KR20120111788A - Method for diagnosing inflammatory diseases through analysis of protein or gene of extracellular vesicle in a body fluid - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 체액 내 세포밖 소포체의 단백질 또는 유전자 분석을 통하여 염증성 질환을 진단하는 방법 등에 관한 것이다.The present invention relates to a method for diagnosing an inflammatory disease through protein or gene analysis of extracellular vesicles in body fluids.
염증성 질환을 진단하는 비침투적 방법으로 환자의 체액에서 염증성 질환 특이적인 사이토카인/케모카인 양을 측정하는 것이 대표적이다. 현재 체액 내 C-반응성 단백시험(CRP)으로는 수용성 단백질의 정량적 측정 등이 사용되고 있다. 더불어, 염증 상황의 내피세포에서 발현이 증가하는 세포부착 단백질(cell adhesion molecule)인 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1), E-selectin이 암환자 및 관상동맥질환, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환의 체액 내에서 높은 양이 존재함이 알려지면서 진단마커로써의 가능성이 제시되어 왔으나 체액 내 세포부착 단백질의 양이 질환 외의 환자 상태(예컨대, 감기와 같은 가벼운 염증상태)에 따라 변동되는 등 환자의 질환 상태를 온전히 대변하지 못하는 문제점이 있다.A noninvasive method of diagnosing inflammatory disease is typically the measurement of inflammatory disease specific cytokine / chemokine levels in the body fluids of the patient. At present, the C-reactive protein test (CRP) in body fluids is used for quantitative measurement of water soluble proteins. In addition, intercellular adhesion molecule-1 (IMC-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), and E-selectin, which are cell adhesion molecules that increase expression in endothelial cells in inflammatory conditions, are cancer patients And the presence of high amounts in bodily fluids of inflammatory diseases, such as coronary artery disease and rheumatoid arthritis, has been suggested as a diagnostic marker. There is a problem that does not fully represent the disease state of the patient, such as fluctuating according to a mild inflammatory state).
최근 수용성 단백질 외에 세포밖 소포체라는 새로운 형태의 정보교환체가 거의 모든 종류의 세포에서 분비됨이 보고되었다. 세포밖 소포체는 이중 지질막으로 이루어진 수십 nm에서 수백 nm 크기를 가진 나노 소포체로 단백질, 지질, 및 유전자 등 생물학적 활성을 가진 물질들로 구성되어 있다. 세포밖 소포체를 통해서 세포에 발현된 막단백질이 그것의 고유한 형태로 세포밖으로 분비 가능함이 알려졌는데, 그 일례로 세포부착 단백질이 있다. 세포밖 소포체의 존재가 알려지기 전까지는 세포막에 발현되어 있던 세포부착 단백질의 세포 바깥부분 도메인(extracellular domain)이 제한효소에 의해 잘려짐으로써 세포밖으로 분비되어 수용성 단백질 형태로만 존재한다고 생각되어 왔다. 그러나, 세포 부착 단백질이 세포밖 소포체에 포함되어 막단백질 형태로도 세포밖으로 분비될 수 있음이 알려졌다. 즉, 세포밖에 존재하는 세포 부착 단백질은 수용성 단백질 형태뿐만 아니라 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태로도 존재가능하다. 이러한 사실에도 불구하고, 현재까지 체액 내 세포부착 단백질의 정량은 이러한 형태적 구분없이 이루어져 왔다.Recently, in addition to water-soluble proteins, a new type of information exchanger called extracellular vesicles has been reported to be secreted by almost all kinds of cells. Extracellular vesicles are nano-vesicles with a size of several tens of nm to hundreds of nm consisting of double lipid membranes and are composed of substances with biological activities such as proteins, lipids, and genes. It is known that membrane proteins expressed in cells through extracellular vesicles can be secreted out of the cell in their native form, such as cell adhesion proteins. Until the presence of extracellular vesicles was known, the extracellular domain of the cell adhesion protein expressed on the cell membrane was cut out by restriction enzymes and secreted out of the cell to exist only in soluble protein form. However, it has been known that cell adhesion proteins can be included in extracellular vesicles and secreted out of the cell even in the form of membrane proteins. That is, the cell adhesion protein present outside the cell may be present in the form of a membrane protein contained in the extracellular vesicles as well as the water-soluble protein form. In spite of this fact, the quantification of cell adhesion proteins in body fluids has been accomplished without this morphological distinction.
또한, 유전자와 같이 세포 밖에서 불안정할 수 있는 물질들도 세포밖 소포체를 통해 세포밖 소포체 내부에 싸여져서 분비됨으로써 세포밖에서도 안정적으로 존재할 수 있다. 이를 바탕으로, 세포밖 소포체 내 유전자 분석을 통한 진단에 대한 연구가 진행되고 있다. 그 외 교아세포종(glioblastoma) 환자의 혈액 내 존재하는 세포밖 소포체에서 변형된 형태의 EGFRⅧ의 유전자 탐지 여부를 기반으로 진단 가능성을 제시한 연구 결과가 있고, 전립선암 환자의 소변 내 세포밖 소포체에서 암세포 유래 세포밖 소포체의 유전체 분석을 통해 알아낸 전립선암 생체 마커인 PCA-3, TMPRSS2:ERG의 존재를 확인한 연구 결과가 있다. In addition, substances that may be unstable extracellularly, such as genes, may be stably present outside the cell by being secreted by being wrapped inside the extracellular vesicles through the extracellular vesicles. Based on this, studies on diagnosis through gene analysis in extracellular vesicles are underway. Other studies have suggested the possibility of diagnosis based on the detection of a modified EGFREG gene in the extracellular vesicles present in the blood of glioblastoma patients, and the cancer cells in the extracellular vesicles in the urine of patients with prostate cancer. There is a study confirming the presence of prostate cancer biomarkers, PCA-3 and TMPRSS2: ERG, identified through genomic analysis of derived extracellular vesicles.
상기한 바와 같이, 세포밖 소포체는 혈액, 복수, 모유, 활액 및 소변 등에 존재할 뿐만 아니라, 구성 성분과 양적 변화가 질환의 진행 정도를 대변할 것으로 판단되어 염증성 질환을 포함한 다양한 질환의 진단에서의 유용성이 기대되고 있다. As described above, the extracellular vesicles are present in blood, ascites, breast milk, synovial fluid and urine, as well as constituents and quantitative changes are believed to represent the progression of the disease, which is useful in the diagnosis of various diseases including inflammatory diseases. This is expected.
그러나, 아직까지 정상 상태 및 염증성 질환 상황에서 세포밖 소포체의 단백질과 유전자를 종합적으로 분석하고 진단에 활용하는 연구나 세포밖 소포체에 존재하는 염증성 질환 관련 단백질 및 유전자를 이용한 진단 방법에 대해 보고된 바 없다.However, there have been reports of studies on the comprehensive analysis and use of extracellular vesicle proteins and genes in normal and inflammatory diseases, and methods of diagnosis using inflammatory diseases related proteins and genes present in extracellular vesicles. none.
따라서, 상기와 같은 문제점들을 극복할 수 있는 염증성 질환 진단 방법에 대한 연구의 필요성이 요구되고 있다.Therefore, there is a need for a study on an inflammatory disease diagnosis method that can overcome the above problems.
본 발명자들은 종래의 세포부착 단백질의 정량시 그것의 존재 형태(수용성 단백질 형태 또는 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태)를 구분하지 아니하고 정량했던 부분을 개선하여, 체액 내 세포부착 단백질 정량을 이용한 진단에 새로운 분석인자(parameter)를 추가한 보다 정확한 질환 진단방법을 제공하고자 한다. 구체적으로 본 발명은 세포부착 단백질을 수용성 단백질 형태와 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태로 분리한 후 각 형태의 세포부착 단백질을 정량 및/또는 형태별 존재량 비율 분석을 수행함으로써 염증질환을 진단하는 방법을 제공하고자 한다.The present inventors have improved the quantified part of the existing cell adhesion protein without discriminating its presence form (a soluble protein form or a membrane protein form contained in extracellular vesicles), and the diagnosis using quantification of cell adhesion protein in body fluids. The aim is to provide a more accurate diagnosis of disease by adding new parameters to the system. Specifically, the present invention provides a method for diagnosing inflammatory diseases by separating cell-adhered proteins into water-soluble protein forms and membrane proteins contained in extracellular vesicles, and then performing quantitative and / or abundance ratio analysis of each type of cell-adhered proteins. To provide a method.
또한, 본 발명은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 비교 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 방법을 제공하고자 한다.In addition, the present invention is to provide a method for diagnosing inflammatory disease, characterized in that the comparative expression of the amount of gene expression present in the extracellular vesicles in body fluids.
이에 더하여, 본 발명은 체액 내 세포부착 단백질의 형태별 존재량 및/또는 존재비율을 측정하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 진단 키트 등을 제공하고자 한다.In addition, the present invention is to provide a kit for diagnosing an inflammatory disease, etc., characterized by measuring the abundance and / or the abundance ratio of the cell adhesion proteins in body fluids.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명은 체액 내 세포부착 단백질을 수용성 단백질 분획 및 세포밖 소포체 분획으로 분리하는 단계; 및 상기 수용성 단백질 분획 및 세포밖 소포체 분획에 존재하는 단백질을 정량하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 진단방법을 제공한다. 상기 방법은 수용성 단백질 및 세포밖 소포체에 존재하는 단백질 존재량의 비율을 비교하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.The present invention comprises the steps of separating the cell adhesion protein in body fluid into a soluble protein fraction and extracellular vesicle fraction; And it provides a method for diagnosing inflammatory disease, comprising quantifying the protein present in the water-soluble protein fraction and extracellular vesicle fraction. The method may further comprise comparing the proportion of protein present in the water soluble protein and extracellular vesicles.
본 발명의 일 실시예로, 상기 정량하는 단백질은 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), E-selectin, 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)을 포함한다.In one embodiment of the invention, the protein to be quantified includes ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), E-selectin, and VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1).
본 발명의 다른 실시예로, 상기 염증성 질환은 암, 패혈증, 동맥경화증, 및 류마티스 관절염을 포함한다.In another embodiment of the present invention, the inflammatory disease includes cancer, sepsis, arteriosclerosis, and rheumatoid arthritis.
본 발명의 또 다른 실시예로, 상기 체액은 혈액, 혈청, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 및 콧물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the body fluid is characterized in that it is selected from the group consisting of blood, serum, urine, ascites, synovial fluid, breast milk, sputum, saliva, sweat, tears, and runny nose.
또한, 본 발명은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 염증성 질환 진단 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for diagnosing inflammatory disease comprising measuring the amount of gene expression present in extracellular vesicles in body fluids.
상기 유전자는 EDN1(Endothelin 1), VCAM1(Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1), SELE(Selectin E), NOS3(Nitric oxide synthase 3), BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VWF(Von Willebrand factor), MPZ(Myelin protein zero), IRF1(Interferon regulatory factor 1), TNF(Tumor necrosis factor), IL32(Interleukin 32), CFLAR(CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10(Chemokine(C-X-X motif) ligand 10), IL6(Interleukin 6), ICK(Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8(Rho GTPase activating protein 8), 및 F3(Coagulation factor Ⅲ) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.The genes include Endothelin 1 (EDN1), Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM1), Intercellular adhesion molecule 1 (IMAM1), Selectin E (SELE), Nitric oxide synthase 3 (NOS3), Bone morphogenetic protein 4 (BMP4), and VWF (VWF) Von Willebrand factor (MPZ), Myelin protein zero (MPZ), Interferon regulatory factor 1 (IRF1), Tumor necrosis factor (TNF), Interleukin 32 (IL32), CASP8 and FADD-like apotosis regulator (CFLAR), Chemokine (CXX motif (CXX motif) ) ligands 10), IL6 (Interleukin 6), ICK (Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2 (Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8 (Rho GTPase activating protein 8), and F3 (Coagulation factor) III) one or more selected from the group consisting of.
또한, 본 발명은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 단백질 및 유전자 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 염증성 질환 진단 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for diagnosing inflammatory disease, comprising measuring the amount of protein and gene expression present in extracellular vesicles in body fluids.
또한, 본 발명은 체액 내 세포부착 단백질의 형태별 존재량 및/또는 존재비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing inflammatory diseases, which measures the amount and / or abundance of the cell adhesion proteins in body fluids.
상기 세포부착 단백질은 수용성 단백질 형태 또는 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태로 존재하는 것을 특징으로 한다.The cell adhesion protein is characterized in that it is present in the form of a water-soluble protein or a membrane protein contained in extracellular vesicles.
상기 본 발명의 체액 및 염증성 질환은 전술한 바와 같다.The fluid and inflammatory diseases of the present invention are as described above.
또한, 본 발명은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing inflammatory diseases, which measures the amount of gene expression present in extracellular vesicles in body fluids.
상기 본 발명의 유전자는 전술한 바와 같다. The gene of the present invention is as described above.
또한, 본 발명은 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 단백질 및 유전자 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 진단 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for inflammatory disease diagnosis, characterized in that the amount of protein and gene expression present in the extracellular vesicles in the body fluid is measured.
본 발명의 진단방법은 체액 내 세포부착 단백질의 정량에 '존재 형태' 라는 또 하나의 분석인자를 추가하여 세분화된 정량을 수행함으로써 염증성 질환의 진단 마커로써의 사용 가능성 및 진단의 정확성을 더욱 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.The diagnostic method of the present invention further improves the possibility of use as a diagnostic marker for inflammatory diseases and the accuracy of diagnosis by performing the granular quantification by adding another analyte called 'existing form' to the quantification of cell adhesion proteins in body fluids. It is expected to be able.
또한, 본 발명에서 발굴한 염증성 질환 상황에서 발현이 증가하는 유전자는 내피세포로부터 유래한 세포밖 소포체가 가지는 유전자로, 실제로 염증성 질환에서 혈관의 손상이 특이적임을 감안할 때 이들 유전자 분석은 향후 혈액을 통한 진단에 매우 유용할 것으로 여겨진다. In addition, the genes with increased expression in the inflammatory disease conditions discovered in the present invention are genes of extracellular vesicles derived from endothelial cells. It is thought to be very useful for diagnosis.
이에 더하여, 본 발명은 단백질 수준에서의 정량뿐만 아니라, 체액 내 세포밖 소포체 내에 존재하는 염증성 질환 관련 유전자 발현량을 분석하여 염증성 질환을 진단하는 방법을 제공함으로써, 궁극적으로 세포밖 소포체 단백질 및 유전자를 동시에 측정하는 멀티플렉스(multiplex) 진단 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for diagnosing inflammatory diseases by analyzing the amount of inflammatory disease related gene expression present in the extracellular vesicles in body fluid as well as quantitating at the protein level, thereby ultimately providing extracellular vesicle proteins and genes. Provided is a multiplex diagnostic method that measures simultaneously.
도 1은 염증 상황의 내피세포에서 유래한 세포밖 소포체를 투과전자현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 세포배양액에서 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체를 분리하는 과정을 나타낸 그림이며, 도 2b는 세포배양액 전체, 세포배양액 내 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체에 대해 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이고, 도 2c는 세포밖 소포체의 표면에 ICAM-1이 존재함을 면역학적 투과전자현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 암환자의 복수 및 혈액에서 유래한 세포밖 소포체의 형태를 투과전자현미경을 통해 분석한 결과이며, 도 3b는 정상인과 직장암 환자의 혈액에서 유래한 세포밖 소포체에 대하여 수크로즈의 밀도구배를 사용한 초고속원심분리 후에 ICAM-1 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 방법을 실시한 결과이고, 도 3c는 세포밖 소포체 표면의 ICAM-1을 면역투과전자현미경을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 정상과 동맥경화증 동물 모델의 혈액 내에 존재하는 수용성 단백질 형태 및 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태의 ICAM-1을 sandwich ELISA(R&D Systems)를 통해 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 내피세포 또는 내피세포 유래 세포밖 소포체에서 분석한 18종의 염증성 질환 관련 유전자 정보를 나타낸 것이다.
도 6은 내피세포 또는 내피세포 유래 세포밖 소포체에서 real time PCR을 통한 유전자 분석에 사용된 프라이머 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 7a는 정상 및 염증 상황에서 내피세포의 18종 염증성 질환 관련 18종 유전자 전체에 대한 유전자 발현량을 나타낸 real time PCR 결과이며, 도 7b는 유전자 발현양이 200 배 이하인 유전자에 대해서만 그 발현량을 나타낸 real time PCR 결과이다.
도 8은 정상 및 염증 상황에서 내피세포 유래 세포밖 소포체의 18종 염증성 질환 관련 유전자 발현 변화를 보여주는 real time PCR 결과이다.Figure 1 shows the results of confirming the extracellular vesicles derived from the endothelial cells of the inflammatory situation through a transmission electron microscope.
Figure 2a is a diagram showing the process of separating the water-soluble protein portion and extracellular vesicles in the cell culture medium, Figure 2b is the ICAM-1, VCAM-1, E for the whole cell culture medium, water-soluble protein portion and extracellular vesicles in cell culture medium Western blotting using the antibody of -selectin, and Figure 2c shows the result confirmed by the immunological transmission electron microscope that the presence of ICAM-1 on the surface of the extracellular vesicles.
Figure 3a is a result of analysis of the form of extracellular vesicles derived from ascites and blood of cancer patients by transmission electron microscopy, Figure 3b is the density gradient of sucrose with respect to the extracellular vesicles derived from blood of normal and rectal cancer patients After ultrafast centrifugation using Western blotting method using the ICAM-1 antibody, Figure 3c shows the results of ICAM-1 on the surface of the extracellular vesicles confirmed using an immuno-transmission electron microscope.
Figure 4 shows the results of quantification of ICAM-1 in soluble protein form and extracellular vesicles present in blood of normal and atherosclerosis animal model through sandwich ELISA (R & D Systems).
5 shows gene information related to 18 inflammatory diseases analyzed in endothelial cells or endothelial cell-derived extracellular vesicles.
Figure 6 shows the primer base sequence used for gene analysis through real time PCR in endothelial cells or endothelial cell-derived extracellular vesicles.
Figure 7a is a real time PCR results showing the gene expression for all 18 genes related to inflammatory diseases of endothelial cells in normal and inflammatory conditions, Figure 7b shows the expression only for genes whose expression is 200 times or less Real time PCR results shown.
FIG. 8 is a real time PCR result showing expression of 18 inflammatory disease related gene expression of endothelial cell-derived extracellular vesicles in normal and inflammatory conditions.
종래부터 체액 내 세포부착 단백질의 정량을 통한 진단 가능성은 제기되어 왔으나, 체액 내 세포부착 단백질의 양은 질환 외의 환자 상태에 따라 변동되는 등의 문제점이 있었다. 이에, 본 발명자들은 종래의 세포부착 단백질의 정량시 그것의 존재 형태 (수용성 단백질 형태 또는 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태) 를 구분하지 않고 정량했던 부분을 개선하여, 세포부착 단백질을 수용성 단백질 형태, 및 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태로 분리 후 각 형태의 세포부착 단백질을 정량하고 형태별 존재량 비율 분석을 수행함으로써 체액 내 세포부착 단백질 정량을 이용한 진단에 '존재 형태' 라는 새로운 분석인자(parameter)를 추가함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. Conventionally, the possibility of diagnosis through the quantification of cell adhesion proteins in body fluids has been raised, but the amount of cell adhesion proteins in body fluids has problems such as fluctuations depending on the patient's condition other than the disease. Accordingly, the present inventors have improved the portion of the conventional cell adhesion protein without quantifying its presence form (soluble protein form or membrane protein form contained in extracellular vesicles), thereby quantifying the cell adhesion protein in water-soluble protein form. A new analytical factor called 'presence form' for diagnosis using quantification of cell adhesion proteins in body fluids by quantifying cell adhesion proteins in each form and analyzing the abundance-specific abundance ratio after separation into membrane proteins contained in the endoplasmic reticulum and extracellular vesicles. The present invention has been completed by adding a parameter).
구체적으로, 본 발명은 체액 내 세포부착 단백질을 수용성 단백질 분획 및 세포밖 소포체 분획으로 분리하는 단계; 및 상기 수용성 단백질 분획 및 세포밖 소포체 분획에 존재하는 단백질을 정량하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 진단방법을 제공한다. Specifically, the present invention comprises the steps of separating the cell adhesion protein in body fluid into a water-soluble protein fraction and extracellular vesicle fraction; And it provides a method for diagnosing inflammatory disease, comprising quantifying the protein present in the water-soluble protein fraction and extracellular vesicle fraction.
또한, 본 발명은 단백질 수준에서의 정량뿐만 아니라, 체액 내 세포밖 소포체 내에 존재하는 염증성 질환 관련 유전자 분석 결과를 바탕으로 세포밖 소포체 단백질 및 유전자를 동시에 측정하는 멀티플렉스(multiplex) 진단 방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 염증성 질환 진단에 있어서 1) 체액 내 세포부착 단백질의 형태별 존재량 및 존재 비율 비교, 2) 체액 내 세포밖 소포체 내 염증성 유전자 양상 분석을 수행함으로써 보다 정확한 염증성 질환의 진단 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a multiplex diagnostic method that simultaneously measures extracellular vesicle proteins and genes based on inflammatory disease related gene analysis results present in extracellular vesicles in body fluids as well as quantification at the protein level. . That is, the present invention provides a more accurate method for diagnosing inflammatory diseases by performing 1) comparison of abundance and abundance ratio of cell-adhered proteins in body fluids, and 2) analysis of inflammatory gene patterns in extracellular vesicles in body fluids. do.
이에 더하여, 본 발명은 체액 내 세포부착 단백질의 형태별 존재량 및 존재비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 키트, 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 키트, 체액 내 세포밖 소포체에 존재하는 단백질 및 유전자 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 키트 등을 제공한다.In addition, the present invention is an inflammatory disease diagnostic kit, characterized in that the amount of abundance and abundance ratio of the cell adhesion protein in body fluids, inflammatory disease, characterized in that for measuring the gene expression in the extracellular vesicles in body fluids Diagnostic kits, kits for inflammatory disease, characterized in that the amount of protein and gene expression present in the extracellular vesicles in the body fluid is measured.
본 발명에서 "세포밖 소포체"란 세포에서 생성되어 세포밖으로 분비되는 소포체로써, 엑소좀(exosome), 마이크로베시클(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "extracellular vesicles" are vesicles produced in cells and secreted out of cells, and include, but are not limited to, exosomes, microvesicles, microparticles, and the like.
본 발명에서 "체액"은 혈액, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 콧물 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "body fluid" includes, but is not limited to, blood, urine, ascites, synovial fluid, breast milk, sputum, saliva, sweat, tears, runny nose, and the like.
본 발명의 일 구현예에서 환자의 혈액 및 복수에서 분리한 세포밖 소포체는 내피세포 외에도 다수의 세포로부터 유래한 세포밖 소포체를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the extracellular vesicles isolated from the blood and ascites of the patient may include extracellular vesicles derived from a plurality of cells in addition to endothelial cells.
본 발명에서 단백질 및 유전자 분석을 수행하는 세포밖 소포체는 내피세포로부터 유래하는 세포밖 소포체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the extracellular vesicles that perform protein and gene analysis may be, but are not limited to, extracellular vesicles derived from endothelial cells.
본 발명에서 사용된 내피세포는 인간에서 유래한 것을 포함한다. 본 발명에서 사용된 내피세포에서 염증 상황을 유도하는 물질은 대표적인 염증성 사이토카인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)이나, 이에 제한되는 것은 아니다.Endothelial cells used in the present invention include those derived from humans. Substances that induce an inflammatory situation in the endothelial cells used in the present invention are representative inflammatory cytokines TNF-α (tumor necrosis factor-α), but are not limited thereto.
본 발명의 세포밖 소포체는 이중 지질막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 유래한 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 유전자 및 대사물 등을 가지고 있다.The extracellular vesicles of the present invention are distinguished from the inside and the outside by a double lipid membrane, and have cell membrane lipids, cell membrane proteins, genes and metabolites of cells derived therefrom.
본 발명에서 염증성 질환 진단에 사용되는 세포밖 소포체는 체액의 연속적인 원심분리(centrifugation) 및 초고속원심분리(ultracentrifugation)를 통해 분리할 수 있으며, 기존에 각각의 체액에서 세포밖 소포체를 분리하는 방법에 따르나, 이에 제한되는 것은 아니다.The extracellular vesicles used for diagnosing an inflammatory disease in the present invention can be separated through continuous centrifugation and ultracentrifugation of body fluid, and in the conventional method for separating extracellular vesicles from each body fluid. However, it is not limited thereto.
상기 세포밖 소포체의 구성 성분 중에서 분석에 사용되는 단백질과 유전자 성분은 염증성 질환과 관련된 세포부착 단백질과 18종의 유전자이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 18종의 유전자는 EDN1(Endothelin 1), VCAM1(Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1), SELE(Selectin E), NOS3(Nitric oxide synthase 3), BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VWF(Von Willebrand factor), MPZ(Myelin protein zero), IRF1(Interferon regulatory factor 1), TNF(Tumor necrosis factor), IL32(Interleukin 32), CFLAR(CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10(Chemokine(C-X-X motif) ligand 10), IL6(Interleukin 6), ICK(Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8(Rho GTPase activating protein 8), 및 F3(Coagulation factor Ⅲ) 이다.Among the components of the extracellular vesicles, proteins and gene components used for analysis are cell adhesion proteins and 18 kinds of genes related to inflammatory diseases, but are not limited thereto. The 18 genes include Endothelin 1 (EDN1), Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM1), Intercellular Adhesion Molecule 1 (IMAM1), Selectin E (SELE), Nitric Oxide Synthase 3 (NOS3), and Bone Morphogenetic Protein 4 (BMP4). , VWF (Von Willebrand factor), MPZ (Myelin protein zero), IRF1 (Interferon regulatory factor 1), TNF (Tumor necrosis factor), IL32 (Interleukin 32), CFLAR (CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10 (Chemokine) (CXX motif) ligand 10), IL6 (Interleukin 6), ICK (Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2 (Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8 (Rho GTPase activating protein 8), and F3 (Coagulation factor III).
상기 세포밖 소포체의 구성 성분 중에서 분석에 사용되는 단백질은 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA, enzyme-linked immunoabsortion assay), 웨스턴 블랏팅 (Western Blotting) 등을 통해 확인될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The protein used for analysis among the components of the extracellular vesicles may be identified through enzyme-linked immunoabsortion assay (ELISA), Western blotting, and the like, but is not limited thereto.
본 발명에서 체액 내 존재하는 단백질의 형태는 수용성 단백질과 막단백질 형태로 나뉘는데, 체액 내 존재하는 막단백질 형태의 단백질을 가지는 것은 세포밖 소포체가 유일하다.In the present invention, the protein present in the body fluid is divided into a water-soluble protein and a membrane protein. However, the extracellular vesicles are the only ones having the protein in the body fluid.
본 발명에서 염증성 질환 진단에 사용되는 유전자는 세포밖 소포체 내에 존재하는 유전자로, 유전자 중에서도 자극에 대해 발현 차이를 보이는 mRNA에 대한 비교이다.In the present invention, a gene used for diagnosing an inflammatory disease is a gene existing in extracellular vesicles, and is a comparison with respect to mRNAs showing differences in expression among genes.
상기 유전자 발현의 차이를 유도하는 자극은 염증성 질환인 경우, 염증성 사이토카인/케모카인, 활성 산소종이 대표적이나 이에 제한되는 것은 아니다.Stimulation that induces the difference in gene expression is an inflammatory disease, inflammatory cytokines / chemokines, reactive oxygen species are typical, but not limited thereto.
상기 체액 내 세포밖 소포체 내에 존재하는 유전자를 분리하는 과정은 세포나 조직에서 유전자를 분리하는 기존의 방법 및 원리가 동일하며, 상기 발명에서는 RNeasy®Mini kit를 사용하였으나 유전자를 분리하는 방법이 이에 제한되는 것은 아니다.The process of separating genes present in the extracellular vesicles in the body fluid is the same as the existing method and principle of separating genes from cells or tissues. In the present invention, the method of separating genes using the RNeasy® Mini kit is limited thereto. It doesn't happen.
상기 분리한 세포밖 소포체 내에 존재하는 유전자는 oligo(dT)를 이용하여 cDNA로 합성된 뒤에 real time PCR을 수행하였으나, real time PCR을 수행하는데 사용되는 주형이 cDNA에 제한되는 것은 아니다.Genes present in the isolated extracellular vesicles were synthesized into cDNA using oligo (dT), followed by real time PCR, but the template used to perform real time PCR is not limited to cDNA.
본 발명의 염증 상황에서는 다수의 염증성 질환 관련 유전자의 발현이 증가하는데, 염증성 사이토카인인 TNF-α를 처리하였을 때 발현 증가를 보이는 모든 유전자가 변해야 하는 것은 아니다.In the inflammatory situation of the present invention, the expression of a number of inflammatory disease-related genes is increased, but not all genes showing increased expression when treated with the inflammatory cytokine TNF-α should be changed.
본 발명의 정상 및 염증 상황의 내피세포에서 발현 차이를 보이는 다수의 유전자가 내피세포 유래 세포밖 소포체에서도 발현 차이를 보이나, 정확하게 일치해야 하는 것은 아니다.Many genes showing differences in expression in endothelial cells in normal and inflammatory conditions of the present invention also show differences in expression in endothelial cell-derived extracellular vesicles, but do not have to be exactly the same.
본 발명에서 세포부착 단백질은 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), E-selectin, 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1) 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, cell adhesion proteins include, but are not limited to, intercellular adhesion molecule-1 (IMC-1), E-selectin, and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1).
본 발명에서 세포부착 단백질은 수용성 단백질 형태 또는 세포밖 소포체에 포함된 막 단백질의 형태로 구분하나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the cell adhesion protein is classified into a water-soluble protein form or a membrane protein included in extracellular vesicles, but is not limited thereto.
본 발명에서 염증성 질환은 암, 패혈증, 동맥경화증, 류마티스 관절염 등 다수의 급성 및 만성 염증성 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Inflammatory diseases in the present invention include, but are not limited to, a number of acute and chronic inflammatory diseases such as cancer, sepsis, arteriosclerosis, rheumatoid arthritis.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.
[실시예] EXAMPLE
실시예Example 1. 염증 상황의 내피세포에서 유래한 1. derived from endothelial cells in inflammatory conditions 세포밖Extracellular 소포체 확인 Vesicle Identification
인간내피세포(인간 제대 정맥 내피세포, HUVEC)에 염증성 싸이토카인인 TNF-α를 10 ng/ml 농도로 12시간 처리 후 세포배양액을 모았다. 이를 4℃, 500 x g에서 10분 동안 고속원심분리(high speed centrifugation)를 하고, 상층액을 수거하여 4℃, 3,000 x g에서 20분 동안 고속원심분리(high speed centrifugation)를 하였다. 상층액을 수거하여 4℃, 100,000 x g에서 2시간 동안 초고속원심분리(ultracetrifugation)를 한 후, 튜브 아래에 존재하는 침전물을 phosphatae-buffered saline(PBS)으로 녹여 세포밖 소포체를 추출하였다. Cell cultures were collected after 12 hours of inflammatory cytokine TNF-α at a concentration of 10 ng / ml in human endothelial cells (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC). This was subjected to high speed centrifugation at 4 ° C. and 500 × g for 10 minutes, and the supernatant was collected and subjected to high speed centrifugation at 4 ° C. and 3,000 × g for 20 minutes. The supernatant was collected and subjected to ultrafast centrifugation (ultracetrifugation) at 4 ° C., 100,000 × g for 2 hours, and the extracellular vesicles were extracted by dissolving the precipitates under the tube with phosphatae-buffered saline (PBS).
도 1은 상기 방법으로 추출한 세포밖 소포체를 투과전자현미경으로 분석한 결과이다. 세포밖 소포체는 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 약 100 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있다.
1 is a result of analyzing the extracellular vesicles extracted by the above method by transmission electron microscopy. The extracellular vesicles consist of a lipid bilayer, which is about 100 nm in size and are generally spherical.
실시예Example 2. 내피세포에서 분비된 세포부착 단백질의 수용성 단백질 형태 및 2. Soluble protein form of the cell adhesion protein secreted from endothelial cells and 세포밖Extracellular 소포체에 포함된 Contained in the endoplasmic reticulum 막단백질Membrane protein 형태별 분리 및 확인 Separation and Confirmation by Type
HUVEC에 TNF-α를 10 ng/ml 농도로 12시간 처리 후 세포배양액을 모으고 4℃, 500 x g에서 10분 동안 고속원심분리를 한 후, 상층액을 수거하여 4℃, 3,000 x g에서 20분 동안 고속원심분리를 하였다. 상층액을 수거하여 일부는 급속냉동 후 냉동고에 보관하고 나머지는 4℃, 100,000 x g에서 2시간 동안 초고속원심분리를 하였다. 상층액은 수거하여 급속냉동 후 보관하고 튜브 아래에 존재하는 침전물을 PBS로 녹여 세포밖 소포체를 추출하였다. After 12 hours of treatment with TNF-α at a concentration of 10 ng / ml in HUVEC, the cell cultures were collected and centrifuged at 500 ° C. for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected for 20 minutes at 4 ° C. and 3,000 × g. High speed centrifugation was performed. The supernatants were collected and some were stored in a freezer after rapid freezing and the others were ultrafast centrifuged for 2 hours at 4 ° C and 100,000 x g. The supernatant was collected and stored after rapid freezing, and the extracellular vesicles were extracted by dissolving the precipitate under the tube with PBS.
도 2a는 세포배양액에서 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체를 분리하는 과정을 나타낸 그림이다. 도 2a에 나타난 바와 같이, 초고속원심분리를 수행하기 전 상층액에는 세포배양액 내에 존재하는 모든 형태의 세포부착 단백질이, 초고속원심분리 후 얻은 상층액에는 수용성 단백질 형태의 세포부착 단백질이, 초고속원심분리 후의 침전물에는 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태의 세포부착 단백질이 존재한다. Figure 2a is a diagram showing the process of separating the water-soluble protein portion and extracellular vesicles in cell culture. As shown in Figure 2a, the supernatant before performing the ultra-centrifugation, all forms of cell adhesion protein present in the cell culture medium, the supernatant obtained after the ultra-centrifugation, the cell-adhesion protein in the form of water-soluble protein, ultra-centrifugation Later precipitates contain cell adhesion proteins in the form of membrane proteins contained in extracellular vesicles.
도 2b는 세포배양액 전체, 세포배양액 내 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체에 대해 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과이다. 도 2b에 나타난 바와 같이, ICAM-1과 E-selectin은 세포배양액 내 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체 부분에 모두 존재하는 반면, VCAM-1은 수용성 단백질 부분에만 존재함을 확인하였다. Figure 2b is the result of Western blotting using the antibody of ICAM-1, VCAM-1, E-selectin for the whole cell culture medium, the water-soluble protein portion in the cell culture medium and extracellular vesicles. As shown in FIG. 2B, ICAM-1 and E-selectin were present in both the water-soluble protein portion and the extracellular vesicle portion in the cell culture, while VCAM-1 was confirmed to be present only in the water-soluble protein portion.
도 2c는 세포밖 소포체의 표면에 ICAM-1이 존재함을 면역학적 투과전자현미경을 통해 확인한 결과이다. Figure 2c is a result confirming the presence of ICAM-1 on the surface of the extracellular vesicles by immunological transmission electron microscope.
상기 결과들은 세 가지 세포부착 단백질이 모두 세포밖으로 분비되나 그것의 분비 형태는 서로 다름을 의미한다.
The results indicate that all three cell adhesion proteins are secreted extracellularly but their secretion forms are different.
실시예Example 3. 정상인과 암환자 혈액 및 복수 내 3. Blood and ascites in normal and cancer patients 세포밖Extracellular 소포체 존재 확인 Confirm the presence of endoplasmic reticulum
정상인과 직장암 환자의 혈액 및 직장암 환자의 복수에서 실시예 1에서와 동일한 방법으로 세포밖 소포체를 분리하였다. Extracellular vesicles were isolated in the same manner as in Example 1 from blood of normal and rectal cancer patients and ascites of rectal cancer patients.
도 3a는 암환자의 복수 및 혈액에서 유래한 세포밖 소포체의 형태를 투과전자현미경을 통해 분석한 결과이며, 도 3b는 정상인과 직장암 환자의 혈액에서 유래한 세포밖 소포체가 전형적인 세포밖 소포체의 밀도를 가지며, ICAM-1이 세포밖 소포체에 존재함을 수크로즈의 밀도구배를 사용한 초고속원심분리 후에 ICAM-1 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 방법으로 확인한 결과이다. Figure 3a is a result of analysis of the form of extracellular vesicles derived from ascites and blood of cancer patients through transmission electron microscope, Figure 3b is the density of extracellular vesicles typical of extracellular vesicles derived from the blood of normal and rectal cancer patients It was confirmed that ICAM-1 is present in the extracellular vesicles by ultra-centrifugation using a density gradient of sucrose after Western blotting using ICAM-1 antibody.
보다 구체적으로, 초고속원심분리를 통해 분리한 세포밖 소포체를 1.5ml의 2.5 M 수크로즈 용액과 섞어 초고속원심분리 튜브에 넣고, 그 위에 2 ml의 1.6 M 수크로즈와 1.3 ml의 0.5 M 수크로즈를 쌓은 후 초고속원심분리를 수행하였다. 농도 구배에 따라 나누어진 분획을 튜브의 위쪽에서부터 각 0.5 ml씩 취하여 총 10개의 분획을 얻고 이에 대해 ICAM-1 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 그 결과, ICAM-1은 세포밖 소포체의 전형적인 밀도인 1.10~1.18 g/ml에서 확인되었다. More specifically, the extracellular vesicles separated through ultracentrifugation were mixed with 1.5 ml of 2.5 M sucrose solution and placed in the ultracentrifugation tube, and 2 ml of 1.6 M sucrose and 1.3 ml of 0.5 M sucrose were placed thereon. After stacking, ultrafast centrifugation was performed. Fractions divided according to the concentration gradient were taken from each of 0.5 ml from the top of the tube to obtain a total of 10 fractions, and Western blotting using ICAM-1 antibody was performed. As a result, ICAM-1 was identified at 1.10-1.18 g / ml, typical density of extracellular vesicles.
도 3c는 세포밖 소포체 표면의 ICAM-1을 면역투과전자현미경을 이용하여 확인한 결과이다.
Figure 3c is the result of confirming the ICAM-1 on the surface of the extracellular vesicles using an immunotransmission electron microscope.
실시예Example 4. 정상과 동맥경화증 동물 모델의 혈액 내 수용성 단백질 형태 및 세포밖 소포체에 포함된 4. Soluble protein forms in blood and extracellular vesicles in normal and atherosclerosis animal models 막단백질Membrane protein 형태의 Form ICAMICAM -1 정량 -1 quantification
5주령의 ApoE knockout 마우스(Jackson Lab)에 웨스턴 다이어트(20% lipid, 1.5% cholesterol)를 섭취시킴으로써 동맥경화증 동물 모델을 만들었다. 이때 대조군으로써 정상 식이를 섭취한 5주령의 정상 마우스(C57BL/6)를 사용하였다. 식이 섭취 시작 8주 후에 Oil-red O 염색을 통해 ApoE knockout 마우스의 aortic sinus (대동맥동) 내 동맥경화병소를 확인하였다. 이 후, 마우스의 혈액을 취하여 이를 PBS에 희석하고 4℃, 100,000 x g에서 2시간 동안 초고속원심분리를 하여 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체를 분리하였다. 수용성 단백질 부분과 세포밖 소포체에 존재하는 ICAM-1을 sandwich ELISA(R&D Systems)를 통해 정량한 결과를 도 4에 나타내었다. Atherosclerotic animal models were made by ingesting a Western diet (20% lipid, 1.5% cholesterol) in 5-week old ApoE knockout mice (Jackson Lab). At this time, 5 weeks old normal mice (C57BL / 6) who consumed a normal diet were used as a control. At 8 weeks after the start of diet, atherosclerosis in aortic sinus (aortic sinus) of ApoE knockout mice was identified by Oil-red O staining. Subsequently, the blood of the mice was taken, diluted in PBS, ultra-centrifuged at 4 ° C. and 100,000 × g for 2 hours to separate the soluble protein portion and the extracellular vesicles. 4 shows the results of quantifying ICAM-1 present in the water-soluble protein portion and extracellular vesicles through sandwich ELISA (R & D Systems).
도 4에 나타난 바와 같이, 동맥경화증 동물 모델의 혈액 내에 수용성 단백질 형태의 ICAM-1과 세포밖 소포체에 포함된 막단백질 형태의 ICAM-1이 모두 증가되어 있음을 알 수 있다. 상기 결과는 두 가지 형태의 세포부착 단백질의 정량결과가 질환 상황과 연관이 있음을 의미한다.
As shown in Figure 4, it can be seen that both the water-soluble protein type ICAM-1 and the membrane protein type ICAM-1 contained in the extracellular vesicles are increased in the blood of the arteriosclerosis animal model. The results indicate that the quantitative results of the two types of cell adhesion proteins are associated with the disease state.
실시예Example 5. 내피세포 및 내피세포 유래 5. Endothelial and Endothelial Cell Derivation 세포밖Extracellular 소포체에서 유전자 분리 및 유전자의 발현 변화 확인 Isolation of Genes and Identification of Gene Expression Changes in Vesicles
선행 논문 연구 결과를 바탕으로, 염증성 질환 상황의 내피세포에서 유전자 발현 차이를 보인 유전자 18종을 선정하였다. 내피세포 유래 세포밖 소포체의 유전자 분석에 사용된 18종의 유전자에 대한 정보는 도 5에 나타내었다.Based on the results of previous studies, 18 genes with different gene expressions in endothelial cells of inflammatory disease were selected. Information on 18 genes used for gene analysis of endothelial cell-derived extracellular vesicles is shown in FIG. 5.
내피세포 또는 내피세포 유래 세포밖 소포체는 RNeasy®Mini kit(QIAGEN, Cat. No. 74104)를 사용해 유전자 (RNA)를 분리하였다. 분리된 유전자는 3' 말단의 poly A tail과 결합하는 oligo(dT) 프라이머를 이용하여 상보적 DNA(cDNA, complementary DNA)로 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형(template)으로 사용하여 실시간 중합연쇄반응(Real time PCR, real time polymerase chain reaction)을 통해 유전자의 발현 변화를 분석하였다. Real time PCR은 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR kit(TAKARA, Cat. No. RR066A)를 이용해 수행하였으며, 전체 중합 반응은 45 사이클까지 확인하였다. 유전자의 발현량 차이는 SYBR 형광값이 측정되기 시작하는 사이클인 Ct(threshold cycle)값을 이용한 상대적인 정량을 수행하였다. 중합 반응이 동일한 유전자 양으로부터 시작되었는지 확인하기 위해 세포에서 항상 발현하는 유전자(housekeeping gene)인 GAPDH를 항상 같이 확인하였다. Real time PCR로 정상 및 염증성 질환 상황에서 내피세포 및 내피세포 유래 세포밖 소포체에서의 유전자 발현 차이를 확인한 18 종 유전자의 프라이머 염기 서열은 도 6에 나타내었다.
Endothelial cells or endothelial cell-derived extracellular vesicles were isolated by gene (RNA) using the RNeasy® Mini kit (QIAGEN, Cat. No. 74104). The isolated gene was synthesized with complementary DNA (cDNA, complementary DNA) using oligo (dT) primer that binds to the poly A tail at the 3 'end. Using the synthesized cDNA as a template (template), the expression changes of genes were analyzed by real time polymerase chain reaction. Real time PCR was performed using a One Step SYBR PrimeScript RT-PCR kit (TAKARA, Cat. No. RR066A), and the entire polymerization reaction was confirmed up to 45 cycles. Differences in the expression levels of the genes were performed using relative quantification using the threshold cycle (Ct), the cycle at which the SYBR fluorescence values began to be measured. GAPDH, a housekeeping gene that is always expressed in cells, was always identified to confirm that the polymerization reaction started from the same gene amount. Primer sequences of 18 genes identified by gene expression in endothelial cells and endothelial cell-derived extracellular vesicles under normal and inflammatory disease conditions are shown in FIG. 6.
실시예Example 6. 내피세포에서의 염증성 질환 관련 유전자의 발현 변화 분석 6. Analysis of Expression of Inflammatory Disease-related Genes in Endothelial Cells
내피세포에서 염증 상황을 유도하기 위해 TNF-α(10 ng/ml)를 24시간 처리하였다. 정상 상황 및 TNF-α에 의해 유도된 염증 상황의 내피세포에서 RNeasy®Mini kit(QIAGEN, Cat. No. 74104) 를 사용해 유전자(RNA)를 분리한 뒤에 real time PCR(TAKARA, Cat. No. RR066A)을 수행하여 정량 분석하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. TNF-α (10 ng / ml) was treated for 24 hours to induce inflammation in endothelial cells. Real time PCR (TAKARA, Cat. No. RR066A) after isolation of genes (RNA) using RNeasy® Mini kit (QIAGEN, Cat. No. 74104) from normal and TNF-α-induced inflammatory endothelial cells. ) Was quantitatively analyzed, and the results are shown in FIG. 7.
상기 도 5에서 명시한 염증성 질환 관련 유전자 18종에 대해 분석을 수행한 결과, 내피세포에서 정상 상황에 비해 염증성 질환 상황에서 발현이 증가하는 유전자를 확인하였다. As a result of analyzing the 18 kinds of inflammatory disease-related genes shown in FIG. 5, it was confirmed that genes in the inflammatory disease condition were increased in the endothelium compared to normal conditions.
도 7a는 18종 유전자 전체에 대한 유전자 발현을 표시한 것이며, 도 7b는 유전자 발현량이 200 배 이하인 유전자에 대해서만 표시한 것이다. FIG. 7A shows gene expression for all 18 genes, and FIG. 7B shows only genes whose gene expression is 200 times or less.
구체적으로, "200배"라 함은 유전자 발현량을 서로 간에 비교하였을 때, 정상 상황에 비해 TNF-α에 의해 유도된 염증 상황에서 유전자의 발현량이 200 배 증가하였다는 것을 의미한다. 18종 유전자 간에 발현량의 차이가 커서 200 배 이하인 유전자에 대해서만 추가로 도 7b에 나타낸 것이다. Specifically, the term "200-fold" means that the expression level of the gene is increased 200-fold in the inflammatory condition induced by TNF-α when compared with the normal expression level. The difference in the expression amount between the 18 genes is shown in Figure 7b further only for
염증성 질환 관련 상황에서 발현이 증가하는 유전자는 CXCL10, ICAM1, SELE가 가장 큰 발현 차이를 보이며, 이외에도 VCAM1, IL6, TNF, TNFAIP2, IRF1, IL32의 발현 증가가 특이적임을 확인하였다.
Genes with increased expression in inflammatory disease-related situations showed the largest difference in expression of CXCL10, ICAM1, and SELE, and in addition, increased expression of VCAM1, IL6, TNF, TNFAIP2, IRF1, and IL32.
실시예Example 7. 내피세포 유래 7. Endothelial Cell Derivation 세포밖Extracellular 소포체에서의 염증성 질환 관련 유전자의 발현 변화 Changes in the Expression of Inflammatory Disease-related Genes in the Vesicles
내피세포에 TNF-α(10 ng/ml)를 24시간 처리하였다. 정상 상황 및 TNF-α에 의해 유도된 염증 상황의 내피세포에서 세포밖 소포체를 분리한 뒤에 이로부터 유전자를 분리하여 real time PCR을 수행하고 정량 분석한 결과는 도 8에 나타내었다. 상기 도 5에서 명시한 염증성 질환 관련 유전자 18종에 대해 분석을 수행한 결과, 세포밖 소포체에서 정상 상황에 비해 염증성 질환 상황에서 발현이 증가하는 유전자를 발굴하였다. Endothelial cells were treated with TNF-α (10 ng / ml) for 24 hours. After the extracellular vesicles were separated from the endothelial cells in the normal situation and inflammatory conditions induced by TNF-α, genes were separated from them, and real time PCR was performed. As a result of analyzing 18 kinds of inflammatory disease-related genes shown in FIG. 5, the genes with increased expression in inflammatory disease conditions in the extracellular vesicles were found.
도 8a는 18종 유전자 전체에 대한 유전자 발현을 표시한 것이며, 도 8b는 유전자 발현량이 25 배 이하인 유전자에 대해서만 표시한 것이다. 염증성 질환 관련 상황에서 발현이 증가하는 유전자는 ICK, TNFAIP2가 가장 큰 발현 차이를 보이며, 이외에도 ICAM1, SELE, BMP4, VWF, IRF1, CXCL10의 발현 증가가 특이적임을 확인하였다. 세포밖 소포체의 유전자 분석 결과, 정상 상황에 비해 염증성 질환 상황에서 발현이 증가하는 유전자의 종류는 내피세포에서의 유전자 분석 결과와 유사하나, 세포밖 소포체 특이적인 유전자 발현이 관찰되었다. FIG. 8A shows gene expression for all 18 genes, and FIG. 8B shows only genes whose gene expression amount is 25 times or less. ICK and TNFAIP2 showed the largest expression difference in the genes with increased expression in inflammatory disease-related situations. In addition, the expression of ICAM1, SELE, BMP4, VWF, IRF1, and CXCL10 was confirmed to be specific. As a result of gene analysis of extracellular vesicles, the type of genes whose expression is increased in inflammatory diseases compared to normal conditions is similar to that of endothelial cells, but extracellular vesicle-specific gene expression was observed.
상기 결과로부터, 세포밖 소포체는 유래 세포의 유전자 발현 상황을 어느 정도 대변하지만, 세포밖 소포체에 단백질이나 유전자가 실리는(loading) 특이적인 작용 기전에 의해 유래 세포에서 차이를 보이는 모든 유전자가 세포밖 소포체에서도 관찰되는 것은 아님을 알 수 있다.
From the above results, the extracellular vesicles represent the gene expression state of the derived cells to some extent, but all genes that differ in the derived cells due to the specific mechanism of action by which proteins or genes are loaded into the extracellular vesicles are extracellular. It can be seen that it is not observed in the endoplasmic reticulum.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.The foregoing description of the present invention is intended for illustration, and it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be easily modified in other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above are to be understood in all respects as illustrative and not restrictive.
Claims (16)
상기 방법은 수용성 단백질 및 세포밖 소포체에 존재하는 단백질 존재량 비율 비교를 추가적으로 포함하는, 염증성 질환 진단 방법.The method of claim 1,
The method further comprises comparing the proportion of protein present in the soluble protein and extracellular vesicles, inflammatory disease diagnostic method.
상기 정량하는 단백질은 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1), E-selectin, 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)을 포함하는 것인, 염증성 질환 진단방법.The method of claim 1,
The quantitative protein includes intercellular adhesion molecule-1 (IMC-1), E-selectin, and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1).
상기 염증성 질환은 암, 패혈증, 동맥경화증, 및 류마티스 관절염을 포함하는 것인, 염증성 질환 진단 방법.The method of claim 1,
Wherein said inflammatory disease comprises cancer, sepsis, arteriosclerosis, and rheumatoid arthritis.
상기 체액은 혈액, 혈청, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 및 콧물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 염증성 질환 진단 방법.The method of claim 1,
Wherein said body fluid is selected from the group consisting of blood, serum, urine, ascites, synovial fluid, breast milk, sputum, saliva, sweat, tears, and runny nose.
상기 유전자는 EDN1(Endothelin 1), VCAM1(Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1), SELE(Selectin E), NOS3(Nitric oxide synthase 3), BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VWF(Von Willebrand factor), MPZ(Myelin protein zero), IRF1(Interferon regulatory factor 1), TNF(Tumor necrosis factor), IL32(Interleukin 32), CFLAR(CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10(Chemokine(C-X-X motif) ligand 10), IL6(Interleukin 6), ICK(Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8(Rho GTPase activating protein 8), 및 F3(Coagulation factor Ⅲ) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 진단 방법.The method according to claim 6,
The genes include Endothelin 1 (EDN1), Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM1), Intercellular adhesion molecule 1 (IMAM1), Selectin E (SELE), Nitric oxide synthase 3 (NOS3), Bone morphogenetic protein 4 (BMP4), and VWF (VWF) Von Willebrand factor (MPZ), Myelin protein zero (MPZ), Interferon regulatory factor 1 (IRF1), Tumor necrosis factor (TNF), Interleukin 32 (IL32), CASP8 and FADD-like apotosis regulator (CFLAR), Chemokine (CXX motif (CXX motif) ) ligands 10), IL6 (Interleukin 6), ICK (Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2 (Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8 (Rho GTPase activating protein 8), and F3 (Coagulation factor) III) at least one selected from the group consisting of, inflammatory disease diagnostic method.
상기 염증성 질환은 암, 패혈증, 동맥경화증, 및 류마티스 관절염을 포함하는 것인, 염증성 질환 진단 키트.The method of claim 9,
Wherein said inflammatory disease comprises cancer, sepsis, arteriosclerosis, and rheumatoid arthritis.
상기 체액은 혈액, 혈청, 소변, 복수, 활액, 모유, 가래, 침, 땀, 눈물, 및 콧물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 염증성 질환 진단 키트.The method of claim 9,
The body fluid is selected from the group consisting of blood, serum, urine, ascites, synovial fluid, breast milk, sputum, saliva, sweat, tears, and runny nose, inflammatory disease diagnostic kit.
상기 유전자는 EDN1(Endothelin 1), VCAM1(Vascular cell adhesion molecule 1), ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1), SELE(Selectin E), NOS3(Nitric oxide synthase 3), BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VWF(Von Willebrand factor), MPZ(Myelin protein zero), IRF1(Interferon regulatory factor 1), TNF(Tumor necrosis factor), IL32(Interleukin 32), CFLAR(CASP8 and FADD-like apotosis regulator), CXCL10(Chemokine(C-X-X motif) ligand 10), IL6(Interleukin 6), ICK(Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8(Rho GTPase activating protein 8), 및 F3(Coagulation factor Ⅲ) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 진단 키트.The method of claim 14,
The genes include Endothelin 1 (EDN1), Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM1), Intercellular adhesion molecule 1 (IMAM1), Selectin E (SELE), Nitric oxide synthase 3 (NOS3), Bone morphogenetic protein 4 (BMP4), and VWF (VWF) Von Willebrand factor (MPZ), Myelin protein zero (MPZ), Interferon regulatory factor 1 (IRF1), Tumor necrosis factor (TNF), Interleukin 32 (IL32), CASP8 and FADD-like apotosis regulator (CFLAR), Chemokine (CXX motif (CXX motif) ) ligands 10), IL6 (Interleukin 6), ICK (Intestinal cell (MAK-like) kinase), TNFAIP2 (Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2), ARHGAP8 (Rho GTPase activating protein 8), and F3 (Coagulation factor) III) one or more selected from the group consisting of, inflammatory disease diagnostic kit.
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| WO2016140540A1 (en) * | 2015-03-04 | 2016-09-09 | 포항공과대학교 산학협력단 | Bacteria identification using extracellular vesicle derived from nuclease-treated bacteria |
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| Human Cells shed not Soluble ICAM-1 but Membrane ICAM-1 Associated with Extracelluar Membrane Vesicle, Kyung Hee Univ., Hwan Myung Lee(2005.08.)* * |
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|---|---|---|---|---|
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