KR20120119425A - Ｐｔｐｒｔ 유전자를 유효성분으로 함유하는 신경재생용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PTPRT(protein tyrosine phosphatase receptor T) 유전자를 유효성분으로 함유하는 신경재생용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신경세포에서 PTPRT는 BCR(Breakpoint cluster region)의 N-말단 부위에 위치하는 177번째 타이로신 잔기를 탈인산화하여, BCR의 N-말단과 C-말단 사이 분자 간 상호작용을 강화시켜 BCR의 Rac1 GAP 활성을 억제시킴으로써 신경세포의 수상돌기 발달 및 액틴 중합을 촉진시킬 수 있으므로, 상기 PTPRT를 이용한 유전자 치료제는 신경세포 발달 촉진을 위해, 특히 신경세포의 발달과 관련된 다양한 신경 정신질환 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＰＴＰＲＴ 유전자를 유효성분으로 함유하는 신경재생용 조성물{A composition for regeneration of nerve cells comprising protein tyrosine phosphatase receptor T genes}

본 발명은 신경재생, 특히 신경 정신질환 치료용 유전자 치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PTPRT(protein tyrosine phosphatase receptor T) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 유전자 전달체를 포함하는 신경세포의 발달 촉진용 조성물, 신경재생용 조성물 또는 신경 정신질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

효과적인 신경 연결(neural connection)은 특정 표적에 대한 축삭돌기(axon)의 적절한 조종, 및 시냅스 신호의 통합을 위해 복잡한 수상돌기가지(dendritic arbors)의 구축을 요구한다. 수상돌기는 적절한 전-시냅스(pre-synapse)와 연결을 형성하기 위해, 그의 표적 부위로 신경세포체로부터 신장해야 한다(Scott and Luo, 2001). 수상돌기가지의 세포골격은 미세소관과 원형질막에 인접한 피질 액틴으로 구성된다. 신경 발달 동안, 신경세포의 수상돌기는 가지를 형성하고, 수상돌기가지의 신장은 투입 수와 관련성이 있다(Van Aelst and Cline, 2004; Carlisle and Kennedy, 2005). 수상돌기의 성장에서 신경 활성의 효과는 작은 Rho GTPase의 활성에 의해 매개된다(Chiu et al., 2008; Peng et al., 2009). Rho GTPases는 신경 발달 동안 많은 형태적 변화를 매개하며, 특히 액틴 세포골격 형성의 중요한 조절자로서 역할을 한다. Rac1은 Rho 계열 중 가장 광범위하게 연구된 인자이다(Luo, 2000; Nakayama et al., 2000; Chen and Firestein, 2009; Chen et al., 2010; Tahirovic et al., 2010). 세포외 신호에 반응하여, 비활성 GDP-결합 형태 및 활성 GTP-결합 형태는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(guanine nucleotide exchange factors, GEFs) 및 GTPase-활성화 단백질(GTPase-activating proteins, GAPs)과 상호작용을 통해 야기된다(Sfakianos et al., 2007; Bosco et al., 2009). 인간 게놈의 예측되는 Rho GAP들 중에서, 단지 일부만 Rac에 대해 GAP 활성을 보이며, BCR은 C-말단 부위에 Rac1 GAP 도메인을 포함한다(Ress and Moelling, 2005; Rosso et al., 2005; Yang and Kazanietz, 2007; Chuang et al., 1995).

BCR(Breakpoint cluster region)은 Rac1 small GTPase의 저해제(Rac1 GAP)로서 알려져 있는데, 발명자들에 의하여 BCR 이 신경세포에서 과발현될 경우 신경세포의 수상돌기 발달을 억제하며, 특히 해마의 신경세포에서 수상돌기의 가지화 및 액틴 중합화를 약화시키는 것이 밝혀졌다.

BCR은 다양한 효소 기능을 발현하는 다중-도메인 단백질로서, 상기 단백질은 N-말단에 위치된 세린/트레오닌 단백질 인산화효소 활성을, C-말단에 GEF 및 GAP 도메인을 가진다. BCR은 Abl의 융합 파트너로서, 만성 골수성 백혈병의 지표인 BCR-Abl를 형성하는 것으로 알려져 있다(Pluk et al., 2002; Ren, 2005). 상기 BCR-Abl 융합 단백질은 Abl의 타이로신 인산화효소 활성을 나타내고, 이때 상기 활성은 시스 및 트랜스 중 어느 하나에서 BCR의 타이로신 잔기를 인산화시킨다. 첫 번째 액손 내에 BCR 타이로신 잔기, 즉 타이로신 177, 283 및 300이 인산화된다고 알려져 있다(Liu et al., 1996; Sini et al., 2004). BCR은 골수 세포의 발달에 중요하고, 인산화된 타이로신 177을 통해 Grb2와 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Pendergast et al., 1993). FES 타이로신 인산화효소는 BCR의 타이로신 177을 인산화하여 BCR 및 Grb2 사이 상호작용을 조절한다(Li and Smithgall, 1996; Li et al., 2001). Ras GTPase의 활성제인 Grb2는 BCR/Abl의 "인산화된" 타이로신 177에 결합한다(Puli et al., 1994; Giubellino et al., 2008). BCR의 N-말단 coiled coil 도메인 및 proline-rich 부위 내 타이로신 잔기는, BCR-Abl 발암에 중심 역할을 한다(McWhirter et al., 1993; He et al., 2002; Beissert et al., 2003). BCR-Abl의 coiled coil은 암세포에서 단백질 다중화를 유도함으로써 Abl 활성을 조절할 수 있다. BCR GAP 도메인 활성은 Rho 구아닌 뉴클레오티드 해리 억제제와 직접적인 단백질/단백질 상호작용에 의해 조절되는 것이 보고된 바 있다(Kweon et al., 2008).

최근에, BCR은 Rac1 GAP 활성과 관련된 과정에서 수상돌기 스파인(dendritic spine)를 형성함으로써, 시냅스 가소성뿐만 아니라, 학습 및 기억을 조절하는 것이 보고된바 있다(Oh et al., 2010). 그러나, 아직까지 BCR의 GAP 활성 조절 기작은 밝혀지지 않았다.

ABR(Active breakpoint cluster region)은 단백질의 GAP 도메인이 본질적으로 활성화됨에도 불구하고 N-말단 기능성 도메인을 포함하고 있지 않다. 랫트 뇌에서 BCR의 발현 수준은 배아 단계로부터 초기 출생 후 생체까지 감소하고, ABR 발현은 성체가 될 때까지 증가한다(Oh et al., 2010). 신경세포의 순환 발달의 초기 단계에서, 이런 과정은 섬세하게 조절되어야 한다.

단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphatase receptor T, PTPRT)는 중추신경계에서 주로 발현되고, 시냅스 형성 및 시냅스 신호 전달을 조절한다(Lim et al., 2009). PTPRT 활성은 신경세포의 타이로신 인산화효소 Fyn에 의해 조절된다. PTPRT 기질은 암 세포에서 일부 확인되고 있음에도 불구하고, 신경세포 발달과 연관된 PTPRT 특이적 기질은 발견되지 않았다(Zhao et al., 2010).

이에, 본 발명자들은 PTPRT에 대한 신경세포의 기질을 알아보기 위해, PTPRT 항체에 의해 매개되는 면역침강반응을 적용한 프로테오믹스 접근법을 랫트 시냅토솜(synaptosome)에 적용한 결과, BCR이 PTPRT의 신경세포 기질인 것을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 PTPRT가 랫트(rat)의 뇌에서 BCR과 상호작용하며, BCR의 N-말단 부위의 177번째 타이로신 잔기를 탈인산화시키는 것을 확인하였고, 신경세포에서 BCR 및 PTPRT의 공동 발현을 통해 PTPRT 발현에 의하여 BCR에 의해 저해되는 수상돌기가지 및 액틴 중합이 회복되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명자들은 PTPRT가 신경세포에서 BCR을 탈인산화시킴으로 BCR의 GAP 활성을 조절하는 것을 확인하여, PTPRT가 신경세포 발달의 중요한 조절자인 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 목적은 PTPRT(protein tyrosine phosphatase receptor T) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 유전자 전달체를 이용한 신경세포 발달 촉진용 조성물, 신경재생용 조성물 또는 신경 정신질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PTPRT(protein tyrosine phosphatase receptor T) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 신경세포의 발달 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PTPRT 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 신경재생용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PTPRT 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 신경 정신질환, 예를 들면 치매, 우울증, 정신분열증, 자폐증 또는 정신지체 등의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PTPRT 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 신경세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 신경세포 발달의 촉진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 PTPRT 유전자 전달체 또는 세포를 개체에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 신경재생 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 PTPRT 유전자 전달체 또는 세포를 개체에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 신경 정신질환, 예를 들면 치매, 우울증, 정신분열증, 자폐증 또는 정신지체 등을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 PTPRT가 BCR을 기질로 이용하여 BCR에 의한 신경세포의 수상돌기 발달 및 액틴 중합의 저해를 회복시킴으로써 신경세포 재생용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있음을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에서는 PTPRT가 BCR의 N-말단 부위에 위치하는 177번째 타이로신 잔기를 탈인산화하여 상기 BCR의 N-말단과 C-말단 사이 분자 간 상호작용을 강화시켜 BCR의 Rac1 GAP 활성을 억제시킴으로써, 신경세포의 수상돌기 발달 및 액틴 중합을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 PTPRT를 이용한 신경세포 발달 증진 활성을 가지는 신경 재생용 약물 개발뿐만 아니라, PTPRT를 활성화하여 BCR의 177번째 타이로신 잔기의 탈인산화를 증가시키는 물질을 탐색하여 신경세포 발달 저하와 관련된 신경 정신 질환, 예를 들면, 치매, 우울증, 정신분열증, 자폐 또는 정신지체 등의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 수상돌기가지(dendritic arborization)가 BCR 및 ABR Rac1 GAP에 의해 약화되는 것을 나타내는 그림이다.
도 1a는 BCR 및 ABR의 개요도를 나타내는 그림이다. BCR-N 및 BCR-C은 BCR의 aa 2-453 및 aa 454-1271을 암호화하는 DNA의 서브클로닝(subcloning)에 의해 구축되었다. coiled coil 및 타이로신 177은 BCR의 N-말단에 위치한다.
도 1b는 해마 신경세포의 수상돌기가지가 BCR 및 ABR Rac1 GAP의 발현으로 약화되는 것을 나타내는 그림이다. 배양된 해마 신경세포에서 EGFP와 함께 인간 BCR 및 ABR가 과발현되었다. 신경세포 수상돌기가지의 신장은 Scholl 프로파일링, 및 첫 번째 및 두 번째 수상돌기 수의 정량을 이용하여 분석되었다. BCR 또는 ABR 중 어느 하나의 발현은 수상돌기가지를 약화시켰다. 데이타의 평균(Means) ± 표준편차(SEMs)는 7개의 대조군 신경세포, 6개의 BCR 신경세포 및 5개의 ABR 신경세포로부터 유래되었다. 대조군에 대하여 *P=0.0127, **P=0.0191, ***P<0.0001(Student's t-test). 스케일바(Scale bar), 100 μm.
도 1c는 BCR GAP 활성에 의한 수상돌기가지의 약화를 나타내는 그림이다. N- 또는 C-말단을 포함하는 BCR의 결실 돌연변이(즉, BCR-N 및 BCR-C)는 해마 신경세포에서 발현되었다. 수상돌기가지는 GAP 도메인을 포함하는 BCR-C에 의해 약화되었다. 반면에, 수상돌기가지는 BCR-N의 발현에 대해 거의 정상이었다. 데이타의 평균± 표준편차는 8개의 대조군 신경세포, 7개의 BCR-WT 신경세포, 9개의 BCR-N 신경세포, 및 6개의 BCR-C 신경세포로부터 유래되었다. BCR-WT에 대하여 *P=0.014, **P<0.0001(Student's t-test). 스케일바, 100 μm.
도 1d는 BCR의 GAP-사멸 돌연변이(BCR-GD)에 의한 수상돌기가지의 회복을 나타내는 그림이다. GAP-활성을 억제하는 돌연변이는 BCR 내로 삽입한 후, 수상돌기가지를 조사하였다. 수지상부(arborization)는 BCR의 GAP-사멸 돌연변이(BCR-GD)에 의해 비록 불완전하게 회복되었다. BCR-WT, -N, 및 -C의 발현은 항-BCR 항체를 이용한 면역형광에 의해 조사하였다. 데이타의 평균± 표준편차는 5개의 대조군 신경세포, 5개의 BCR-WT 신경세포, 및 7개의 BCR-GD 신경세포로부터 유래되었다. BCR-WT에 대하여 *P<0.0001(Student's t-test). 스케일바, 100 μm.
도 1e는 ABR의 GAP-사멸 돌연변이(ABR-GD)에 의한 수지상부(arborization)의 회복을 나타내는 그림이다. 데이타의 평균± 표준편차는 7개의 대조군 신경세포, 5개의 ABR-WT 신경세포, 및 5개의 ABR-GD 신경세포로부터 유래되었다. ABR-WT에 대하여 *P=0.0155(Student's t-test). 스케일바, 100 μm.
도 2는 신경세포에서 BCR 녹다운에 의해 수상돌기가지가 증가하는 것을 나타내는 그림이다.
도 2A 및 도 2B는 BCR-shRNA의 첨가 하에서, BCR의 발현이 쥐 해마 신경세포에서 효율적으로 녹다운되는 것을 나타내는 그림이다.
도 2C는 BCR 녹다운 신경세포에서 수상돌기가지가 유의적으로 향상되는 것을 나타내는 그림이다.
도 2D는 BCR 녹다운 신경세포에서 BCR이 과발현되는 경우, 수상돌기가지가 약화되는 것을 나타내는 그림이다.
도 2D 및 도 2E는 눌 돌연변이 마우스(null mutant mice)(BCR -/-)로부터 유래된 해마 신경세포의 수상돌기 발달이 야생형 신경세포에 비해 증가되었고, BCR의 과발현에 의해 BCR -/- 세포의 수상돌기가지가 약화되는 것을 나타내는 그림이다.
도 3은 BCR GAP 활성이 N-말단 coiled coil의 결실에 의해 영향을 받는 것을 나타내는 그림이다.
도 3a는 BCR의 N-말단에서 coiled coil 부위의 결실에 의한 수지상부(arborization)의 회복을 나타내는 그림이다. BCR-Abl 발암유전자(oncogene)에서 중심축 역할을 하는 것으로 알려진 N-말단 coiled coil이 BCR로부터 결실되어 BCR-ΔCC 돌연변이를 수득하였고, 그 결과, 수지상가지는 현저히 회복되었다. BCR-WT 및 -ΔCC의 발현은 항-BCR 항체를 이용한 면역형광에 의해 시각화하였다. 데이타의 평균± 표준편차는 10개의 대조군 신경세포, 9개의 BCR-WT 신경세포, 및 9개의 BCR-ΔCC 신경세포로부터 유래되었다. BCR-WT에 대하여 *P=0.0004, **P<0.0001(Student's t-test). 스케일바, 100 μm.
도 3b는 액틴(Actin) 중합(polymerization)는 coiled coil 부위가 결핍된 BCR 돌연변이에 의해 회복되는 것을 나타내는 그림이다. F-액틴은 Alexa Fluor 555와 결합된 팔로이딘으로 염색한 후, 액틴 중합을 분석하였다. 중합된 F-액틴 수준은 BCR-ΔCC가 발현될 때 해마 신경세포에서 증가하였다. 데이타의 평균± 표준편차는 12개의 대조군 신경세포, 12개의 BCR-WT 신경세포, 및 10개의 BCR-ΔCC 신경세포로부터 유래되었다. BCR-WT에 대하여 *P=0.001(Student's t-test). 스케일바, 30 μm.
도 3c는 GAP-사멸 돌연변이에 의한 액틴 중합의 회복을 나타내는 그림이다. 중합된 F-액틴은 BCR GAP-사멸 돌연변이(BCR-GD)의 존재 하에서 증가되었다. 데이타의 평균± 표준편차는 10개의 대조군 신경세포, 13개의 BCR-WT 신경세포, 및 7개의 BCR-GD 신경세포로부터 유래되었다. BCR-WT에 대하여 *P=0.0085(Student's t-test). 스케일바, 30 μm.
도 4는 활성 도메인(catalytic domain)을 통한 BCR 및 PTPRT의 상호작용을 나타내는 그림이다.
도 4a는 MS 및 MS/MS 모드에서 생성된 대표적인 기준 피크 크로마토그램(base peak chromatograms)을 나타내는 그림이다. 상부 패널은 MS 측량 스캔(MS survey scan)의 기준 피크 크로마토그램을 나타내고, 하부 두 패널은 MS/MS 채널(MS/MS channel)로부터 유래한 기준 피크 크로마토그램을 나타낸다.
도 4b는 BCR 펩티드 이온의 결합된 MS/MS 스펙트럼을 나타내는 그림이다. 아미노산 서열은 Mascot 데이타베이스 검색 프로그램을 이용하여 확인되었다. 가장 개연성있는 서열에 대한 일치되는 단편 이온 피크는 스펙트럼에서 표지화되었다.
도 4c는 랫트 뇌 시냅토솜(synaptosome) 단백질의 생체내(In vivo) 공면역침전(coimmunoprecipitation)을 나타내는 그림이다. BCR은 항-PTPRT 단일클론 항체에 의해 공면역침전되었다. 투입(Input), 10%. 정량화(Quantification)(%, 면역침전된 단백질/투입 단백질): BCR, 21.1; PSD-95, 6.7; SSCAM, 3.2; GRIP, 6.3; Homer, 4.3; CASK, 5.9; PTPRT, 16.9.
도 4d는 항-PTPRT 항체의 특이적 반응성을 나타내는 그림이다. HEK293 세포에서 발현되는 BCR은 항-PTPRT 단일클론 항체에 의해 촉발되지 않았다.
도 4e, 도 4f 및 도 4g는 HEK293 세포에서 BCR 및 PTPRT 결실 돌연변이를 이용하여 수행된 공면역침전을 나타내는 그림이다. BCR 및 PTPRT는 세포내 활성 도메인(intracellular catalytic domain)을 통해 상호작용한다. BCR은 PTPRT(RT-JD)의 활성 도메인에 결합하고, 이런 친화력은 PTPRT의 전장 단백질(RT-FL), 세포외 엑토 도메인(RT-ΔJDD) 또는 막통과 도메인을 포함하는 세포내 단백질 부위(RT-TJDD) 보다 강하였다. BCR은 PTPRT의 활성 도메인(RT-JD)에 의해 감소(pull down)되었고, PTPRT(RT-JD)는 BCR에 의해 풀 다운되었다.
(도 4f 및 도 4g) 정량화(Quantification)(%, 면역침전된 단백질/투입 단백질): (도 4e) RTFL, 13.5에 의해; RT-ΔJDD, 9.6에 의해; RT-TJDD, 9.7에 의해 감소(pull down)되는 BCR; (도 4f) RT-JD, 24.1에 의해 끌리는 BCR; (도 4g) BCR, 40.3에 의해 감소(pull down)되는 RT-JD.
도 5는 수상돌기가지 및 액틴 중합이 PTPRT에 의해 회복되는 것을 나타내는 그림이다.
도 5a는 수상돌기가지가 PTPRT에 의해 회복되는 것을 나타내는 그림이다. PTPRT 활성 도메인(RT-WT)의 공동발현은 BCR에 의해 약화된 수상돌기가지를 회복시켰다. PTPRT의 발현은 항-PTPRT 항체를 이용한 면역형광에 의해 시각화되었다. 데이타의 평균± 표준편차는 9개의 대조군 신경세포, 7개의 BCR 신경세포, 및 7개의 BCR+RT-WT 신경세포로부터 유래되었다. 단일 형질감염된 BCR 신경세포에 대한 *P=0.0007, **P=0.0013(Student's ttest). 스케일 바, 100 μm.
도 5b는 액틴 중합이 PTPRT에 의해 회복되는 것을 나타내는 그림이다. 중합된 F-액틴의 수준은 PTPRT 활성 도메인 및 BCR의 공동발현으로 증가되었다. 데이타의 평균± 표준편차는 12개의 대조군 신경세포, 10개의 BCR 신경세포, 및 10개의 BCR+RT-WT 신경세포로부터 유래되었다. BCR로 단일 형질감염된 신경세포에 대한 *P=0.0106(Student's ttest). 스케일 바, 30 μm.
도 6은 PTPRT의 신규한 기질을 나타내는 그림이다.
도 6a는 배양된 해마 신경세포에서 BCR 타이로신의 인산화를 나타내는 그림이다. 해마 신경세포의 단백질은 가용성화 되었고, 내생의 BCR은 면역침전되었다. 배양된 신경세포는 타이로신 탈인산화효소(tyrosine phosphatase)의 잠재적인 억제제인 펄바나데이트(pervanadate)로 처리되었을 때, BCR의 타이로신 잔기는 인산화되었다.
도 6b는 BCR이 Fyn에 의해 인산화되고, PTPRT에 의해 탈인산화되는 것을 나타내는 그림이다. HEK293 세포에서, 인산화된 BCR의 수준은 Fyn 신경세포의 타이로신 인산화효소가 BCR과 공동발현될 때 증가하였고, PTPRT의 발현으로 감소하였다.
도 6c는 BCR의 N-말단 proline-rich 부위에 위치된 타이로신 177은 Fyn의 주요 표적이다. 인산화된 BCR의 수준은 타이로신 177이 페닐알라닌으로의 돌연변이에 의해 감소되었고, 이는 타이로신 283, 328, 또는 360이 돌연변이화될 때보다 더 컸다. 정량화(%, 돌연변이/야생형 BCR): BCR-Y177F, 32.6; BCR-Y283F, 86.6; BCR-Y328F, 75.6; BCR-Y360F, 76.3.
도 6d는 타이로신 177 잔기는 PTPRT의 주요 표적임을 나타내는 그림이다. 타이로신 177 잔기는 온전하고(BCR-3YF), 타이로신 283, 328, 및 360이 페닐알라닌으로의 비-인산화를 모방하는 인산화된 BCR 삼중 돌연변이 단백질은 PTPRT에 의해 현저히 감소되었다. 정량화(%, 돌연변이/야생형 BCR): BCR-3YF, 16.5.
도 6e는 재조합 PTPRT이 BCR을 특이적으로 탈인산화시키는 것을 나타내는 그림이다. PTPRT 활성 도메인을 포함하는 정제된 재조합 단백질이 BCR에 첨가되었고, 복합체가 촉발되었고, 이어서 펄바나데이트(pervanadate)에 의해 처리되었다. PTPRT는 MKP5 단백질 타이로신 탈인산화효소의 작용에 대조적으로, BCR을 완전히 탈인산화하였다.
도 7은 신경세포 발달이 타이로신 177의 비인산화를 모방하는 BCR 돌연변이에 의해 회복되는 것을 나타내는 그림이다.
도 7a는 수상돌기가지가 타이로신 177의 비인산화를 모방하는 BCR 돌연변이에 의해 회복되는 것을 나타내는 그림이다. 타이로신 177이 페닐알라닌으로 돌연변이된 BCR-돌연변이(BCRY177F)는, 인산화를 모방하는 BCR 돌연변이(BCR-Y177E)가 적용될 때; 수지상부의 정도가 BCR-WT의 존재 하에 나타내는 것과 유사한 것으로 나타내는 것과 대조적으로, 수상돌기가지를 회복시켰다. 데이타의 평균± 표준편차는 9개의 대조군 신경세포, 8개의 BCR-WT 신경세포, 7개의 BCR-Y177F 신경세포, 및 6개의 BCR-Y177E 신경세포로부터 유래되었다. BCR-WT에 대한 *P=0.0009, **P<0.0001(Student's t-test), 스케일바, 100 μm.
도 7b는 액틴 중합은 BCR-Y177F의 발현에 의해 회복되는 것을 나타내는 그림이다. 중합된 F-액틴의 수준은 Alexa Fluor 555로 결합된 팔로이딘에 의해 염색하여 확인하였으며, 타이로신 177의 비-인산화 모방 BCR 돌연변이(BCR-Y17F)가 발현될 때 증가하였다. 인산화 모방 BCR-Y177E가 BCR-WT의 존재 하에서 나타나는 것보다 더 높게 F-액틴 중합을 증가시키지 않았다. 데이타의 평균± 표준편차는 10개의 대조군 신경세포, 13개의 BCR-WT 신경세포, 8개의 BCR-Y177F 신경세포, 및 8개의 BCR-Y177E 신경세포로부터 유래되었다. BCR-WT에 대한 *P=0.0009(Student's t-test). 스케일바, 30 μm.
도 7c는 N-말단 풍부 부위에 위치된, 타이로신 177과 다른 타이로신 잔기의 돌연변이를 포함하는 BCR은, 수상돌기가지를 회복시키지 않는 것을 나타내는 그림이다. BCR 타이로신 283, 328, 및 360이 페닐알라닌으로 변경된 경우(BCR-Y283F, -Y328F, -Y360F), 타이로신 177이 돌연변이된 경우 관찰되는 것과 대조적으로, 수상돌기가지가 회복되지 않았다. 데이타의 평균± 표준편차는 8개의 대조군 신경세포, 7개의 BCRWT 신경세포, 6개의 BCR-Y177F 신경세포, 7개의 BCR-Y283F 신경세포, 7개의 BCR-Y328F 신경세포, 및 9개의 BCR-Y360F 신경세포로부터 유래되었다. BCR-WT에 대한 *P<0.0001, **P=0.0005(Student's t-test). 스케일바, 100 μm.
도 7d는 타이로신 177과 다른 타이로신 잔기의 돌연변이를 포함하는 BCR은, 액틴 중합을 회복시키지 않는 것을 나타내는 그림이다. 타이로신 283이 페닐알라닌으로 변경하는 경우(BCR-Y283F), 중합된 F-액틴의 수준이 증가하지 않았다. 데이타의 평균± 표준편차는 12개의 대조군 신경세포, 12개의 BCR-WT 신경세포, 11개의 BCR-Y177F 신경세포, 12개의 BCR31 Y283F 신경세포, 및 12개의 BCR-Y177E 신경세포로부터 유래되었다. BCR-WT에 대한 *P=0.0235(Student's t-test). 스케일바, 30 μm.
도 8은 BCR 타이로신 177의 비-인산화 모방 돌연변이는 임의의 다른 분자내 단백질-단백질 상호작용의 발달을 야기하지 않는 것을 나타내는 그림이다.
도 8a는 수상돌기가지의 정도가 BCR 결핍 돌연변이의 N-말단 부위에서, 타이로신 177의 비-인산화 모방 돌연변이의 생성에 따라 증가되는 것을 나타내는 그림이다. 탈인산화된 타이로신 177 잔기를 포함하는 단백질의 분자내 상호작용이 나타나지 않았다.
도 8b는 BCR 단백질의 N- 및 C- 말단 사이 분자내 상호작용을 나타내는 개요도이다. BCR GAP 활성은 N- 및 c-말단 사이 상호작용을 통해 조절될 수 있다. 이런 분자내 상호작용은 BCR의 N-말단에서 타이로신 177이 탈인산화되는 PTPRT에 의해 증진될 수 있고, Rac1 GAP 활성은 억제될 수 있다. 타이로신 177이 Fyn 타이로신 인산화효소에 의해 인산화되는 경우, Rac1 GAP 활성은 N-말단으로부터 분리된 GAP 도메인에 의해 증진될 수 있다.
도 9는 BCR의 GAP 활성은 BCR 단백질의 N- 및 c-말단 사이 상호작용에 의해 조절되는 것을 나타내는 그림이다.
도 9a는 BCR의 N- 및 C- 말단 사이 상호작용이 정제된 GST 융합 단백질을 이용하여 분석되는 것을 나타내는 그림이다. BCR C-말단을 암호화하는 재조합 단백질은 타이로신 177이 페닐알라닌으로 변경되어, 비-인산화를 모방하는 경우(BCR-N-Y177F), BCR N-말단을 포함하는 GST 융합 단백질에 의해 감소(pull down)되었다. 그러나, 야생형 N-말단(BCR-N-WT)은 감소에 대해 비효과적이었다.
도 9b는 BCR C-말단에 의해 BCR N-말단의 공동면역침전을 나타내는 그림이다. 재조합 GFP-태그된 BCR N-말단 부위는 FLAG에 의해 태그된 BCR C-말단 부위와 공동발현되는 경우 항-FLAG 항체에 의해 공동면역침전되었다. 상호작용은 타이로신 177의 비-인산화 모방 돌연변이(Y177F)에 의해 증진되었고; 이런 조건 하에서, 공동면역침전의 정도는 야생형(WT) 단백질 또는 인산화 모방 돌연변이(Y177E)를 포함하는 단백질이 적용되는 경우보다 훨씬 증가되었다. 정량화(%, 돌연변이/야생형 BCR): BCR-Y177F, 187.9: BCR-Y177E, 64.8.
도 9c는 FRET 실험을 위해 제조된 YFP-BCR-CFP 컨스트럭트의 개요도를 나타내는 그림이다. BCR 중에서, YFP는 N-말단에 태그되었고, CFP는 C-말단에 태그되었다.
도 9d는 FRET가 타이로신 177의 비-인산화 모방 돌연변이(Y177F)에 의해 증가되었고, 그 정도는 야생형(WT) 단백질 또는 이의 타이로신 177의 인산화 모방 돌연변이(Y177E)가 적용되는 경우보다 증가되었다. 수용체(YFP) 광-블리칭(photo-bleaching)이 HEK293 세포에서 수행된 경우, CFP의 높은 강도는 BCR의 N- 및 C- 말단 사이 강한 분자내 상호작용을 나타내었다. CFP 강도는 시간 척도에서 별표로 나타낸 위치에서 측정되었고, 증가의 기울기가 계산되었다. 3번의 독립적인 FRET이 수행되었다. 스케일바, 10 μm.
도 9e는 CFP 강도는 타이로신 177의 비-인산화 모방 돌연변이(YF)에 의해 증가되고, 그 정도는 야생형(WT) 단백질 또는 이의 인산화 모방 돌연변이(YE)가 적용되는 경우보다 증가되는 것을 나타내는 그림이다. 데이타의 평균± 표준편차는 42개의 BCR-WT 세포, 40개의 BCR-Y177F 세포, 및 34개의 BCR-Y177E 세포로부터 유래되었다. BCR-WT에 대한 *P=0.0302(Student's t-test).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 PTPRT(protein tyrosine phosphatase receptor T) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 신경세포의 발달 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PTPRT 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 신경재생용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PTPRT 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 신경 정신질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 PTPRT 유전자는 인간 PTPRT 유전자인 것이 바람직하며, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자(GenBank Acession Number NM_133170)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 제조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 거세포 바이러스(Cytomegalo Virus, CMV)인 것이 더욱 바람직하나 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 신경 정신질환은 치매, 우울증, 정신분열증, 자폐증 및 정신지체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 BCR이 수상돌기가지 및 액틴 중합을 약화시키는, 신경세포 발달의 음성 조절자로서 역할을 하는 것을 확인하였다. 신경세포 타이로신 탈인산화효소인 PTPRT이 BCR과 상호작용하고, BCR의 탈인산화된 타이로신 177이 Fyn 타이로신 인산화효소에 의해 인산화되는 것을 확인하였다. PTPRT 발현은, BCR 발현에 의해 약화되는 수상돌기가지 및 액틴 중합을 모두 회복시키는 것을 확인하였다. BCR 타이로신 177의 비인산화 모방 돌연변이가 신경세포 발달을 회복시키는 것을 확인하였다. BCR의 Rac1 GAP 활성이, 타이로신 177의 탈인산화에 의해 증진되는 BCR의 N-말단 및 C-말단 사이 새로운 분자내 산호작용에 의해 조절되는 것을 확인하였다. 따라서 BCR의 Rac1 GAP 활성이 PTPRT에 의해 조절하기 때문에, PTPRT 및 BCR이 신경세포 발달을 조절하는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서는 Fyn 타이로신 인산화효소 및 PTPRT 타이로신 탈인산화효소가 BCR의 타이로신 177에 작용하는 것을 확인하였다. Grb2 경로 활성의 인지되는 효과에 대조적으로, 타이로신 177의 "탈인산화"는 Rac1 GTPase 시스템을 활성화하고 GAP 활성의 억제를 통해 F-액틴 중합을 유도하는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서는 BCR의 Rac1 GAP 활성이 coiled coil의 결실에 의해 조절되고, 그 결과 해마 신경세포에서 수상돌기가지 및 F-액틴 중합을 모두 회복시키는 것을 확인하였다. 그러나, 타이로신 177의 "인산화"는 Ras GTPase 신호 경로를 활성화하지 않고, 수상돌기가지 또는 액틴 중합 상태의 변화를 나타내지 않는 것을 확인하였다. BCR 타이로신 177의 "탈인산화"는 신경세포 발달을 획복시키고 Rac1 GAP 활성을 조절하는 것을 확인하였다. Rac1 GTPase의 활성에 중요한 탈인산화된 타이로신 177과 관련된, 다른 상호작용이 있는지 알아보기 위해, 타이로신 177의 탈인산화 모방 돌연변이를 BCR-N 결실 돌연변이 내로 삽입(BCR-N-Y177F를 제조)한 결과, BCR-N-WT 돌연변이에서 관찰되는 것과 비교하여 수상돌기가지의 변화가 관찰되지 않았다. 따라서, BCR 타이로신 177의 탈인산화는 BCR GAP 활성을 조절하는 것을 알 수 있었다. 또한, BCR의 N-말단 부위에 위치된 타이로신 잔기의 탈인산화가 C-말단 부위에 위치된 GAP 도메인의 활성을 조절하는 방법을 알아보기 위해, BCR의 N-말단 및 C-말단 사이 분자내 상호작용을 조사한 결과, 상기 분자내 상호작용을 통해 타이로신 177의 탈인산화에 의해 BCR의 GAP 활성이 영향이 미치는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서는 BCR의 N-말단 및 C-말단에서 각각 YFP 및 CFP로 융합된 BCR의 FRET 분석을 통해 BCR의 N-말단 및 C-말단 사이 분자내 상호작용을 확인하였다. 상기 분자내 상호작용은 PTPRT에 의해 탈인산화로 증진되고, BCR의 Rac1 GAP 활성은 타이로신 177의 탈인산화에 의해 조절되는 분자내 상호작용에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, Rac1 GTPase 경로의 활성은 액틴 중합 및 수상돌기가지를 포함하는, GAP 활성의 억제에 기인할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서는 Rac1 GAP 활성과 관련된, 뇌에서 발현되는 BCR은, 신경세포에 세포외 시냅스 신호의 전달을 조절하는 PTPRT에 의해 조절되는 것을 확인하였다. 해마 신경세포에서, 시냅스 형성을 조절하는 PTPRT에 의해, 특이적 타이로신 잔기의 탈인산화에 의해 BCR GAP 활성이 조절되고, 그 결과 BCR Rac1 GAP는 PTPRT와 협력하여 신경세포 발달을 조절하는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서는 PTPRT가 해마 신경세포에서 과발현되는 경우 신경세포의 시냅스 수는 증가하며, 시냅스 전달은 PTPRT의 녹다운 후 감소하는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 PTPRT의 기질을 확인하기 위해, 랫트 뇌 시냅토솜을 데옥시콜산으로 추출한 후, 상기 단백질을 항-PTPRT 단일클론 항체를 이용하여 면역침전시킨 다음, 다양한 BCR 펩타이드를 LC/Q-TOF MS/MS 분광분석법을 이용하여 확인하였다. 그런 다음, PTPRT 및 BCR 사이 상호작용을 뇌 시료에서 확인한 후, 비상동 세포에서 상기 단백질들의 공동-발현을 확인하였다. BCR의 특이적 타이로신 잔기는 PTPRT에 의해 탈인산화되는 것으로 나타남으로써, BCR이 PTPRT 효소의 기질이 되는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서는 PTPRT가 BCR의 타이로신 177을 탈인산화함으로써, 수상돌기가지 및 액틴 중합을 회복시키는 것을 확인하였다. PTPRT는 BCR의 신경세포 GAP 활성을 억제함으로써 신경세포 발달을 조절할 뿐만 아니라, 뉴로기닌과 상호작용을 통해 신경세포의 시냅스 형성을 조절한다. 따라서 PTPRT가 BCR Rac1 GTPase-활성 단백질의 활성을 억제함으로써 Rho GTPase 신호 경로를 조절하기 때문에, PTPRT 발현은 정신지체 및 자폐증을 포함하는 신경 질환과 관련될 수 있다. 신경세포 발달과 관련된 많은 유전적 질환은 Rho GTPase 신호 경로의 구성성분에서의 돌연변이에 의해 야기된다. 이런 증상 중에서, 비-증후군 정신지체는 X-염색체에 위치된 유전자의 결실 또는 돌연변이와 관련될 수 있다(예를 들면, 올리고프레닌 1; Rho GTPase에 대한 특이적 GAP). 그 외 이런 유전자들은 PAK3(p21-activated kinase 3, Rac 및 Cds42의 다운스트림을 기능하는 세린/트레오닌 인산화효소) 및 ARHGEF6(Rho GTPase에 대한 특이적 GAP; 또한 α-PIX 또는 Cool-2로 알려짐)(Luo, 2000)를 암호화하는 것들을 포함한다. 신경발달 장애인 윌리암 증후군(William's syndrome)은, 코필린으로 불리는 액틴 중합 인자를 인산화하기 위해 Rac 및 Rho의 다운스트림에 작용하는 단백질을 암호화하는 한쌍의 LIM-인산화효소 유전자의 결실에 의해 야기된다. 이와 관련하여, PTPRT는 BCR Rac1 GAP을 통해 매개되는 상호작용에 의해, Rho GTPase 신호경로의 중요한 성분으로 확인되었다. 따라서, PTPRT는 정신지체 및 자폐증을 포함하는 신경 질환의 치료를 위한 가치있는 약물 표적이 될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에서는 BCR 및 PTPRT이 Rac1 GTPase 경로에서의 개입을 통한 신경 발달을 조절하는 것을 확인하였다. BCR의 Rac1 GAP 활성은 상기 단백질의 N-말단 및 C-말단 사이 분자내 상호작용에 의해 조절되는데, PTPRT는 N-말단 부위에 위치한 177번째 타이로신 잔기의 탈인산화에 의해 BCR의 Rac1 GAP 활성을 조절하는 것을 확인하였다. 따라서 이런 BCR의 새로운 분자내 상호작용은 BCR의 N-말단 도메인이 BCR-Abl 종양형성에서 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다.

결론적으로, 본 발명에서는 PTPRT가 BCR의 N-말단 부위에 위치하는 177번째 타이로신 잔기를 탈인산화하여, BCR의 N-말단과 C-말단 사이 분자 간 상호작용을 강화시켜 BCR의 Rac1 GAP 활성을 억제시킴으로써 신경세포의 수상돌기 발달 및 액틴 중합을 촉진시킬 수 있으므로, 상기 PTPRT를 이용한 유전자 치료제는 신경세포 발달 촉진, 신경 재생, 특히 신경세포의 발달과 관련된 다양한 신경 정신질환 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 PTPRT 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료제는, 임상 투여시에 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 치료제는 실제 임상 투여시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁 용제로는 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 치료제로서의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하는 것이 바람직하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

상기 치료제의 유효 용량은 체중 1㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁷ 내지 10¹¹ 바이러스 입자(10⁵ 내지 10⁹ IU)/㎏, 세포의 경우에는 10³ 내지 10⁶ 세포/㎏이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁸ 내지 10¹⁰ 입자(10⁶ 내지 10⁸ IU)/㎏, 세포의 경우에는 10² 내지 10⁵ 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

또한, 본 발명은 PTPRT 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 신경세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 신경세포 발달의 촉진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 PTPRT 유전자 전달체 또는 세포를 개체에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 신경재생 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 PTPRT 유전자 전달체 또는 세포를 개체에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 신경 정신질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 PTPRT 유전자는 인간 PTPRT 유전자인 것이 바람직하며, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자(GenBank Acession Number NM_133170)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 제조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 거세포 바이러스(Cytomegalo Virus, CMV)인 것이 더욱 바람직하나 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 개체는 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하고, 인간, 마우스, 랫트, 기니피그, 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 개, 소, 원숭이 및 침팬지로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더욱 바람직하나 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 신경 정신질환은 치매, 우울증, 정신분열증, 자폐증 및 정신지체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 투여 방법은 PTPRT 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 화학적 방법, 물리적 방법, 리포좀을 이용한 접합방법, 수용체 및 바이러스를 이용한 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 세포 내로 도입시키는 것이 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

인간 PTPRT 을 포함하는 벡터의 제조

전장 인간 BCR(NM_004327, aa 1-1271), 인간 ABR(NM_02162, aa 1-859), 및 인간 PTPRT(NM_133170; aa 1-1460; 서열번호 2)를 GW1-CMV 내로 서브클론시켰다. BCR-N 및 BCR-C를 p3xFLAG-CMV-7.1(Sigma) 내로 BCR의 aa 2-453 및 aa 454-1271를 암호화하는 DNA의 서브클로닝에 의해 구축하였다. BCRΔCC를 전장 BCR-GW1로부터 aa 27-55를 결실시킴으로써 구축하였다. GAP-사멸 돌연변이(BCR-GD and BAR-GD)를 제조하기 위해, Quick-Change system(Stratagene)(Oh et al., submitted)을 이용하여 BCR의 Arg1090 및 ABR의 Arg683를 Ala로 변경하였다. Quick-Change system을 이용하여 위치지정돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 Y177F, Y177E, Y283F, Y328F, 및 Y360F BCR 컨스트럭트를 제조하였다. BCR의 N-말단 내로 YFP를 삽입하고 pECFP-N1(Clontech) 내로 YFP-BCR의 서브클로닝함으로써 YFP-BCR-CFP를 구축하였다.

신경세포의 형질감염, 면역조직화학분석, 및 F- 액틴 염색

배자기(embryonic day) 18일(E18) 랫트(rat)로부터 준비된, 초기 해마 신경세포를 시험관내에서(in vitro) 7일 동안 배양(7 DIV)한 후, 이전에 보고된 방법(Lim et al. 2009)과 같이, 인산칼슘 방법을 이용하여 상기 해마 신경세포를 상기 [실시예 1]의 벡터로 형질감염시켰다.

또한, 면역형광분석을 위해, 10 DIV 해마 신경세포를 4%(v/v) 포름알데하이드/4%(w/v) 슈크로즈에 고정시킨 후, 인산완충식염수에서 0.2%(v/v) Triton X-100로 투과시킨 다음, 1차 항체로 반응시킨 후, 최종적으로 형광단이 결합된 2차 항체(Jackson Immunoresearch)로 반응시켰다. 해마 신경세포에서 중합된 액틴(F-액틴)을 시각화하기 위해, 1:20으로 희석된 Alexa Fluor 555(Invitrogen)과 결합된 팔로이딘을 2차 항체 용액과 혼합한 후, 반응 2시간 후 해마 신경세포를 세척하였다.

BCR 및 ABR 의 수상돌기가지에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 BCR(Breakpoint cluster region) 및 ABR(active breakpoint cluster region)가 수상돌기가지의 발달에 미치는 영향을 분석하기 위해, Scholl 분석을 수행하여 수지상돌기가지의 Scholl 프로파일을 획득하였다. 구체적으로, Scholl 분석은 Nakayama et al. (2000)의 변형된 방법을 적용하여 수행하였다. 우선, 각 신경세포를 공초점 현미경(LSM Meta, Zeiss)을 적용하여 20× 대물렌즈를 이용하여 이미지화하였고, 상기 이미지를 인쇄하였다. 그런 다음, 상기 인쇄물을 20 μm으로 증가시키는 직경을 갖는 동심원을 갖는 투명용지 아래에 놓았다. 그런 다음, 상기 동심원의 중심을 세포체 중심에 놓고, 각 동심원을 가로지르는 수상돌기의 수를 계산하였다. 1차 및 2차 수상돌기의 정량은 20× 대물렌즈를 이용하여 각 신경세포의 이미지화를 통해 수행하였다. F-액틴 형광 강도의 정량을 위해, 수상돌기 몸통에서 평균 픽셀 강도를 신경세포체로부터 20 μm 떨어져서 측정하였다.

그 결과, BCR 및 ABR가 배양된 해마 신경세포에서 과발현되는 경우, 수상돌기가지의 발달이 매우 약화되었다(도 1b). Scholl 프로파일은 BCR 및 ABR이 해마 신경세포의 수상돌기가지를 유의적으로 약화시키는 것을 나타내었다. 1차 및 2차 수상돌기의 수는 BCR 및 ABR의 과발현에 따라 상당히 감소하였다. BCR은 N-말단 부위에서 다양한 효소적 기능성 도메인을 가지나 C-말단의 GAP 도메인은 수상돌기가지의 약화를 야기하는 것을 나타내었다(도 1c). BCR 결실 돌연변이의 경우, GAP 도메인을 포함하는 C-말단 부위(BCR-C)는 해마 신경세포에서 발현되었고, 수상돌기가지는 약화되었으며, 1차 및 2차 수상돌기의 수는 BCR 야생형(BCR-WT) 단백질이 존재하는 경우에 비해 그 수준이 감소하는 것으로 나타났다(도 1a). 한편, N-말단을 발현하는 BCR 결실 돌연변이(BCR-N)는 대조군과 유사한 표현형을 나타내었다. 이런 결과는 수상돌기가지가 BCR 및 ABR의 Rac1 GAP 활성에 의해 조절되는 것을 나타내었다.

또한, 본 발명자들은 GAP 활성을 차단하는, GAP-사멸 돌연변이를 BCR 및 ABR 모두 내로 삽입한 후, 수상돌기가지 발달을 조사하였다(Kawashima et al., 2000).

그 결과, BCR 및 ABR의 GAP-사멸 돌연변이(BCR-GD 및 ABR-GD)에서, 수상돌기가지는 회복하였으며, 1차 및 2차 수상돌기의 수는 유의적으로 증가하였다(도 1d 및 도 1e). 따라서, BCR 및 ABR는 Rac1 GAP 도메인와 관련된 기작을 통해 신경세포 발달을 약화시키는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 BCR 녹다운을 이용하여 BCR이 수상돌기가지에 미치는 영향을 알아보기 위해, 배양된 해마 신경세포에서 BCR 발현을 억제하기 위해 BCR shRNA를 제조[쥐 BCR의 363-381 뉴클레오티드(GGTCAACGACAAAGAGGTG; BCR-shRNA XM_228091.4)를 pSuper.gfp/neo (OligoEngine) 내로 서브클론함.]한 후, 상기 BCR shRNA의 존재 하에서 BCR의 발현을 확인하였다.

그 결과, BCR-shRNA의 첨가 하에서, BCR의 발현은 쥐 해마 신경세포에서 효율적으로 녹다운(knockdown)되었다(도 2A 및 도 2B).

또한, 본 발명자들은 신경세포 발달에 대한 BCR 녹다운의 효과를 확인하였다.

그 결과, 수상돌기가지는 대조군 신경세포와 비교하여 BCR 녹다운 신경세포에서 유의적으로 향상되었다(도 2C).

BCR(Resc BCR)이 BCR 녹다운 신경세포에서 과발현되는 경우, 수상돌기가지는 대조군 신경세포의 수준으로 떨어졌다.

또한, 본 발명자들은 눌 돌연변이 마우스(null mutant mice)(BCR -/-)로부터 유래된 해마 신경세포의 수상돌기 발달 정도를 관찰하였다.

그 결과, 수상돌기 발달은 야생형 신경세포의 수상돌기 발달에 비해 증가되었다(도 2D 및 도 2E). 또한, BCR의 과발현에 의해 BCR -/- 세포의 수상돌기가지가 약화되었다.

또한, 본 발명자들은 BCR 녹다운 신경세포에서 F-액틴 중합을 검사하였다.

그 결과, 팔로이딘으로 염색된 F-액틴의 수준은 대조군 신경세포에 비해 BCR 녹다운 신경세포에서 증가하였으며, Resc BCR의 발현에 따라 한번 더 감소되었다. BCR 녹다운에 의한 Rac1 GAP 활성의 감소는 액틴 중합이 증진되었으나, Resc BCR에 의한 BCR의 재-발현은 GAP 활성을 회복시켰다.

따라서, BCR 녹다운은 액틴 세포골격의 중합을 증진시킴으로써 수상돌기가지를 증가시키는 것을 알 수 있었다.

BCR N-말단의 coiled coil 의 GAP 활성에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 coiled coil 도메인이 수상돌기가지와 관련되었는지 여부를 알아보기 위해, coiled coil 결핍 BCR 돌연변이(BCR-ΔCC)를 제조한 후, 면역형광분석법을 수행하였다.

그 결과, BCR-ΔCC는 배양된 해마 신경세포에서 발현하였다(도 3a). 수상돌기가지, 및 1차 및 2차 수상돌기 수 모두는 BCR-ΔCC에 의해 유의적으로 회복하였다. coiled coil이 N-말단에 위치하여 C-말단의 GAP 도메인으로부터 떨어져 있음에도 불구하고, coiled coil 부위의 결실은 BCR의 GAP 활성을 감소시키는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명자들은 Rac1 GAP 활성이 coiled coil의 결실에 의해 영향을 받는 경우, 액틴 중합 수준의 차이는 BCR-ΔCC의 발현으로 명백해질 수 있다. 이에, 형광단(Alexa Fluor 555)에 결합된 팔로이딘을 이용하여, 배양된 해마 신경세포에서 F-액틴 중합을 측정하였다.

그 결과, BCR의 Rac1 GAP 활성의 발현은 액틴 중합을 감소시켰고, 팔로이딘으로 염색된 F-액틴의 수준은 BCR-WT의 발현으로 감소되었다. 한편, coiled coil 결핍 BCR 돌연변이(BCR-ΔCC), 및 GAP-사멸 돌연변이(BCR-GD)은 액틴 중합을 유의적으로 회복시켰다(도 3b 및 도 3c). 따라서, N-말단에서 coiled coil 부위의 결실은 BCR C-말단에서 GAP 도메인의 활성을 조절하고, 액틴 세포골격의 중합을 증가시킴으로써 수상돌기가지를 회복시키는 것을 알 수 있었다.

PTPRT 의 수상돌기가지에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 BCR와 PTPRT의 상호작용을 알아보기 위해, 항-PTPRT-특이적 단일클론항체를 적용하여 면역침전된 랫트 뇌 시냅토솜 단백질의 분석을 위해 MS/MS 분석을 수행한 후, Mascot 데이타베이스 검색 프로그램을 이용하여, 펩타이드 이온의 결합된 MS/MS 스펙트럼의 아미노산 서열을 확인하였다.

그 결과, BCR이 PTPRT의 가능한 상호작용 파트너임을 새롭게 확인하였다(도 4a 및 도 4b).

또한, 본 발명자들은 공동-면역침전분석을 이용하여, 랫트 뇌 시냅토솜 단백질의 분석을 수행하였다. 구체적으로, 공동-면역침전 분석은 랫트 시냅토솜(synaptosome)의 데옥시콜산나트륨(sodium deoxycholate)을 항-PTPRT 단일클론 항체(Lim et al., 2009) 또는 비-면역 마우스 면역글로불린(IgG)과 반응시킨 후, 공동-면역침전된 BCR을 항-BCR 항체(Santa Cruz; sc-886)를 이용하여 탐색하였다. BCR 및 PTPRT를 HEK293 세포에서 발현시킨 후, 이런 세포의 세포잔해를 제거한 용해물(Cleared lysate)을 항-BCR 또는 항-PTPRT 항체와 반응시켰다. 그런 다음, 공동면역침전된 PTPRT 및 BCR을 SDS-PAGE 겔에 로딩한 후 적절한 항체를 이용하여 웨스턴블랏팅을 수행하였다.

그 결과, 항-PTPRT 항체는 HEK293 세포에서 PTPRT와 관련된 BCR을 감소시키지 않았고, BCR은 PTPRT와 상호작용하는 경우에만 침전되었다(도 4c 및 도 4d). 또한, BCR이 PTPRT의 활성 도메인(catalytic domain)(RTJD 도메인)과 주로 상호작용하는 반면에, 전장 PTPRT(RT-FL에 의해 예시되는), PTPRT의 세포외 엑토 도메인(RT-ΔJDD에 있는), 및 막통과 부위를 포함하는 세포내 도메인(RT-TJDD에 있는)은 BCR과 단지 약한 상호작용을 보이는 것을 확인하였다(도 4e, 도 4f 및 도 4g).

또한, 본 발명자들은 BCR Rac1 GAP와 상호작용에 의해 매개되는, 신경세포 발달의 조절에서 PTPRT의 기능을 상세하게 분석하였다.

그 결과, PTPRT 활성 도메인(RT-WT에 있는)이 해마 신경세포에서 BCR과 공동발현되는 경우, 수상돌기가지는 유의적으로 회복되는 것을 확인하였다(도 5a). 전장 PTPRT가 상대적으로 비효율적임에도 불구하고, PTPRT 활성 도메인의 발현은 BCR 발현에 대해 약화된 신경세포의 발달을 회복시키는 것을 알 수 있었다. 또한, 액틴 중합은 배양된 신경세포에서 PTPRT의 공동발현으로 유의적으로 회복되는 것을 확인하였다(도 5b). 따라서, PTPRT는 신경세포 발달을 조절하고, BCR과 상호작용하고, 수상돌기가지 및 액틴 중합을 모두 조절할 수 있는 것을 알 수 있었다.

BCR 이 PTPRT 의 신경세포 기질로서의 역할 분석

본 발명자들은 BCR이 PTPRT의 신경세포 기질이 될 수 있는지 알아보기 위해, 시험관내(In vitro) 타이로신 탈인산화효소 분석을 수행하였다. 구체적으로, 타이로신 탈인산화효소 분석은, 우선 15분 동안 200 μM 펄바나데이트(pervanadate)로 처리된 HEK293 세포에서 형질감염 2일 후에 BCR를 발현시켰다. 그런 다음, 1%(v/v) Triton X-100가 포함된 PBS에서 용해된 세포의 세포잔해를 제거한 용해물(Cleared lysate)을 단백질 A-아가로즈에 결합된 항-BCR 항체와 반응시킨 다음, 세 번 세척하였다. 그런 다음, 면역침전된 BCR을 25℃에서 30분 동안 PTPRT 활성 도메인(catalytic domain)을 포함하는 정제된 재조합 단백질과 반응시켰다(Lim et al., 2009). 그런 다음, SDS 시료 완충용액을 첨가하여 상기 반응을 종결시킨 후, BCR의 차이로신 인산화를 항-포스포타이로신(phosphotyrosine) 항체(Upstate; 4G10)를 이용하여 탐색하였다.

그 결과, BCR의 타이로신 잔기는, 단백질 타이로신 탈인산화효소의 잠재적 억제제인 펄바나데이트(pervanadate)로 처리된 해마 신경세포에서 인산화되었다(도 6a). 신경세포 타이로신 인산화효소 Fyn이 BCR을 인산화하는 것을 나타내었다(도 6b). BCR의 타이로신 잔기는 Fyn에 의해 인산화되었고 PTPRT에 의해 탈인산화되었다. 따라서 BCR은 Fyn 타이로신 인산화효소 및 PTPRT 타이로신 탈인산화효소의 신경세포 기질이 될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 Fyn의 주요 표적인 타이로신 잔기를 확인하기 위해, 타이로신 비-인산화 모방 BCR 돌연변이를 제조한 후, 인산화 수준을 측정하였다.

그 결과, 타이로신 177의 비-인산화 모방 BCR 돌연변이는 유의적으로 감소된 타이로신 인산화를 나타냄으로써, 타이로신 177은 Fyn 타이로신 인산화효소의 주요 표적이 되는 것을 알 수 있었다(도 6c).

또한, 본 발명자들은 타이로신 177이 PTPRT의 주요 표적인지 여부를 결정하기 위해, 타이로신 177을 제외한, 타이로신 283, 328, 및 360 모두의 비-인산화 모방 BCR 삼중 돌연변이(BCR-3YF)를 제조한 후, 타이로신 인산화 패턴을 조사하였다.

그 결과, PTPRT는 타이로신 인산화를 현저히 감소시켜, 타이로신 177이 PTPRT의 주요 표적이 되는 것을 나타내었다(도 6d).

또한, 본 발명자들은 BCR이 PTPRT의 기질임을 확인하기 위해, PTPRT 활성 도메인을 포함하는 재조합 단백질이 재조합 BCR 단백질과 혼합시킨 후, 25℃에서 반응시켰다.

그 결과, PTPRT의 활성 도메인은 BCR 인산화를 유의적으로 감소시켰으나, 그 외 단백질 타이로신 탈인산화효소는 그렇지 않았다(도 6e). 따라서, 해마 신경세포에서 BCR은 PTPRT의 기질임을 명백하게 알 수 있었다.

BCR 의 탈인산화 조절 기작 분석

본 발명자들은 해마 신경세포에서 타이로신 177의 비-인산화 모방 돌연변이(BCR-Y177F)의 발현이 수상돌기가지에 영향을 미치는지 조사하였다.

그 결과, BCR-Y177F는 인산화 모방 돌연변이(타이로신이 글루타메이트로 돌연변이된; BCR-Y177E)와 달리, 신경세포 발달을 유의적으로 회복시켰다. BCR-Y177F 및 BCR-Y177E 단백질은 해마 신경세포에서 유사한 수준으로 발현되었다. BCR-Y177F는 해마 신경세포 내에서 액틴 중합을 유의적으로 감소시키는 반면에, BCRY177E는 그렇지 않았다(도 7a 및 도 7b). BCR-Y177E가 수상돌기가지, 또는 BCR의 인산화된 타이로신 177에 Grb2의 결합을 통해 Ras GTPase의 활성을 나타내는 액틴 중합 중 어느 것도 영향을 미치지 않는 것은 신경세포 발달에 중요한 것이 아님을 알 수 있었다. 그 외 타이로신 잔기의 비-인산화 모방 BCR 돌연변이, 특히 BCR-Y283F, -Y328F, 및 -Y360F 돌연변이는 수상돌기가지 또는 액틴 중합 중 어느 하나를 회복시키지 않았다(도 7c 및 도 7d).

또한, 본 발명자들은 BCR의 탈인산화된 타이로신 177과 관련된 기작을 통해 수상돌기가지를 증진시키는 또다른 기작이 있는지 알아보기 위해, 타이로신 177의 비-인산화 모방 돌연변이를 BCR-N 결실 돌연변이 내로 삽입(BCR-N-Y177F)한 후, 수상돌기가지의 정도를 정량하였다.

그 결과, BCRN- Y177F가 BCR-N-WT와 비교한 경우, 수상돌기가지의 명백한 차이가 없는 것을 해마 신경세포에서 나타내었고, 탈인산화된 타이로신 177과 관련된 다른 상호작용이 나타나지 않았다(도 8a). 따라서, PTPRT에 의한 타이로신 177의 탈인산화는 BCR의 GAP 활성을 억제하여 액틴 중합 및 신경세포 발달을 동시에 회복시키는 것이며, 이는 Rac1 GTPase 경로에 의한 것임을 알 수 있었다.

PTPRT 에 의한 BCR GAP 활성 조절 분석

본 발명자들은 PTPRT이 N-말단 부위에 위치된 타이로신 잔기의 탈인산화를 통해 C-말단 GAP 활성이 조절되는지, GAP 활성이 BCR의 N-말단 및 C-말단 사이 분자내 상호작용에 의해 조절될 수 있는지, 및 이런 상호작용이 탈인산화에 의해 조절되는지 조사하였다.

그 결과, BCR의 N-말단 및 C-말단 사이 가능한 상호작용을 확인하였다. BCR N-말단을 포함하는 GST-융합 단백질은, 타이로신 177이 페닐알라닌으로 변경하여 탈인산화를 모방하는 경우 BCR C-말단을 포함하는 재조합 단백질을 감소시켰으나, 야생형 재조합 BCR은 이것과 관련하여 비효과적이었다(도 8b 및 도 9a).

또한, 본 발명자들은 이런 데이타를 확인하기 위해, GFP(BCR-N-GFP) 또는 FLAG(BCR-C-FALG) 중 어느 하나로 태그된 N-말단 및 C-말단을 포함하는, 재조합 BCR 단백질들 사이 상호작용을 HEK 293 세포에서 조사하였다.

그 결과, 비-인산화 모방 BCR-N-GFP(BCR-N-GFP-Y177F)는 BCR-C-FLAG에 의해 공동면역침전되었고, 이는 야생형(BCR-N-GFP-WT), 또는 타이로신 177의 인산화 모방 돌연변이 BCR 단백질(BCR-N-GFP-Y177E)이 적용되는 경우보다 휠씬 더 증가된 것으로 나타났다(도 9b).

또한, 본 발명자들은 BCR의 N-말단 및 C-말단에 융합된 YFP 및 CFP 컨스트럭트(YFP-BCR-CFP)를 이용한 수용체 브리칭(Acceptor bleaching) FRET 분석을 수행한 후, 타이로신 177의 비-인산화 또는 인산화 중 어느 하나의 모방 돌연변이를 적용하여 FRET 효율을 조사하였다. 구체적으로, 수용체 브리칭 FRET은 수용체의 존재 하에서 공여체 "디퀀칭(dequenching)"의 측정과 관련된 것으로서, 광-블리칭에 의해 수용체의 파괴 전 및 후에 동일한 시료의 공여체 형광 강도를 비교함으로써 획득하였다. 만약, FRET이 초기에 존재한다면, 공여체 형광의 증가는 수용체의 블리칭 즉시 일어날 것이다. 에너지 전이 효율은 다음과 같이 정량화하였다:

FRETeff =(Dpost-Dpre)/Dpost;

여기서, Dpost은 수용체 블리칭 후 공여체 형광 강도이고 Dpre는 수용체 블리칭 전 공여체 형광 강도이다. FRETeff는 Dpost > Dpre일 때, 양성이다.

그 결과, YFP 수용체가 514 nm에서 반복적인 여기(excitation)에 의해 블리치되는 경우, CFP 및 YFP 사이에 FRET이 차단되었고, 이에 CFP로부터 유래된 방출 스펙트럼 수준이 증가하였다. 상기 CFP 방출 스펙트럼은 타이로신 177의 비-인산화 모방 돌연변이(Y177F)가 적용되는 경우, 야생형 단백질의 스펙트럼, 또는 타이로신 177의 인산화 모방 돌연변이 단백질(Y177E)과 비교하여 증가되었다(도 9c, 도 9d 및 도 9e).

이런 결과는 BCR의 N-말단 및 C-말단 사이 상호작용이 타이로신 177이 PTPRT의 작용에 의해 탈인산화되는 경우 증가되는 것을 나타내는 것이다. 따라서, BCR의 Rac1 GAP 활성은 타이로신 177의 탈인산화에 의해 증진되는 분자내 BCR 상호작용에 의해 조절되는 것을 알 수 있었다.

결론적으로, BCR 및 PTPRT는 Rac1 GTP 신호 경로와 관련된 프로세스에 의해 신경세포 발달을 조절할 수 있는 것을 알 수 있었다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 PTPRT를 이용한 신경세포 발달 증진 활성을 가지는 신경 재생용 약물 개발뿐만 아니라, PTPRT를 활성화하여 BCR의 177번째 타이로신 잔기의 탈인산화를 증가시키는 물질을 탐색하여 신경세포 발달 저하와 관련된 신경 정신 질환, 예를 들면, 치매, 우울증, 정신분열증, 자폐 또는 정신지체 등의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A composition for regeneration of nerve cells comprising protein tyrosine phosphatase receptor T genes <130> 11p-01-35 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12701 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cctcccgcct cagttcgcgc cgcgcctcgg cttggaacgc aggagcgccg gctccgggag 60 cccgagcgga gccagccgcg cgcacagcca gcggccgcgc cggcgatgcg gggccacccc 120 gcgcccgccc cagtcccggc cccggccccc gcgggaaggg gctgagctgc ccgccgccgc 180 ccggatggcg agcctcgccg cgctcgccct cagcctgctc ctgaggctgc agctgccgcc 240 actgcccggc gcccgggctc agagcgccgc aggtggctgt tcctttgatg agcactacag 300 caactgtggt tatagtgtgg ctctagggac caatgggttc acctgggagc agattaacac 360 atgggagaaa ccaatgctgg accaggcagt gcccacagga tctttcatga tggtgaacag 420 ctctgggaga gcctctggcc agaaggccca ccttctcctg ccaaccctga aggagaatga 480 cacccactgc atcgacttcc attactactt ctccagccgt gacaggtcca gcccaggggc 540 cttgaacgtc tacgtgaagg tgaatggtgg cccccaaggg aaccctgtgt ggaatgtgtc 600 cggggtcgtc actgagggct gggtgaaggc agagctcgcc atcagcactt tctggccaca 660 tttctatcag gtgatatttg aatccgtctc attgaagggt catcctggct acatcgccgt 720 ggacgaggtc cgggtccttg ctcatccatg cagaaaagca cctcattttc tgcgactcca 780 aaacgtggag gtgaatgtgg ggcagaatgc cacatttcag tgcattgctg gtgggaagtg 840 gtctcagcat gacaagcttt ggctccagca atggaatggc agggacacgg ccctgatggt 900 cacccgtgtg gtcaaccaca ggcgcttctc agccacagtc agtgtggcag acactgccca 960 gcggagcgtc agcaagtacc gctgtgtgat ccgctctgat ggtgggtctg gtgtgtccaa 1020 ctacgcggag ctgatcgtga aagagcctcc cacgcccatt gctcccccag agctgctggc 1080 tgtgggggcc acatacctgt ggatcaagcc aaatgccaac tccatcatcg gggatggccc 1140 catcatcctg aaggaagtgg aatatcgcac caccacaggc acgtgggcag agacccacat 1200 agtcgactct cccaactata agctgtggca tctggacccc gatgttgagt atgagatccg 1260 agtgctcctc acacgaccag gtgagggggg tacgggaccg ccagggcctc ccctcaccac 1320 caggaccaag tgtgcagatc cggtacatgg cccacagaac gtggaaatcg tagacatcag 1380 agcccggcag ctgaccctgc agtgggagcc cttcggctac gcggtgaccc gctgccatag 1440 ctacaacctc accgtgcagt accagtatgt gttcaaccag cagcagtacg aggccgagga 1500 ggtcatccag acctcctccc actacaccct gcgaggcctg cgccccttca tgaccatccg 1560 gctgcgactc ttgctgtcta accccgaggg ccgaatggag agcgaggagc tggtggtgca 1620 gactgaggaa gacgttccag gagctgttcc tctagaatcc atccaagggg ggccctttga 1680 ggagaagatc tacatccagt ggaaacctcc caatgagacc aatggggtca tcacgctcta 1740 cgagatcaac tacaaggctg tcggctcgct ggacccaagt gctgacctct cgagccagag 1800 ggggaaagtg ttcaagctcc ggaatgaaac ccaccacctc tttgtgggtc tgtacccagg 1860 gaccacctat tccttcacca tcaaggccag cacagcaaag ggctttgggc cccctgtcac 1920 cactcggatt gccaccaaaa tttcagctcc atccatgcct gagtacgaca cagacacccc 1980 attgaatgag acagacacga ccatcacagt gatgctgaaa cccgctcagt cccggggagc 2040 tcctgtcagt gtttatcagc tggttgtcaa ggaggagcga cttcagaagt cacggagggc 2100 agctgacatt attgagtgct tttcggtgcc cgtgagctat cggaatgcct ccagcctcga 2160 ttctctacac tactttgctg ctgagttgaa gcctgccaac ctgcctgtca cccagccatt 2220 tacagtgggt gacaataaga catacaatgg ctactggaac cctcctctct ctcccctgaa 2280 aagctacagc atctacttcc aggcactcag caaagccaat ggagagacca aaatcaactg 2340 tgttcgtctg gctacaaaag caccaatggg cagcgcccag gtgaccccgg ggactccact 2400 ctgcctcctc accacaggtg cctccaccca gaattctaac actgtggagc cagagaagca 2460 ggtggacaac accgtgaaga tggctggcgt gatcgctggc ctcctcatgt tcatcatcat 2520 tctcctgggc gtgatgctca ccatcaaaag gagaagaaat gcttattcct actcctatta 2580 cttgaagctg gccaagaagc agaaggagac ccagagtgga gcccagaggg agatggggcc 2640 tgtggcctct gccgacaaac ccaccaccaa gctcagcgcc agccgcaatg atgaaggctt 2700 ctcttctagt tctcaggacg tcaacggatt cacagatggc agccgcgggg agctttccca 2760 gcccaccctc acgatccaga ctcatcccta ccgcacctgt gaccctgtgg agatgagcta 2820 cccccgggac cagttccaac ccgccatccg ggtggctgac ttgctgcagc acatcacgca 2880 gatgaagaga ggccagggct acgggttcaa ggaggaatac gaggccttac cagaggggca 2940 gacagcttcg tgggacacag ccaaggagga tgaaaaccgc aataagaatc gatatgggaa 3000 catcatatcc tacgaccatt cccgggtgag gctgctggtg ctggatggag acccgcactc 3060 tgactacatc aatgccaact acattgacgg ataccatcga cctcggcact acattgcgac 3120 tcaaggtccg atgcaggaga ctgtaaagga cttttggaga atgatctggc aggagaactc 3180 cgccagcatc gtcatggtca caaacctggt ggaagtgggc agggtgaaat gtgtgcgata 3240 ctggccagat gacacggagg tctacggaga cattaaagtc accctgattg aaacagagcc 3300 cctggcagaa tacgtcatac gcaccttcac agtccagaag aaaggctacc atgagatccg 3360 ggagctccgc ctcttccact tcaccagctg gcctgaccac ggcgttccct gctatgccac 3420 tggccttctg ggcttcgtcc gccaggtcaa gttcctcaac cccccggaag ctgggcccat 3480 agtggtccac tgcagtgctg gggctgggcg gactggctgc ttcattgcca ttgacaccat 3540 gcttgacatg gccgagaatg aaggggtggt ggacatcttc aactgcgtgc gtgagctccg 3600 ggcccaaagg gtcaacctgg tacagacaga ggagcaatat gtgtttgtgc acgatgccat 3660 cctggaagcg tgcctctgtg gcaacactgc catccctgtg tgtgagttcc gttctctcta 3720 ctacaatatc agcaggctgg acccccagac aaactccagc caaatcaaag atgaatttca 3780 gaccctcaac attgtgacac cccgtgtgcg gcccgaggac tgcagcattg ggctcctgcc 3840 ccggaaccat gataagaatc gaagtatgga cgtgctgcct ctggaccgct gcctgccctt 3900 ccttatctca gtggacggag aatccagcaa ttacatcaac gcagcactga tggatagcca 3960 caagcagcct gccgccttcg tggtcaccca gcaccctcta cccaacaccg tggcagactt 4020 ctggaggctg gtgttcgatt acaactgctc ctctgtggtg atgctgaatg agatggacac 4080 tgcccagttc tgtatgcagt actggcctga gaagacctcc gggtgctatg ggcccatcca 4140 ggtggagttc gtctccgcag acatcgacga ggacatcatc cacagaatat tccgcatctg 4200 taacatggcc cggccacagg atggttatcg tatagtccag cacctccagt acattggctg 4260 gcctgcctac cgggacacgc ccccctccaa gcgctctctg ctcaaagtgg tccgacgact 4320 ggagaagtgg caggagcagt atgacgggag ggagggacgt actgtggtcc actgcctaaa 4380 tgggggaggc cgtagtggaa ccttctgtgc catctgcagt gtgtgtgaga tgatccagca 4440 gcaaaacatc attgacgtgt tccacatcgt gaaaacactg cgtaacaaca aatccaacat 4500 ggtggagacc ctggaacagt ataaatttgt atacgaggtg gcactggaat atttaagctc 4560 cttttagctc aatgggatgg ggaacctgcc ggagtccaga ggctgctgtg accaagcccc 4620 cttttgtgtg aatggcagta actgggctca ggagctctga ggtggcaccc tgcctgactc 4680 caaggagaag actggtggcc ctgtgttcca cggggggctc tgcaccttct gaggggtctc 4740 ctgttgccgt gggagatgct gctccaaaag gcccaggctt ccttttcaac ctaaccagcc 4800 acagccaagg gcccaagcag aagtacaccc acaagcaagg ccttggattt ctggctccca 4860 gaccacctgc ttttgttctg agtttgtgga tctcttggca agccaactgt gcaggtgctg 4920 gggagtggga ggctcccctg ccctccttct ccttaggagt ggaggagatg tgtgttctgc 4980 tcctctacgt catggaaaag attgaggctc ttgggggtca ctgctctgct gccccctgca 5040 acctccttca ggggcctctg gcaccagaca tttgcagtct ggaccagtgt gaccttacga 5100 tgttccctag gccacaagag aggcccccca tcctcacacc taacctgcat ggggcttcgc 5160 ccacaaccat tctgtacccc ttccccagcc tgggccttga ccgtccagca ttcactggcc 5220 ggccagctgt gtccacagca gtttttgata aaggtgttct ttgctttttt gtgtggtcag 5280 tgggaggggg tggaactgca gggaacttct ctgctcctcc ttgtctttgt aaaaagggac 5340 cacctccctg gggcagggct tgggctgacc tgtaggatgt aacccctgtg tttctttggt 5400 ggtagctttc tttggaagag acaaacaaga taagatttga ttattttcca aagtgtatgt 5460 gaaaagaaac tttcttttgg agggtgtaaa atcttagtct cttatgtcaa aaagaagggg 5520 gcgggggagt ttgagtatgt acctctaaga caaatctctc gggcctttta ttttttcctg 5580 gcaatgtcct taaaagctcc caccctggga cagcatgcca ctgagcaagg agagatgggt 5640 gagcctgaag atggtccctt tggtttctgg ggcaaataga gcaccagctt tgtgcataat 5700 ttggatgtcc aaatttgaac tccttcctaa agaaacccag cagccacctt gaaaaaggcc 5760 attgtggagc ccattatact ttgatttaaa ataggccaag agaatcaggc ctggagatct 5820 agggtcttgt ccaaagtgtg agtgagtcaa tgagagggaa ccaacatttg ctaagtctct 5880 actgtatgcc agggatcatg cttggcactt tccataggac atttcacaca gtccttagaa 5940 cccccaggag agagctactg acttgttatc atctccattt gatcatctcc tccaatgagg 6000 aaacccacgc accttcctta gtaatgaaat cctgggttcc aaaggggcag gtaatggcaa 6060 tgagacttct ccgtgctgtt ttcttcatct tctctaagcc aagcaattat tttatggagg 6120 gaaaataagg ccagaaactt ctgagcagat aactccacaa atggaaattt agtactttct 6180 tcctgatgcc agttcttctg ggaagcgcag aatttcagat atattttagt aacacattcc 6240 cagctcccca ggaaagccag tctcatctaa tttcttagtc agtaaaaaca attccctgtt 6300 ccttcaggct atgaatggac cagccaggga aactctcgac cttgatctct agccagtgct 6360 taggcccaat atctgacagc ctcaggtggg ctgggaccta ggaagctcca tcttgaaggc 6420 tggtctagcc ccagacaggg catgaggggc agagaattca agaaggtaca gctttggccc 6480 tcaagagccc actgtatgct ggggaaatgg aaccatggtg cagtagtgtg gagtggatga 6540 gtgttccatg agcctaggag caagaaagtc tcttcggcct cgggcttcct ggagaagggg 6600 acgtccattc ctgctgggtc ttaacaagca taaaaaggaa aaaaaggaaa ctcaggcaaa 6660 gggatccata tgtgcaatgg caaagaaatg tgaaaaggca ttgggagaag cagtctgggg 6720 gaggccagcc cagtgcgggc acagcacaac acggggagca gcaagagatg agccagggtc 6780 caggagacag atgcccatcg cgagtacaga ctttgtccta ttggcaacaa ggagtccatg 6840 gagctttaga gagatgcact cagcttcgtg ttggccaaga ctccttctgg gccaatgggg 6900 ctgcctcttt tcctttcatc agacactgtg aaaacattcc cttaagcgtg cactttttaa 6960 tatcacatct atttgtctgt ctgctcattg ttttgttgct ggaactaaat atgcaatgga 7020 tcatgagact cagattctat gagaaaccca gggtctctgc tttaccacgg agcagggtca 7080 ccaacccaga tctccaggcc catgaggatg gaacatgaaa ggagccgaca aaagttgctt 7140 ccattggcat gggctctgga gctgtccaga agtccaggga caccagactt gatcaaggaa 7200 gggctgtcac tttagaggtt caaaaggaag tgcctcaaag caaaggcaag caaaggaacc 7260 ccacgatgaa cttgctcttt tcctttgatg agcctctccc caggtgtatt tcagcagacc 7320 ccggggaccc acccccactg ggcctgctgg cctccctcgg ctccagccca atgccccagc 7380 tggccttccc cagcctgcaa ggagcctgta gcatggcaaa tctgcctgct gtatgctatt 7440 ttcttagatc ttggtacatc cagacaggat gagggtggag ggagagctat ttaacacaaa 7500 tcctaagatt tttttctgct caggaagggg tgaaatagct ggcagataca aaagacagtg 7560 gcttttatca ttttaaatgg taggaattta aggtgtgact tcagggagaa acaaacttgc 7620 aaaaaaaaaa aatctcaggc catgttgggg taacccagca agggccagtg atgatttccc 7680 ccagctcatc cccttatttt cccacaaccc aaccattctc taaagcagga cagtgaatag 7740 gtcttaggcc agtgcacaca ggaagaaatt gaggcttatg gatggggatg acttccctaa 7800 gatcccatgg gacaaggatg tggcaaggct tggatgagat ggggcaccag tgcccaggaa 7860 tttgaacatt ttcctttacc caggaaatct ccggagccaa caccaccacc cccagggggt 7920 ctccccaccc caccccattt acagggtgag ctcagcctgt catgagcaga ggaaaatatt 7980 attaatgctc tctgagtctt tacaacagga gctcttacct catagatgtg ggctctgttt 8040 ggggaagatg caaggaagta atgagaagcc caggaaattt ctccacctgt gtttatggcc 8100 taaatagctt caggatgtat cttagctgca ctccaacatt gcatcctttc tggggtgaag 8160 aatctgggcc aaccaggggt ccttgggcct ctagaaggcc acagtaggcc tctctttgtg 8220 ggaatggaag gggacagttt gcttttagtg ctggccctct ctgtgggtgt ggcctgcaaa 8280 ggaaccaaca gaccctatgc tggggactct aacatgtgag ctcattaaat tcttccagca 8340 ttctaaagga gggtttgtga ttgtcaccat ttactgatga ggaaactaag gctcctaggg 8400 gagaaatcac ttgcccacag ttccacagct agtgagtgaa tgaaccagga tttaaaccgg 8460 ttttttctca ctacagagac aatatttttc caccattgta tctcacattt ttcccaggag 8520 gttacccata acagaagaga ctagagtgga acagatacgt cagtggataa agctcaaagc 8580 aaacaacagt aagcttaaaa ttccttcata gtctcatgtt ttacgttcac aattcatgca 8640 aaatttgcat tccactttct gatttagcct tgttggtttt aatatgactc tatgaatatt 8700 tcaaaaaaaa atgtgctctg ttcctcatgt tgttctgttc tgttcacccc gctatgacgg 8760 accctaggtc agctggtctt cagcttgacc ctagaattga ctctaggagc agtgaccctg 8820 ctgcctccca gagccagtta taggctcaag atcaagacca actgaccttc tcctaggcag 8880 ctcctttggt gtgtgggtgc tctgacctca ctgttcatga ggggacctca actaaggcat 8940 cttccagttg ggtgctggaa ggaacccatt aactcacact agaatgatga ggatttgctc 9000 atctggcgtg gagaaggatg agcccacaaa accctaaagg gaaaagagaa gctggacaca 9060 gctgtactca gcagattcct gaatgctagg ctggaaagtg gtgcctgttg tccaagtgga 9120 gtcacatggt tgctaatgtg ggcaagtctg aggacacact tcatgagcag ctggggtctg 9180 gaaggctcct cactttaccc tagccacaca taattactgg gtgcctacag cacctagcac 9240 cttggagggg gcactattag gaaatcgaga ttactatggc acaattaatt cctgggtaag 9300 gcatggggtt gtggtggaca gagctcagtc tttagtttga acgaaaacat acatacatga 9360 aaaacataca tgaaaaaagg accctcatca acattagaag gggtagattt ggagcacttt 9420 aggcaggaaa acaggaacgc aaggccagga aactggaacc cagtgaatac tcagaaccga 9480 ggatgcagat gacttattta gcaaaatggt cacttctgtg acatagctgg agaaaggatg 9540 ggtaacagct tgccagagcc acttggaaca agggcaaatc tcagtgtctg gggcaaaaga 9600 tgatgcattt ccctctgacc catcatgttt attcatcctc cactccccat tgccacacta 9660 gctcttgctg taagtcctca ccaggatcta catttcctcg tcgctggtgg gaacccctta 9720 gagtacatag aggtatcagt ccagtaagac tgctctacac aacagaagtg aggcccaggg 9780 agtagcagcc aggcccttat cctgttacct ctgcaggagt gactgcccaa cccagatcca 9840 gagacattga aggaaatgat aattccttgg tacctcactg ccttgggaca aaatgaagaa 9900 agccaccctt ccttaggctg cagcttgcca ctcctgggct gggtaaacag gtcatcagca 9960 ccaagctcaa ccaggagtaa cactctggaa gacatgggtg agcccaagag gaagcatgaa 10020 caggacgctg ttcctaagtc atgtcaacag gttgtgctgg gccaggatcc ccagggaaaa 10080 aaatggtcaa cccaactgga gggtaggtta gaagaaaaaa aacataaacg tggatagtca 10140 tgtcatctca aatccctgac ttggcttccc cattacttaa cagtctgagc tccttcttag 10200 cctgtgacca gcttcaaatc acagccaagt aaaacaagga aataggaaaa gtaaatccaa 10260 ctagaagaga caagctgaga ttcagatttg tttactcctc ccatgcaaag tttccctgtt 10320 ggaggttttc catgtataca tgtctagaag tgatagaatg caaggccttg gctttgtctt 10380 gcagggatct gcctttgagg tcatagactg aacagcaggg agagaggtta gtggtggagt 10440 gtggggggag ctgttctagc tccagtttct tctgacacat ttttcaggat catggatctg 10500 atcctccgaa gcacagcaga gatatctaag ccatatttgt gcacatgagc agactcttct 10560 agttttttag taaccaggga tgggcttttg catggcactg actatagaga tgtcttgtag 10620 agatcaagcc agtcttttgc atcccacctg cccacctcca gaagagatgg gaaaaggtca 10680 tcaaagggca ttcaccaact gaaatccact catgaatgtt aggtctctaa aaggaggcat 10740 caacactcac aatggtagcc tccaaaccta gcatcccacc tatctaagag ctcaggggtg 10800 gtccactggg gcagatacaa gggaagtgca agggctcagg atgaaagaaa atctattggg 10860 aagagtttta ggggcttgat cattatgggg cttccttcta tatctgagaa ctgctctggg 10920 tggtgagatg tggactctga tccttaattg gaatgttcgg agaatgagtg tctggtggcc 10980 ttgaagtgtt ggacagaaaa gtatcagtat aaaagcctgg agctcagggt aattaatgta 11040 gttcatggtt ccttagtgag caggactctt ggatgtggag gagaaagggt cataggaagt 11100 aaaccaccaa aattacaaaa ttgagtctct gtacaattac ttcagtgcct ttgggcttat 11160 gaatacaaat cagtgggcct tctctatgat ggtccaacaa actctcagtg tccaccctgt 11220 ccctgtatct cccatggaag atgaataatg tcaggtgttc tttgggtcaa aggccccagg 11280 gcagtctgga ggcttagagg gcagagtggt gtcattccat gtaaagttag gcttctgagg 11340 ggtcaggcag aatatggtgt ccatatcttc catagctctg cagattcttg gatgaagtca 11400 agcacagttt gctagaccca ggtcactcct ctgagtataa ctaggaccca tgagtgaaac 11460 ttaatagctg taaggaagaa cctgctgtct gccagagagg ataagctgcc catctcagca 11520 gctgtctaaa agaaggcagg tgtctcttta aagggaagag aagcattggt gaaatggatt 11580 tcaggtcact tccattccag atgggtgaga tcttgtggag ctgggatcat gtttgaactc 11640 attcatacct gtagagcacg aatccaagta gattgtgttt ggtctgtaca ggctgaagcc 11700 ccctgctctc ccacccaagt gcccccactg agcaggccaa catgctgttg tggccacata 11760 tactgggctg atccaggctg gttatcacca aacagcaaac catagggaac agctgctttg 11820 ccatagaccc aatacccatg tagatctctc atgagagcag ccataactca gacccactga 11880 ccaacagggc catgagtgac agccagaacc agtgaaggtc caagtaggac acagagcagg 11940 gcttttctta ccatacacat tatctccaga ggttatttct accccactcc ctattcaagg 12000 cctgttggag cacactgcaa aagcaaaagc acagtaactc aatttacaca tgattataat 12060 catttccagt gcacacattt catcaccagg tggatcctga gctagcccat gtaaatccgg 12120 gttaacccat attggtaatc atactcaaaa gcacttttca ccctacattc tactagccaa 12180 tcaaagacaa agagttgtgg cctctaccat tgccttggct tctggacacc ctcacaagct 12240 atcccaaggt tcccgctcaa ctccagggag gctgacatct tcacatccac tgggcatata 12300 atattgcatg agaccaaagt ctccacactc tttgcagcct cctccatgaa tcccaatggc 12360 ctgcacttgt acagtttggg tgtttgatag ataaagcacg tatgagaaga gaaaacaaaa 12420 taaatcaact ttttaaaaaa gccagcactg tgctgtcaat gttttttttt tcttttcaat 12480 tctagctcag aaaagcagaa ggtaaataat gtcaggtcaa tgaatatcag atatattttt 12540 tgactgtaca ttacagtgaa gtgtaatctt tttacacctg caagtccatc ttatttattc 12600 ttgtaaatgt tccctgacaa tgtttgtaat atggctgtgt taaaaaatct atacaataaa 12660 gctgtgaccc tgagattcat gttttcctaa gataaaaaaa a 12701 <210> 2 <211> 1460 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Arg Leu Gln 1 5 10 15 Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Arg Ala Gln Ser Ala Ala Gly Gly Cys 20 25 30 Ser Phe Asp Glu His Tyr Ser Asn Cys Gly Tyr Ser Val Ala Leu Gly 35 40 45 Thr Asn Gly Phe Thr Trp Glu Gln Ile Asn Thr Trp Glu Lys Pro Met 50 55 60 Leu Asp Gln Ala Val Pro Thr Gly Ser Phe Met Met Val Asn Ser Ser 65 70 75 80 Gly Arg Ala Ser Gly Gln Lys Ala His Leu Leu Leu Pro Thr Leu Lys 85 90 95 Glu Asn Asp Thr His Cys Ile Asp Phe His Tyr Tyr Phe Ser Ser Arg 100 105 110 Asp Arg Ser Ser Pro Gly Ala Leu Asn Val Tyr Val Lys Val Asn Gly 115 120 125 Gly Pro Gln Gly Asn Pro Val Trp Asn Val Ser Gly Val Val Thr Glu 130 135 140 Gly Trp Val Lys Ala Glu Leu Ala Ile Ser Thr Phe Trp Pro His Phe 145 150 155 160 Tyr Gln Val Ile Phe Glu Ser Val Ser Leu Lys Gly His Pro Gly Tyr 165 170 175 Ile Ala Val Asp Glu Val Arg Val Leu Ala His Pro Cys Arg Lys Ala 180 185 190 Pro His Phe Leu Arg Leu Gln Asn Val Glu Val Asn Val Gly Gln Asn 195 200 205 Ala Thr Phe Gln Cys Ile Ala Gly Gly Lys Trp Ser Gln His Asp Lys 210 215 220 Leu Trp Leu Gln Gln Trp Asn Gly Arg Asp Thr Ala Leu Met Val Thr 225 230 235 240 Arg Val Val Asn His Arg Arg Phe Ser Ala Thr Val Ser Val Ala Asp 245 250 255 Thr Ala Gln Arg Ser Val Ser Lys Tyr Arg Cys Val Ile Arg Ser Asp 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Val Ser Asn Tyr Ala Glu Leu Ile Val Lys Glu Pro 275 280 285 Pro Thr Pro Ile Ala Pro Pro Glu Leu Leu Ala Val Gly Ala Thr Tyr 290 295 300 Leu Trp Ile Lys Pro Asn Ala Asn Ser Ile Ile Gly Asp Gly Pro Ile 305 310 315 320 Ile Leu Lys Glu Val Glu Tyr Arg Thr Thr Thr Gly Thr Trp Ala Glu 325 330 335 Thr His Ile Val Asp Ser Pro Asn Tyr Lys Leu Trp His Leu Asp Pro 340 345 350 Asp Val Glu Tyr Glu Ile Arg Val Leu Leu Thr Arg Pro Gly Glu Gly 355 360 365 Gly Thr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Leu Thr Thr Arg Thr Lys Cys Ala 370 375 380 Asp Pro Val His Gly Pro Gln Asn Val Glu Ile Val Asp Ile Arg Ala 385 390 395 400 Arg Gln Leu Thr Leu Gln Trp Glu Pro Phe Gly Tyr Ala Val Thr Arg 405 410 415 Cys His Ser Tyr Asn Leu Thr Val Gln Tyr Gln Tyr Val Phe Asn Gln 420 425 430 Gln Gln Tyr Glu Ala Glu Glu Val Ile Gln Thr Ser Ser His Tyr Thr 435 440 445 Leu Arg Gly Leu Arg Pro Phe Met Thr Ile Arg Leu Arg Leu Leu Leu 450 455 460 Ser Asn Pro Glu Gly Arg Met Glu Ser Glu Glu Leu Val Val Gln Thr 465 470 475 480 Glu Glu Asp Val Pro Gly Ala Val Pro Leu Glu Ser Ile Gln Gly Gly 485 490 495 Pro Phe Glu Glu Lys Ile Tyr Ile Gln Trp Lys Pro Pro Asn Glu Thr 500 505 510 Asn Gly Val Ile Thr Leu Tyr Glu Ile Asn Tyr Lys Ala Val Gly Ser 515 520 525 Leu Asp Pro Ser Ala Asp Leu Ser Ser Gln Arg Gly Lys Val Phe Lys 530 535 540 Leu Arg Asn Glu Thr His His Leu Phe Val Gly Leu Tyr Pro Gly Thr 545 550 555 560 Thr Tyr Ser Phe Thr Ile Lys Ala Ser Thr Ala Lys Gly Phe Gly Pro 565 570 575 Pro Val Thr Thr Arg Ile Ala Thr Lys Ile Ser Ala Pro Ser Met Pro 580 585 590 Glu Tyr Asp Thr Asp Thr Pro Leu Asn Glu Thr Asp Thr Thr Ile Thr 595 600 605 Val Met Leu Lys Pro Ala Gln Ser Arg Gly Ala Pro Val Ser Val Tyr 610 615 620 Gln Leu Val Val Lys Glu Glu Arg Leu Gln Lys Ser Arg Arg Ala Ala 625 630 635 640 Asp Ile Ile Glu Cys Phe Ser Val Pro Val Ser Tyr Arg Asn Ala Ser 645 650 655 Ser Leu Asp Ser Leu His Tyr Phe Ala Ala Glu Leu Lys Pro Ala Asn 660 665 670 Leu Pro Val Thr Gln Pro Phe Thr Val Gly Asp Asn Lys Thr Tyr Asn 675 680 685 Gly Tyr Trp Asn Pro Pro Leu Ser Pro Leu Lys Ser Tyr Ser Ile Tyr 690 695 700 Phe Gln Ala Leu Ser Lys Ala Asn Gly Glu Thr Lys Ile Asn Cys Val 705 710 715 720 Arg Leu Ala Thr Lys Ala Pro Met Gly Ser Ala Gln Val Thr Pro Gly 725 730 735 Thr Pro Leu Cys Leu Leu Thr Thr Gly Ala Ser Thr Gln Asn Ser Asn 740 745 750 Thr Val Glu Pro Glu Lys Gln Val Asp Asn Thr Val Lys Met Ala Gly 755 760 765 Val Ile Ala Gly Leu Leu Met Phe Ile Ile Ile Leu Leu Gly Val Met 770 775 780 Leu Thr Ile Lys Arg Arg Arg Asn Ala Tyr Ser Tyr Ser Tyr Tyr Leu 785 790 795 800 Lys Leu Ala Lys Lys Gln Lys Glu Thr Gln Ser Gly Ala Gln Arg Glu 805 810 815 Met Gly Pro Val Ala Ser Ala Asp Lys Pro Thr Thr Lys Leu Ser Ala 820 825 830 Ser Arg Asn Asp Glu Gly Phe Ser Ser Ser Ser Gln Asp Val Asn Gly 835 840 845 Phe Thr Asp Gly Ser Arg Gly Glu Leu Ser Gln Pro Thr Leu Thr Ile 850 855 860 Gln Thr His Pro Tyr Arg Thr Cys Asp Pro Val Glu Met Ser Tyr Pro 865 870 875 880 Arg Asp Gln Phe Gln Pro Ala Ile Arg Val Ala Asp Leu Leu Gln His 885 890 895 Ile Thr Gln Met Lys Arg Gly Gln Gly Tyr Gly Phe Lys Glu Glu Tyr 900 905 910 Glu Ala Leu Pro Glu Gly Gln Thr Ala Ser Trp Asp Thr Ala Lys Glu 915 920 925 Asp Glu Asn Arg Asn Lys Asn Arg Tyr Gly Asn Ile Ile Ser Tyr Asp 930 935 940 His Ser Arg Val Arg Leu Leu Val Leu Asp Gly Asp Pro His Ser Asp 945 950 955 960 Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile Asp Gly Tyr His Arg Pro Arg His Tyr 965 970 975 Ile Ala Thr Gln Gly Pro Met Gln Glu Thr Val Lys Asp Phe Trp Arg 980 985 990 Met Ile Trp Gln Glu Asn Ser Ala Ser Ile Val Met Val Thr Asn Leu 995 1000 1005 Val Glu Val Gly Arg Val Lys Cys Val Arg Tyr Trp Pro Asp Asp Thr 1010 1015 1020 Glu Val Tyr Gly Asp Ile Lys Val Thr Leu Ile Glu Thr Glu Pro Leu 1025 1030 1035 1040 Ala Glu Tyr Val Ile Arg Thr Phe Thr Val Gln Lys Lys Gly Tyr His 1045 1050 1055 Glu Ile Arg Glu Leu Arg Leu Phe His Phe Thr Ser Trp Pro Asp His 1060 1065 1070 Gly Val Pro Cys Tyr Ala Thr Gly Leu Leu Gly Phe Val Arg Gln Val 1075 1080 1085 Lys Phe Leu Asn Pro Pro Glu Ala Gly Pro Ile Val Val His Cys Ser 1090 1095 1100 Ala Gly Ala Gly Arg Thr Gly Cys Phe Ile Ala Ile Asp Thr Met Leu 1105 1110 1115 1120 Asp Met Ala Glu Asn Glu Gly Val Val Asp Ile Phe Asn Cys Val Arg 1125 1130 1135 Glu Leu Arg Ala Gln Arg Val Asn Leu Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr 1140 1145 1150 Val Phe Val His Asp Ala Ile Leu Glu Ala Cys Leu Cys Gly Asn Thr 1155 1160 1165 Ala Ile Pro Val Cys Glu Phe Arg Ser Leu Tyr Tyr Asn Ile Ser Arg 1170 1175 1180 Leu Asp Pro Gln Thr Asn Ser Ser Gln Ile Lys Asp Glu Phe Gln Thr 1185 1190 1195 1200 Leu Asn Ile Val Thr Pro Arg Val Arg Pro Glu Asp Cys Ser Ile Gly 1205 1210 1215 Leu Leu Pro Arg Asn His Asp Lys Asn Arg Ser Met Asp Val Leu Pro 1220 1225 1230 Leu Asp Arg Cys Leu Pro Phe Leu Ile Ser Val Asp Gly Glu Ser Ser 1235 1240 1245 Asn Tyr Ile Asn Ala Ala Leu Met Asp Ser His Lys Gln Pro Ala Ala 1250 1255 1260 Phe Val Val Thr Gln His Pro Leu Pro Asn Thr Val Ala Asp Phe Trp 1265 1270 1275 1280 Arg Leu Val Phe Asp Tyr Asn Cys Ser Ser Val Val Met Leu Asn Glu 1285 1290 1295 Met Asp Thr Ala Gln Phe Cys Met Gln Tyr Trp Pro Glu Lys Thr Ser 1300 1305 1310 Gly Cys Tyr Gly Pro Ile Gln Val Glu Phe Val Ser Ala Asp Ile Asp 1315 1320 1325 Glu Asp Ile Ile His Arg Ile Phe Arg Ile Cys Asn Met Ala Arg Pro 1330 1335 1340 Gln Asp Gly Tyr Arg Ile Val Gln His Leu Gln Tyr Ile Gly Trp Pro 1345 1350 1355 1360 Ala Tyr Arg Asp Thr Pro Pro Ser Lys Arg Ser Leu Leu Lys Val Val 1365 1370 1375 Arg Arg Leu Glu Lys Trp Gln Glu Gln Tyr Asp Gly Arg Glu Gly Arg 1380 1385 1390 Thr Val Val His Cys Leu Asn Gly Gly Gly Arg Ser Gly Thr Phe Cys 1395 1400 1405 Ala Ile Cys Ser Val Cys Glu Met Ile Gln Gln Gln Asn Ile Ile Asp 1410 1415 1420 Val Phe His Ile Val Lys Thr Leu Arg Asn Asn Lys Ser Asn Met Val 1425 1430 1435 1440 Glu Thr Leu Glu Gln Tyr Lys Phe Val Tyr Glu Val Ala Leu Glu Tyr 1445 1450 1455 Leu Ser Ser Phe 1460

Claims (13)

1. PTPRT(protein tyrosine phosphatase receptor T) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 신경재생용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, PTPRT 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 신경재생용 약학적 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 신경재생용 약학적 조성물.
   
4. 제 3항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경재생용 약학적 조성물.
   
5. 제 3항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 거세포 바이러스(Cytomegalo Virus, CMV)인 것을 특징으로 하는 신경재생용 약학적 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서, PTPRT는 BCR(Breakpoint cluster region)을 기질로 이용하는 것을 특징으로 하는 신경재생용 약학적 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서, PTPRT는 BCR의 N-말단으로부터 177번째에 위치한 타이로신을 탈인산화시키는 것을 특징으로 하는 신경재생용 약학적 조성물.
   
8. 제 1항에 있어서, PTPRT는 신경세포의 수상돌기 발달 및 액틴 중합을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 신경재생용 약학적 조성물.
   
9. PTPRT(protein tyrosine phosphatase receptor T) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 신경 정신질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
10. 제 9항에 있어서, 신경 정신질환은 치매, 우울증, 정신분열증, 자폐증 및 정신지체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경 정신질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
    
11. 시험관내(In vitro)에서 PTPRT(protein tyrosine phosphatase receptor T) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 신경세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 신경세포의 발달 촉진 방법.
    
12. 제 11항에 있어서, 상기 신경세포는 해마 유래 신경세포인 것을 특징으로 하는 신경세포의 발달 촉진 방법.
    
13. 제 11항에 있어서, 상기 도입은 PTPRT 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 화학적 방법, 물리적 방법, 리포좀을 이용한 접합방법, 수용체를 이용한 방법, 및 바이러스를 이용한 방법으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법에 의하여 세포내로 도입시키는 것을 특징으로 하는 신경세포의 발달 촉진 방법.
    

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