CN102656455B - 用于诊断针对病毒的免疫应答的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断针对病毒的细胞免疫应答方法，其使用灭活病毒。在本发明的方法中，将来自对象的PBMC与灭活病毒制备物孵育并随后检测对象的PBMC中至少一种T细胞特异性细胞因子的表达来检测针对病毒的细胞免疫应答，优选通过流式细胞术。在所述方法中有利的是，使用灭活病毒与来自对象的PBMC孵育，以使可以在不具有BSL-3分级的实验室中实施该方法。优选地，所述方法为使用福尔马林灭活的病毒，通过检测CD107、IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α的一或多种的表达来检测针对流感病毒的CD4+和CD8+T细胞应答的方法。本发明还涉及试剂盒，其包含对在对象中检测针对病毒的细胞免疫应答有用的组件。

Description

用于诊断针对病毒的免疫应答的方法
发明领域
本发明涉及医药领域。本发明尤其涉及病毒学和免疫学领域，更具体地本发明涉及用于诊断针对病毒的细胞免疫应答的方法，其使用灭活的病毒，如流感病毒。
发明背景
对高致病性和流行性流感病毒进行研究需要BSL-3的高度密封设施。这种设施的限制实质上影响了实验室潜力。因此，存在对能够检测针对高致病性流感病毒的免疫应答的测定的需要，其可以在不需要BSL-3高度密封设施的情况下进行。
通过将高致病性和流行性流感病毒灭活，可以在不具有BSL-3分级的实验室中使用这些病毒。目前，在生产裂解和亚单位流感疫苗的过程中，福尔马林化学处理应用于灭活流感病毒，并且还可用于全流感病毒灭活(1，2)。福尔马林通过不可逆地交联蛋白质起作用，从而彻底去除病毒感染性(3)。因此，此过程有效地灭活了流感病毒并且允许在BSL-3限制之外使用福尔马林处理的灭活病毒。
通过标准血细胞凝集和神经氨酸酶抑制试验确定针对流感的体液免疫应答(4，5，12)。然而，已经显示难以检测针对灭活流感病毒的细胞免疫应答。通过常规的51Cr释放测定确定CTL活性缺乏灵敏度(6)。在51Cr释放测定之前，7天体外刺激期间的记忆CTL扩增很可能遮掩任何差异，表明体外扩增会降低该测定的灵敏度。更灵敏的测定如ELISPOT测定能够检测由邻近细胞产生的分泌细胞因子，并且不需要体外扩增步骤(7)。尽管ELISPOT是灵敏的，此测定并不能同时检测多重效应子功能并且不能区分不同的功能性群体。
重要的是，已经显示具有多重效应子功能(即产生多种细胞因子和/或细胞毒性物质)的T细胞(多功能T细胞)对确定免疫应答质量是重要的。因此，通过流式细胞仪检测这些细胞有助于确定疫苗质量和疫苗设计(8)。
Rutebemberwa等人(9)公开了用二硫二吡啶(Aldrithiol)灭活HIV-1的方法。然后分离PBMC并将其暴露于灭活的病毒，进行流式细胞测定以检测尤其是IFN-γ。
Skarsvik等人(10)公开了如何用热灭活的柯萨奇(Coxsackie)病毒刺激PBMC，其随后用若干标记物通过流式细胞测定检测T细胞活化。
Betts等人(11)公开了用代表HIV-1的抗原部分的混合肽刺激PBMC，其随后用若干标记物通过流式细胞分析检测T细胞活化。然而，对确定针对整个活病毒的完整的生理学相关CD8 T细胞应答来说，使用重叠肽不是有效的选择。产生覆盖完整病毒蛋白组的重叠肽库并同时拥有足够的待用这些库刺激的PBMC实际上是不可能的。另外，外源添加的肽缺少了在MHC分子呈递前对肽的胞内处理，从而可能错过依赖于胞内翻译后修饰的应答。此外，天然处理允许在天然水平将肽呈递，其导致生理学相关的体外免疫应答，而外源添加的肽可能导致刺激生理学无关的T细胞应答。
然而，现有技术没有公开使用灭活病毒检测针对病毒的T细胞应答的方法，其中T细胞应答可靠地反映足够强度的由活病毒获得的应答。现有技术尤其没有公开这样的用于检测针对流感病毒的T细胞应答的方法。
因此，本领域仍存在着对提供用于可靠地并同时灵敏地检测多种标记物并用于确定针对病毒特别是流感病毒的T细胞应答的表型(phenotyping)(在效应子功能的数量和类型以及不同标记物的表达方面)的手段和方法的需要。本发明的目的是提供这样的手段和方法。
发明概述
检测针对病毒的免疫应答中的一个复杂因素是活病毒的使用通常被视为对确定CD8+T细胞应答是绝对必须的，因为只有活病毒感染的T细胞允许在I型MHC分子上通过直接呈递途径表达病毒表位(K.L.Rock，TheJournal of Immunology，2010，184，9-15)。然而，因为活病毒感染需要用于高致病性病毒的BSL-3条件，我们已经开发了允许检测用灭活病毒刺激后的CD8 T细胞应答的方法。本技术利用了替代的呈递路线，其为树突状细胞和巨噬细胞独有的，通过称作交叉呈递的过程将其外部环境中的抗原呈递在I型MHC肽上(K.L.Rock，The Journal of Immunology，2010，184，9-15)。
在第一方面，本发明涉及用于检测对象中针对病毒的免疫应答存在的方法。所述方法优选为用于检测针对病毒的细胞免疫应答的方法。更具体地，该方法检测针对病毒的T细胞应答。用于检测对象中针对病毒的免疫应答的方法优选包括步骤：a)将来自所述对象的PBMC与灭活的病毒孵育；和，b)通过流式细胞术检测所述PBMC中至少一种T细胞活性标记物的表达。
在所述方法中有利的是，使用灭活病毒与来自对象的PBMC孵育，以使得在不具有BSL-3分级的实验室中实施该方法是可行的。用于灭活病毒的不同手段是本领域已知的。例如用于灭活病毒的化学手段包括用有效剂量的一或多种下述试剂处理：去污剂(如Triton X-100)、甲醛、福尔马林、β-丙内酯或硫柳汞。用于灭活的另外的化学手段可包括用亚甲基蓝、补骨脂素、羧酸富勒烯(C60)或其任何组合处理。灭活病毒的其它方法为本领域已知的，例如，如二元乙胺、乙酰乙烯亚胺和物理手段如加热、紫外线或γ射线。对于本发明的方法所用的灭活病毒的制备，可应用任何这些手段或其组合。
本文中灭活病毒可理解为优选指不具有可检测的感染性的病毒制备物。本发明所用的灭活病毒制备物的感染性可用本领域公知的方法确定(见例如Goldstein和Tauraso，1970，supra)。一般地，灭活制备物的感染性相比于对应的非处理和/或空白处理(mock-treated)的病毒制备物的感染性，其中灭活病毒制备物的滴度比非处理和/或空白处理的病毒制备物的滴度低至少6、7、8、9或10个数量级。优选地，在灭活制备物中检测不到病毒感染性。
在用于制备本发明所用的灭活病毒的优选的方法中，通过用至少约0.02% v/v的福尔马林处理病毒至少18小时来获得灭活病毒。优选地，在37℃处理病毒。技术人员将会理解，最小灭活时间和福尔马林浓度可以不同，例如当使用较低福尔马林浓度时将需要较长的灭活时间，而对较高福尔马林浓度而言可需要较短时间。因此，在用于制备本发明所用的灭活病毒的优选的方法中，通过用福尔马林在这样的条件下(即持续一段时间，在一定浓度的福尔马林中和一定的温度下)处理病毒来获得灭活病毒，所述条件产生与用至少约0.02% v/v的福尔马林在37℃处理病毒至少18小时所获得的相同的灭活程度(即灭活病毒制备物的滴度为相同数量级，其低于未经处理和/或空白处理的相同病毒制备物的滴度)。
在另外的用于制备本发明所用的灭活病毒的优选的方法中，通过如透析、渗滤或色谱(如尺寸排阻或亲和色谱)处理从灭活病毒制备物中去除灭活剂(如甲醛)。用于这样的处理的手段和方法是本领域公知的。毫无疑问，病毒制备物的灭活将在具有所需的BSL分级的实验室中进行。然而，在灭活并去除灭活剂后，灭活病毒制备物可以根据本发明转移至并储存于和/或使用于不具有BSL-3分级的实验室中。
在本发明的方法中将灭活病毒与PBMC孵育。PBMC(外周血单核细胞)可用多种本领域公知的方法从人或其它哺乳动物血中获得(见例如Coligan等人，1994，In：Coico R，ed.Current protocols in immunology.Vol.2：JohnWiley和Sons，Inc.，1994：711-2)。例如，包含PBMC的组合物例如可由通过来自哺乳动物或人血的成分单采(aphaeresis)、Ficoll密度梯度离心和/或血红细胞裂解可获得的PBMC组成。
在本发明的方法中，PBMC和灭活病毒在培养基中并在如本领域公知的适合于T细胞维持、增殖和/或刺激的条件下孵育(见例如Current protocolsin immunology，Coico R，ed，John Wiley和Sons，Inc.，1994)。在本发明的方法中，在用流式细胞术检测细胞因子表达之前，PBMC和灭活病毒优选孵育约24-96小时。因此，在本发明的方法中，优选在PBMC与病毒孵育约24-96小时后检测细胞因子表达，即在“感染”后或更确切是刺激后约24-96小时。更优选地，在PBMC与病毒孵育至少36、48、60、66、68或70小时后，并优选PBMC与病毒孵育不超过96、90、84、78或74小时后检测细胞因子表达。更优选地，在PBMC与病毒孵育后72小时左右检测细胞因子表达。
在本发明的方法的一个实施方案中，检测至少2种不同的T细胞活性标记物的表达。优选地，在所述方法中同时检测至少2种不同的T细胞活性标记物的表达，例如通过使用至少2种不同的荧光标记(同时)检测每种T细胞活性标记物。
一般地，在本发明的方法中，可通过使用待检测的标记物或抗原特异性的(单克隆)抗体在流式细胞仪中合适地检测T细胞活性和/或分化抗原的标记物(如CD4和CD8)，所述抗体通过与荧光标记(即荧光团)缀合而标记。对技术人员，可获得种类繁多的用于与针对待检测的细胞因子或分化抗原的抗体相缀合的荧光标记。可与一抗相缀合的合适的荧光团包括但不限于，荧光素、罗丹明、德克萨斯红、VECTOR红、ELF(酶标荧光)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy7、Fluor X、钙黄绿素、钙黄绿素-AM、CRYPTOFLUOR、Orange(42kDa)、Tangerine(35kDa)、Gold(31kDa)、Red(42kDa)、Crimson(40kDa)、BHMP、BHDMAP、Br-Oregon、Lucifer黄、Alexa染料系列、N-[6-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-重氮-4-基)氨基]乙酰](NBD)、BODIPY、氟硼二吡咯亚甲基、Oregon绿、MITOTRACKER红、藻红蛋白、藻胆蛋白BPE(240kDa)、RPE(240kDa)CPC(264kDa)、APC(异藻蓝蛋白，104kDa)、光谱蓝、光谱浅蓝绿、光谱绿、光谱金、光谱橙、光谱红、红外线(IR)染料、环化GDP-核糖(cGDPR)、Calcofluor白、丽丝胺、伞形花内酯、酪氨酸或色氨酸。
在本发明的方法中，用流式细胞术检测PBMC中至少一种T细胞活性标记物的表达。所述标记物优选为细胞毒T细胞活性标记物。另外的T细胞活性标记物可为细胞因子。如本文所用，术语“细胞因子(cytokine)”或“细胞因子(cytokines)”是指作用/影响免疫系统细胞的常见类型的生物学分子。所述定义指，包括但不限于，那些局部起作用或可在血液中循环的生物学分子。示例性的细胞因子包括但不限于，干扰素、白介素、肿瘤坏死因子和多种集落刺激因子。本文中，T细胞特异性细胞因子理解为在T细胞如CD4+T细胞和CD8+T细胞中表达的细胞因子。或者，检测表达的所述T细胞活性标记物不是细胞因子而是另外表明T细胞活性的标记物，例如细胞毒性T细胞活性的标记物，如抗原刺激后T细胞脱颗粒的标记物。
在本发明的方法的另一个实施方案中，检测表达T细胞活性标记物的T细胞的类型。优选地，本发明的方法检测给定的T细胞活性标记物是否在至少为CD4+和CD8+细胞中的一种的T细胞类型中表达。更优选地，本发明的方法(同时)检测给定的T细胞活性标记物是否在CD4+T细胞中表达以及该标记物是否在CD8+T细胞中表达。
在本发明方法的一个实施方案中，T细胞活性标记物(其表达在所述方法中检测)选自CD107a、CD107b、IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α。
由CD107a和CD107b(LAMP-1/LAMP-2)组成的CD107分子在抗原刺激后的T细胞脱颗粒过程中瞬时表达于T细胞表面(Betts等人，2004，Meth.Cell Biol.，75：497-512)。CD107的表达直接涉及细胞毒性化合物的排出(extrusion)，其是T细胞细胞毒性应答的一部分。CD107分子存在于细胞中的细胞毒性颗粒膜中。在排出的时候，CD107分子暴露于细胞外侧。通过向细胞培养物中加入标记的抗体，CD107分子将被标记并通过流式细胞术可视化。因此，CD107的表达是CD107产生和此分子必然在细胞膜上表达的结果。在本发明的方法中，可通过检测CD107a和CD107b中的至少一种来检测作为T细胞活性标记物的CD107的表达。
CD107a(分化簇107a)和CD107b(分化簇107b)也分别称为溶酶体相关膜蛋白质1和2(LAMP1和LAMP2)(Chang等人，2003，J.Biol.Regul.Homeost.Agents 16(2)：147-151)。本文中人CD107a理解为具有NCBI编号NP_005552(第3版，2009年9月)的氨基酸序列的糖蛋白或其等位变体。本文中人CD107b理解为具有NCBI编号NP_002285(第5版，2009年10月)的氨基酸序列的糖蛋白或其等位变体。CD107a和b涉及将碳水化合物配体呈递给选择素(selectin)和在溶酶体、核内体和质膜之间穿梭的蛋白质。
IFN-γ或干扰素-γ(IFN-γ)是二聚化的可溶性细胞因子，其为II型干扰素唯一的成员(Gray等人，1982，Nature 298(5877)：859-863)。IFN-γ为细胞因子，其对针对病毒和胞内细菌感染的固有免疫和适应性免疫是关键的，并且对肿瘤控制也是关键的。作为固有免疫应答的一部分，IFN-γ主要由天然杀伤(NK)细胞和天然杀伤T(NKT)细胞产生，以及一旦抗原特异性免疫发生，其由CD4+和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应性T细胞产生。本文中人IFN-γ理解为具有NCBI编号NP_000610(第28版，2009年9月)的氨基酸序列的蛋白质或其等位变体。
IL-2，白介素-2，是白细胞介素，其为人体对微生物感染的天然应答的工具。结合于T细胞受体(TCR)的抗原刺激IL-2的分泌(Stern和Smith，1986，Science 233：203-206)。本文中人IL-2理解为具有NCBI编号NP_000577(第28版，2009年9月)的氨基酸序列的蛋白质或其等位变体。
IL-10，白介素-10，通过抑制促炎细胞因子的产生而在抑制免疫应答和炎症反应中起主要作用。据报告，在急性病毒感染过程中由感染外围的抗病毒CD8+和CD4+效应性T细胞产生的IL-10调节了在急性流感病毒感染过程中的炎症反应(Sun，2009，Nature Medicine，15(3)：277-84)。本文中人IL-10理解为具有NCBI编号CAG46825(第16版，2008年10月)的氨基酸序列的蛋白质或其等位变体。
TNF-α，肿瘤坏死因子α(cachexin或cachectin)，是参与全身性炎症的细胞因子，并且是刺激急性期反应的细胞因子组的成员。本文中人TNF-α理解为具有NCBI编号NP_000585(版本28，2009年9月)的氨基酸序列的蛋白质或其等位变体。
本发明的方法所用的针对标记物、细胞因子和分化抗原的荧光标记抗体可商购获得。其实例，在例如本文的实施例中表明。
本发明的方法可用于检测对象中针对任何病毒的免疫应答的存在，所述病毒包括例如正粘病毒科如流感病毒；逆转录病毒科如人免疫缺陷病毒(HIV)；风疹病毒；副粘病毒科如副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒；黄病毒科如黄热病病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、日本脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒或西尼罗河病毒；疱疹病毒科如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒；布尼亚病毒科；沙粒病毒科；汉坦病毒科如汉坦病毒；冠状病毒科；乳多空病毒科如人乳头瘤病毒；弹状病毒科如狂犬病毒；冠状病毒科如人冠状病毒；披膜病毒科；动脉炎病毒科；丝状病毒科如埃博拉病毒；沙粒病毒科；痘病毒科如天花病毒和非洲猪瘟病毒。
在优选的实施方案中，本发明的方法用于检测对象中针对流感病毒的免疫应答的存在。因此，在根据本发明优选的方法中，灭活病毒为灭活的流感病毒。流感病毒可为流感病毒属A、B或C的流感病毒，其中最优选A。本发明的方法优选检测的免疫应答所针对的流感病毒A的亚型包括H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3和H10N7，其包括2009年的流行性猪源A型(H1N1)流感病毒(SOIV或H1N1v)。
本发明的方法可有利地用于针对病毒的免疫应答的表型分类(phenotyping)。具体地，可在类型的数目和每细胞的效应子功能强度以及不同标记物(由细胞)的表达方面进行T细胞应答的表型分类。
本发明的方法中，PBMC来自哺乳动物对象。获得PBMC的对象可为非人的测试动物，如例如小鼠、大鼠、棉鼠兔(Sigmodon sp.)、非人灵长类或雪貂(如地中海雪貂(Mustela putorius furo))。另外，在本发明的方法的一个实施方案中，获得PBMC的对象可为人，所述PBMC来自人对象而灭活病毒为能够感染人和/或疑似感染人的病毒的灭活形式。
在本发明的方法中，向PBMC添加的灭活病毒的量至少为足够诱导(细胞)免疫应答的，所述免疫应答可通过如本文描述的标记物的表达而确定。最方便地，待向PBMC添加的灭活病毒的量涉及其活化前的病毒量。因此，向PBMC添加的灭活病毒的量为对应于(等于)能够产生如下M.O.I.的活化前的病毒的量，所述M.O.I.为至少约0.1、0.2、0.5、1或2，优选不高于10或5，更优选为大约1-3，最优选为大约2。
在本发明的方法的另外的实施方案中，可通过使用莫能霉素(如Golgi-stop，BD Biosciences)，一种在内质网中引起蛋白质积累的蛋白质胞内运输抑制剂，改善对胞内标记物表达的检测。优选在检测前的最后几小时，例如在培养最后的20、16、12或8小时期间向培养的PBMC中添加莫能霉素。为了检测胞内标记物的表达，通常通过本领域本身已知的方法进一步固定并可渗透化处理PBMC。
第二方面，本发明涉及用于检测对象中针对病毒的T细胞应答的方法，其中所述方法包括步骤：a)将来自所述对象的PBMC与灭活的病毒孵育；和，b)检测PBMC中CD107的表达。所述方法大体如上文所描述地进行，除了本发明这方面至少确定PBMC中CD107的表达，而CD107的表达不必要通过流式细胞术确定。因此，在本发明的第二方面，可用技术人员已知的多种方法确定用灭活病毒刺激的PBMC中的CD107的表达。如上文表明，可通过检测CD107a和CD107b中至少一种的表达而检测CD107的表达。另外应理解，在本发明的不同方面，可在细胞中和细胞上(表面)检测CD107的表达。
如本文所用，当与检测基因的表达有关时，使用术语“表达”(例如CD107或另一个标记物的表达)可指检测基因的转录(即，检测mRNA水平)和/或检测基因的翻译(检测产生的蛋白质)。检测基因的表达是指主动确定基因是否表达的行为。这可包括确定与对照相比基因表达是否上调，与对照相比是否下调或与对照相比是否不变。因此，检测表达的步骤不要求基因表达实际上上调或下调，但相反，还可包括检测基因表达没有变化(即，检出基因不表达或基因表达无变化)。通过任何本领域已知的多种方法测量转录物和/或蛋白质的表达。对RNA表达，方法包括但不限于：提取细胞mRNA并使用可与编码全长或部分基因的转录物杂交的标记的探针进行Northern印迹；使用基因特异性引物、聚合酶链式反应(PCR)和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增mRNA，随后通过任何不同的手段定量检测产物；从细胞提取总RNA，然后将其标记并用于探测在任何不同表面上的编码所述基因的cDNA或寡核苷酸；原位杂交；和检测报告基因。测量蛋白质表达水平的方法一般包括但不限于：蛋白质印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫吸附斑点法(ELISPOT)或荧光斑点测定、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、表面等离子体共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组化分析、基质辅助激光解析/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、微细胞计数、微阵列、显微技术、荧光激活细胞分选(FACS)和流式细胞术。
在本发明的方法的一个实施方案中，除了检测CD107表达，任选地可检测另外的标记物的表达，例如IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α中的一或多种。
本发明另一方面涉及“试剂盒”，其包含本发明的方法中使用的元件。这样的试剂盒可以包含载体，其中容纳一或多个如管或小瓶的容器。试剂盒可包含如上述定义的灭活病毒，用于检测标记物、细胞因子和/或分化抗原的未标记或已标记的抗体，和其它本文提及的试剂，如培养基、莫能霉素、用于固定和可渗透化处理细胞的试剂和流式细胞术试剂。在优选的实施方案中，试剂盒至少包含灭活病毒制备物和用于检测标记物、细胞因子和/或分化抗原的抗体。试剂可以冻干的形式存在，或在适当的缓冲液中。试剂盒还可包含实施本发明所必须的任何其它组件，如从对象获得PBMC的装置、缓冲液、移液器，微孔板和书面说明。本发明的试剂盒的这样的其它组件本身是已知的。
在本文档和其权利要求中，动词“包含”和以其非限制性含义使用的其词形变化意指包括了跟随在该词后的项，但并不排除未具体提及的项。另外，用不定冠词“a”或“an”指代的元素并不排除存在多于一个元素的可能，除非上下文明确地要求存在一个并只存在一个所述元素。因此不定冠词“a”或“an”通常意指“至少一个”。
所有在本说明书中引用的专利和参考文献以其整体通过引用并入本文。
提供下述实施例仅用于说明的目的，而不是为了以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1.人PBMC流式细胞术分析，其用空白培养物上清液刺激作为阴性对照，或用葡萄球菌(Staphylococcus)肠毒素B(SEB)刺激作为阳性对照，用活A/H3N2病毒(A/Wisconsin/67/2005；活flu)刺激，或用灭活的A/H3N2病毒(A/Wisconsin/67/2005)刺激，其用热处理(H.I.flu)、福尔马林处理(F.I.flu)或BPL处理(BPL.I.flu)灭活。如所标明，在感染/刺激后24小时、72小时和16天测量CD8+ T细胞中的IFN-γ(a)、TNF-α(b)、CD40L(c)和CD107(d)表达。通过在MDCK细胞上连续3个10天培养灭活制备物，在细胞中没有发生任何细胞病理效应来验证病毒灭活。
图2.人PBMC的流式细胞术分析，其用活的或福尔马林灭活的(FI)A/H3N2病毒(A/Wisconsin/67/2005)刺激或用福尔马林处理的空白培养物上清液作为阴性对照进行刺激。如所标明，在感染后24、48、72和168小时测量CD4+(a、c、e和g)和CD8+(b、d、f和h)T细胞中的IFN-γ(a和b)、TNF-α(c和d)、CD107a(e和f)和IL-2(g和h)表达。■空白；病毒；病毒。
图3.人PBMC的流式细胞术分析，其用活的或FI-A/H3N2病毒，用福尔马林处理的空白培养物上清液作为阴性对照或用葡萄球菌肠毒素B(SEB)作为阳性对照进行刺激。如所标明，在感染后72小时测量CD4+和CD8+T细胞中的IFN-γ(a)、TNF-α(b)、CD40L(c)和IL-2(d)表达。
图4.来自2个最近感染了SOIV A/H1N1的个体(供体A和B)的人PBMC的流式细胞术分析，其用福尔马林灭活的流行性SOIVA/H1N1(A/Paris/2590/2009)病毒(FI SOIV H1N1)，季节性活的或FI-A/H1N1(A/New Caledonia/20/99)病毒，活的或FI-A/H3N2病毒，福尔马林处理的空白培养物上清作为阴性对照或用葡萄球菌肠毒素B(SEB)作为阳性对照刺激。如所标明，在感染后72小时测量CD4+(a和c)和CD8+(b和d)T细胞中的CD107a(a和b)和IL-2(c和d)表达。
图5.来自供体MB-126的人PBMC的流式细胞术分析，其用福尔马林灭活的(FI)-A/H1N1病毒(A/New Caledonia//20/99)刺激，并用IL-10特异性抗体染色或用同种型匹配抗体作为阴性对照。如所标明，在刺激后18、36、54和72小时测量CD4+(A)和CD8+(B)T细胞中的表达。
实施例
1.实施例1
1.1.材料和方法
1.1.1供体的纳入和PBMC的分离
根据人类实验准则(项目编号S03.0015-X)从Sanquin Blood Bank NorthWest Region获取健康个体的血棕黄层。另外，从2个之前健康的具有实验室确认的A型流感(H1N1)v感染的个体(51岁的女性，55岁的男性)，分别在症状开始的13天和19天后获得外周血单核细胞(PBMC)。在研究开始前所有参加者提供了书面的知情同意书。本研究已获乌特勒支大学医学中心的医学伦理委员会批准。通过密度离心分离人PBMC并在90%的FCS(Hyclone，Logan，Utah)/10%的DMSO(Sigma-Aldrich St.Louis，USA)中于-130℃低温保藏直至分析。
1.1.2流感病毒
S.van der Werf博士(Institute Pasteur，Paris，France)慷慨地提供了季节性流感病毒株H3N2 A/Wisconsin/67/2005和H1N1 A/New Caledonia/20/99以及SOIV H1N1 A/Paris/2590/2009株。通过感染MDCK细胞生产所有的病毒株。未感染的MDCK细胞培养基(空白)用作阴性对照。
1.1.3病毒灭活
1.1.3.1福尔马林灭活
将流感病毒培养物上清液与PBS中0.02% v/v的福尔马林(37%福尔马林，Merck)于37℃孵育18小时。灭活后，立即使用DispoDialyzers MWCO10kDa(Spectrum Laboratory Inc，Rancho Dominguez，USA)透析清除福尔马林，以防止影响病毒学和免疫测定。样品储存于-80℃直至使用。
1.1.3.2β-丙内酯(BPL)灭活
将流感病毒培养物上清液与1:1060稀释于pH7.3的0.1M磷酸缓冲液中的BPL(BPL，5ml烧瓶中的98%溶液，Acros，www.acros.com)于4℃孵育18小时。接下来通过37℃孵育2小时水解BPL。样品储存于-80℃直至使用。
1.1.3.2热灭活
将流感病毒培养物上清于65℃孵育30小时。样品储存于-80℃直至使用。
1.1.4刺激PBMC和流式细胞术分析
用活病毒以感染复数(MOI)2感染PBMC，或用等量的灭活病毒刺激PBMC，并在含10% FCS、P/S的RPMI培养基中以48孔板(Greiner Bio-one)中每孔1×106细胞培养。用福尔马林灭活空白感染的细胞培养物上清液并用作阴性对照(空白)。葡萄球菌肠毒素B(SEB)用作阳性对照。在5%的CO2中将细胞37℃孵育不同时间。在培养结束前16小时加入CD107a特异的抗体PE(BD Biosciences，San Jose，USA)。为了检测胞内细胞因子的产生，在培养的最后16小时期间加入莫能霉素(Golgi-stop，BD Biosciences)。孵育后，收获PBMC，转移入V底平板(Greiner BioOne)并用FACS缓冲液(PBS，0.5% BSA，5mM EDTA)洗涤。黑暗中用CD4太平洋蓝(Biolegend，SanDiego，USA)、CD8 PerCP Cy5.5(BD Biosciences)和活/死可修复的死细胞染剂(Invitrogen，Paisley，UK)4℃染色30分钟。用100μl的FACS缓冲液洗涤PBMC一次。随后，在CytoFix/CytoPerm溶液(BD Biosiences)中于4℃黑暗中将PBMC固定并可渗透化处理20分钟。用100μl Perm/Wash缓冲液(BDBioscience)洗涤PBMC三次并在黑暗中用IFN-γ APC(BD Bioscience)、IL-2FITC(eBioscience，San Diego，USA)、CD40L APC Alexa Fluor750(eBioscience)和TNF-α PeCy7(BD Bioscience)4℃染色30分钟。染色后，用100μlPerm/Wash缓冲液洗涤PBMC两次并用100μl FACS缓冲液洗涤1次。在150μl的FACS缓冲液中重悬PBMC并且直接使用FACS Canto II(BDBioscience)获取PBMC。根据前方-侧向散射特性和活-死染色分析，获取至少100,000存活的淋巴细胞。使用FACSDiva软件(BD Bioscience)分析结果。
1.1.5灭活病毒的验证
1.1.5.1通过在MDCK细胞上培养来验证灭活
将对照和处理的流感病毒培养物上清液置于MDCK细胞上盲传最多3代。因此，将汇合的MDCK细胞与50μl培养物上清液和5ml感染培养基于37℃在T25 cm2-烧瓶中孵育60分钟。一小时后用磷酸缓冲盐水(PBS)漂洗单分子层，用感染培养基(2.5μg/ml胰蛋白酶)覆盖并在37℃孵育10天。10天的孵育期后，烧瓶接受一次冻融循环。在不存在cpe情况下，收获的培养物材料用作在MDCK细胞上随后的传代的接种物(50μl)。所有收获的培养物上清液储存于-80℃。
1.1.5.2通过血细胞凝集测定验证灭活
在PBS中制备2倍系列稀释的活的和灭活的流感病毒培养物上清液，并与PBS中0.25%的火鸡红细胞4℃孵育。60分钟后，读取血细胞凝集滴度，其表示为产生完全血细胞凝集的最高稀释度的倒数。
1.1.5.3通过基质PCR验证灭活
用MagNA Pure LC总核酸分离试剂盒，在MagNA Pure LC(v3.0)提取机械手(Roche，Mannheim，Germany)上从200μl流感病毒培养物上清液中提取总核酸(50μl)。为了定性分析培养料中流感病毒负链基因组RNA，使用鸟类成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)(Promega，WI，USA)和正链基质基因引物5′AAG ACC AAT CCT GTC ACC TCT GA 3′(M-Fw)进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以产生副本DNA(cDNA)。为了在培养材料中检测病毒正链RNA转录物，使用rTth DNA聚合酶(Applied Biosystems，CA，USA)和基质基因反义引物5′CAA AGC GTC TAC GCT GCA GTC C 3′(M-Rv)将总RNA转录为cDNA，随后用RNAse H(Roche)和RNase A(Sigma-Aldrich)处理以去除所有的RNA。随后，使用480实时PCR系统(Roche)、TaqMan Master(Roche)、引物对M-Fw和M-Rv、并用标记的扩增子特异的探针5′TTT GTG TTC ACG CTC ACCGTG CC 3′扩增104碱基对的基质基因片段。
1.2结果
1.2.1三种不同的灭活流感病毒的方法比较及其对T细胞应答的影响
我们首先利用不同的技术灭活流感病毒。然后将用不同技术灭活的病毒用于刺激PBMC并且接下来评估CD8+T细胞应答。用于灭活病毒的方法包括：热灭活、福尔马林灭活和β丙内酯(BPL)灭活(见上文1.1.3)。将用灭活病毒刺激后获得的CD8+T细胞应答与用活病毒刺激获得的应答相比较。将葡萄球菌外毒素B(SEB)刺激用作阳性对照。确定CD4+和CD8+T细胞中IFN-γ、TNF-α、CD40L、CD107a和IL-2应答。图1显示了BPL灭活的病毒在CD8+T细胞中给出非常不一致的应答，热灭活的病毒给出很少或无应答，但福尔马林灭活的病毒产生了一致的CD8+T细胞应答，其为用活病毒感染获得的强度的约75%。对CD4+T细胞，获得了相似的结果(结果未显示)。
1.2.2对福尔马林灭活的季节性流感病毒的T细胞应答
用福尔马林处理流感病毒仅轻微地降低血细胞凝集和神经氨酸酶活性并显示了最高保留程度的HA和NA活性。因此，将福尔马林灭活(FI)的流感病毒用于确定福尔马林处理后T细胞表位抗原性是否保留。首先，将PBMC与活的或FI-A/H3N2病毒(A/Wisconsin/67/2005)孵育，之后在感染后(p.i.)的24、48、72和168小时测量IFN-γ、TNF-α、CD107a和IL-2的表达以确定检测T细胞应答的最优时间点。福尔马林处理的空白刺激的PBMC用于确定所有标记物的背景表达。用活的A/H3N2病毒刺激PBMC导致在CD4+和CD8+T细胞中CD107a和IL-2的表达显著提高，并且在p.i.48小时-96小时之间最高(图2)。在用FI-A/H3N2病毒刺激的PBMC中观察到相似的表达模式。然而，与活的A/H3N2刺激相比，用FI-A/H3N2刺激后CD107a+和IL-2+细胞要晚大约24小时达到最高百分比。另外，与活的H3N2病毒诱导的百分比相比，由FI-A/H3N2诱导的CD107a+和IL-2+T细胞百分比较低，但是仍显著地高于由空白刺激诱导的百分比。与CD107a+和IL-2+T细胞的诱导相似，用活的和FI-A/H3N2刺激PBMC诱导不显著的IFN-γ+和TNF-α+T细胞增加趋势。一般来说，在p.i.72小时检测活的和FI-A/H3N2刺激的T细胞应答是最优的并进一步用于检验其它流感病毒亚型。此时间点另外用于检验对活的和FI-A/H1N1流感病毒亚型(A/New Caledonia/20/99)的T细胞应答(图3)。在活的和FI-A/H1N1刺激后，A/H1N1病毒还诱导显著数目的CD107a+和IL-2+T细胞。此外，由FI-A/H1N1诱导的CD107a+和IL-2+T细胞的百分比显著地高于由空白感染诱导的百分比。与A/H3N2病毒相比，由FI-A/H1N1刺激所诱导的IFN-γ+和TNF-α+T细胞并不显著。
一并地，这些数据证实，除了HA和NA活性，季节性流感病毒的T细胞表位抗原性也在福尔马林处理后高度地保留。
2.1.3对福尔马林灭活的流行性SOIV A/H1N1的T细胞应答
由于福尔马林处理有效地灭活了季节性流感病毒但保留了T细胞表位抗原性，我们希望确定在用福尔马林灭活后，流行性SOIV A/H1N1病毒的T细胞表位抗原性是否也保留。为了确定对FI-SOIV A/H1N1(A/Paris/2590/2009)的T细胞应答，我们使用了从两个近期感染SOIVA/H1N1的个体分离的PBMC以确保存在显著数量的SOIV A/H1N1特异性T细胞并确定所诱导的CD107a+和IL-2+T细胞。用FI-空白、季节性活的或FI-A/H1N1(A/New Caledonia/20/99)病毒处理的PBMC作为对照。用FI-SOIVA/H1N1体外刺激来自近期感染SOIV A/H1N1的个体的PBMC，证实了两个供体中CD4+和CD8+T细胞亚组中CD107a+T细胞百分比都有显著地提高。季节性活的和FI-A/H1N1病毒诱导了相似的CD107a+细胞提高。另外，活的A/H1N1、FI-A/H1N1和FI-SOIV A/H1N1刺激在来自供体A的PBMC中诱导了IL-2+T细胞并且在CD8+T细胞亚组中最明显。然而，用活的A/H1N1、FI-A/H1N1或FI-SOIV A/H1N1刺激来自供体B的PBMC，在CD4+和CD8+T细胞亚组中不诱导IL2+T细胞，表明了在T细胞应答中一定的供体变异。
一并地，这些数据证实，在福尔马林处理后流行性SOIV A/H1N1病毒保留了刺激T细胞的能力，表明对此流行性流感病毒也保留了T细胞表位抗原性。
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Claims (16)

1.用于检测对象中针对流感病毒的T细胞应答的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)将来自所述对象的PBMC与福尔马林灭活的流感病毒孵育；
b)检测至少一种T细胞活性标记物的表达。
2.权利要求1的方法，其中检测至少2种不同标记物的表达。
3.权利要求1或2的方法，其中用流式细胞术检测至少一种T细胞活性标记物的表达。
4.权利要求1或2的方法，其中检测表达所述标记物的T细胞的类型。
5.权利要求4的方法，其中所述T细胞的类型为CD4+细胞和CD8+细胞中的至少一种。
6.权利要求1或2的方法，其中所述标记物是细胞因子。
7.权利要求1或2的方法，其中所述标记物选自CD107a、CD107b、IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α。
8.权利要求1或2的方法，其中通过处理病毒获得所述灭活流感病毒，所述处理与用至少0.02％v/v的福尔马林于37℃处理至少18小时产生相同程度的灭活病毒。
9.权利要求1或2的方法，其中在所述PBMC与所述病毒孵育24-96小时后检测所述标记物的表达。
10.权利要求9的方法，其中在所述PBMC与所述病毒孵育60-84小时后检测所述标记物的表达。
11.权利要求1或2的方法，其中所述灭活病毒的量对应于活化前的病毒产生1-3的M.O.I.。
12.权利要求11的方法，其中所述M.O.I.是2。
13.权利要求1或2的方法，其中所述PBMC来自人对象，并且其中所述灭活病毒为能够感染人或疑似感染人的病毒的灭活形式。
14.用于检测对象中针对病毒的T细胞应答的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)将来自所述对象的PBMC与福尔马林灭活的流感病毒孵育；和
b)检测PBMC中CD107a和CD107b中至少一种的表达。
15.权利要求14的方法，还包括检测一或多种其它T细胞特异性细胞因子的表达的步骤。
16.权利要求14或15的方法，其中所述灭活病毒为灭活流感病毒。
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