KR20120115441A - 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자 및 그 제조방법 - Google Patents

파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자에 관한 것으로서, 상기 나노입자는 파크리탁셀 및 상기 파크리탁셀 표면을 둘러싸면서 코팅되어 있는 수용성 고분자를 포함하고, 상기 고분자는 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] (poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate-co-methacrylic acid], PDM)인 것을 특징으로 하며, 본 발명에 따른 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자는 친수성의 구분자로 파크리탁셀을 둘러싼 나노입자로서, 수용성이며 생체적합성을 가질 뿐만 아니라, 다중약물내성(muliti-drug resistance, MDR)을 가지는 암 세포에 대해서 파크리탁셀 약물을 효과적으로 방출, 전달하여 기존의 자연 그대로의 파크리탁셀보다 수천 배 이상의 증가된 항암효과를 가진다.

Description

파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자 및 그 제조방법 {Paclitaxel- loaded polymeric nanoparticle and preparation thereof}
본 발명은 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생체적합성, 수용성 성질을 가지고 다중약물내성을 갖는 암 세포에 파크리탁셀을 효과적으로 전달, 방출할 수 있는 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
암은 질병 증상이 복잡하고, 전 세계적으로 천만 건 이상의 다양한 케이스로 진단되고 있어 주요한 글로벌 질환 중의 하나이고, 암의 치료를 위한 항암제가 현재 사용되고 있으나, 항암제는 치료효과에도 불구하고, 그에 따른 부작용에 의해서 항상 많은 문제점을 야기하고 있다.
특히, 다중약물내성(multi-drug resistance, MDR)의 발생은 항암제에 의한 암치료에 있어서 큰 장애가 되고 있다. MDR과 연관되어 있는 가장 보편적인 메커니즘은 ATP 결합-ABC 수송 단백질에 의해서 암세포에 약물이 결합하지 못하고, 유출되는 것이다. ABC 수송 단백질의 하나인, P-글리코프로틴(P-glycoprotein, MDR-1에 의해서 코딩된 P-글리코프로틴)은 다중약물내성(MDR)을 일으키는 원인으로 보고되어 있다. P-글리코프로틴은 구조적, 기능적으로 다양하게 암세포에 특이적으로 작용하는 물질을 수송하는 역할을 하는 단백질의 하나이고, 종양세포에 대한 P-글리코프로틴의 과다발현은 세포내에 약물축적을 감소시키고 이에 따라 항암제의 치료효과를 감소시키고 있다.
따라서, P-글리코프로틴 저해제에 의한 약물내성을 극복하기 위하여 항암제와 P-글리코프로틴과 상호 작용할 수 있는 고분자 나노입자로 캡슐화된 항암제 등이 보고되고 있다.
최근에는 암치료에 있어서 나노입자에 대한 관심이 증대되고 있다. 나노입자는 특정 생물학적 장벽을 통과하는 성질, 세포독성 효과를 일으키는 면역학적 또는 비특이적 상호작용, 폴리에틸렌글리콜과 같은 특정 고분자와 기능적으로 결합하여 혈장 단백질과의 상호작용을 예방하는 성질로 인하여 더욱 관심이 증대대고 있다.
특히, 나노입자는 항암제의 세포내 축적, 그리고 세포내로 약물의 전달을 향상시켜서 약물내성을 쉽게 극복할 수 있게 한다. 예를 들면, 항종양성 항생물질인 독소루비신(doxorubicin)이나 파크리탁셀(paclitaxel)은 인체내에서 과다발현된 P-글리코프로틴의 영향으로 독소루비신이나 파크리탁셀 자체로의 세포활성 억제효과 보다 6배 내지 9배까지 낮은 IC50값을 나타낸다. 그리고 파크리탁셀이 선적된 폴리카폴로락탄 / 폴록사머 188 고분자 나노입자는 약물내성 세포에 대하여 주목나무에서 채취한 항암제 물질인 택솔(taxol)보다 10배까지 낮은 IC50값을 나타낸다.
주요 항암제의 하나인 파크리탁셀은 태평양 주목나무(Taxus brevifolia)로부터 추출되는 항종양제 신약의 선도 물질로서 주요 암인 난소암, 유방암 등에 효과적인 제제이고 암세포의 성장 및 분리를 억제하는 독특한 동작 메커니즘을 갖고 있다.
다만, 물에 대한 불용해성으로 크레모포어 이엘(Cremophor? EL, 폴리에톡시화 피마자 오일 유도체)과 같은 보조제를 제형에 첨가하여야 하는 문제와 화학요법적 치료에 있어서 에탄올의 독성으로 인하여 알레르기 과민증, 고지혈증, 비정상적 단백질 패턴의 합성 등의 부작용이 있다.
따라서, 파크리탁셀의 항암제 효과를 높이고 약물내성을 극복하기 위하여 수용성이고, 생체적합성을 갖는 파크리탁셀과 고분자 나노입자의 복합체에 대한 개발이 절실히 필요한 실정이다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 파크리탁셀과 상기 파크리탁셀을 산과 염기로 모두 활성을 갖는 양쪽성 고분자 전해질(polyampholyte)에 선적하여 다중약물내성을 갖는 암 세포에 파크리탁셀을 효과적으로 전달하여 증가된 항암효과를 가질 수 있는 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 파크리탁셀과 상기 고분자 물질에 의해서 상기 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 과제를 달성하기 위하여,
파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자로서, 상기 나노입자는 파크리탁셀 및 상기 파크리탁셀 표면을 둘러싸면서 코팅되어 있는 수용성 고분자를 포함하고, 상기 고분자는 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] (poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate-co-methacrylic acid], PDM)인 것을 특징으로 하는 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 제공한다.
또한, 상기 나노입자는 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] 공중합체와 상기 파크리탁셀을 혼합하고 밀링하여 복합체를 형성한 후, 상기 복합체를 물에 용해하고 원심분리하여 제조하는 것을 특징으로 하는 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] 공중합체는 메타크릴산(methacrylic acid, MAA) 모노머와 2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, DMAEMA) 모노머를 질소 분위기하에서 라디칼 중합 반응시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 양쪽성 고분자 전해질인 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] 내 MAA의 몰비율은 5-30%일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자의 크기는 120-600 ㎚일 수 있다.
본 발명은 상기의 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자는 친수성의 고분자로 파크리탁셀을 둘러싼 나노입자로서, 수용성이며 생체적합성을 가질 뿐만 아니라, 다중약물내성(multi-drug resistance, MDR)을 가지는 암 세포에 대해서 파크리탁셀 약물을 효과적으로 방출, 전달하여 기존의 자연 그대로의 파크리탁셀보다 수천 배 이상의 증가된 항암효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 제조하는 고체상 반응(Solid-state reaction)을 나타낸 개략도이다. A는 파크리탁셀의 구조식이고, B는 공중합체인 PDM의 구조식이다.
도 2a는 파크리탁셀을 나타내는 TEM 이미지이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 전처리하여 PDM에 선적되는 파크리탁셀의 형상을 나타내는 SEM 이미지이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 3은 (1) pH 5.2에서 (2) pH 7.4에서, 각각 다른 pH 환경에서 파크리탁셀이 선적된 나노입자에서 약물이 방출되는 정도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 PAX(파크리탁셀 용액), PP(파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자), PAX+ZQS(파크리탁셀과 조스퀴다르(zosquidar) 혼합 용액), PDM+PAX (파크리탁셀과 PDM 혼합 용액) 각각의 세포 활성효값 IC50을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 MCF7 세포에 대해서 본 발명에 따른 파크리탁셀이 선적된 나노입자가 컨쥬게이션된 FITC의 세포내 분포를 보여주는 형광 이미지이다.
도 5b는 MCF7 세포에 대해서 (1) 비표지 세포, (2) FITC-PP를 4 ℃이하의 조건에서, (3) FITC-PP를 37 ℃, 10%의 이산화탄소 조건, (4) FITC-PP를 ATP가 소모된 조건으로 전처리하고, 37 ℃, 10%의 이산화탄소 조건에서 각각 유세포 분석(flow cytometric analysis)한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5c는 MCF7/ADR 세포에 대해서 본 발명에 따른 파크리탁셀이 선적된 나노입자가 컨쥬게이션된 FITC의 세포내 분포를 보여주는 형광 이미지이다.
도 5d는 MCF7/ADR 세포에 대해서 (1) 비표지 세포, (2) FITC-PP를 4 ℃ 이하의 조건에서, (3) FITC-PP를 37 ℃, 10%의 이산화탄소 조건, (4) FITC-PP를 ATP가 소모된 조건으로 전처리하고, 37 ℃, 10%의 이산화탄소 조건에서 각각 유세포 분석(flow cytometric)한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자는 하기 [구조식 1]의 파크리탁셀 및 상기 파크리탁셀 표면을 둘러싸면서 코팅되어 있는 수용성 고분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
[구조식 1]
Figure pat00001
상기 고분자는 양이온과 음이온 모두 전리할 수 있고, 산 또는 염기로 모두 활성을 갖는 양쪽성 고분자 물질(polyampholyte)로서, 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] (PDM)인 것을 특징으로 한다.
상기 PDM은 하기 [구조식 2]과 같으며, 반복적 구조체로서 약염기((2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, D)부분과 약산 부분(methacrylic acid, M)을 포함하고 있는 것을 특징으로 한다.
[구조식 2]
Figure pat00002
상기 PDM은 산성에 불안정하고 분해될 수 있는 물질이어서, 체내 조직의 산성 pH에서 분해되어 파크리탁셀을 방출할 수 있는 것을 특징으로 하고, 즉, 종양의 경우 일반적으로 산성이서 효과적으로 파크리탁셀을 종양 조직에 방출, 전달할 수 있다.
또한, 상기 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] 공중합체는 메타크릴산(methacrylic acid, MAA) 모노머와 2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, DMAEMA) 모노머를 질소 분위기하에서 라디칼 중합 반응시켜서 제조하는 것을 특징으로 하고, 상기 양쪽성 고분자 전해질인 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] 내 상기 MAA의 몰비율은 5-30%일 수 있다.
본 발명은 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하고, 상기 암은 백혈병, 뇌종양, 신장암, 위암, 피부암, 방광암, 유방암, 자궁암, 폐암, 결장암, 전립선암, 난소암, 간암, 대장암, 복막암, 복막전이암 및 췌장암으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 '약제학적 조성물'은 본 발명의 나노입자 화합물과 함께 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 '담체(carrier)'라 함은 세포 또는 조직 내로 화합물의 부가를 용이하게 하는 물질을 의미하고, 상기 '희석제(diluent)'함은 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키는 물에서 희석되는 물질을 의미한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 약제학적 조성물은 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수망강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
기타 본 명세서에서 사용된 용어와 약어들은 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
<실시예>
제조예. 파크리탁셀을 선적한 고분자 나노입자의 제조
(1) 본 발명의 나노입자 제조에 따른 단량체(monomer)인 메타크릴산(methacrylic acid, MAA)은 Jassen사에서 구입하였으며, 2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, DMAEMA)는 알드리치사로부터 구입하여 제조에 사용하였다.
그리고, 항암제인 파크리탁셀은 Bolak (Lot No. 200805001, South Korea)에서 구입하였으며, 독소루비신 하이드로클로라이드(doxorubicin hydrochloride)는 AK Scientific, Inc.(USA)로부터 구입하여 사용하였다.
세포독성 조사를 위한 MTT assay에서 사용한 MTT 시약 (thiazoyl blue tetrazolium bromide, 97.5% TLC), Bisbenzimide H 33258, Fluorescein isothiocyanate (FITC), sodium azaid, rhodamine 123, 2-deoxy-D-glucose는 각각 시그마-알드리치사로부터 구입하여 사용하였으며, 아세토니트릴(HPLC Gradient grade)과 DMSO는 LAB-SCAN사와 Roth사에서, 세포 배양을 위한 DMEM(GlutaMAX)과 페니실린-스트렙토마이신은 Gibco사로부터 구입하여 사용하였고, fetal bovine serum (FBS)는 PAA Laboratories GmbH로부터 구입하여 사용하였다.
(2) 양쪽성 고분자 전해질(polyampholyte)의 합성
폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] 공중합체는 메타크릴산과 2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트을 질소 분위기하에서 라디칼 중합 반응시켜서 합성하였다.
PDM의 몰 분획은 원소분석기(elemental analysis, Thermo Quest Analyzer, EA-1110)로 분석하였으며, 광산란 장비(SLS, DLS-8000, Otsuka Electronics Co., Ltd., cylindrical optical cell (직경: 1.9 ㎝))를 사용하여 질량을 분석하였고, 공중합체의 특정 굴절율은 DRM-3000(Otsuka Electronics Co., Ltd.)으로 분석하였다. 그리고, pH값 측정은 pH 미터기(ThermoOrion, Model 550A)를 사용하였으며, 공중합체 PDM의 표면 전하는 ELS-Z (Otsuka Electronics Co., Ltd.)를 사용하여 측정하였다.
(3) 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자의 합성
파크리탁셀과 PDM을 믹싱 볼과 함께 스테인레스 캡슐에 넣고 상온에서 60 분간 20 Hz로 혼합한 후에 1 ㎎/㎖의 농도로 물에 용해시키고 10 분간 원심분리하여 비착화된 파크리탁셀을 제거하였다. 그리고, 물을 추가하여 추가적으로 계속 원심분리하여 상청액을 수집하여 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 수거하였다. 그 후, 상청액을 동결-건조하였다.
입자의 모양과 표면 전하 특성을 SEM과 ELS로 각각 측정하였다. 그리고, 입자의 크기를 확인하기 위하여 동결-건조된 파우더를 물에 용해시키고 1 분간 초음파 처리하였다. 입자의 크기는 광산란 장비(DLS)를 이용하여 확인하였으며, 파크리탁셀의 로딩 효율은 UV-Vis 스펙트로스코피로 관측하였다.
하기 도 2a의 스틱 형상인 파크리탁셀이 PDM과 고체상 반응을 한 후에는 하기 도 2b에 나타난 것과 같이 나노크기의 구형 형상으로 그 형태가 변형되었음을 확인할 수 있다. 파크리탁셀의 형상이 나노입자 크기의 구형 형태로 바뀜에 따라서, 약물 방출 및 약물의 분산 메카니즘에 영향을 미치게 된다. 특히, 250 ㎚보다 작은 나노입자의 경우 종양 세포에 효율적으로 축적되어 항암효과를 나타나게 된다.
본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자의 경우 크기는 다이나믹 광 스캐터링(DLS) 측정 결과 하기 도 2c에 나타난 바와 같이, 평균입자의 크기가 250 ㎚인 것을 확인하였다.
실험예
(1) 약물 방출 실험
10 ㎎의 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 투석주머니에 넣고, 약물 방출 실험을 위하여 2% fetal bovine serum과 0.02% 소듐 아자이드(sodium azide)가 포함된 아세테이트 용액(pH 5.2)과 인산 완충용액(pH 7.4)을 릴리징 미디어(releasing media)로 사용하였다.
투석 주머니에 포함된 나노입자를 상기 릴리징 미디어 20 ㎖에 넣고 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 파크리탁셀의 양은 고성능 액체크로마토그래피(Zorbax C18 column (5 ㎛, 4.5×250 ㎜), 물:아세토니트릴=45:55, UV 230 ㎚)로 분석하였다.
(2) 세포 배양
10% fetal bovine serum (FBS)와 1% 페니실린 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 10% 이산화탄소와 37 ℃의 조건에서 배양하였다. 독소루비신 내성 세포인 MCF7/ADR과 MT3/ADR은 0.1 ㎍/㎖ 독소루비신을 함유한 배지에서 배양하였다.
(3) 세포독성 평가
MCF7, MCF7/ADR, MT3, and MT3/ADR에 대한 항암 효과를 확인하기 위하여, 비색 분석법(MTT colorimetric assay)을 이용하였다. 96 웰에 MCF7과 MCF7/ADR을 1.5×104 세포/웰의 농도로 씨딩하고, MT3와 MT3/ADR을 1.5×104 세포/웰의 농도로 씨딩한 후에 10% 이산화탄소 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다.
(4) 세포 유입(Cellular uptake) 분석
세포 유입 분석을 위하여 FITC(fluorecein isothiocyanate)-파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 유세포 분석(FACS, flow cytometric analysis)으로 측정하였다.
FITC가 라벨링된 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자(FITC-PP)에서 FITC의 isothiocyanate기가 PDM의 아민기와 상호 반응한다. FITC-PP는 1 ㎎/㎖의 DMSO에 용해된 FITC 용액을 준비하였고, 10 ㎕의 FITC 용액을 10 ㎖의 나노입자 분산액에 첨가하여 2 시간 동안 인큐베이션하여 제조하였다. FITC-PP는 셀룰로오스 투석막에 의해서 빛이 없는 곳에서 2 일간 투석시키고 물은 12 시간마다 교체해주었다.
FACS 분석을 위하여 MCF7과 MCF7/ADR 세포를 37 ℃그리고 4 ℃에서 30분 동안 배양, 또는 10 mM NaN3와 50 mM 2-deoxy-D-glucose를 사용하여 30 분간 전처리하였다. 이후 0.1 μM FITC-PP를 각각의 전처리된 세포에 처리하였다.
(5) 파크리탁셀의 로딩 효율
자외 및 가시건 분광분석법(UV-Vis 스펙트로스코피)으로서 효율을 측정하였으며, 파크리탁셀의 로딩 효율은 파크리탁셀과 PDM의 흡광계수의 상관관계에 의해서 측정할 수 있다. 파크리탁셀과 PDM은 각각 280 ㎚, 230 ㎚에서 측정되었다. 280 ㎚와 230 ㎚에서 측정하였으며, ePAX ,280=1225 L/mol·㎝, ePAX ,230=28316 L/mol·㎝, ePDM,280=58529 L/mol·㎝, ePDM ,230=649850 L/mol·㎝이었다. 이에 의해서 본 발명에 따른 파크리탁셀의 로딩 효율은 57.62%이었다.
(6) 파크리탁셀의 방출
파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자는 수용성 물질인 PDM에 의해서 파크리탁셀이 둘러싸여 있는 것을 특징으로 하여 수용성을 갖는다. 따라서, 상기 나노입자로부터 파크리탁셀의 방출의 조절은 PDM이 의존하는 pH에 따라서 결정되어진다.
상기 PDM은 백본 또는 가지에 산성에 불안정하며 화학적으로 분해되는 작용기를 가져서 결국, 파크리탁셀을 선적한 나노입자의 표면이 분해되어서 pH에 반응하여 파크리탁셀 약물을 방출할 수 있는 것을 특징으로 한다. 이처럼 pH에 반응하여 세포 내에 약물을 전달할 수 있는 시스템에 의해서 효과적으로 약물을 방출하여 특정의 조직에 약물을 전달할 수 있다.
일반적인 조직 및 혈액의 pH는 7.4이다. 하지만, 대부분의 종양 조직은 pH가 5.7-7.8에 해당한다. 따라서, 본 발명에 따른 파크리탁셀 약물을 선적한 나노입자는 pH에 반응하여 암세포에 직접적으로 약물을 방출, 전달할 수 있어서 항암효과가 우수하다.
하기 도 3에는 (1) pH 5.2에서 (2) pH 7.4에서 각각 다른 pH 환경에서 파크리탁셀이 선적된 나노입자에서 약물이 방출되는 정도를 나타내는 것으로서, pH 5.2에서 파크리탁셀이 방출되는 속도가 pH 7.4보다 빠른 것을 확인할 수 있으며, 24 시간 인큐베이션 후에는 pH 7.4보다 산성 환경에서 30% 증가된 즉, 약 60%가 방출된 것을 확인할 수 있다.
(7) 파크리탁셀이 선적된 나노입자의 암세포 저해 효과
MCF7, MCF7/ADR, MT3 및 MT3/ADR에 대한 P-글리코프로틴(P-glycoprotein, P-gp)의 과다발현으로 인한 내성기능을 확인하기 위하여 Western blot과 rhodamine 123 assay를 이용하였다.
하기 도 4와 [표 1]에 본 발명에 따른 나노입자에 대한 세포활성효 IC50 값을 비교하여 나타내었다.
Cell Line IC50(nM)
PAX PP PAX+ZQS PDM+PAX
MCF7 0.93±0.12 0.001 < 0.35±0.01 10.43±1.80
MCF7/ADR > 20000 4.75±0.54 26.94±2.63 13650±2570
MT3 5.28±0.54 0.59±0.15 0.27±0.02 0.65±0.49
MT3/ADR 300.77±31.05 2.92±0.09 6.38±0.48 > 20000
PAX : 파크리탁셀 용액
PP : 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자
PAX+ZQS : 파크리탁셀과 조스퀴다르(zosquidar) 혼합 용액
PDM+PAX : 파크리탁셀과 PDM 혼합 용액
상기 [표 1]을 참조하면, 본 발명에 따른 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자(PP)는 자연 그대로의 파크리탁셀(PAX)에 비하여 수십배 내지 수천배의 암세포 저해 효과가 있음을 알 수 있으며, P-gp의 저해제로 알려진 조스퀴다르(zosquidar)를 추가로 첨가한 파크리탁셀과 조스퀴다르(zosquidar) 혼합 용액과 비교하여도 MT3에 대해서는 유사하나 효과를 보이고, MCF7/ADR에 대해서는 6-8 배 더 나은 효과를 보임을 알 수 있다
(8) 나노입자의 세포내 축적 및 세포내 내재화 평가
파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자의 세포내 축적과 세포내 내재화를 확인하기 위하여 유세포 분석(FACS, flow cytometric analysis)과 공초점-현미경을 이용하여 FTIC(fluorecein isothiocyanate)-PP(파크리탁셀이 선적된 나노입자)의 세포내 분포를 확인하였다. 핵은 비스벤지미드(bisbenzimide)로 표지하였다.
약물이 선적된 나노입자는 내포작용 (endocytosis)에 의해서 세포막에 의해 함입되고 세포내에 축적을 증가시켜 치료효과가 증가된다. 특히, 다중약물내성을 갖는 암세포에 대해서는 고분자에 나노입자에 선적된 약물이 P-gp에 의해 세포밖으로 운반되는 것이 아니라 세포내에 축적됨에 따라 치료효과를 증폭시키게 된다.
엔도시토시스는 낮은 온도(4 ℃) 또는 ATP가 감소된 환경에서 저해된다. 이를 확인하기 위하여 4 ℃, 37 ℃의 ATP가 감소된 환경(NaN3와2-deoxy-D-glucose로 전처리한 경우), 37 ℃의 일반적인 환경에서 각각 실험하였고 그 결과를 하기 도 5a 내지 도 5d에 나타내었다.
하기 도 5a 내지 도 5d에서 보는 바와 같이, MCF7, MCF7/ADR에 대해서 파크리탁셀이 선적된 나노입자의 세포내 유입을 확인할 수 있다. 결국, FITC-PP가 엔도시토시스에 의해서 세포에 축적되고 세포내에 내재화된 것을 형광 이미지로 알 수 있고, 이로 인하여 암세포에 유효하게 파크리탁셀이 전달되어 세포내에서 농도가 증가한 것을 확인할 수 있으며 이는 본 발명에 따른 파크리탁셀이 선적된 나노입자에 의한 치료효과를 확인할 수 있는 것이다.
이와 같이 다중약물내성 유전자에 의해서 코딩된 P-gp의 과다발현은 암에 대한 다양한 화학적 치료에 있어서 약물내성을 가져와 암세포 치료에 있어서 주요한 장해 요인이 되고 있다.
본 발명에 따른 제조한 프크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자는 친수성 표면을 가지는 고분자에 의해서 파크리탁셀을 둘러싸고 있으며, 그 크기가 나노크기인 것을 특징으로 하여 특정의 암세포에 대해서 파크리탁셀을 유효하게 전달, 방출할 수 있어 약물내성을 가지는 세포에 대해서 우수한 항암효과를 가져오게 된다. 특히, 자연 그대로의 파크리탁셀보다 100-4000 배 뛰어난 효과를 가진다.
이상으로, 본 발명의 특정한 부분과 그 특징, 효과를 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 의해서 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의해서 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자로서,
    상기 나노입자는 파크리탁셀; 및 상기 파크리탁셀 표면을 둘러싸면서 코팅되어 있는 수용성 고분자;를 포함하고,
    상기 고분자는 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] (poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate-co-methacrylic acid], PDM)인 것을 특징으로 하는 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (ⅰ) 상기 나노입자는 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] 공중합체와 상기 파크리탁셀을 혼합하고 밀링하여 복합체를 형성한 후,
    (ⅱ) 상기 복합체를 물에 용해하고 원심분리하여 제조하는 것을 특징으로 하는 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] 공중합체는 메타크릴산(methacrylic acid, MAA) 모노머와 2-다이메틸아미노에틸메타크릴레이트(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, DMAEMA) 모노머를 질소 분위기하에서 라디칼 중합 반응시켜서 제조하는 것을 특징으로 하는 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸메타크릴레이트-co-메타크릴산] 내 MAA의 몰비율은 5-30%인 것을 특징으로 하는 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자의 크기가 120-600 ㎚인 것을 특징으로 하는 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 파크리탁셀이 선적된 고분자 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
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