KR20120117008A - 바이러스에 대한 면역 반응 진단 방법 - Google Patents

바이러스에 대한 면역 반응 진단 방법 Download PDF

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드 슈타트 데르 네덜란덴, 베르테겐부어디그트 두어 드 미니스터 반 폭스겐트존하이트 벨지인 엔 스포츠
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Abstract

본 발명은 불활성화 바이러스를 사용하여 바이러스에 대한 세포성 면역 반응을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서, 바이러스에 대한 세포성 면역 반응은 대상자로부터 얻은 PBMCs를 불활성화 바이러스의 제조물과 함께 배양하고, 후속적으로 대상자의 PBMCs에서, 바람직하게 플로우 사이토메트리에 의해 적어도 하나의 T 세포 특이 사이토카인의 발현을 검출함으로써 대상자에서 검출된다. 상기 방법에서 유리하게, 불활성화 바이러스는 대상자로부터 얻은 PBMCs와 함께 배양하는데 사용되어, 상기 방법이 BSL-3 분류없이 실험실에서 수행되는 것이 실현가능해 지도록 한다. 바람직하게, 상기 방법은 포르말린 불활성화 인플루엔자 바이러스를 사용하여 CD107a, CD107b, IFN-γ, IL-2, IL-10 및 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 검출함으로써 인플루엔자 바이러스에 대한 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 반응을 검출하는 방법이다. 본 발명은 또한 대상자에서 바이러스에 대한 세포성 면역 반응을 검출하는데 유용한 성분들을 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

바이러스에 대한 면역 반응 진단 방법{METHODS FOR DIAGNOSIS OF IMMUNE RESPONSES AGAINST VIRUSES}
본 발명은 의학 분야에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 바이러스학 및 면역학 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게 본 발명은 불활성 바이러스를 이용하여 인플루엔자 바이러스와 같은 바이러스에 대한 세포성 면역 반응을 진단하는 방법에 관한 것이다.
고 병원성 및 유행성 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응에 관한 연구는 BSL-3 고 차단 설비를 필요로 한다. 이러한 설비에서 통제는 실질적으로 실험실 포텐셜에 영향을 미친다. 따라서, BSL-3 고 차단 설비가 필요없이 수행될 수 있는 고 병원성 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 검출할 수 있는 분석법이 요구된다.
고 병원성 및 유행성 인플루엔자를 불활성화시킴으로써, 이러한 바이러스는 BSL-3 분류없이 실험실에 사용될 수 있다. 현재, 스플릿- 및 서브유닛 인플루엔자 백신의 제조 도중에, 포르말린을 이용한 처리가 인플루엔자 바이러스를 불활성화시키는데 적용되고 있으며, 또한 전체 바이러스 인플루엔자를 불활성화시키는데 사용될 수 있다(1, 2). 포르말린은 비가역적으로 가교하는 단백질에 의해 작용하여 완전히 바이러스 감염성을 제거한다(3). 따라서, 이러한 방법은 인플루엔자 바이러스를 효과적으로 불활성화시키며, 포르말린-처리된 불활성화 바이러스를 BSL-3 차단물 밖에서 사용할 수 있도록 해준다.
인플루엔자에 대한 체액성 면역 반응은 표준 혈구응집반응- 및 뉴라미니다아제 저해 어세이에 의해 검출된다(4, 5, 12). 그러나, 불활성화 인플루엔자 바이러스에 대한 세포성 면역 반응의 검출은 어려운 것으로 나타났다. 통상적인 51Cr-방출 어세이에 의해 검출되는 CTL 활성은 감도가 부족하다(6). 51Cr-방출 어세이 전에 시험관 내 자극으로 7일간 메모리 CTLs의 증식은 아마도 어떠한 차이점을 감출 수 있으며, 이는 시험관 내 증식이 그 분석의 감도를 감소시킴을 나타낸다. ELISPOT 어세이와 같은 보다 민감한 어세이는 바로 인접한 세포들에 의해 생성되는 분비 사이토카인을 검출할 수 있으며, 시험관 내 증식 단계를 필요로 하지 않는다(7). ELISPOT가 민감함에도 불구하고, 이 어세이는 동시에 다중 이펙터 기능을 검출할 수 없으며 별개의 기능적 짐단을 구별하지 못한다.
중요하게도, 다중 이펙터 기능을 갖는 T 세포(다기능 T 세포), 즉, 다중 사이토카인 및/또는 세포독성제를 생성하는 T 세포는 면역 반응의 품질을 결정하는데 중요한 것으로 나타났다. 따라서, 플로우 사이토메트리에 의한 이러한 세포들의 검출은 백신의 품질을 측정하는 것을 촉진하고 백신 설계를 촉진한다.
Rutebemberwa 등(9)은 알드리티올(Aldrithiol)을 이용하여 HIV-1을 불활성화시키는 방법에 대해 개시하였다. PBMCs가 그 다음에 분리되고, 불활성화 바이러스에 노출되고, 그 다음 특히 IFN-감마를 검출하기 위해 플로우 사이토메트리를 수행하였다.
Skarsvik 등(10)은 PBMCs가 어떻게 열 불활성화 코삭키 바이러스에 의해 자극되고, 그 다음, 여러 마커를 이용하여 플로우 사이토메트리 분석에 의해 T 세포 활성화를 검출하는 방법에 대해 개시하였다.
Betts 등(11)은 HIV-1의 항원부를 나타내는 펩타이드의 칵테일로 PBMCs를 자극한 다음, 여러 마커를 이용하여 플루오 사이토메트리 분석에 의해 T 세포 활성화를 검출하는 방법에 대해 개시하였다. 그러나, 중복된 펩타이드의 사용은 전체 생 바이러스에 대한 완전한 생리학적 관련 CD8 T 세포 반응을 검출하는 유효한 대안이 아니다. 완전한 바이러스 프로테옴을 포함하는 중복 펩타이드의 뱅크를 생성하며, 이와 동시에 이러한 뱅크를 이용하여 자극하기 위해 충분한 PBMCs를 갖는 것은 실질적으로 불가능하다. 또한, 펩타이드의 외인성 첨가는 MHC 분자에 의한 발현 전에 펩타이드의 세포내 프로세싱을 배제하여, 이에 따라 세포내 번역후 변형에 의존하는 반응을 놓칠 수 있다. 더욱이, 자연적인 프로세싱은 생리학적으로 관련된 시험관 내 면역 반응을 이끄는 자연 수준으로의 펩타이드 발현을 일으키지만, 펩타이드의 외인성 첨가는 생리학적으로 관련된 T 세포 반응의 자극을 일으킬 수 있다.
그러나, 종래 기술에서는 불활성화 바이러스를 이용하여 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하고, 이에 따라 T 세포 반응이 충분한 강도로 생 바이러스로 획득되는 반응을 신뢰성있게 반영하는 T 세포 반응 검출 방법에 대해 개시하고 있지 않다. 특히, 종래 기술에서는 이러한 방법에서 인플루엔자 바이러스에 대해 T 세포 반응을 검출하는 방법에 대해 개시하고 있지 않다.
따라서, 신뢰할 수 있으며 민감한 다중 마커의 동시 검출 수단 및 방법, 및 이펙터 기능의 수 및 타입 뿐만 아니라 별개의 마커의 발현와 관련하여 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스에 대한 T 세포 반응을 페노타이핑(phenotyping)하는 수단 및 방법을 제공할 필요성이 당해 기술분야에 여전히 요구된다. 본 발명의 목적은 이러한 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 대상자에서 바이러스에 대한 면역 반응의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게 바이러스에 대한 세포성 면역 반응을 검출하는 방법이다. 보다 상세하게, 상기 방법은 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출한다. 대상자에서 바이러스에 대한 면역 반응을 검출하는 방법은 바람직하게 a) 대상자로부터 얻은 PBMCs를 불활성화 바이러스와 함께 배양하는 단계; 및 b) 플로우 사이토메트리에 의해 PBMC에서 T 세포 활성에 대한 적어도 하나의 마커의 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
도 1. 음성 대조구로서 모의(mock) 배양 상층액으로 자극되거나, 또는 양성 대조구로서 스타필로코커스 엔테로톡신 B(Staphylococcus enterotoxin B)(SEB)로 자극되거나, 생 A/H3N2 바이러스(A/Wisconsin/67/2005; Live flu) 또는 열처리(H.I. flu)로 불활성화된 A/H3N2 바이러스(A/Wisconsin/67/2005)로 자극되거나, 포르말린-처리(F.I. flu) 또는 BPL-처리(BPL. I. flu)로 자극된 인간 PBMCs의 플로우 사이토메트리 분석. IFN-γ(a), TNF-α(b), CD40L(c) 및 CD107(d) 발현을 표시된 바와 같이 CD8+ T 세포에서 감염/자극 후 24시간, 72시간 및 6일에 측정하였다. 바이러스 불활성화는 세포 상에서 어떠한 세포 병리학적 영향이 일어나지 않고 MDCK 세포에 불활성화 제조물의 3개의 10일 연속 배양물에 의해 입증되었다.
도 2. 생-A/H3N2 또는 포르말린 불활성화 (FI)-A/H3N2 바이러스(A/Wisconsin/67/2005)로 자극되거나, 또는 음성 대조구로서 포르말린 처리된 모의 배양 상층액으로 자극된 인간 PBMCs의 플로우 사이토메트리 분석. IFN-γ(a 및 b), TNF-α(c 및 d), CD107a(e 및 f) 및 IL-2(g 및 h) 발현을 표시된 바와 같이 CD4+(a, c, e 및 g) 및 CD8+ T 세포에서 감염 후 24시간, 48시간, 72시간 및 168시간에 측정하였다. ■ 모의(mock); ▼ H3N2 바이러스; ◆ FI H3N2 바이러스.
도 3. 생-A/H3N2 또는 FI-A/H3N2 바이러스로 자극되거나, 음성 대조구로서 포르말린 처리된 모의 배양 상층액으로 자극되거나, 또는 양성 대조구로서 스타필로코커스 엔테로톡신 B(Staphylococcus enterotoxin B)(SEB)로 자극된 인간 PBMCs의 플로우 사이토메트리 분석. IFN-γ(a), TNF-α(b), CD107a(c) 및 IL-2(d) 발현을 표시된 바와 같이 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 감염 후 72시간에 측정하였다.
도 4. 포르말린 불활성화 유행성 SOIV A/H1N1(A/Paris/2590/2009) 바이러스(FI SOIV H1N1), 계절성 생-A/H1N1 또는 FI-A/H1N1(A/New Caledonia/20/99) 바이러스, 생-A/H3N2 또는 FI-A/H3N2 바이러스, 음성 대조구로서 포르말린-처리된 모의 배양 상층액으로 자극되거나, 또는 양성 대조구로서 스타필로코커스 엔테로톡신 B(Staphylococcus enterotoxin B)(SEB)로 자극된, 최근에 SOIV A/H1N1-감염된 두 개체(도너 A 및 B)로부터의 인간 PBMCs의 플로우 사이토메트리 분석. CD107a(a 및 b) 및 IL-2(c 및 d) 발현을 표시된 바와 같이 CD4+(a 및 c) 및 CD8+(b 및 d) T 세포에서 감염 후 72시간에 측정하였다.
도 5. 포르말린 불활성화 (FI)-A/H1N1 바이러스(A/New Caledonia/20/99)로 자극되고, IL-10에 특이적인 항체로 염색되거나 음성 대조구로서 아이소타입-매치된 항체로 염색된 도너 MB-126으로부터의 인간 PBMCs의 플로우 사이토메트리 분석. 발현을 표시된 바와 같이 CD4+(패널 A) 및 CD8+(패널 B) T 세포에서 감염 후 18, 36, 54 및 72시간에 측정하였다.
T 세포의 생 바이러스 감염만이 직접적인 프리젠테이션 경로를 통해 MHC-클래스 I 분자에서 바이러스 에피토프의 발현을 가능하게 하기 때문에, 바이러스에 대한 면역 반응의 검출시 복합 인자는 생 바이러스의 사용이 일반적으로 CD8+ T 세포 반응 검출에 절대적으로 필요한 것으로 여겨진다(K.L. Rock, The Journal of Immunology, 2010, 184, 9-15). 그러나, 생 바이러스 감염은 고 병원성 바이러스에 대한 BSL-3 컨디션을 필요로 하기 때문에, 본 발명자들은 불활성화 바이러스를 이용한 자극 후에 CD8 T 세포 반응의 검출을 가능하게 하는 분석법을 개발하였다. 이 기술은 수지상 세포(dendritic cells) 및 대식 세포가 크로스-프리젠테이션(cross-presentation)이라 불리는 프로세스를 통해 이들의 외부 환경에서 항원으로부터 MHC 클래스 I 펩타이드에 존재하는데 독특한 변형적 프리젠테이션 경로를 사용한다(K.L. Rock, The Journal of Immunology, 2010, 184, 9-15).
제1 견지로, 본 발명은 대상자에서 바이러스에 대한 면역 반응의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게 바이러스에 대한 세포성 면역 반응을 검출하는 방법이다. 보다 상세하게, 상기 방법은 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출한다. 대상자에서 바이러스에 대한 면역 반응을 검출하는 방법은, 바람직하게 a) 대상자로부터 얻은 PBMCs를 불활성화 바이러스와 함께 배양하는 단계; 및 b) 플로우 사이토메트리에 의해 PBMC에서 T 세포 활성에 대한 적어도 하나의 마커의 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서 유리하게, 불활성화 바이러스가 대상자로부터 얻어진 PBMCs와 함께 배양하는데 사용되어, 상기 방법이 BSL-3 분류없이 실험실에서 수행되는 것이 실행가능하도록 한다. 바이러스의 불활성화를 위한 다양한 수단이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 바이러스를 불활성화하는 화학적 수단은 하기 제제들 중 하나 이상을 유효량으로 처리하는 것을 포함한다: 세제(예, Triton X-100), 포름알데히드, 포르말린, 베타-프로피오락톤 또는 메티올레이트. 불활성화를 위한 부가적인 화학적 수단은 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시플러렌(C60) 또는 이의 어느 조합으로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 바이러스 불활성화를 위한 다른 방법으로서, 예를 들어 바이너리 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민 및 가열, UV 광 또는 감마 조사와 같은 물리적 수단 등이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 불활성화 바이러스의 제조를 위해 이러한 어느 수단 또는 이의 조합이 적용될 수 있다.
불활성화 바이러스는 본 명세서에서 바람직하게 검출가능한 감염성을 갖지 않는 바이러스 제조물을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명에 사용되는 불활성화 바이러스 제조물의 감염성은 당해 기술분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 검출될 수 있다(참조 예, Goldstein 및 Tauraso, 1970, 상기 참조). 일반적으로, 불활성화 제조물의 감염성은 이에 상응하는 무처리된 및/또는 모의 처리된(mock-treated) 바이러스 제조물의 감염성과 비교되어, 불활성화 바이러스 제조물의 타이터(titer)는 무처리된 및/또는 모의 처리된 바이러스 제조물의 타이터에 비해 적어도 6, 7, 8, 9 또는 10배 낮다. 바람직하게, 불활성화 제조물에서 바이러스 감염성은 검출될 수 없다.
본 발명에서 사용되는 불활성화 바이러스를 제조하는 바람직한 방법으로, 상기 불활성화 바이러스는 적어도 약 0.02%v/v 포르말린으로 적어도 18시간 동안 바이러스를 처리하여 획득된다. 바람직하게, 상기 바이러스는 37℃에서 처리된다. 숙련자는 최대 불활성화 시간 및 포르말린 농도가 달라질 수 있으며, 예를 들어, 보다 낮은 포르말린 농도를 사용할 경우에 보다 긴 불활성화 시간이 요구될 것이며, 보다 높은 포르말린 농도에서는 보다 짧은 시간이 요구될 것임을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에 사용되는 불활성화 바이러스를 제조하는 바람직한 방법으로, 상기 불활성화 바이러스는 37℃에서 적어도 약 0.02%v/v 포르말린으로 적어도 18시간 동안 상기 바이러스로 처리하여 획득된 것과 동일한 불활성화도를 생성하는(즉, 불활성화 바이러스 제조물의 타이터가 무처리된 및/또는 모의 처리된 바이러스 제조물의 타이터에 비해 동일한 정도로 낮음) 조건 하에서(즉, 소정의 시간동안, 소정의 포르말린 농도 및 온도에서) 바이러스를 포르말린 처리하여 획득된다.
본 발명에 사용되는 불활성화 바이러스를 제조하는 보다 바람직한 방법으로, 불활성화 바이러스, 불활성화제(예, 포름알데히드)가 투석, 정용여과(diafiltration) 또는 크로마토그래피(예, 크기-배제 또는 친화성 크로마토그래피)와 같은 공정에 의해 불활성화 바이러스의 제조물로부터 제거된다. 이러한 공정을 위한 수단 및 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 바이러스 제조물의 불활성화는 필수 BSL 분류에 따라 실험실에서 수행될 것이라는 것은 분명하다. 그러나, 불활성화제의 불활성화 및 제거 후에, 불활성화 바이러스 제조물은 BSL-3 분류없이 실험실에서 본 발명에 따라 운반 및 저장 및/또는 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 불활성화 바이러스가 PBMCs와 함께 배양된다. PBMCs(말초혈액 단핵구세포(peripheral blood mononuclear cells))는 당해 기술분야에 잘 알려진 다양한 방법을 이용하여 사람 또는 다른 포유류 혈액에서 획득될 수 있다(참조 예, Coligan 등., 1994, In: Coico R, ed. Current protocols in immunology. Vol. 2: John Wiley & Sons, Inc., 1994:711-2.). PBMCs를 포함하는 조성물은 예를 들어, 포유류 또는 인간 혈액으로부터 어패어시스(aphaeresis), 피콜 밀도 구배 원심분리 및/또는 적혈구 세포 용해에 의해 획득가능한 PBMC 벌크로 구성될 수 있다.
본 발명의 방법에서, PBMCs 및 불활성화 바이러스는 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 T 세포의 유지, 증식 및/또는 자극에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양된다(참조 예. Current protocols in immunology, Coico R, ed, John Wiley & Sons, Inc., 1994). 본 발명의 방법에서, PBMCs 및 불활성화 바이러스는 바람직하게 플로우 사이토메트리에 의해 사이토카인 발현을 검출하기 전에 약 24시간 내지 96시간 동안 배양된다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 사이토카인 발현은 바람직하게 바이러스와 함께 PBMCs를 약 24-96시간 배양한 후, 즉, "감염(infection)" 후 또는 자극 후에 약 24-96시간 동안 바이러스와 함께 PBMCs를 배양한 후에 검출된다. 보다 구체적으로, 사이토카인 발현은 상기 바이러스와 함께 PBMCs를 적어도 36, 48, 60, 66, 68 또는 70시간 배양한 후에, 바람직하게 상기 바이러스와 함께 PBMCs를 96, 90, 84, 78 또는 74시간 이하 동안 배양한 후에 검출된다. 가장 바람직하게, 사이토카인 발현은 상기 바이러스와 함께 PBMCs를 약 72시간 배양한 후에 검출된다.
본 발명의 방법의 일 구현으로, T 세포 활성에 대한 적어도 2가지의 다른 마커의 발현이 검출된다. 바람직하게, 상기 방법에서 T 세포 활성에 대한 적어도 2가지의 다른 마커의 발현은 예를 들어, T 세포 활성에 대한 각 마커의 (동시) 검출을 위한 적어도 2가지의 다른 형광 표지를 사용하여 동시에 검출된다.
일반적으로, 본 발명의 방법에서, T 세포 활성 및/또는 분화 항원(예, CD4 또는 CD8)에 대한 마커는 검출하고자 하는 마커 또는 항원에 특이적인 (모노클로날) 항체를 사용하여 플로우 사이토메트리에서 적절히 검출될 수 있으며, 여기서 항체는 형광 표지, 즉, 형광단에 컨쥬게이션에 의해 표지된다. 검출하고자 하는 사이토카인 또는 분화 항원에 대한 항체와의 컨쥬게이션을 위한 다양한 형광 표지가 당해 기술분야의 숙련자에 의해 사용될 수 있다. 일차 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 적절한 형광단은 이에 한정하는 것은 아니나, 플루오레세인, 로다민, 텍사스 레드, VECTOR Red, ELF(효소-표지 형광), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7, 플루오르 X(Fluor X), 칼세인(Calcein), 칼세인-AM(Calcein-AM), CRYPTOFLUOR, 오렌지(Orange)(42kDa), 탄제린(Tangerine)(35kDa), 금(Gold)(31kDa), 레드(Red)(42kDa), 크림슨(Crimson)(40kDa), BHMP, BHDMAP, Br-오레곤(Br-Oregon), 루시퍼 옐로우, 알렉사 염료과(Alexa dye family), N-[6-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]카프로일](NBD), BODIPY, 보론 디피로메텐 디플루오라이드, 오레곤 그린, MITOTRACKER Red, 피코에리트린, 피코빌리프로틴 BPE(240kDa) RPE(240kDa) CPC(264kDa) APC(알로피코시아닌, 104kDa), 스펙트럼 블루, 스펙트럼 아쿠아, 스펙트럼 그린, 스펙트럼 골드, 스펙트럼 오렌지, 스펙트럼 레드, 적외선(IR) 염료, 시클릭 GDP-리보스(cGDPR), 칼코플루오르 화이트(Calcofluor White), 리사민(Lissamine), 움벨리페론(Umbeliferone), 티로신 또는 트립토판을 포함한다.
본 발명의 방법에서, T 세포 활성을 위한 적어도 하나의 마커의 발현은 플로우 사이토메트리에 의해 PBMC에서 검출된다. 상기 마커는 바람직하게 세포독성 T 세포 활성을 위한 마커이다. T 세포 활성을 위한 부가적인 마커는 사이토카인일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "사이토카인(cytokine)" 또는 "사이토카인들(cytokines)"은 면역 시스템의 세포에 영향을 주거나 받는 일반적인 종류의 생물학적 분자를 지칭한다. 이러한 정의는 이에 한정하는 것은 아니나, 국소적으로 작용하거나 혈액으로 순환할 수 있는 생물학적 분자들을 포함하는 것을 의미한다. 예시적인 사이토카인은 이에 한정하는 것은 아니나, 인터페론, 인터루킨, 종양 괴사인자 및 다양한 콜로니 자극 인자들을 포함한다. T 세포 특이 사이토카인은 본 명세서에서 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포와 같이 T 세포에서 발현되는 사이토카인으로 이해된다. 변형적으로, 그 발현이 검출되는, T 세포 활성을 위한 마커는 사이토카인이 아니라 예를 들어, 항원 자극 후 T 세포 탈과립을 위한 마커와 같은 세포독성 T 세포 활성을 위한 마커와 같이, T 세포 활성을 나타내는 그 밖의 마커이다.
본 발명의 방법의 다른 구현으로, T 세포 활성을 위한 마커를 발현하는 T 세포의 타입이 검출된다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 T 세포 활성을 위한 소정의 마커가 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 중 적어도 하나인 T 세포의 타입으로 발현되는지 검출한다. 보다 바람직하게, 본 발명의 방법은 T 세포 활성을 위한 소정의 마커가 CD4+ T 세포에서 발현되는지 그리고 상기 마커가 CD8+ T 세포에서 발현되는지 검출한다.
본 발명의 방법의 일 구현으로, T 세포 활성을 위한 마커(본 발명의 방법에서 이의 발현이 검출된다)는 CD107a, CD107b, IFN-γ, IL-2, IL-10 및 TNF-α로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 마커이다.
CD107a 및 CD107b(LAMP-1/LAMP-2)로 구성되는 CD107 분자는 항원 자극 후에 T 세포 탈과립 도중에 T 세포의 표면에서 일시적으로 발현된다(Betts 등., 2004, Meth. Cell Biol., 75;497-512). CD107의 발현은 T 세포의 세포독성 반응의 일부로서 세포독성 화합물의 분출과 직접적으로 관련된다. CD107 분자는 세포에서 세포독성 그래뉼의 멤브레인에 존재한다. 분출 순간에, CD107 분자는 세포의 외부에 노출된다. 표지 항체를 세포 배양물에 첨가함으로써, CD107 분자는 표지될 것이며, 플로우 사이토메트리에 의해 가시화될 것이다. 결국, CD107의 발현은 CD107 생성 및 세포 멤브레인에서 상기 분자의 필연적인 발현의 결과물이다. 본 발명의 방법에서, T 세포 활성을 위한 마커로서 CD107의 발현은 CD107a 및 CD107b 중 적어도 하나의 검출에 의해 검출될 수 있다.
CD107a(분화 107a의 클러스터) 및 CD107b(분화 107b의 클러스터)는 각각, 리소좀-관련 멤브레인 프로틴 1 및 2(LAMP1 및 LAMP2)로도 알려져 있다(Chang 등., 2003, J. Biol. Regul. Homeost. Agents 16(2): 147-151). 인간 CD107a는 본 명세서에서 NCBI 고유번호 NP_005552(2009년 9월 3일 버전)의 아미노산 서열을 갖는 글리코프로틴 또는 이의 대립 변이체인 것으로 이해된다. 인간 CD107b는 본 명세서에서 NCBI 고유번호 NP_002285(2009년 10월 5일 버전)의 아미노산 서열을 갖는 글리코프로틴 또는 이의 대립 변이체인 것으로 이해된다. CD107a 및 b는 셀렉틴에 대한 카보하이드레이트 리간드를 제시하는 것과 연루되며, 그 단백질은 리소좀, 엔도좀 및 플라즈마 멤브레인 사이를 왕래한다.
IFN-γ 또는 인터페론-감마(IFN-γ)는 타입 II 클래스의 인터페론의 유일한 멤버인 다이머 가용성 사이토카인이다(Gray 등., 1982, Nature 298 (5877): 859-863). IFN-γ는 바이러스 및 세포내 박테리아 감염에 대한 선천적이며 적응적인 면역력에 중요하며, 종양 제어에 중요한 사이토카인이다. IFN-γ는 선천적인 면역 반응의 일부로서 내츄럴 킬러(NK) 세포 및 내츄럴 킬러 T(NKT) 세포에 의해, 그리고 항원-특이 면역력이 발달하면 CD4+ 및 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL) 이펙터 T 세포에 의해 주로 생성된다. 인간 IFN-γ는 본 명세서에서 NCBI 고유번호 NP_000610(2009년 9월 28일 버전)의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 대립 변이체인 것으로 이해된다.
IL-2, 인터루킨-2는 미생물 감염에 대한 몸의 자연 반응시 중요한 인터루킨이다. T 세포 리셉터(TCR)에 대한 항원 바인딩은 IL-2의 분비를 자극한다(Stern 및 Smith, 1986, Science. 233: 203-206). 인간 IL-2는 본 명세서에서 NCBI 고유번호 NP_000577(2009년 9월 28일 버전)의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 대립 변이체인 것으로 이해된다.
IL-10, 인터루킨-10은 전염증 사이토카인의 생성을 저해함으로써 면역 억제 및 염증 반응에 주된 역할을 한다. 급성 바이러스 감염 도중에 감염된 주변부에서 항바이러스 CD8+ 및 CD4+ 이펙터 T 세포에 의해 생성되는 IL-10은 급성 인플루엔자 감염 도중에 염증 반응을 조절한다(Sun, 2009, Nature Medicine, 15(3):277-84). 인간 IL-10은 본 명세서에서 NCBI 고유번호 CAG46825(2008년 10월 16일 버전)의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 대립 변이체인 것으로 이해된다.
TNF-α, 종양 괴사인자-알파(카켁틴)는 전신성 염증에 연루된 사이토카인이며 급성 상 반응(acute phase reaction)을 자극하는 사이토카인 그룹의 멤버이다. 인간 TNF-α는 본 명세서에서 NCBI 고유번호 NP_000585(2009년 9월 28일 버전)의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 대립 변이체인 것으로 이해된다.
본 발명의 방법에 사용되는 마커, 사이토카인 및 분화 항원에 대한 형광 표지 항체는 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다. 이의 예는 예를 들어, 본 명세서에 실시예로 나타낸 바와 같다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 인플루엔자 바이러스와 같은 오르토믹소 바이러스과; 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 레트로 바이러스과; 루벨라 바이러스; 파라인플루엔자 바이러스, 홍역, 볼거리, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncitial virus), 인간 메타뉴모 바이러스(metapneumovirus)와 같은 파라믹소 바이러스과; 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 헤파타이티스 C 바이러스(HCV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 진드기 매개 뇌염 바이러스(tick-borne encephalitis virus), 세인트 루이스 뇌염 또는 웨스트 나일 바이러스와 같은 플라비바이러스과; 단순 헤르페스 바이러스(Herpes Simplex virus), 사이토메갈로 바이러스, 엡스테인-바 바이러스와 같은 헤르페스 바이러스과; 버냐 바이러스과; 아레나 바이러스과; 한탄과 같은 한타 바이러스과; 코로나 바이러스과; 인간 파필로마 바이러스와 같은 파포바 바이러스과; 광견병 바이러스와 같은 랩도 바이러스과; 인간 코로나 바이러스와 같은 코로나 바이러스과; 알파 바이러스과, 아테리 바이러스과, 에볼라 바이러스와 같은 필로 바이러스과, 아레나 바이러스과, 스몰폭스 바이러스와 같은 폭스 바이러스과 및 아프리카 돼지 콜레라 바이러스를 포함하는 어느 바이러스에 대한 면역 반응의 대상자에서 그 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.
바람직한 구현으로, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응의 대상자에서 그 존재를 검출하는데 사용된다. 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 구현으로, 상기 불활성화 바이러스는 불활성화 인플루엔자 바이러스이다. 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A, B 또는 C 속의 인플루엔자 바이러스일 수 있으며, 이 중에서 인플루엔자 바이러스 A속이 가장 바람직하다. 본 발명의 방법으로 면역 반응이 바람직하게 검출되는 인플루엔자 A 바이러스의 서브타입은 2009 유행성 돼지 기원 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스(SOIV 또는 H1N1v)를 포함하는, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3 및 H10N7을 포함한다.
본 발명의 방법은 상기 바이러스에 대한 면역 반응을 페노타이핑하는데 유리하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 T 세포 반응은 세포 당 이펙터 기능의 수, 타입 및 강도 뿐만 아니라, 별개의 마커들의 (그 세포에 의한) 발현과 관련되어 페노타이핑될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 PBMCs는 포유류 대상자로부터 얻은 것이다. 상기 PBMCs가 얻어지는 대상자는 예를 들어, 마우스, 래트, 코튼 래트(시그모돈 종), 토끼, 비인간 영장류 또는 흰담비(예, 머스텔라 푸토리우스 퓨로(Mustela putorius furo))와 같은 비인간 시험 동물일 수 있다. 변형적으로, 상기 PBMCs가 얻어지는 대상자는 인간 대상자일 수 있다. 본 발명의 방법의 일 구현으로, 상기 PBMCs는 인간 대상자로부터 얻어지며, 상기 불활성화 바이러스는 인간을 감염시킬 수 있으며 그리고/또는 이러한 것으로 추정되는 불활성화 형태의 바이러스이다.
본 발명의 방법에서, 상기 PBMCs에 첨가되는 불활성화 바이러스의 양은 최소한 본 명세서에 기재된 마커의 발현에 의해 측정될 수 있을 정도로 (세포성) 면역 반응을 유도하기에 충분한 것이다. 상기 PBMCs에 첨가되는 불활성화 바이러스의 양은 가장 편리하게 이의 활성화 전의 바이러스의 양과 상관된다. 따라서, 상기 PBMCs에 첨가되는 불활성화 바이러스의 양은, 적어도 약 0.1, 0.2, 0.5, 1 또는 2의 M.O.I.를 생성하는 활성화 전의 바이러스의 양에 상응하는 양이며, 바람직하게, 상기 M.O.I.는 약 10 또는 5 이하, 보다 바람직하게, 약 1-3, 가장 바람직하게 약 2의 M.O.I.이다.
본 발명의 방법의 다른 구현으로, 세포내 마커의 발현의 검출은 소포체에서 단배질의 축적을 일으키는 세포내 단백질 수송의 인히비터인 모넨신(monensin)(예, Golgi-stop, BD Biosciences)을 이용하여 향상될 수 있다. 모넨신은 바람직하게 예를 들어, 배양의 마지막 20, 16, 12 또는 8시간 도중에서와 같이, 검출 전 마지막 시간에 배양된 PBMCs에 첨가된다. 세포내 마커의 발현의 검출을 위해, PBMCs는 보통 당해 기술분야에 알려진 방법에 의해 더욱 고정되고 투과성으로 된다.
제2 견지로, 본 발명은 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 a) 대상자로부터 얻은 PBMCs를 불활성화 바이러스와 함께 배양하는 단계; 및 b) 상기 PBMCs에서 CD107의 발현을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 본질적으로 본 발명의 이러한 견지에서 적어도 CD107의 발현이 PBMCs에서 측정되나, CD107 발현은 반드시 플로우 사이토메트리에 의해 측정될 필요가 없는 것을 제외하고 상술한 바와 같이 수행되는 방법이다. 따라서, 본 발명의 이러한 제2 견지에서, 불활성화 바이러스로 자극된 PBMCs에서 CD107 발현은 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 상술한 바와 같이, CD107의 발현은 CD107a 및 CD107b 중 적어도 하나의 발현의 검출에 의해 검출될 수 있다. 또한, 본 발명의 다양한 견지로, CD107 발현은 세포에서뿐만 아니라, 세포 상에서(표면에서) 검출될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현(expression)"(예, CD107 또는 다른 마커의)은 유전자의 발현을 검출하는 것과 관련되어 사용될 경우에 그 유전자의 전사를 검출하고, 그리고/또는 그 유전자의 번역을 검출하는 것(생성된 단백질을 검출하는 것)을 지칭할 수 있다. 유전자의 발현을 검출하는 것은 유전자가 발현되는지 여부를 적극적으로 측정하는 행위를 지칭한다. 이는 유전자 발현이 대조구에 비해 상향조절되거나, 대조구에 비해 하향조절되거나, 또는 대조구에 비해 변화하지 않았는지 여부를 측정하는 것을 포함한다. 따라서, 발현을 검출하는 단계는 유전자의 발현이 실제로 상향조절되거나 하향조절되는 것을 필요로 하는 것이 아니라, 유전자의 발현이 변화하지 않는 것을 검출하는 것(즉, 유전자의 무발현 또는 유전자 발현의 무변화를 검출하는 것)을 포함할 수 있다. 전사체 및/또는 단백질의 발현은 당해 기술분야에 알려진 어느 다양한 방법에 의해 측정된다. RNA 발현에 대해, 그 방법은 이에 한정하는 것은 아니나, 세포성 mRNA의 추출 및 그 유전자의 전체 또는 일부를 코딩하는 전사체에 하이브리드되는 표지 프로브를 이용한 노던 블럿팅; 유전자-특이 프라이머, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 역전사중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용한 mRNA의 증폭 후, 어느 다양한 수단에 의한 그 산물의 정량적 측정; 그 세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 그 다음 이를 표지하여 상기 유전자를 코딩하는 cDNAs 또는 올리고뉴클레오타이드를 탐침함; 원위치 하이브리드화; 및 리포터 유전자의 검출을 포함한다. 단백질 발현을 측정하는 방법은 일반적으로 이에 한정하는 것은 아니나, 웨스턴 블롯, 면역블롯, 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA), 효소-결합 면역흡착 스폿(ELISPOT) 또는 플루오로스폿(FluoroSpot) 어세이, 방사면역 측정법(RIA), 면역침전법, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance), 화학 발광, 형광 편광, 인광, 면역조직화학 분석, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 타임 오브 플라이트(MALDI-TOF) 질량 분석기, 마이크로사이토메트리, 마이크로어레이, 현미경, 형광 활성화 세포 분리장치(FACS) 및 플로우 사이토메트리를 포함한다.
본 발명의 방법의 일 구현으로, CD107 발현의 검출에 부가적으로, 선택적으로 예를 들어, 하나 이상의 IFN-γ, IL-2, IL-10 및 TNF-α와 같은 추가 마커의 발현이 검출될 수 있다.
다른 견지로, 본 발명은 본 발명의 방법에 사용되는 구성 요소를 함유하는 "키트(kit)"에 관한 것이다. 이러한 키트는 튜브 또는 바이얼과 같이 하나 이상의 용기를 그 안에 수용하기 위한 캐리어를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 정의한 바와 같은 불활성화 바이러스, 마커를 검출하기 위한 비표지 또는 표지 항체, 사이토카인 및/또는 분화 항원 및 예를 들어, 배지, 모넨신, 세포의 고정 및 투과를 위한 시약들 및 및 사이토메트리 시약들과 같은 본 명세서에 언급된 기타 시약들을 포함할 수 있다. 바람직한 구현으로, 상기 키트는 최소한, 적어도 하나의 불활성화 바이러스의 제조물 및 마커 검출용 항체, 사이토카인 및/또는 분화 항원을 포함한다. 상기 시약들은 동결 건조된 형태 또는 적절한 버퍼에 존재할 수 있다. 또한, 상기 키트는 대상자로부터 PBMCs를 획득하기 위한 수단들, 버퍼, 파이펫, 마이크로타이터 플레이트 및 서면 지시와 같은 본 발명을 수행하는데 필요한 어느 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명의 키트에 대한 이러한 다른 성분들은 공지되어 있다.
본 명세서 및 청구범위에서, 동사 "포함하다(to comprise)" 및 이의 동사 활용형은 비제한적 견지로 그 단어에 후속하는 아이템들을 포함하며, 특별히 언급되지 않은 아이템들이 배제되는 것은 아닌 것을 의미한다. 또한, 부정관사 "하나의(a 또는 an)"는 정황상 분명히 하나이거나 단지 하나의 구성 요소가 존재하는 것을 필요로 하지 않는 한, 하나 이상의 구성 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정관사 "하나의(a 또는 an)"는 보통 "적어도 하나(at least one)"를 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고문헌들은, 그의 전문이 본 명세서에 참조로 편입된다.
하기 실시예는 설명을 위한 목적으로 제공되며, 어느 식으로든 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
실시예
1. 실시예 1
1.1 재료 및 방법
1.1.1 도너의 인클루젼 및 PBMC 의 분리
건강한 개체의 연막(buffy coats)을 인간 실험 지침서(프로젝트 번호 S03.0015-X)에 따라 Sanquin Blood Bank North West Region으로부터 회수하였다. 또한, 증상 시작 후 각각 13일 및 19일에 실험실에서 확인된 인플루엔자 A(H1N1)v 감염을 가진, 그 이전에는 건강하였던 두 사람(51세 여성, 55세 남성)으로부터 말초혈단핵세포(PBMC)를 회수하였다. 모든 참가자들은 연구 시작 전에 서면으로 통지된 동의서를 제공하였다. 시험은 유트레히트 대학 의학 센터(Utrecht University Medical Center)의 의학 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 인간 PBMC를 밀도 원심분리에 의해 분리하고, 분석 전까지 90% FCS(Hyclone, Logan, Utah)/10% DMSO(Sigma-Aldrich, St Louis, USA)에 -135℃에 냉동 보존하였다.
1.1.2 인플루엔자 바이러스
계절성 인플루엔자 바이러스 스트레인 H3N2 A/Wisconsin/67/2005 및 H1N1 A/New Calendonia/20/99, 뿐만 아니라 SOIV H1N1 A/Paris/2590/2009 스트레인을 Dr. S. van der Werf(Institute Pasteur, Paris, France)에 의해 후하게 제공받았다. 모든 바이러스 스트레인은 MDCK 세포를 감염시켜 생성되었다. 음성 대조구로서 감염되지 않은 MDCK 세포의 (모의) 배지를 사용하였다.
1.1.3 바이러스 불활성화
1.1.3.1 포르말린 불활성화
인플루엔자 바이러스 배양 상층액을 PBS에서 0.02% v/v 포르말린(포르말린 37%, Merck)과 함께 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 불활성화 직후에, DispoDialyzers MWCO 10kDa(Spectrum Laboratory Inc, Rancho Dominguez, USA)을 이용한 투석에 의해 포르말린을 제거하여 바이러스 및 면역 분석에 대한 영향을 방지하였다. 그 시료를 분석 전까지 -80℃에 보관하였다.
1.1.3.2 베타- 프로피오락톤 ( BPL ) 불활성화
인플루엔자 바이러스 배양 상층액을 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.3)에서 1:1060 희석의 BPL(BPL, 5ml 플라스크 98% 용액, Acros, www.acros.com)에 4℃에서 18시간 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 BPL을 37℃에서 2시간 동안 배양하여 가수분해하였다. 그 시료를 분석 전까지 -80℃에 보관하였다.
1.1.3. 2 열 불활성화
인플루엔자 바이러스 배양 상층액을 65℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 시료를 분석 전까지 -80℃에 보관하였다.
1.1.4 PBMC 자극 및 플로우 사이토메트리 분석
PBMC를 생 인플루엔자 바이러스로 2 MOI(multiplicity of infection)로 감염시키거나 동등한 양의 불활성화 바이러스로 자극시키고, 48-웰 플레이트(Greiner Bio-one)의 웰 당 1*106 cells로 10% FCS, P/S를 함유하는 RPMI 배지에 배양하였다. 모의-감염된 세포의 배양 상층액을 포르말린으로 불활성화시키고, 음성 대조구(모의(mock))로 사용하였다. 양성 대조구로서, 스타필로코커스 엔테로톡신 B(Staphylococcus enterotoxin B)(SEB)를 사용하였다. 그 세포들을 37℃ 및 5% CO2에서 다양한 시간 동안 배양하였다. CD107a PE(BD Biosciences, San Jose, USA)에 특이적인 항체를 배양이 끝나기 전 16시간에 첨가하였다. 세포내 사이토카인 생성을 검출하기 위해, 모넨신(Golgi-stop, BD Biosciences)을 배양의 마지막 16시간 동안에 첨가하였다. 배양 후, PBMC를 수거하고, V-바닥 플레이트(Greiner BioOne)으로 옮기고, FACS 버퍼(PBS, 0.5% BSA, 5mM EDTA)로 세정하였다. 그 세포들을 CD4 퍼시픽 블루(Pacific blue)(Biolegend, San Diego, USA), CD8 PerCP Cy5.5(BD Biosciences) 및 LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain(Invitrogen, Paisley, UK)로 4℃의 어둠 속에서 30분간 염색하였다. PBMC를 100㎕ FACS 버퍼로 1회 세정하였다. 후속적으로, 상기 PBMC를 4℃의 어둠 속에서 CytoFix/CytoPerm 용액(BD Biosciences)으로 20분간 고정화 및 투과성화(permeabilized)하였다. PBMC를 100㎕ Perm/Wash 버퍼(BD Biosciences)로 3회 세정하고, IFN-γ APC(BD Biosciences), IL-2 FITC(eBioscience, San Diego, USA), CD40L APC Alexa Fluor 750(eBioscience) 및 TNF-α PeCy7(BD Biosciences)로 4℃의 어둠 속에서 30분간 염색하였다. 염색 후, PBMC를 100㎕ Perm/Wash 버퍼로 2회 세정하고, 100㎕ FACS 버퍼로 1회 세정하였다. PBMC를 150㎕의 FACS 버퍼에 재현탁하고, FACS Canto II(BD Biosciences)를 사용하여 직접 획득하였다. 적어도 100,000개의 생존 가능한 림프구를 전면 스캐터 특성 및 라이브-데드 스테이닝의 분석에 기초하여 획득하였다. 그 결과를 FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
1.1.5 바이러스 불활성화의 확인
1.1.5.1 MDCK 세포에서 배양에 의한 불활성화 확인
대조구 및 처리된 인플루엔자 바이러스 배양 상층액 모두를 MDCK 세포에 최대 3회의 블라인드 패시지에 적용하였다. 이에 따라, 컨플루언트 MDCK 세포를 T25㎠-플라스크에 50㎕ 배양 상층액 및 5ml 감염 배지와 함께 37℃에서 60분간 배양하였다. 1시간 후, 그 모노레이어를 인산완충염(PBS)으로 세정하고, 감염 배지(2.5㎍/ml 트립신)로 덮고, 10일간 37℃에서 배양하였다. 10일 배양 기간 후에, 상기 플라스크를 1회 동결-융해 사이클에 적용하였다. cpe의 부재하에서, 수거된 배양물을 MDCK 세포에 대한 후속 패시지를 위한 접종원(50㎕)으로 사용하였다. 모든 수거된 배양 상층액을 -80℃에 보관하였다.
1.1.5.2 혈구응집반응 어세이에 의한 불활성화 확인
연속 2-배 희석의 생 인플루엔자 바이러스 및 불활성화 인플루엔자 바이러스 배양 상층액을 PBS에 제조하고, 4℃에서 PBS에 0.25% 터어키 에리트로사이트와 함께 배양하였다. 60분 후, 전체 혈구응집반응을 생성하는 최고 희석물에 대해 발현된 혈구응집반응 타이터가 판독되었다.
1.1.5.3 매트릭스 PCR 의 불활성화 확인
전체 핵산(50㎕)을 MagNA Pure LC(v3.0) 추출 로봇(Roche, Mannheim, Germany)에서 MagNA Pure LC 전체 핵산 분리 키트를 이용하여 200㎕ 인플루엔자 바이러스 배양 상층액으로부터 추출하였다. 배양물에서 인플루엔자 네가티브 센스 게놈의 정량 분석을 위해, 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 조류 골수 아세포증 바이러스(avian myeloblastosis virus) 역전사효소(AMV-RT)(Promega, WI, USA) 및 센스 매트릭스 유전자 프라이머 5' AAG ACC AAT CCT GTC ACC TCT GA 3'(M-Fw)를 사용하여 수행하여 복제 DNA(cDNA)를 생성하였다. 배양물에서 파지티브 센스 바이러스 RNA 전사체를 검출하기 위해, 전체 RNA를 rTth DNA 중합효소(Applied Biosystems, CA, USA) 및 매트릭스 유전자 안티센스 프라이머 5' CAA AGC GTC TAC GCT GCA GTC C 3'(M-Rv)을 이용하여 cDNA에서 전사한 다음, RNAse(Roche) 및 RNase A(Sigma-Aldrich) 처리에 의해 모든 RNA를 제거하였다. 후속적으로, 104 염기쌍 매트릭스 유전자 프레그먼트가 LightCycler® 480 실시간 PCR 시스템(Roche), LightCycler® TaqMan Master(Roche), 프라이머쌍 M-Fw 및 M-Rv, 및 FAM/BHQ-1®로 표지된 증폭물 특이 프로브 5' TTT GTG TTC ACG CTC ACC GTG CC 3'을 이용하여 증폭되었다.
1.2 결과
1.2.1 3개의 다른 인플루엔자 불활성화 방법의 비교 및 이의 T 세포 반응에 대한 영향
본 발명자들은 인플루엔자 바이러스의 불활성화를 위한 다양한 기술을 이용하였다. 그 다음, 다양한 기술에 의해 불활성화된 바이러스를 PBMC를 자극하는데 사용하고, 그 다음, CD8+ T 세포 반응을 평가하였다. 바이러스 불활성화 방법은 열 불활성화, 포르말린 불활성화 및 베타 프로피오락톤(BPL) 불활성화(상기 1.1.3 참조)를 포함한다. 불활성화된 바이러스로 자극한 후에 획득된 CD8+ T 세포 반응은 생 바이러스 자극으로 획득된 반응과 비교하였다. 양성 대조구로서 스타필로코커스 엔테로톡신 B(Staphylococcus enterotoxin B)(SEB)를 이용한 자극이 이용되었다. IFN-γ, TNF-α, CD40L과 CD107a, 그리고 IL-2 반응이 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 측정되었다. 도 1은 CD8+ T 세포에서 BPL-불활성화 바이러스가 매우 일관성 없는 반응을 나타내고, 열 불활성화 바이러스는 반응을 나타내지 않거나 거의 나타내지 않았으나, 포르말린 불활성화 바이러스는 생 바이러스 감염으로 획득된 강도의 약 75%에 부합되는 CD8+ T 세포 반응을 생성하였음을 보여준다. 유사한 결과가 CD4+ T 세포에서 획득되었다(데이타로 나타내지 않음).
1.2.2 포르말린-불활성화 계절성 인플루엔자에 대한 T 세포 반응
인플루엔자 바이러스의 포르말린 처리는 혈구응집반응 및 뉴라미니다아제 활성을 단지 미미하게 감소시켰으며, 가장 높은 HA 및 NA 활성 보존도를 나타내었다. 따라서, 포르말린-불활성화 (FI) 인플루엔자 바이러스는 포르말린 처리 후에 T 세포 에피토프 항원성이 보존되는지 여부를 측정하는데 사용되었다. 우선, T 세포 반응의 검출을 위한 최적 시점을 생-A/H3N2 또는 FI-A/H3N2 바이러스(A/Wisconsin/67/2005)와 함께 PBMCs를 배양함으로써 조사하였으며, 그 후, IFN-γ, TNF-α, CD107a 및 IL-2 발현을 감염 후(p.i.) 24, 48, 72 및 168시간에 측정하였다. 포르말린-처리된 모의물(mock)을 이용한 PBMCs의 자극은 모든 마커들의 백그라운드 발현을 측정하는데 사용되었다. 생 A/H3N2 바이러스를 이용한 PBMCs의 자극은 CD107a 및 IL-2를 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 현저한 증가를 일으켰으며, 감염 후 48시간 내지 96시간에 가장 높았다(도 2). 유사한 발현 패턴이 FI-A/H3N2 바이러스로 자극된 PBMCs에서 관찰되었다. 그러나, CD107a+ 및 IL-2+ 세포의 최고 퍼센트는 생 A/H3N2 자극에 비해 FI-A/H3N2 자극으로 약 24시간 후에 도달하였다. 또한, FI-A/H3N2에 의해 유도된 CD107a+ 및 IL-2+ 세포의 퍼센트는 생 H3N2 바이러스에 의해 유도된 퍼센트에 비해 낮았지만, 모의 자극에 의해 유도된 퍼센트 보다는 여전히 현저히 높았다. CD107a+ 및 IL-2+ T 세포의 유도와 유사하게, 생-A/H3N2 및 FI-A/H3N2를 이용한 PBMCs의 자극은 증가된 IFN-γ+ 및 TNF-α+ T 세포에 유의하지 않은 경향을 유도하였다. 일반적으로, 생-A/H3N2 및 FI-A/H3N2 자극에 대한 T 세포의 검출은 감염 후 72시간에서 가장 최적이었으며, 다른 인플루엔자 서브타입의 추가 검사를 위해 사용되었다. 이러한 시점은 생-A/H1N1 및 FI-A/H1N1 서브타입 인플루엔자 바이러스(A/New Caledonia/20/99)에 대한 T 세포 반응의 추가 검사를 위해 사용되었다(도 3). 또한, 상기 A/H1N1 바이러스는 생-A/H1N1 및 FI-A/H1N1 자극 후 모두에서 현저한 수의 CD107a+ 및 IL-2+ T 세포를 유도하였다. 또한, FI-A/H1N1에 의해 유도된 CD107a+ 및 IL-2+ T 세포의 퍼센트는 모의 감염에 의해 유도된 퍼센트에 비해 현저히 높았다. A/H3N2 바이러스에 비해, FI-A/H1N1 자극에 의한 IFN-γ+ 및 TNF-α+ T 세포의 유도는 현저히 유도되지 않았다.
또한, 이러한 데이터는 HA 및 NA 활성에 비해, 계절성 인플루엔자 바이러스의 T 세포 에피토프 항원성이 포르말린 처리 후에 높게 보존되는 것을 입증한다.
2.1.3 포르말린-불활성화 유행성 SOIV A/ H1N1 에 대한 T 세포 반응
포르말린 처리는 계절성 인플루엔자 바이러스를 효과적으로 불활성화시키지만, T 세포 에피토프 항원성을 보존하기 때문에, 본 발명자들은 유행성 SOIV A/H1N1 바이러스의 T 세포 에피토프 항원성이 포르말린 처리에 의한 불활성화 후에도 보존되는지 검출하고자 하였다. FI-SOIV A/H1N1(A/Paris/2590/2009)에 대한 T 세포 반응을 검출하기 위해서, 현저한 수의 SOIV A/H1N1-특히 T 세포의 존재를 보장하기 위해 둘의 최근에 SOIV A/H1N1-감염된 개체로부터 분리된 PBMCs를 사용하였으며, CD107a+ 및 IL-2+ T 세포의 유도를 검출하였다. 대조구로서, PBMCs를 FI-모의, 계절성 생-A/HINI 또는 FI-A/H1N1(A/New Caledonia/20/99) 바이러스로 자극하였다. 최근에 SOIV A/H1N1-감염된 개체로부터 얻은 PBMCs의 FI-SOIV A/H1N1을 이용한 시험관 내 자극은 두 도너 모두에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브셋에서 CD107a+ T 세포 퍼센트의 현저한 증가를 보여주었다(도 4). 상기 계절성 생-A/H1N1 바이러스 및 FI-A/H1N1 바이러스는 CD107a+ 세포의 유사한 증가를 유도하였다. 또한, 생 A/H1N1, FI-A/H1N1 및 FI-SOIV A/H1N1 자극은 도너 A로부터 얻은 PBMCs에서 IL-2+ T 세포를 유도하였으며, CD8+ T 세포 서브셋에서 가장 분명하였다. 그러나, 도너 B로부터 얻은 PBMCs를 생 A/H1N1, FI-A/H1N1 또는 FI-SOIV A/H1N1로 자극한 경우에는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브셋 모두에서 IL2+ T 세포를 유도하지 못하였으며, 이는 T 세포 반응에서 약간의 도너 가변성을 보여준다.
전체적으로, 이러한 데이터는 상기 유행성 SOIV A/H1N1 바이러스가 포르말린 처리 후에 T 세포 자극 능력을 보유함을 입증하며, 이는 또한 T 세포 에피토프 항원성이 이러한 유행성 인플루엔자 바이러스에 대해 보존됨을 나타낸다.
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Claims (14)

  1. a) 대상자로부터 얻은 PBMCs를 포르말린-불활성화 바이러스와 함께 배양하는 단계; 및
    b) 플로우 사이토메트리에 의해 T 세포 활성에 대한 적어도 하나의 마커의 발현을 검출하는 단계
    를 포함하는, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    적어도 2가지의 다른 마커의 발현을 검출하는, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 마커를 발현하는 T 세포의 타입을 검출하는, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 T 세포의 타입은 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포 중 적어도 하나인, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 마커는 CD107a, CD107b, IFN-γ, IL-2, IL-10 및 TNF-α로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 불활성화 바이러스는 불활성화 인플루엔자 바이러스인, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 불활성화 인플루엔자 바이러스는 적어도 0.02% v/v 포르말린으로 37℃에서 적어도 18시간 동안 처리하는 것과 동일한 정도의 바이러스 불활성화를 생성하는 바이러스 처리에 의해 획득되는, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마커의 발현은 상기 바이러스와 함께 PBMCs를 약 24시간 내지 96시간 배양한 후에 검출되는, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 마커의 발현은 상기 바이러스와 함께 PBMCs를 약 60시간 내지 약 84시간 배양한 후에 검출되는, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    불활성화 바이러스의 양은 약 1-3의 M.O.I., 바람직하게 약 2의 M.O.I.를 생성하는, 활성화 전의 바이러스의 양에 해당하는, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PBMCs는 인간 대상자의 것이며, 상기 불활성화 바이러스는 인간을 감염시킬 수 있거나 감염시키는 것으로 추정되는 불활성화 형태의 바이러스인, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  12. a) 대상자로부터 얻은 PBMCs를 불활성화 바이러스와 함께 배양하는 단계; 및
    b) 상기 PBMCs에서 CD107a 및 CD107b 중 적어도 하나의 발현을 검출하고, 선택적으로 하나 이상의 추가 T 세포 특이 사이토카인의 발현을 검출하는 단계
    를 포함하는, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 불활성화 바이러스는 불활성화 인플루엔자 바이러스인, 대상자에서 바이러스에 대한 T 세포 반응을 검출하는 방법.
  14. 불활성화 바이러스의 제조물을 가진 용기; 및
    T 세포 활성에 대한 마커의 검출을 위한 항체를 가진 용기
    를 포함하는, 바이러스에 대한 T 세포 반응 검출용 키트.
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