상기 장애를 예방, 관리, 치료 또는 개선시키기에는 충분하지만 본 발명의 조성물과 관련된 부작용을 유발하기에는 불충분하거나 상기 부작용을 감소시키기에 충분한 양이 또한 상기 기재된 투여량 및 투여 횟수 계획에 포함된다. 또한, 대상체에게 본 발명의 조성물을 다중 투여량으로 투여하는 경우, 모든 투여량이 동일할 필요는 없다. 예를 들면, 대상체에 투여되는 투여량을 증가시켜 조성물의 예방 또는 치료 효과를 개선시킬 수 있으며, 이를 감소시켜 특정 대상체가 경험하는 1종 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서 본 발명자들은 Raw264.7 murine 대식세포 및 RBL-2H3 rat 호염기 세포주에 대한 짚신나물(Agrimonia pilosa, 이하 'AP 라 함)의 in vitro 항-염증 및 항-앨러지 효과를 조사하였다. 또한 본 발명자들은 ovalbumin(OVA)-유도된 마우스 모델에서 기도(airway) 염증에 대한 AP의 항-천식(athmatic) 효과를 조사하였다.

AP는 LPS-유도된 Raw264.7 세포에 대한 전구염증(pro-inflammatory) 사이토카인들 및 산화 질소(NO), proglandin E₂(PGE₂)과 같은 염증성 매개체의 생성을 억제하였다. AP는 또한 IgE-DNP 유도된 RBL-2H3 세포 활성 억제를 통한 탈과립(degranulation)과 interleukin(IL)-4 생성을 저해하였다. 또한 AP는 OVA-유도된 기도 염증 모델에 대한 기도-반응성증가(airway-hyperresponsiveness), BALF에서 사이토카인 생성 및 폐로 면역 세포의 침착을 감소시켰다.

본 발명의 결과는 AP가 대식세포와 호염기세포의 활성화를 억제하고 또한 OVA-유도된 기도 염증을 저해한다는 것을 나타낸다. 이 결과들은 AP가 여러 염증성 질환에 대한 강력한 항 염증 효과를 가진다는 것을 나타낸다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

AP 는 LPS -유도된 RAW264 .7 세포에 대한 NO , PGE ₂ 및 전구염증성 사이토카인 생성을 저해한다

NO, PGE₂ 및 전구염증성 사이토카인 생성에 대한 AP의 효과를 조사하기 위하여, NO는 Griess 시약에 의하여 그리고 PGE₂ , IL-1β및 IL-6는 ELISA에 의하여 측정하였다. LPS 만 처리한 세포들은 정상 세포와 비교하여 NO, PGE₂ 및 사이토카인 생성이 크게 증가하였다. AP는 도 1a ~ d에서 보여주는 것과 같이 NO, PGE₂의 수준을 현저하게 저해한다. 이들 데이터들은 AP가 IL-1β 및 IL-6와 같은 전구염증성 사이토카인, NO, PGE₂ 분비를 억제하는 활성을 가진다는 것을 나타낸다.

AP 는 DNP - IgE -유도된 RBL -2 H3 세포에 대한 mast 세포 활성화를 저해한다

본 발명자들은 AP가 인 비트로 또는 인 비보에서 항 앨러지 효과를 가지는지를 조사하였다. AP 처리에 의한 사이토카인 발현 및 항원 유도된 mast 세포 탈과립화의 조절을 조사하였다. 마스트 세포 탈과립과 사이토카인 생성을 β-hexosaminidase 및 ELISA 분석에 의하여 각각 측정하였다. 도 2에서 나타낸 것과 같이, AP는 용량 의존적인 형태로 DNP-IgE-유도된 탈과립 및 IL-4 생성을 현저하게 저해하였다.

AP 는 OVA -유도된 기도( airway ) 염증에 대한 IL -4, IL -5 및 IgE 생성을 저해한다

AP가 인 비보에서 항 염증 효과를 가지는지를 조사하기 본 발명자들은 BAL fluid 및 혈청에서 각각 사이토카인 및 IgE 생성에 대한 AP의 효과를 조사하였다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, AP는 OVA-유도된 IL-4, IL-5 및 IgE 생산을 현저하게 저해하였다.

AP 는 OVA -유도된 기도 염증에 대한 폐로 세포 침착 및 기도 과반응성(hyper-responsiveness)을 저해한다

AP가 OVA-유도된 기도 염증에 대한 AHR를 저해하는지를 조사하기 위하여, 최종 OVA 챌린지 24시간 후 Penh 값을 계산하여 AHR을 평가하였다. OVA-처리된 군의 Penh 값은 정상 군의 값과 비교하여 현저하게 증가하였다. AP 처리된 군에서, 그 Penh 값은 OVA-처리된 군의 것과 비교하여 크게 감소하였다(도 4a). 폐로 세포 투과에 대한 AP의 효과는 폐 조직 H&E 염색을 모티너링하여 수행하였다. OVA 군은 정상 군과 비교하여 기도 벽에서 더 많은 세포를 가진다. 그러나 AP는 용량 의존적으로 폐 기도 벽으로 세포 투과를 현저하게 감소시켰다(도 4b). 이 결과들은 동물 모델에서 AP가 강력한 항 천식 효과를 가진다는 것을 나타낸다.

본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 RBL-2H3 세포에서 β-hexosaminidase 분석 및 ELISA를 통해서 탈과립과 IL-4 사이토카인 생성을 저해한다는 것을 입증하였고, 본 발명의 데이터는 또한 AP가 기도벽으로 백혈구의 침투, 사이토카인 발현 및 기도 과민반응을 저해한다는 것을 보였다.

따라서 AP의 메탄올 추출물은 LPS-자극된 RAW264.7 세포에서 NO, PGE₂ 및 전구성 염증 사이토카인 생성을 저해하고, 또한 AP는 mast 세포 활성화를 저해한다. 또한 AP는 OVA-유도된 기도 염증을 완화한다. 따라서 AP는 여러 염증 관련 질환의 우수한 치료제 후보물질일 수 있다.

도 1은 염증성 매개체 생성에 대한 AP의 효과를 나타낸 그림.
RAW264.7 세포를 여러 농도(0, 50, 100, 200㎍/ml)의 AP를 전처리한 후 18시간 동안 LPS로 처리하였다. (a,b) 배양 상등액을 모아서 아질산염(nitrite) 생성 및 PGE₂.에 대하여 분석하였다. (c,d) 100ng/ml LPS와 시료를 동시에 RAW264.7 세포에 24시간 처리한 후 분비된 사이토카인인 IL-1 및 IL-6의 양을 나타낸다. 그 결과들은 세번의 독립적인 실험으로부터 평균± 표준 편차로 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01 및 **p<0.001를 LPS 처리된 세포와 비교하였다.
도 2는 AP가 DNP-IgE-유도된 RBL-2H3 세포에 대한 탈과립화 및 IL-4 생성을 저해하는 것을 보여주는 그림.
세포를 DNP로 배양하기 1시간 전에 두 시간 동안 AP로 전처리하였다.
도 2(a) β-hexosaminidase 분석에 의하여 결정된 탈과립화를 나타낸다. (b) 세포를 DNP로 배양하기 4시간 전에 두 시간 동안 AP로 전처리하였다. IL-4 생성을 ELISA에 의하여 결정하였다. 그 결과는 세번의 독립적인 실험으로부터 평균± 표준 편차로 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01 및 **p<0.001를 DNP만 단독 처리된 세포와 비교하였다.
도 3은 AP가 OVA-유도된 기도 염증 모델에서 혈청 내 IgE 및 BALF내 IL-4, IL-5 생성을 저해하는 것을 나타내는 그림.
혈청 및 BALF를 마지막 ovalbumin(OVA)-처리된 마우스에서 48시간 후에 수집하였다. 각 수준을 ELISA (n=5)를 사용하여 분석하였다.
(a,b) BALF 내의 IL-4 및 lL-5 분비량을 나타내고,
(c) 혈청 내에 전체 IgE 분비량을 나타낸다. Normal:PBS 만 처리된 정상 마우스, Control: OVA-감작화된(sensitized) 마우스, 50mg/kg: AP (50mg/kg)+ OVA-감작화된(sensitized) 마우스, 100mg/kg: AP (100mg/kg)+OVA-감작화된(sensitized) 마우스. 값들은 평균± 표준 편차로 나타낸다(n=5/group). *대조군과 유의차(Significant difference), P<0.05.
도 4는 AP가 OVA-유도된 기도 염증 모델에서 기도 과민성(hyper-responsiveness) 및 폐로 세포 투과를 억제하는 것을 나타내는 그림.
(a) AHR는 OVA-챌린지 후 24시간 동안 methacholine(0mg/ml-60mg/ml)을 증가시키면서 혈류량 측정법(plethysmography)을 사용하여 측정하였다. Normal:PBS 만 처리된 정상 마우스, Control: OVA-감작화된(sensitized) 마우스, 50mg/kg: AP (50mg/kg)+ OVA-감작화된(sensitized) 마우스, 100mg/kg: AP (100mg/kg)+OVA-감작화된(sensitized) 마우스.
(b) 최종 OVA 챌린지 48시간 후에 수행된 폐 조직의 조직학 조사 결과를 나타낸다. 폐 조직을 고정화하고 4μm 두께로 절편화하고, H&E 용액으로 염색하였다( x20 확대). Normal:PBS 만 처리된 정상 마우스, Control: OVA-감작화된(sensitized) 마우스, 50mg/kg: AP (50mg/kg)+ OVA-감작화된(sensitized) 마우스, 100mg/kg: AP (100mg/kg)+OVA-감작화된(sensitized) 마우스. 값들은 평균± 표준 편차로 나타낸다(n=5/group).

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1:시약 및 항체들

프로스타그란딘 E2 Parameter Assay Kit는 R&D systems(Minneapolis, USA)사로부터 구입하였다. TNF-알파, IL-6, IL-1βELISA Set (BD OptEIA TMSet) 및 TMB Substrate Reagent Set는 BD Biosciences (Franklin Lakes, SD, USA)로부터 구입하였다. iNOS 항체는 Upstate Biotechnology (CA, USA)로부터 구입하였다. COX-2, Phospho-AKT 항체는 Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)로부터 구입하였다. p38, ERK, JNK 및 STATs의 인산화-형태 및 전체-형태(form)에 대한 항체는 Cell Signaling Technology Inc. (MA, USA)로부터 구입하였다. ECL 검출 시약 및 PVDF 멤브레인은 American Biosciences (NJ, USA)로부터 구입하였다. 리포폴리사카라이드 (LPS), 오발부민 (OVA) 및 다른 시약들은 Sigma-Aldrich (St,Louis,MO)로부터 구입하였다.

실시예 2: 식물 추출물 제조

AP의 메탄올 추출물은 한국 생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology;KRIBB)의 식물 Extract Bank로부터 제공받았다. 증거 표본(KRIB 0007217)은 KRIBB내 Plant Extract Bank의 식물표본관(herbarium)에 기탁하였다.

본 발명에 사용된 식물은 대한민국 전라남도에서 수집하였다. 식물학적 동정(botanical authentication)은 대한민국의 KRIBB의 분류학자인 신호강 박사에 의하여 수행되었다. AP의 건조된 식물 전체를 분말화하고 ASE 200 accelerated 용매 추출기(Dionex, Camberly, UK)에서 20분간 50℃에서 압력(1500 psi)하에서 메탄올로 추출하였다. 그 추출물을 각 처리를 위해 DMSO에 녹였다.

실시예 3: 세포 배양

Murine 대식세포 RAW264.7 및 랫트 호염구 RBL-2H3 세포를 American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA)로부터 구입하여 10% 열 불활성화된 FBS 및 항생물질(100U/ml의 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신)이 보충된 DMEM에서 5% CO₂ 및 95% 에어에서 37℃에서 유지하였다.

실시예 4: 동물 및 처리

Female BALB/c 마우스(22-25g, 6-주령)을 대한민국 오리엔트 바이오로부터 구입하였다. 그들을 사료 및 물을 자유롭게 이용할 수 있는 표준 조건(온도 22±2℃, 습도 55±5%, 12-시간-명/암 주기)하에서 5개의 군에서 키웠다. 모든 실험은 건국대학교 실험 동물 위원회의 가이드라인에 따라 수행되었다. 마우스를 100㎍의 OVA 및 2mg의 aluminium hydroxide(100㎕의 식염수 내)로 0일과 14일에 복강내 주사로 면역화하였다. 마우스를 17, 18 및 19일에 초음파 네뷸라이져(NE-U12; Omron Corp., 동경, 일본)을 사용하여 30분간 OVA (PBS 내 1%)로 기도를 통하여 챌린지하였다. AHR를 최종 에어로졸 챌린지 24시간 후 전체 몸체 혈량 측정장치(OCP3000; Allmedicus, 대한민국)을 사용하여 측정하였다. 각 마우스를 3분 동안 에어로졸화된 methacholine (0,20,40 및 60mg/ml)로 챌린지하였다. 그 마우스를 AHR 24시간 후 희생하였다. AP (50,100mg/kg)를 PBS에 현탁하여 14,15,17,18 및 20일에 복강내 주사로 투여하였다.

실시예 5: NO 생산의 결정

배양 배지내 아질산염 농도는 Griess reagent으로 결정하였다. 그 배양 상등액(100㎕)을 Griess reagent (100 ㎕, 1% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthyl ethylenediamine)으로 10분간 혼합한 후 발색 azo-유도체 분자의 흡광도를 550nm에서 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 신선한 배양 배지를 모든 실험에서 블랭크로 사용하였다. 아질산 나트륨의 희석 범위를 각 샘플의 아질산 염의 양으로 표준 곡선을 위하여 사용하였다.

실시예 6: Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA )

사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 측정은 ELISA에 의하여 결정되었다.24웰 플레이트에서 웰당 2x10⁵ 세포에 2시간 동안 AP로 전처리하고 혈청 존재하에서 RBL-2H3 세포에 대해서는 DNP-IgE (25ng/ml)로 그리고 RAW264.7에 대해서는 LPS (100ng/ml)로 자극하였다. 그 배양된 RAW264.7 및 RBL-2H3 세포의 상등액을 LPS로 자극 24시간 후 그리고 DNP-IgE 자극 4시간 후에 수집한 후 사이토카인의 농도를 제조업자의 지시에 따라서 BD OptEIA TM^Set 에 의하여 측정하였다. 생성된 색깔을 분광 마이크로타이터 플레이트리더(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450nm에서 측정하였다. PGE2 생성은 Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit (R&D systems. Inc., Minneapolis, USA)로 측정하였다.

실시예 7: 역전사 중합효소 연쇄반응( RT - PCR )

LPS (100ng/ml)에 AP첨가 또는 LPS단독으로 6 시간 배양 후,전체 RNA를 QIAzol ^tm lysis reagent(QIAGEN sciences, Maryland, USA)로 추출하였다. 2㎍의 전체 RNA를 First Strand cDNA Synthesis 키트(Invitrogen, CA, USA)를 사용하여 cDNA로 전환하였다. PCR를 주형으로 상기 제조된 cDNA를 사용하여 수행하였다. 그 프라이머들은 바이오니아로부터 구입하였다. 전체 RNA를 제조업자의 지시에 따라서 TRIzol 시약을 사용하여 세포로부터 분리한 후, 2㎍을 Oligo (dT) 18 primer 및 AccuPowerTM RT Premix를 사용하여 cDNA를 만들기 위하여 역전사하였다. PCR 증폭은 제조업자의 지시에 따라서 수행되었다. 그 증폭은 thermal cycler (-, Hercules, CA, USA)에서 하기 조건 하에서 수행되었다: 30 (iNOS) 또는 22 (COX-2) 사이클 동안 95℃, 30sec 변성, 65℃ (iNOS) 또는 55℃ (COX-2)에서 30sec 어닐링 그리고 72℃에서 40sec 익스텐젼. 변성 전 단계는 94℃에서 3 분간 수행하였고 최종 익스텐젼은 72℃에서 5 분간 수행하였다. PCR 산물들을 1.5% 아가로스 젤에서 전기영동하고, ethidium bromide로 염색하였다.

실시예 8: 면역 blot 분석

그 세포들을 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 1% Nonidet P-40 (NP-40), 150mM sodium chloride, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 프로테이즈 및 포스파테이즈 저해제 칵테일을 함유하는 버퍼에서 용해시켰다. 세포 파쇄액으로부터 동량의 샘플을 10% SDS-PAGE 젤 전기영동에 의하여 분리하고 polyvinylidene fluoride (PVDF)로 트랜스퍼하였다. 그 막을 5% 탈지분유를 함유하는 TBS로 상온에서 2시간 동안 블록킹하였다. 그 후에, 그 막을 4℃에서 1차 항체로 하룻밤 배양하고 면역 복합체를 horseradish peroxidase-부착된 항체로 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 2차 항체의 적용 후, 그 막을 Luminescent 이미지 분석장치(LAS-3000; Fujifilm, Tokyo, Japan)에 의하여 ECL 검출 키트를 사용하여 시각화하기 위하여 현상하였다.

실시예 9: 탈과립화( Degranulation )

탈과립화는 β-hexosaminidase 분석에 의하여 측정하였다. Anti-DNP IgE-감작화된 RBL-2H3 세포들(2X10⁵ 세포/웰, 24-웰 플레이트에서)을 AP로 2시간 동안 전처리하고 DNP (25ng/ml)로 자극하였다. 그 세포들을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 세포들에 의하여 분비된 β-hexosaminidase 활성의 양을 결정하기 위하여, 25㎕의 상등액및 100㎕의 0.05M 초산 나트륨 버퍼(pH 4.4) 내 1.2mM β-hexosaminidase 기질(4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide)를 96-웰 플레이트에서 혼합하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 생성된 색깔을 분광 마이크로타이터 플레이트리더(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450nm에서 측정하였다.

실시예 10: 기관지폐포 세척액( Bronchoalveolar lavage fluid ; BALF ) 및 혈청

그 마우스를 희생하고, 아이스-콜드 PBS (1ml)를 폐에 넣었다. 기관기폐포세척액(BALF)을 세번 흡인(aspiration)하여 얻었다. BALF를 원심분리하고 상등액을 모아서 사용 전에 -70℃에서 보관하였다. BALF내의 IL-4, IL-5 및 혈청 내 IgE를 제조업자의 지시에 따라서 BD OptEIA TM^Set를 사용하여 ELISA에 의하여 측정하였다.

실시예 11: 폐 H&E 염색

폐 조직을 4% paraform aldehyde에서 24시간 고정하였다. 냉동되는 매질에 충진한 후 4μm 두께로 절편화하였다. 그 조직을 H&E 용액으로 염색하였다.

상기 실시예의 모든 실험 결과들은 세번의 실험의 평균±표준편차로 나타내었다. 통계학적 분석은 Student's t-테스트를 사용하여 수행하였고, 0.5 이하의 P-값들을 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

Claims (10)

1. 짚신나물 추출물을 포함하는 항 염증용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 항 염증용 약학 조성물.
3. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 NO, PGE₂ 또는 전구염증성 사이토카인 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항 염증용 약학 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 전구염증성 사이토카인은 IL-1β 또는 IL-6인 것을 특징으로 하는 항 염증용 약학 조성물.
5. 짚신나물 추출물을 포함하는 항 앨러지용 약학 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 조성물은 마스트 세포 탈과립 또는 IL-4 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항 앨러지용 약학 조성물.
7. 짚신나물 추출물을 포함하는 천식 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 조성물은 IL-4, IL-5 또는 IgE 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료용 약학 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 상기 조성물은 폐 기도 벽으로 세포 침착을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료용 약학 조성물.
10. 짚신나물 추출물을 포함하는 사료용 조성물.

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